專利名稱：細胞色素c氧化酶復合體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種2-酮基-L-古洛糖酸的重組生產及其中有用的生物材料。
背景技術：
細胞色素C氧化酶(細胞色素aa3；EC 1.9.3.1)是在線粒體及許多細菌中的有氧呼吸電子傳遞系統中一種末端氧化酶。該酶是一種跨細胞質膜復合體，其催化最終的電子傳出；周質表面的亞鐵細胞色素C(電子供體)的再氧化/細胞質表面的分子氧(電子受體)向水的還原。這些反應與質子跨膜排出偶連，且這種偶連對于由底物氧化的生物能量儲存是必不可少的。
不同類型的細胞色素復合體，例如，aa3，a1，caa3，o，bo，co，bd-型，已經被證實其具有末端氧化酶的功能；已經報道了一些末端氧化酶的純化及表征。Matsushita等報道了醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)IFO3283含有兩個末端氧化酶，細胞色素a1及o，并且對細胞色素a1進行了純化及表征(美國國家科學院院報979863，1990；細菌學雜志174122，1992)。Matsushita等同時也報道了從葡糖桿菌屬(Gluconobacter)中分離純化細胞色素o(生物化學生物物理學通報，894304，1987)。Tayama等也揭示了醋化醋桿菌(A.aceti)中的末端氧化酶(細胞色素a1)基因(JP 93-317054)；他們純化的氧化酶包括四個亞基(其分子量分別為72，34，21及13kDa)，且含有血紅素a及b。醋桿菌屬及葡糖桿菌屬中的氧化酶同屬醌醇氧化酶。細胞色素aa3(細胞色素C氧化酶)已從牛心，酵母，及包括脫氮副球菌(Paracoccousdenitrificans)(Solioz等，生物學化學雜志，2571579-1582，1982)及類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler等，生物學化學雜志.，26724264-24272，1992)的細菌中純化。
哺乳動物(線粒體)細胞色素C氧化酶(aa3型)復合體含有13種不同的亞基；三種核心亞基I，II及III(CO I，II及III)由線粒體DNA編碼，而其余的10種為核來源。細菌aa3型細胞色素C氧化酶也含有3種核心亞基，其與線粒體核心亞基同源。然而，據報道，純化時CO III容易丟失，結果導致制品中只含有CO I及CO II(Ludwig等，美國國家科學院院報，77196-200，1980)。隨著電化學質子梯度的產生，含有2種亞基(CO I及CO II)的細胞色素C氧化酶復合體顯示出一種氧化還原活性。在使用脫氮副球菌(Haltia等，歐洲分子生物學雜志，102015-2021，1991)及類球紅細菌(Cao等，基因，101133-137，1991)的情況中，兩亞基型(CO I/CO II)型及三亞基型(CO I/II/III)復合體分別由不同的純化方法分離。從遺傳學角度來講，編碼CO II及III的基因位于操縱子中，而編碼CO I的基因位于獨立位點(Raitio等，歐洲分子生物學雜志，92825-2833，1987；Shapleigh等，美國國家科學院院報，894786-4790，1992)。
如上所述末端氧化酶在有氧條件下的生長中在還原分子氧過程中起到關鍵作用，在有氧發酵時，含有末端氧化酶的呼吸鏈對于完成底物氧化以產生氧化產物發揮了作用，在本申請中，其對于提高呼吸鏈的效率以有效氧化發酵至關重要。
氧化葡糖桿菌DSM 4025由L-山梨糖經L-山梨酮產生的2-酮基-L-古洛糖酸(以下稱2KGA)，是L-抗壞血酸生產工藝過程中的一個重要的中間產物(T.Hoshino等，EP 0366922A)。底物L-山梨糖至2KGA的氧化被認為是通過呼吸電子傳遞鏈完成的。催化最終電子排至分子氧的末端氧化酶很可能是在2KGA生產系統及其他氧化還原組份中的一個動力學速率限制步驟。
負責從L-山梨糖形成2KGA的原初脫氫酶已被分離(T.Hoshino等，EP606621A)，然后該基因被克隆及測序；發現了四個同工酶(T.Hoshino等，EP832974A)，且他們的直接電子受體細胞色素c551被純化，其基因被克隆(T.Hoshino等，EP 0869175A)。然而，末端氧化酶卻未分離，其基因未克隆。
發明內容
本發明的目的就是提供一種物質，其可以提高細胞色素C氧化酶的數量及質量，且改善在使新的細胞色素C氧化酶的基因可得的情況下由細胞色素C氧化酶完成的氧化發酵。保藏號為No.DSM 4025的微生物氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)，其為一個來源優選實例，其提供了本發明的新的細胞色素C氧化酶及其遺傳物質。
