一種趨化小肽與雙特異抗體的融合蛋白的制作方法

專利名稱：一種趨化小肽與雙特異抗體的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程抗體領域，更具體地，涉及一種趨化因子SLC(Secondary lymphoid tissue chemokine，次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白；這種融合蛋白的構建、表達和純化方法；含有該融合蛋白的載體和大腸桿菌宿主菌。
背景技術：
隨著抗體工程的發展，免疫治療是繼手術、放療、化療后，又一治療腫瘤的重要方法。理想的治療方案應是針對腫瘤細胞的特異性高效殺傷的，即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞的雙特異抗體，是這個方案的較理想的候選。它一方面針對腫瘤，實現與靶腫瘤細胞的特異性結合，另一方面將效應細胞富集在腫瘤細胞周圍，模擬天然配體的作用，在腫瘤部位與效應細胞引發分子結合，激活效應細胞，實現對腫瘤的特異性殺傷和裂解(參考文獻1-10)。但富集在腫瘤部位的效應細胞的數量畢竟有限，使這一作用難以得到最大的發揮。
趨化因子的發現使這一問題的解決出現新的曙光。趨化因子(趨化性細胞因子的簡稱)是一由小分子(8-10KD)的堿性分泌蛋白組成的復雜超家族，對各種白細胞有趨化效應(參考文獻11-15)。根據N末端半胱氨酸的數量和位置，趨化因子分為四個亞家族CC，CXC，CX3C和C。其中SLC是CC家族的成員(參考文獻16)，主要在次級淋巴組織(如脾臟、淋巴結、派氏集結、淋巴內皮中)表達，對T淋巴細胞、B淋巴細胞、成熟的樹突狀細胞有趨化作用。
最近，一些趨化因子的三維結構已經得到解析(參考文獻17-22)，從已有的資料看趨化因子的三維結構是高度保守的，他們大都有一柔性無序的N末端，而后是呈螺旋轉角的N末端環形區，接著是三個反平行的β折疊，最后是C末端α螺旋，N末端和N末端區通過兩個二硫鍵連接到β折疊上。人們通過截短N末端區或對N末端區和N末端環形區進行丙氨酸掃描，證明了這兩個區域在配體結合和激活受體是必須的(參考文獻23-26)。Pius Loetscher等人證實SDF-1的N末端區和N末端環形區對其受體CXCR4有足夠的結合活性，對表達該受體的淋巴細胞有一定的趨化活性(參考文獻27)。本實驗室也證實CCL21的N末端區和N末端環形區對受體CCR7的結合活性很高，對樹突狀細胞和T淋巴細胞有相當的趨化活性。
結合雙特異抗體與趨化因子的特點，本發明人已成功構建了趨化因子SLC的N末端十八肽和抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白，并已證明該融合蛋白即有對表達CCR7受體的細胞結合和趨化活性，又具有雙特異抗體對相應的腫瘤細胞的結合和殺傷活性。這樣該融合蛋白在雙特異抗體的導向作用下到達腫瘤部位，而后發揮趨化作用將足夠量的樹突狀細胞和T淋巴細胞吸引到腫瘤部位，殺傷腫瘤，這樣可以高效地治療腫瘤。

發明內容
本發明將趨化因子CC家族SLC的N末端十八肽，抗卵巢癌單鏈抗體×抗CD3單鏈抗體依次相連構建趨化因子SLC(Secondary lymphoid tissuechemokine，次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白；這一構建物能將二者的優點充分發揮。一方面，利用SLC的N末端十八肽的趨化作用，吸引T淋巴細胞和樹突狀細胞到相應部位；另一方面，利用抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的橋連作用，特異性激活T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞。該融合蛋白在卵巢癌的免疫治療領域，具有較大的應用前景。
因此，本發明的一個目的是提供一種趨化小肽與雙特異抗體的融合蛋白。
在本發明的一個實施方案中，所述趨化小肽是CC家族趨化因子SLC(次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽(SDGGAQDCCLKYSQRKIP)。
在本發明的另一個實施方案中，所述雙特異抗體是抗腫瘤×抗CD3雙特異抗體。在本發明中優選所述抗腫瘤×抗CD3雙特異抗體是抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體。
在本發明的一個具體實施方式
中，所述融合蛋白是由CC家族趨化因子SLC(次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)2連接肽、抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體依次連接而成。優選所述融合蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所編碼，其C末端可以任選地帶有C-myc(氨基酸序列為EQKLISEEDLN)和His6標簽。
本發明另外一個目的是提供一種表達載體，其特征在于包含權利要求1-6中任何一項所述融合蛋白的編碼基因。優選所述載體是p18TBHL。
本發明還提供含有上述載體的宿主細胞，優選大腸桿菌。
本發明另一方面還提供一種純化上述任一種融合蛋白的方法，其特征在于聯合采用DEAE陰離子交換樹脂和Ni親和柱進行純化。
更具體地，按照本發明的一方面，提供了一種治療卵巢癌的趨化因子SLC的N末端十八肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白。
在本發明的另一方面，提供了一種構建趨化因子SLC的N末端十八肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白的方法。
優選本發明所述的融合蛋白的氨基酸序列如以下SEQ ID NO2所示。
SDGGAQDCCLKYSQRKIPGGGGSGGGGSLELEDVQLLESGPEAKKPGETVRISCKASGYTFTTAGMQWVQKMPGKGLKWLGWINTNSEVPKYAEDFRGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATFFCARSFTWGTMDYWGQGTPVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLELKEFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSELDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRATSGGGGSGGGGSGGGGSSREVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSS(粗體部分是趨化因子SLC的N末端十八肽，下劃線部分是(GGGGS)2連接肽，以下部分是抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體)