本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶復合體，其從自然界進行分離或用遺傳工程手段制備。這樣一種具有細胞色素C氧化酶活性的酶復合體是可獲得的，或者得自起源于被鑒定為氧化葡糖桿菌DSM 4025的微生物的生物學或遺傳物質，或者得自具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒定特征的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。這樣本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶復合體，其用做呼吸鏈中介導電子傳遞的關鍵成分。
這里作為例證的一種細胞色素氧化酶C復合體顯示出如下的物理化學特性(i)顯示出至少兩種核心亞基I(CO I)及II(CO II)的存在，其中使用SDS-PAGE分析手段所獲得的CO I的表觀分子量大約是43+/-10kDa；COII的表觀分子量大約是36+/-10kDa，且(ii)吸收光譜顯示出aa3-型細胞色素C氧化酶；其在還原型減去氧化型的差別光譜上表現為605+/-1nm峰。這樣一種細胞色素C氧化酶復合體可以被提供為基本上均質的分離物，它來自鑒定為氧化葡糖桿菌DSM 4025的微生物的培養物，或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
本發明的一種新的細胞色素C氧化酶復合體同樣可以以一種重組酶的形式提供，其可以包括一個重組多肽作為核心亞基I(COI)，其中的重組多肽可以選自含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，及那些具有與所述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。更進一步講，其它兩個亞基II(CO II)及III(CO III)可以為重組多肽，其選自含有如SEQ ID NOs4，6和/或8所示的氨基酸序列的多肽，及那些含有具有與所述任一種氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。
作為本發明的另一方面，各自核心亞基，即CO I，CO II及CO III可以以重組多肽形式提供，其用于本發明的新的細胞色素C氧化酶復合體的組份。
這里作為例證的COI為一重組多肽，其包含于細胞色素C氧化酶復合體，其中多肽包含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性。一個重組的COI可以為能夠為如本發明所述的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
這里同樣作為例證的CO II為重組多肽，其包含于本發明的細胞色素C氧化酶復合體，其中多肽包含如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性。重組的CO II可以為能夠向如本發明所述的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這里作為例證的COIII為重組多肽，其包含于本發明的細胞色素C氧化酶復合體。這類多肽包含有如SEQ ID NOs6及8中任一個或兩者所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與上述SEQ ID No 6和8的氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性。一個重組的COIII可以為能夠向如本發明所述的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
作為本發明的又一方面，提供了用遺傳工程手段制備各個核心亞基即CO I，COII及COIII有用的重組DNA片段。這些重組多肽對于包含在本發明的新細胞色素C氧化酶復合體的組份是非常有用的。正如如上解釋的那樣，這些多肽應該能夠為本發明的復合體提供細胞色素C氧化酶活性。
這兒例證的COI的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述的DNA序列(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