更優選編碼本發明所述融合蛋白的核苷酸序列如以下SEQ ID NO1所示。
agcgatggtggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccgggtggtggtggttctggtggtggtggttctctcgagctcgaggatgtgcagctgctggagtctggacctgaggcgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaactgctggaatgcagtgggtgcaaaagatgccaggaaagggtttgaagtggcttggctggataaacaccaactctgaagttccaaaatatgcagaagacttcaggggacggtttgccttctctttggagacctctgccagcactgcatatttacagataagcaacctcaaaaatgaggacacggctacgtttttctgtgcgagatcttttacttgggggactatggactattggggccaagggaccccggtcaccgtctcctcaactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcttctagagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagacccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaaactcctgatctacaaggtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctcaaagaattccagaatgcgctgttagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcagagctcgacatccagatgacccagaccacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagaaattatttaaactggtatcaacagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaagttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaggatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtggacgttcgctggaggcaccaaactggaactgaagcgcgctactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcttctagagaggtgaagctggtggagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagtcatggaaagaaccttgagtggatgggacttattaatccttacaaaggtgttagtacctacaaccagaagttcaaggacaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggaactcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcggggtactacggtgatagtgactggtacttcgatgtctggggcgcaggaacctcagtcactgtctcctca發明詳述在本發明的上下文中，所使用的術語除非另外說明，一般具有本領域的普通技術人員通常理解的含義。
本發明所構建的趨化因子SLC的N末端十八肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白是通過基因工程重組的方法構建的，即具有吸引T淋巴細胞和樹突狀細胞的能力，又具有激活T淋巴細胞殺傷腫瘤的功能。具體地，本發明所述的趨化因子SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白是將具有趨化能力的CC家族趨化因子SLC的N末端十八肽經(GGGGS)2連接肽與抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體串聯而成的分子。本發明選用具有趨化能力的CC家族趨化因子SLC的N末端十八肽，而未用SLC全分子，這就避免因分子過大造成后續的純化和用藥的困難。在十八肽和雙特異抗體之間加入連接肽，可以保證兩部分都能正確折疊，行使正常的功能。在雙特異抗體的C端加上C-myc標簽和組氨酸標簽(參考文獻28，29)，便于活性的檢測和純化。該融合蛋白具有以下優點1.利用CC家族趨化因子SLC的N末端十八肽的趨化能力可吸引大量的T淋巴細胞和樹突狀細胞到相應的部位；2.發揮卵巢癌雙特異抗體的功能，激活T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞。
本發明所述的純化，是采用DEAE陰離子交換樹脂和Ni親和柱耦連，首先將胞內可溶表達產物，經過DEAE陰離子交換層析，使大部分雜蛋白被吸附在DEAE柱上，而趨化因子SLC的N末端十八肽與雙特異抗體的融合蛋白隨流穿液流出，而后流穿液過Ni親和柱進一步除去殘留的雜蛋白，純度可達90％。
本發明的技術方案如下首先將載體pTMF酶切處理，與片段c-myc-his6相連而成pTMFMH。而后將載體pTMFMH雙酶切與擴增的BHL-1相連構建pTCMBO，接著將pTCMBO酶切、補平，再酶切；十八肽兩條互補鏈在適當溫度退火形成雙鏈片段，隨后與處理好的載體連接構建p18TBHL。質粒p18TBHL轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自美國Invitrogen公司)，用IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(購自寶生物工程(大連)有限公司)進行低溫誘導表達，表達產物超聲上清用DEAE陰離子交換柱(法碼西亞公司)和Ni親和柱(法碼西亞公司)純化。SDS-PAGE和免疫印記檢測表達純化情況。用趨化實驗檢測純化產物對刺激過的外周血淋巴細胞的趨化作用。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測純化產物的抗原結合活性，單色流式細胞術(FACS)檢測其對腫瘤細胞和淋巴細胞的結合活性。MTT法(四甲基偶氮唑藍法)檢測純化產物介導T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞的效果。雙色FACS法檢測純化產物介導T淋巴細胞對卵巢癌細胞的殺傷。