這里同樣作為例證的COII的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這里同樣作為例證的COIII的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽的DNA片段，且包括一種或多種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO7所示DNA序列或，(c)編碼具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
此外，作為本發明的另一方面，其提供了一種含有一種或多種上述重組DNA片段的表達載體，其中載體對于在生物體如原核或真核宿主細胞中進行表達是適宜的。
更進一步說，提供一個重組生物體是本發明的另一方面，所述生物體導入了上述表達載體。本發明的這樣一個重組生物體對于本發明的重組細胞色素C氧化酶復合體的遺傳制備是非常有用的，且可用于在合適的培養基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的工藝。本發明所述重組生物體的宿主細胞可以是真核來源的，最好是哺乳動物或植物細胞，也可以是原核來源的。這些宿主細胞特別是可以從細菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM 4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒定特征的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
本發明也可直接用于生產細胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養基中培養上述本發明重組生物體，特別是含有這里所例證的優選DNA序列的重組生物體，且從培養基中回收細胞色素C氧化酶。
更進一步，本發明也可直接用于從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2KGA的工藝，其包括在合適的培養基中培養上述本發明的重組生物體，且從培養物中回收2KGA。
下述圖及詳細說明可以進一步闡述本發明。
圖1顯示的是氧化葡糖桿菌DSM4025的aa3型細胞色素C氧化酶的吸收光譜圖。在室溫下蛋白質濃度為0.08mg/ml的含有0.5％蔗糖單月桂酸及5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)中記錄光譜。[A]顯示的是氧化型的光譜，[B]顯示的是還原型的光譜，[C]顯示的是還原型減去氧化型的差異光譜。
圖2顯示的是通過SDS-PAGE分析的純化的氧化葡糖桿菌DSM 4025的細胞色素C氧化酶aa3。通過與2％SDS，50mM二硫赤蘚糖醇，62.5mMTris-HCl(pH6.8)及10％甘油在37℃下孵育5小時變性該純化酶(在0.5mG/ml蛋白質濃度下)。按照Laemmli(自然，227680-685，1970)的方法在12.5％丙烯酰胺濃度下進行電泳，使用的緩沖液含有25mM Tris，0.192M甘氨酸，及0.1％SDS。A和B分別是6及3微克純化酶，C是低分子量預染色的SDS-PAGE標準液(Bio-Rad實驗室，CA，美國).
圖3顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的CO I的部分氨基酸序列與來自其它生物的序列之對比。
圖4顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的CO II的部分氨基酸序列與來自其它生物的序列之對比。
圖5顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的CO III的部分氨基酸序列與來自其他生物的序列之對比。
圖6顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的細胞色素C氧化酶復合體的部分CO I，II及III基因的PCR擴增的引物。
圖7顯示的是分別含有″CO I″及″CO II及III″基因的8.0kb PstI及9.3kb EcoRI片段的物理圖譜.
圖8顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的完整的CO I氨基酸序列與來自其他生物的序列之對比。
圖9顯示的是用于表達來自于氧化葡糖桿菌DSM 4025的細胞色素C氧化酶復合體的基因的pVKcoxes的遺傳圖譜。
本發明的新型細胞色素C氧化酶復合體屬于這樣的蛋白質家族，其功能為一個末端氧化酶及其基因。更為確切的講，本發明的新型細胞色素C氧化酶可用作一個末端氧化酶氧化細胞色素C，脫氫酶的電子受體例如乙醇及乙醛脫氫酶(AADH)，因此在呼吸鏈中可用作介導電子轉移的核心成份。本發明的細胞色素C氧化酶復合體可以是從自然界進行分離的，或者借助遺傳工程的方式制備的。這樣的一個具有細胞色素C氧化酶活性的酶復合體可從起源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM 4025的微生物的生物材料獲得，或者從具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒別特征的微生物的生物學和/或分類學上同源培養物獲得。
正如這兒所使用術語“具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒別特征的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物”指的是一種具有氧化葡糖桿菌DSM4025的下述14種特征中至少12種特征的微生物(a)從L-山梨糖生產2-KGA；(b)將乙醇氧化成乙酸；(c)將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸及2-酮基-D-葡糖酸；(d)顯示多元醇的生酮作用；(e)在pH為4及5甘露醇肉湯培養基中顯示出菌膜及菌環生長(24小時培養)，而且，在pH為4.5葡萄糖肉湯培養基中表現出菌膜生長，(f)基本上不氧化甘油成二羥丙酮，(g)從山梨糖醇及葡糖二酸生產2-酮基-D-葡糖二酸，而不能從葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、甘露醇或者2-酮基-D-葡糖酸生產，(h)呈多態狀，無明顯的緶毛，(i)從果糖中產生褐色色素，(j)當與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或其細胞提取液共同培養時表現出好的長勢，(k)對于鏈霉素敏感，(l)具有圓形末端的桿狀，(m)平均細胞直徑大約為0.3-0.6毫米，(n)平均細胞長度大約為1-1.5毫米，且如HPLC所測，該微生物用HPLC進行測量在培養基中以至少0.01g/L的2-KGA水平從L-山梨糖生產2-KGA。除此之外，詞組“具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒別特征的微生物的生物學上和/或分類學上同源的培養物”應該被理解為涵蓋一種包含這樣的多核苷酸序列的微生物，該多核苷酸序列在高度嚴格的條件下可與另一編碼選自SEQ ID NO2，4，6，及8的多肽之多核苷酸序列進行雜交，正如本領域技術人員熟知的那樣，基于氨基酸序列的同源性就可鑒別該微生物。本發明的細胞色素C氧化酶復合體顯示出下列物理-化學特征該復合體顯示出aa3型細胞色素C氧化酶在還原型減去氧化型差別光譜上的吸收波長，在605+/-1nm的吸收峰；在SDS-PAGE上，包含在細胞色素C氧化酶復合體的兩個多肽的表觀分子量大約為43+/-10kDa及36+/-10kDa。
本發明的一個新的重組酶復合體可以使用遺傳物質進行制備，所述遺傳物質即起源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM 4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒別特征的生物學上和/或分類學上同源的微生物的培養物的重組DNA片段。這樣一種新的細胞色素C氧化酶復合體可以包含至少一種重組多肽作為核心亞基之一。作為所述復合體核心亞基I的重組多肽可以選自如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，和那些具有與上述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。同樣，另外的核心亞基II(CO II)及III(CO III)之一或者二者均可為重組多肽。CO II可以選自有如SEQ ID NO4所示部分氨基酸序列的重組多肽，和那些具有與上述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。CO III可以選自含有如SEQ IDNO6和8所示的部分氨基酸序列，和那些具有與各氨基酸序列有85％或者更高相同性的部分氨基酸序列的多肽，只要這些重組多肽能夠為復合體提供細胞色素C氧化酶活性。