應當指出，在本說明書的上下文，尤其是“實施例”部分的公開內容的基礎上，本發明的其它方面和優點對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。


圖1.構建SLC的N末端18肽和卵巢癌雙特異抗體融合蛋白的質粒圖。SLC的N末端18肽以NcoI和XhoI構建到卵巢癌雙特異抗體BHL的N末端，在融合蛋白的C末端有檢測標簽C-myc和純化標簽6His。
圖2.融合蛋白表達純化圖。第一泳道，表達產物超聲上清；第二泳道，DEAE流穿；第三泳道，DEAE洗脫；第四泳道，Ni柱上樣樣品；第五泳道，Ni柱流穿；第六泳道，Ni柱洗滌；第七泳道，Ni柱洗脫；第八泳道，低分子量蛋白標準(上海生物化學研究所)。
圖3.檢測純化的融合蛋白。第一泳道，純化的融合蛋白；第二泳道，預染蛋白分子量標準。
圖4.趨化試驗結果圖。SLC，18T-BHL，18T，BHL，BSA在0.1，1，10，100，1000，10000nM時對外周血單個核細胞PBMC的趨化作用。
圖5.BHL和18T-BHL對SKOV3膜抗原結合的ELISA檢測。兩種樣品的濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625和0.3125μg/ml，圖中曲線Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被SKOV3膜抗原，分別加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。圖中曲線Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被SKOV3膜抗原時，加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。
圖6.BHL和18T-BHL對PBL膜抗原結合的ELISA檢測。兩種樣品的濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125μg/ml，圖中曲線Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被PBL膜抗原，分別加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。圖中曲線Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被PBL膜抗原時，加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。
圖7.BHL和18T-BHL對Jurkat膜抗原結合的檢測。兩種樣品的濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125μg/ml，圖中曲線Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被Jurkat膜抗原，分別加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。圖中曲線Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被Jurkat膜抗原時，加入一定量的18T-BHL和BHL的結果。
圖8.18T-BHL和BHL對SKOV3細胞結合的FACS鑒定，圖中帶陰影的峰是不加樣品18T-BHL和BHL的對照樣品測定結果，不帶陰影的峰是添加18T-BHL和BHL的樣品測定結果。其中左邊的圖是BHL的測定結果，右邊的圖是18T-BHL的測定結果。
圖9.18T-BHL和BHL對Jurkat細胞結合的鑒定，圖中帶陰影的峰是不加樣品18T-BHL和BHL的對照樣品測定結果，不帶陰影的峰是添加18T-BHL和BHL的樣品測定結果。其中左邊的圖是BHL的測定結果，右邊的圖是18T-BHL的測定結果。
圖10.18T-BHL和BHL對PBL細胞結合的鑒定，圖中帶陰影的峰是不加樣品18T-BHL和BHL的對照樣品測定結果，不帶陰影的峰是添加18T-BHL和BHL的樣品測定結果。其中左邊的圖是BHL的測定結果，右邊的圖是18T-BHL的測定結果。
圖11.MTT檢測不同濃度的18T-BHL和BHL介導的T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的結果。效應細胞和靶細胞的比率為10∶1時，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μg/ml的18T-BHL和BHL介導的T淋巴細胞對靶細胞SKOV3的殺傷結果。
圖12.PKH26和AnnexinV-FITC雙標記被殺傷的腫瘤細胞(SKOV3)的FACS檢測結果。效應細胞和靶細胞的比率為10∶1時，18T-BHL和BHL的濃度分別為20，10，1，0μg/ml時介導T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷。左上區為PKH26染色的未凋亡的SKOV3細胞，右上區為PKH26和雙染色的凋亡細胞。
圖13.PKH26和AnnexinV-FITC雙標記被殺傷的腫瘤細胞(SKOV3)的FACS檢測結果的統計圖。BHL濃度為20，10，1，0μg/ml時，凋亡的細胞分別為45.58％，43.54％，28.37％，26.02％。18T-BHL濃度為20，10，1，0μg/ml時，凋亡細胞分別為52.33％57.33％47.04％24.68％。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，本說明書中的實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
實施例1載體pTCMBO的構建。
(1)載體pTMF的處理。
PTMFMH的構建流程。首先將載體pTMF(載體pTMF來源于載體pET28a(+)(Novagen公司)，由本公司將合成的一段多克隆位點取代載體pET28a(+)的多克隆位點構建而成，見參考文獻30)用限制性內切酶BamHI(寶生物工程(大連)有限公司，下同)酶切，具體如下取載體pTMF18μl，BamHI 1.5μl，K緩沖液3μl，用ddH2O補足體積至30μl，37℃水浴酶解反應4小時。按照小量膠回收試劑盒(華舜生物技術有限公司產品，下同)說明純化回收酶切后的DNA。回收產物用Bpul 102I酶切，具體如下pTMF 16μl，Bpul 102I 1.5μl(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)，基本緩沖液3μl，用ddH2O補足體積至30μl，37℃水浴酶解反應4小時。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，參照小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。
(2)片段c-myc-his的制備根據c-myc和his的序列，設計合成兩條互補鏈上游5’aacggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcacatcat3’下游5’gacgcttagcttattgctcgtgatggtgatgatgatgtgcggccccattcagatcctctt 3’兩條互補鏈PCR擴增得到含有酶切位點BamHI和Bpul 102I的互補雙鏈。具體操作如下上游引物2μl，下游引物2μl，PCR緩沖液2μl(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)，dNTP 2μl(上海博亞生物技術有限公司，下同)，pfu酶1μl(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)，H2O 11μl，反應程序95℃變性5min；94℃1min 53℃1min 72℃1min反應25個循環，72℃5min。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用小量膠回收試劑盒純化回收所需的片段。回收的片段分別進行BamHI和Bpul 102I酶切，具體操作參照(1)，小量膠回收試劑盒純化回收酶切的片段。
(3)載體片段pTMF和片段c-myc-his的連接取回收的雙酶切pTMF約40ng，c-myc-his片段約20ng，加入2μl 10×T4DNA連接酶緩沖液(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下660mM Tris-HCl(pH7.6)，66mM MgCl2，100mM DTT，1mM ATP，下同)，1μl T4DNA連接酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜(約16小時)。
(4)大腸桿菌感受態細胞的制備用氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態細胞，方法如下從野生大腸桿菌菌株Top10(Invitrogen公司)平板上挑取單菌落，接種于3ml LB(10g/l 胰蛋白胨(GIBCO公司)，5g/l酵母膏(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5)液體培養基中，37℃震蕩培養過夜。以1％的接種量轉接于40ml的LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600值為0.3-0.4時，將菌液置于冰浴中10分鐘，于4℃，4000rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀重懸于20ml預冷的0.1mol/L CaCl2(Sigma公司)中，冰浴放置30分鐘，4℃，4000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入2ml預冷的0.1mol/L CaCl2(含20％甘油)重懸細胞，以每管200μl分裝備用。不及時使用的各管于-70℃保存。
(5)重組DNA的轉化，陽性克隆的篩選及測序鑒定10μl連接產物加入到200μl的感受態細胞Top10中，輕輕混勻，冰浴放置30分鐘，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分鐘，然后加入800μl不加抗生素的液體LB培養基，輕輕混勻，37℃輕搖培養復蘇45-60分鐘。取200μl培養液涂布于LB(含50μg/ml Km)平板上，表面干燥后，37℃倒置培養過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，用BamHI和Bpul 102I雙酶切，能切下大約87bp的片段，即初步確定為陽性克隆；同時，進行PCR鑒定。引物序列如下上游引物5’atagcgatggtggtgcacaggattgctg3’，下游引物5’gacggatccttattgctcgtgatggtgatgatgatgtgcggccccattcagatcctctt，PCR反應參照分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，冷泉港實驗室出版)，PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，得到與預期大小相同的片段，進一步鑒定了插入外源片段的質粒。將鑒定后的質粒送上海博亞生物技術有限公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為pTMFMH。
(6)設計一對擴增BHL-I(編碼卵巢癌雙特異抗體的序列)的引物，分別含有酶切位點XhoI和BamHI。引物序列如下引物1 5’ttctcgaggatgtgcagcctgctggagtc 3’引物2 5’atggatcctgaggagacagtgactgagg 3’以pBHL-I為模板(參考文獻10)，PCR反應參照分子克隆，PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，得到1590bp大小的片段。并將片段進行XhoI(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)和BamHI雙酶切，小量膠回收試劑盒回收。
(7)pTCMBO的構建將質粒pTMFMH進行XhoI和BamHI雙酶切，小量膠回收試劑盒回收，與酶切的片段BHL-I連接，轉化大腸桿菌感受態細胞Top10，而后篩選陽性克隆。先進行PCR鑒定，擴增出約1600bp大小的片段，再用XhoI和BamHI對重組質粒進行酶切鑒定，切下1600bp大小的片段。將鑒定陽性的質粒送上海博亞生物技術有限公司測序鑒定，測序正確的陽性質粒命名為pTCMBO。