術語“相同性”優選地是指出現在各自位置的氨基酸不僅在其特性上相似，而且事實上也是相同的。在一個優選實施例中氨基酸序列的比較是以最佳模式進行的。
本發明也涉及包含在所述細胞色素C氧化酶復合體的多肽。包含在所述細胞色素C氧化酶復合體的多肽和描述于SEQ ID NOs2，4，6及8的氨基酸序列最多與包含在其他細胞色素氧化酶的多肽及相應的部分氨基酸序列顯示出50-82％的同源性。例如，本發明的CO I多肽(SEQ ID NO2)與來自于脫氮副球菌的CO Iα(登記號No.P08305)和CO Iβ(登記號No.P98002)，及與來自于類球紅細菌的CO I(登記號No.P33517)分別顯示出77％，81％及79％的同源性。本發明的部分的CO II多肽(SEQ ID NO4)與分別來自于脫氮副球菌及類球紅細菌的CO II多肽顯示出73％及68％的同源性。本發明的部分CO III多肽(SEQ ID NO6)與來自于脫氮副球菌的CO III多肽顯示出54％的同源性。另一種多肽(SEQ ID NO8)與分別來自于脫氮副球菌及類球紅細菌的CO III多肽顯示出71％及63％的同源性。這些同源性檢索可以通過計算機程序來進行，例如通過這樣的程序″SearchHomology″，Genetyx-SVIRC版本3.2.0(Genetyx軟件發展公司，東京，日本)。
這樣，各個核心亞基即COI，CO II及CO III可以以重組多肽提供，這些多肽可用作本發明的新的細胞色素C氧化酶復合體的組份。
復合體中的亞基COI可以是包含在本發明的細胞色素C氧化酶復合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者該多肽包含與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠為復合體提供如上所述的細胞色素C氧化酶活性。重組的COI也可以是能夠為本發明的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽，其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
同樣，亞基COII可以是包含在本發明的細胞色素C氧化酶復合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或者該多肽包含與所述氨基酸序列有85％或者更高的相同性的氨基酸序列且能夠為所述復合體提供如上所述的細胞色素C氧化酶活性。重組的COII也可以是能夠為本發明的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步說，亞基CO III可以為包含在本發明的細胞色素C氧化酶復合體中的重組多肽，其中多肽分別包含有如SEQ ID NO6及8任一或兩者所示的氨基酸序列，或者具有與SEQ ID NO6和8各個氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列，只要所述重組多肽能夠為所述復合體提供細胞色素C氧化酶活性。重組的CO III可以為能夠向本發明所述的復合體提供細胞色素C氧化酶活性的重組多肽，其被包含一種或多種選自如下的DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步講，本發明還包括上述重組多肽的功能性衍生物。這些功能性衍生物是基于本發明的氨基酸序列確定的，其可以通過增加，插入，刪除，和/或置換該序列的一個或多個氨基酸殘基來進行，其中包含有這種衍生物的細胞色素C氧化酶復合體仍然具有可以通過本領域普通技術人員周知的檢定方法或者此處描述的具體技術所測量的細胞色素C氧化酶活性。這些功能性衍生物可通過化學肽合成或者基于本領域業已周知和公開的手段如Sambrook等的方法(出處同上)(″分子克隆″二版，冷泉港實驗室出版1989，紐約)制備。一般來說不改變該分子活性的蛋白質及肽中的氨基酸交換是本技術領域的公知常識，例如H.Neurath及R.L.Hill在″蛋白質″(學院出版社，紐約，1979，特別參見圖6，14頁)中所述。最常發生的交換為Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，反過來也成立。
本發明涉及重組DNA片段，其編碼包含在所述細胞色素C氧化酶復合體的重組多肽，該復合體是呼吸鏈中介導電子傳遞的必須組分之一。
提供了可用于通過遺傳工程手段制備各個核心亞基即CO I，CO II及CO III的重組DNA片段。這類重組多肽可用于包含在本發明所述的新的細胞色素C氧化酶復合體的組份。