實施例2載體p18TBHL的構建趨化因子18肽的制備根據SLC的序列，設計合成兩條產生N末端18肽的互補鏈etup5’agcgatggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccg3’etdown 5’ctcgagagaaccaccaccaccagaaccaccaccacccggaattttacgctggctata3’兩條互補鏈PCR擴增得到3’端含有酶切位點XhoI的互補雙鏈。具體操作參照分子克隆指南。用小量膠回收試劑盒回收PCR產物。回收的PCR產物進行XhoI單酶切，酶切反應參照產品說明書，用小量膠回收試劑盒純化回收酶切的片段。
載體pTCMBO的處理載體pTCMBO先用NcoI酶切(購自寶生物工程(大連)有限公司，下同)，補平，再用XhoI酶切。具體操作如下載體pTCMBO的NcoI酶切，酶切反應參照產品說明書，用小量膠回收試劑盒純化回收酶切的片段。酶切載體的補平DNA 15μl PCR緩沖液3μl pfu酶1μl dNTP 3μlH2O 8μl，94℃10min 72℃20min，用小量膠回收試劑盒純化回收補平的片段。補平片段用XhoI酶切酶切反應參照產品說明書，用小量膠回收試劑盒純化回收酶切的片段。
載體pTCMBO與十八肽的連接取回收的酶切補平載體pTCMBO約40ng，十八肽片段約20ng，加入2μl 10×T4DNA連接酶緩沖液，1μl T4DNA連接酶，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜(約16小時)。
(4)重組DNA的轉化，陽性克隆的篩選及測序鑒定質粒轉化參照實施例1的(5)。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，進行PCR鑒定。引物序列如下上游引物5’agcgatggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccg 3’下游引物5’tgaggagacagtgactgaggttc 3’PCR反應參照分子克隆，PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，得到與預期大小相同的片段，將鑒定后的質粒送上海博亞生物技術有限公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為p18TBHL。
實施例3p18TBHL的低溫誘導胞內可溶表達(1)將p18TBHL轉化大腸桿菌BL21(DE3)按照實施例1的(4)中所述制備感受態細胞的方法，制備大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受態細胞。按照質粒提取試劑盒(上海華舜公司)的說明書提取質粒p18TBHL，按照實施例1的(5)進行轉化實驗。
(2)低溫誘導表達將含有p18TBHL的BL21(DE3)涂LB-K平板，37℃過夜培養，然后挑取單克隆，接種于5ml LB-K液體培養基中，在大試管內，37℃搖床培養過夜(200轉/分鐘)。次日取過夜培養物按1/100的比例轉接到250mlLB-K液體培養基中，繼續37℃搖床培養(200轉/分鐘)至A600＝0.6，補加IPTG(購自寶生物工程(大連)有限公司)至終濃度為0.4mmol/ml，繼續在30℃培養4小時，進行低溫誘導表達。室溫12,000rpm離心10分鐘，收集菌體，懸于1/5培養體積的緩沖液中，進行菌體超聲破碎。經過進一步室溫12,000m離心10分鐘后，離心上清組分含有胞內可溶表達的趨化因子SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白。因為超聲上清可以直接用于純化和后續的體外活性實驗，省去了變性和復性的步驟，大大節約生產成本和時間。
實施例4采用DEAE陰離子交換柱和Ni親和柱純化趨化因子SLC的N末端十八肽與雙特異抗體的融合蛋白將上述250ml的低溫誘導胞內可溶表達產物室溫12,000rpm離心10分鐘，收集菌體并懸于1/5體積(50ml)的DEAE陰離子交換樹脂(法碼西亞公司)的平衡緩沖液(10mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH9.0)中，進行超聲破碎。然后室溫12,000rpm離心10分鐘，離心上清直接用于純化。
將20mlDEAE陰離子交換樹脂懸浮在100ml平衡緩沖液中，進行裝柱(上海華美公司)，柱的規格為16mm×20cm；然后使用5個柱體積的平衡緩沖液進行平衡，流速為1ml/分鐘；將上述超聲產物的離心上清直接上柱，上樣流速為0.25ml/分鐘，收集流穿組分；收集結束后，使用2個柱體積(約40ml)的洗脫緩沖液(500mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH9.0)進行洗脫，流速為0.25ml/分鐘；使用2個柱體積(約40ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，2個柱體積(40m1)1mol/L NaCl進行柱的再生，流速為0.5ml/分鐘；最后再使用2個柱體積(40ml)平衡緩沖液平衡柱料，流速為1ml/分鐘用于下一次純化。如果較長時間不使用，必須使用4個柱體積以上的20％乙醇水溶液過柱后，保存在4℃，以免柱料滋生細菌。
將10ml Ni親和柱料(法碼西亞公司)懸浮在50ml平衡緩沖液(50mMNaH2PO4150mM NaCl PH8.0)中，進行裝柱(上海華美公司)，柱的規格為10mm×8cm；然后用5個柱體積的平衡緩沖液進行平衡，流速為0.5ml/分鐘；將上述DEAE流穿液上柱，上樣流速為0.25ml/分鐘，收集流穿組分，用平衡液洗至基線；使用2個柱體積的洗滌液(50mM NaH2PO4150mMNaCl PH8.0 20mM咪唑)洗滌柱，收集洗滌組分；用2個柱體積的洗脫液(50mM NaH2PO4150mM NaCl PH8.0250mM咪唑)洗脫，收集洗脫組分，使用2個柱體積(約20ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，最后用水沖洗。如果較長時間不使用，必須使用4個柱體積以上的20％乙醇水溶液過柱后，保存在4℃，以免柱料滋生細菌。
Ni柱的再生，首先用0.2M醋酸(sigma公司)洗滌5個柱體積，用水沖洗；再用0.5M NaOH洗滌5個柱體積，用水沖洗；進而用100mM EDTA(乙二胺四乙酸)鏊合下Ni離子，用足夠的水沖洗；然后用200mM NiSO4再生柱3個柱體積，最后用水沖洗掉未結合的Ni離子。