CO I的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
CO II的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步說，CO III的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶復合體的多肽且含有一種或多種選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
本發明的重組DNA片段也可以包括一種DNA序列，其在下文將給出更詳盡論述的標準嚴格條件下能夠與SEQ ID NO1，3，5或7所示序列進行雜交。
“標準條件”對于雜交來說意味著本領域普通技術人員用于檢測特定雜交信息及如Sambrook等(出處同上)所描述的條件，或最好稱為嚴格雜交及非嚴格清洗條件，或更優選稱為中度嚴格條件，甚至更優選嚴格雜交條件及嚴格清洗條件，這些對于本領域普通技術人員都是熟知的，也是為如Sambrook等(出處同上)所描述過的。
本發明同時也提供了一種表達載體，其含有一種或多種上述重組DNA片段，其中載體對于在生物體如原核或真核宿主細胞中進行表達是適宜的。這樣的表達載體可以通過將一種或多種上述重組DNA片段插入到可能攜帶有本領域所熟知的表達調控元件的合適的載體中進行構建。
此外，本發明的重組生物體可以通過將上述表達載體引入一個合適的宿主細胞進行制備。本發明的該重組生物體對于遺傳制備本發明的重組細胞色素C氧化酶復合體是非常有用的，其同樣適用于在合適的培養基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的工藝。本發明的重組生物體的宿主細胞可以是真核來源的，最好是哺乳動物或植物細胞，但也可以是原核來源的。這些宿主細胞尤其可以從細菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM 4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒別特征的微生物的生物學上和/或分類學上同源的培養物。此外，宿主細胞也可以選自下述細菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌(Acetobacterhansenii)，及氧化葡糖桿菌。
此外，本發明的另一目的是提供一種生產細胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養基中培育上述定義的重組宿主細胞，且從該培養基中回收細胞色素C氧化酶。
本發明的細胞色素C氧化酶復合體同樣適用于改進從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA，此外，也適用于(不管是體內還是體外)在有醇及醛脫氫酶存在下從相應底物中生產醛類、碳酸類及酮類。
化合物2KGA是生產L-抗壞血酸的重要的中間物質，其可按照著名的Reichstein方法進行轉化。通過發酵從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2KGA的工藝已經已知[T.Hoshino等，EP 88116156A].已知葡糖桿菌屬菌株可以經過山梨糖及山梨酮脫氫酶催化的反應來生產2KGA，正如農業生物化學，54(5)，1211-1218，1990[T.Hoshino等]及在EP 606621 A[T.Hoshino等]中揭示的那樣。負責從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的原初脫氫酶基因已經獲得[T.Hoshino等，EP 832974A]。此外，作為來自原初脫氫酶的電子受體的細胞色素C其基因同樣也已經被分離[T.Hoshino等，EP 869175A]。這些脫氫酶及細胞色素C已經被用于體外生產2KGA。其基因已被用于構造從L-山梨糖和D-山梨糖醇中制備2KGA的重組生物體，例如，攜帶有醇/醛脫氫酶(AADH)基因的惡臭假單胞菌與細胞色素C一起可從L-山梨糖制備2KGA。
因此，本發明的細胞色素C氧化酶用于生產2KGA的用途也是本發明的一個目的。
本發明的細胞色素C氧化酶復合體的末端氧化酶活性可以通過使用TMPD(N，N，N′，N′-四甲基-對-苯二胺二鹽酸鹽)進行分光光度法測量。TMPD作為人工底物(電子供體)。反應混合物例如，含有2.5mM TMPD，0.05％Tween-20及0.1M 3(N-嗎啉)丙磺酸鈉(Na-MOPS)(pH 6.5)。TMPD氧化酶活性可以通過增加520nm的吸光值進行測量，TMPD的摩爾系數認為是6.1/mM/cm。一單位酶活性被定義為在室溫下每分鐘氧化1微摩爾的TMPD。
使用還原型減去氧化型的差別光譜通過檢測在605nm峰周圍的特征性陽性峰進行a-型血紅素的分光光度鑒定和定量。每一樣品的還原可以通過添加微量連二亞硫酸鈉，氧化可以加入過硫酸銨。a-型血紅素的摩爾系數峰(605nm-630nm)認為在11.7/mM/cm。
在以更詳盡的方式描述本發明之前，先來描述一下由獲自氧化葡糖桿菌DSM 4025的亞基COI及COII組成的純化的細胞色素C氧化酶的物理化學特性。
(1)吸收光譜細胞色素C氧化酶復合體在還原型減去氧化型差別光譜的吸收圖譜顯示于圖1。
(2)分子量SDS-PAGE分析顯示，細胞色素C氧化酶的亞基CO I及CO II的表觀分子量分別為大約43+/-10及36+/-10Kda，顯示于圖2。
(3)CO I及CO II的氨基酸序列使用制備型圓盤SDS-PAGE(NA-1800，Nippon Eido Co，.)將純化的細胞色素C氧化酶復合體分解為CO I及II兩個亞基。經過未鑒定的修飾封閉兩個N-末端α-氨基酸殘基。然后部分消化的肽片段(15-45KDa MW.)經過賴氨酰內肽酶處理獲得，用從15％SDS-PAGE板上提取的條帶進行分離，然后在Centricon-10(Amicon)中用15％甲醇及0.1％SDS洗，加入測序儀。分別從CO I及CO II獲得“KDlGLLYLVAAGVVGF”(SEQ ID NO11)及“KASQFTHNTPLEIVWTIVPV”(SEQ ID NO14)序列。
用于分離本發明的細胞色素C氧化酶的多肽及基因的優選菌種為氧化葡糖桿菌菌株，其已按布達佩斯條約于1987年3月17日被保藏于德意志微生物保藏中心，Gottingen(德國)，保藏號為DSM 4025。而且，該菌株的傳代培養物也按布達佩斯條約被保藏于工業科技代理處，發酵研究所，日本，保藏號為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)FERM BP-3812(保藏日期1992年3月30日)。此外，EP 278447也揭示了該菌株的特征。功能等同物，傳代培養物，及所述微生物的變種及突變體也可用于本發明。具有菌株DSM4025鑒別特征的微生物的生物學或分類學上同源的培養物也可被用作本發明所述細胞色素C氧化酶的多肽及基因的來源。
本發明所提供的細胞色素C氧化酶可以如此制備，方法是通過培養一合適的生物體，破壞細胞，將其從破壞的細胞的無細胞提取物中分離，純化，最好從生物體的可溶級分中分離并純化。
生物體可在有氧條件下培養在補充合適的營養成分的含水的培養基中，在pH4～9之間進行培養，優選在含水的培養基中6～8之間進行培養。培養期的變化依賴于pH，溫度及所使用的培養基，通常2～6天就會出現有利的結果。實施該培養的優選溫度范圍為約13℃到36℃，最好為約18℃到33℃。
一般情況下要求培養基含有下述營養組份可同化的碳源，可消化的氮源，及無機物質，維生素，微量元素及其它生長促進因子。作為可同化的碳源，甘油，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯醇，L-山梨糖，D-山梨醇及其類似物可使用。
不同的有機或無機物也可用作氮源，可使用例如酵母提取液，肉膏提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸出液，尿素，氨基酸，硝酸鹽，銨鹽及其類似物。作為無機物，硫酸鎂，磷酸鉀，氯化鐵和氯化亞鐵，碳酸鈣及其類似物。
下面將要詳細描述經過培養從生物體中分離及純化細胞色素C氧化酶及克隆基因/DNA序列的實施例。
(1)經過離心或過濾從發酵肉湯中收獲細胞。
(2)細胞懸于緩沖液中，且用勻漿器、超聲波儀處理或者用溶菌酶及其類似物處理得到細胞的裂解液。
(3)使用常用的蛋白質純化法例如硫酸銨沉淀法，透析法，離子交換色譜法，凝膠過濾色譜法及親和色譜法從生物體的破裂細胞的無細胞提取液中，優選地可溶性級分中分離和純化細胞色素C氧化酶。
本發明所提供的細胞色素C氧化酶用作末端氧化酶氧化細胞色素C，來自屬于脫氫酶的酶之電子受體，用于從醇類及醛類生產醛類，羧酸類及酮類，尤其是從L-山梨糖或D-山梨糖醇經過L-山梨酮(L-sorbosone)來生產2KGA。
簡單來講，本發明所用的細胞色素C氧化酶基因、DNA序列、重組表達載體及重組生物體(也可稱為轉化宿主細胞)均可以通過下述步驟獲得(1)從本發明所述的能夠提供細胞色素C氧化酶的重組生物體中分離染色體DNA，然后在大腸桿菌中構建染色體DNA基因文庫。