上述收集的各組分，直接進行還原SDS-PAGE，鑒定純化效果。SDS-PAGE的結果顯示經過DEAE陰離子交換和Ni親和柱純化，可以去除超聲上清中的大部分雜蛋白，使用數字圖象分析儀(美國AlphaInnotech公司，AlphaImage 2200 Documentation & analysis system)確定18TBHL的純度達到90％左右，結果見圖2。用免疫印跡的方法檢測純化產物，操作方法參照分子克隆，同樣表明產物的純度很高，結果見圖3。
上述純化樣品需要對PBS(磷酸鹽緩沖液)(8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl調pH至7.4，定容至1升)透析過夜(4℃)。透析體積為500ml，每隔6個小時換一次透析液。采用Bradford法對透析后的樣品進行蛋白定量，具體操作按照《精編分子生物學實驗指南》(顏子穎，王海林譯，金冬雁校，1999，科學出版社，)進行。定量后的樣品補加NaN3(Sigma公司)至終濃度0.05％(W/V)，作為防腐劑；補加海藻糖(購自中國科學院微生物研究所)至終濃度0.15mol/L，作為穩定劑。然后分裝為1ml/份凍存于-80℃，待用。
實施例5趨化試驗(1)外周血單個核細胞(PBMC)的分離將北京紅十字中心血站購得的濃白血液用2倍體積的RPMI1640(GIBCO公司，下同)稀釋。加3ml淋巴細胞分離液到10ml離心管，而后緩慢加入6ml血液到同一離心管，保持分層不被破壞。2500rpm離心25分鐘，出現分層，上層為稀釋的血漿，中層為淋巴細胞分離液，下層為紅細胞。在上層與中層間的灰白色層為外周血單個核細胞。吸取外周血單個核細胞到50ml離心管，加適量的RPMI1640稀釋，而后2000rpm離心5分鐘。棄取上清，加適量的RPMI1640重懸細胞，1800rpm離心5分鐘。棄取上清，細胞沉淀用適量的RPMI1640重懸，1500rpm離心5分鐘。棄去上清，細胞用RPMI1640(含10％的FBS(胎牛血清)(黑龍江江海生物工程技術公司))重懸，調整細胞濃度到1×106，37℃，5％CO2培養箱培養備用。
(2)趨化試驗細胞遷移試驗在48孔細胞趨化小室中進行(Neuroprobe，USA)。外周血單個核細胞(PBMC)懸浮培養于RPMI1640(含有10％的)，分別經PHA(20mg/L)刺激3天，IL-2(1000kU/L)刺激2天，充分活化后使用。下層孔加入30μl含有不同濃度的各種實驗樣品，上層孔加入50μl的4×106細胞/ml的細胞懸液。上層孔和下層孔為5μm孔徑的無聚乙烯吡咯酮的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，USA)所分隔。朝向下層孔的膜面事先用5μg/ml四型膠原蛋白在室溫預包被2小時，然后用滅菌水充分洗滌。試驗在37℃濕潤的環境中(含5％的CO2)進行4小時。而后試驗后的聚碳酸酯膜被洗滌，固定，用Liu solution試劑盒染色(Baso Diagnostic Inc.Taiwan)。在高倍鏡下(160×)隨機選取5個視野記錄趨化的細胞數量。計算趨化指數(CI)，趨化指數＝趨化因子作用下趨化的細胞數/遷移到對照孔的細胞數。結果見圖4。由圖可見SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白對外周血淋巴細胞有較強的趨化能力。
實施例6ELISA方法檢測趨化因子SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白的抗原結合活性Jurkat細胞膜抗原的制備收集Jurkat細胞(人急性白血病淋巴瘤細胞)(購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，序號TIB-152)約5×106，1,000g離心10分鐘后，將細胞沉淀懸浮在0.5ml PBS中，進行超聲破碎。將超聲破碎液12,000rpm室溫離心10分鐘后，保留超聲上清，使用Bradford法進行蛋白濃度定量。然后補加NaN3至終濃度0.05％(W/V)，作為防腐劑；補加海藻糖(購自中國科學院微生物研究所)至終濃度0.15mol/L，作為穩定劑。后分裝為100μl/份凍存于-80℃，待用。SKOV3(購自美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，序號)和PBL(外周血淋巴細胞)參照Jurkat細胞膜抗原的制備ELISA操作步驟(1)包被抗原濃度分別為10μg/ml SKOV3細胞膜抗原；10μg/ml Jurkat細胞膜抗原；10ug/ml PBL細胞膜抗原。包被體積為100μl/孔包被。包被緩沖液配方1.36g Na2CO3，7.35g NaHCO3，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH調pH9.2，補水至1L。PBS 37℃包被2小時或4℃包被過夜。
封閉PBS洗板1-2次后，加入封閉液PBSA(PBS-1％BSA(W/V))，200μl/孔，37℃封閉1-2小時。
(3)加樣PBS洗板三次后，加入純化樣品，100μl/孔，37℃孵育1-2小時。樣品使用方法以20μg/ml的純化趨化因子SLC的N末端十八肽與雙特異抗體的融合蛋白作為起始濃度，進行倍比稀釋7個梯度，每個梯度三復孔。
(4)加入第一抗體PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次后，以封閉液1/1000稀釋自制兔抗抗體，37℃孵育1-2小時。
(5)加入第二抗體PBST洗板三次后，以封閉液1/1000稀釋標記的羊抗兔IgG(購自華美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小時。
(6)顯色PBST洗板5次后，添加顯色液(48.6ml 0.1M檸檬酸，51.4ml0.2M Na2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物緩沖液；10ml底物緩沖液中加入4mg OPD即鄰苯二胺((Sigma公司)，15μl 30％H2O2配成顯色液)，100μl/孔，室溫避光顯色15-30分鐘。
(7)終止反應添加終止液(1mol/L HCl)，50μl/孔。
(8)測定結果在490nm讀取吸光值。
ELISA結果見圖5-7。由圖可見對于SKOV3膜抗原，SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白有著與卵巢癌雙特異抗體相似的結合能力，對于Jurkat和PBL膜蛋白，SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白的結合能力強于卵巢癌雙特異抗體。
實施例7FACS(流式細胞術)方法檢測融合蛋白與腫瘤細胞的結合活性首先采用間接FACS方法檢測融合蛋白對腫瘤細胞SKOV3的結合。
具體操作如下(1)培養、收集腫瘤細胞SKOV3細胞的培養條件均為液體培養基RPMI1640(GIBCO公司)，10％FBS(黑龍江江海生物工程技術公司)，5％CO2，37℃孵箱培養。在細胞生長至對數期后，收集細胞5×105個。
(2)將上述細胞1,000g離心10分鐘后，使用PBS懸浮細胞，再次1,000g離心10分鐘后，將細胞沉淀懸浮在100μl含有10μg/ml融合蛋白和雙特異抗體BHL的PBS中，4℃放置30分鐘。每種細胞均設立不加抗體的同型對照，該對照以下各步均與待測樣品同樣操作。
(3)1,000g離心10分鐘后，將細胞沉淀懸浮在100μl含有1/10000稀釋兔抗抗體PBS中，繼續4℃放置30分鐘。
(4)1,000g離心10分鐘后，將細胞沉淀懸浮在100μl含有1/1000稀釋FITC偶聯羊抗鼠IgG(BD公司)的PBS中，繼續4℃放置30分鐘。
(5)流式細胞儀(BD公司，FACS Calibur)檢測，激發光為488nm，每次收10,000個細胞。
上述實驗結果見圖8。由圖可見SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白與卵巢癌雙特異抗體對SKOV3細胞有相似的結合能力實施例8FACS(流式細胞術)方法檢測融合蛋白與外周血淋巴細胞(PBL)和Jurkat細胞的結合活性我們還采用直接FACS的方法檢測融合蛋白對外周血淋巴細胞(PBL)和Jurkat細胞的結合活性。具體實驗操作參照實施例7。
上述實驗結果如圖9和10所示。由圖可見對Jurkat和PBL細胞，SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白的結合能力比卵巢癌雙特異抗體強。
實施例9MTT融合蛋白介導T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞SKOV3的活性我們以與雙特異抗體BHL發生特異結合的卵巢癌細胞SKOV3為靶細胞(Target cells)，以PBL為效應細胞(Effect cells)，在體外按照一定的效靶比(靶細胞/效應細胞，E/T)混合，同時添加一定濃度的融合蛋白和卵巢癌雙特異抗體BHL，然后在37℃培養48小時，再采用MTT方法測定腫瘤細胞的存活情況。以此檢測二者介導T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞SKOV3的活性。具體操作如下(1)提取收集PBMC，具體操作與實施例5的(1)相同。
(2)培養收集SKOV3細胞，具體操作與實施例6相同。
(3)使用RPMI1640培養基(購自GIBCO公司)調整效應細胞(PBMC)和靶細胞(SKOV3)的濃度固定SKOV3細胞的密度為1×105個/ml，100μl/孔加入到96孔細胞培養板(Nunc公司)中。同時添加PBL，100μl/孔加入到上述細胞培養板中，使效靶比為10。同時使用RPMI1640培養基調整18TBHL和BHL的濃度。以50μl/孔加入已經加有效應細胞和靶細胞的96孔細胞培養板中，然后在37℃的CO2(5％)培養箱中，培養48小時。每種樣品均為4復孔。同時每種效靶比均設立不加抗體的陰性對照，單獨效應細胞或靶細胞的陰性對照以及不加任何細胞的培養基陰性對照。
(4)將細胞培養基棄掉后，使用PBS(300μl/孔)洗板一次，再加入MTT(Sigma公司)溶液(濃度200μl/孔)，37℃孵育4小時后，使用PBS(300μl/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亞砜，200μl/孔)(Sigma公司)37℃孵育30分鐘后，測定A600。
(5)特異殺傷率(specific cytolysis)的計算公式為特異殺傷率(％)＝[A600(E/T)-A600(E/T/A)]/[A600(E/T)-A600(M)]×100％A600(E/T)每種效靶比不加抗體的陰性對照孔的A600測定值；A600(E/T/A)每種樣品的A600測定值；A600(M)不加任何細胞的培養基陰性對照的A600測定值。
MTT殺傷結果見圖11。由圖可見SLC的N末端十八肽與卵巢癌雙特異抗體的融合蛋白介導外周血淋巴細胞殺傷SKOV3細胞的功能稍強于卵巢癌雙特異抗體。
實施例9流式檢測融合蛋白介導T淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞SKOV3的活性1.靶細胞標記PKH26(1)使用新鮮無血清培養基(RPMI1640)洗滌靶細胞，室溫400g離心5分鐘。將靶細胞沉淀懸浮在250μl的重懸緩沖液中，并吹打均勻，盡量成為單細胞懸液。
(2)將PKH26250×稀釋在250μl的重懸緩沖液(10-6M)(3)將兩者混合后，立即吹打均勻，室溫反復倒轉，混合2-5分鐘。
(4)加入500ul的1％BSA或FBS，充分混勻，并放置1分鐘。
(5)加入1ml完全培養基，含有10％FBS。
(6)室溫400g離心10分鐘，使用1ml完全培養基洗三次。最后將細胞懸浮在1ml完全培養基中。
2.殺傷試驗及凋亡檢測(1)使用新鮮完全培養基(RPMI1640)將樣品稀釋到一定濃度，以一定體積加入到U形底96孔細胞培養板。
(2)使用新鮮完全培養基(RPMI1640)將PKH26標記和未標記的靶細胞均稀釋至106ml，并且10μl/孔加入到U形96孔細胞培養板中。
(3)使用新鮮完全培養基(RPMI1640)將效應細胞稀釋至2×106/ml，并以50μl/孔加入到96孔細胞培養板中，使效靶比為10∶1。
(4)室溫250g離心5分鐘，在37℃孵育3-4小時。
(5)將平行孔細胞合并在一個1.5ml的離心管中，400g離心10分鐘。細胞沉淀使用PBS洗一次，將細胞沉淀懸浮在100μl結合緩沖液中。
(6)每管加入3-5ul AnnexinV-FITC(異硫氰酸熒光素，Fluoresceinisothiocynate)，室溫細胞沉淀懸浮在400μl結合緩沖液中。
(7)FACS檢測。FITCFL1，PKH26FL2。
結果如圖12-13所示。由圖可見融合蛋白介導外周血淋巴細胞殺傷卵巢癌細胞SKOV3的能力稍強于卵巢癌雙特異抗體。
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Ala Arg Ser Phe Thr Trp Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr130 135 140Pro Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly145 150 155 160Gly Ser GIy Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Val Val Met Thr Gln Thr165 170 175Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys180 185 190Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His195 200 205Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys210 215 220Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly225 230 235 240Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp245 250 255Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe260 265 270Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Phe Gln Asn Ala Leu Leu275 280 285Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val290 295 300Glu Val Ser Glu Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu305 310 315 320Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln325 330 335Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr340 345 350Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro355 360 365
Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile370 375 380Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly385 390 395 400Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys405 410 415Arg Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly420 425 430Gly Gly Ser Ser Arg Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu435 440 445Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr450 455 460Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys465 470 475 480Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr485 490 495Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser500 505 510Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser515 520 525Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp530 535 540Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser545 550 55權利要求
1.一種趨化小肽與雙特異抗體的融合蛋白。
2.權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于趨化小肽是CC家族趨化因子SLC(次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽。
3.權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于雙特異抗體是抗腫瘤×抗CD3雙特異抗體。
4.權利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述抗腫瘤×抗CD3雙特異抗體是抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體。
5.權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是由CC家族趨化因子SLC(次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)2連接肽、抗卵巢癌×抗CD3雙特異抗體依次連接而成。
6.權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，優選由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所編碼，其C末端可以任選地帶有C-myc和His6標簽。
7.一種表達載體，其特征在于包含權利要求1-6中任何一項所述融合蛋白的編碼基因。
8.權利要求7所述的載體，其是p18TBHL。
9.含有權利要求7或8所述載體的宿主細胞，優選大腸桿菌。
10.一種純化權利要求1-6中任何一項所述融合蛋白的方法，其特征在于聯合采用DEAE陰離子交換樹脂和Ni親和柱進行純化。
全文摘要
本發明涉及一種趨化小肽與抗腫瘤×抗CD3雙特異抗體的融合蛋白，其特征在于由CC家族趨化因子SLC(Secondary lymphoid tissuechemokine，次級淋巴組織趨化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)
文檔編號C07K1/00GK1958614SQ200510117179
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月1日 優先權日2005年11月1日
發明者黃華樑, 宋景震, 王祥斌, 春雷, 樸錦華, 張眾, 林晴 申請人:北京安波特基因工程技術有限公司