(2)通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法，PCR克隆法(聚合酶鏈式反應)或Western-blot分析法或類似方法；(3)由常用方法確定如上述所得細胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列，以挑選含有所述細胞色素C氧化酶基因的重組DNA片段；且構建其中細胞色素C氧化酶基因可充分表達的表達載體。
(4)通過轉化、轉導、轉接合及電穿孔技術構建攜帶有細胞色素C氧化酶基因的重組生物體。
用于本發明上述方面的材料和技術下面將詳細例證說明總染色體DNA可以被本領域貫知技術純化。通過下述方法，從總染色體DNA將編碼細胞色素C氧化酶的基因克隆于質粒或噬菌體載體中(i)經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從凝膠中分離整個蛋白質或肽酶處理的多肽片段，并且將其應用于蛋白質測序儀，例如應用生物系統自動氣相測序儀470A(Perkin Elmer Corp.，Norwalk，Conn.，美國)確定來自于純化的細胞色素C氧化酶亞基的部分氨基酸序列，使用DNA合成儀例如應用生物系統自動DNA測序儀381A(Perkin Elmer)按照上述獲得的氨基酸序列來合成寡核苷酸探針，從帶有目的基因的該菌株基因文庫中分離攜帶有目的基因的克隆，方法是使用寡聚核苷酸探針通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法；(ii)使用免疫學方法用針對細胞色素C氧化酶亞基的抗體，從基因文庫中挑選表達細胞色素C氧化酶亞基的克隆；或者(iii)使用兩個寡聚核苷酸(按照上述確定的氨基酸序列合成)，使用PCR方法從總染色體DNA中擴增DNA，然后通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法用由此獲得的PCR產物作為探針，從構建于大腸桿菌的基因文庫中分離攜帶有細胞色素C氧化酶亞基的完整基因的克隆。上述作用于細胞色素C氧化酶亞基的抗體可以通過使用純化的細胞色素C氧化酶亞基的蛋白質或者其片段使用如酶學方法，73卷，46頁，1981所述方法獲得。
細胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列可以通過大家熟知的雙脫氧鏈終止法使用M13噬菌體確定(Sanger F.等，美國國家科學院院報，745463-5467，1977)。
為了表達細胞色素C氧化酶復合體亞基的基因，可以使用多種啟動子；例如最初的位于所述細胞色素C氧化酶亞基的基因上游的啟動子，抗生素抗性基因的啟動子，例如Tn5卡那霉素抗性基因(Berg，D.E.，和C.M.Berg.1983.生物/技術1417-435)，pBR322氨芐青霉素抗性基因，及大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lac)，trp-、tac-、trc-啟動子，λ-噬菌體啟動子，及其它在宿主中(包括這樣的生物體，如細菌，諸如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌，特別是氧化葡糖桿菌DSM 4025，和哺乳動物細胞及植物細胞)有功能的啟動子。
為了上述目的，在編碼序列導入的宿主細胞中為可操縱的其他一些調控元件如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主細胞中可操作的天然或合成序列)及轉錄終止子(反向重復結構，包括在宿主細胞中可操作的天然或合成序列)將被導入且與上述啟動子一起使用。
宿主/克隆載體組合的廣泛多樣性可被應用于克隆雙鏈DNA。克隆載體一般地說是質粒或噬菌體，其含有復制起點，調控元件，包含有多重克隆位點及選擇標志如抗生素抗性基因(如氨芐青霉素，四環素，卡那霉素，鏈霉素，慶大霉素，壯觀霉素等抗性基因)的克隆位點。
在大腸桿菌中表達目的基因的優選載體可從例如pBR322或其衍生物包括pUC18及pBluescript II，pACYC177，pACYC184[細菌學雜志，1341141-1156，1978]或其衍生物等一般用于大腸桿菌的載體中的任一個選擇，也可從寬宿主范圍質粒如RK2及RSF1010中選擇。在包括氧化葡糖桿菌DSM 4025的葡糖桿菌屬及惡臭假單胞菌中表達目的基因的優選載體可從在葡糖桿菌屬和/或惡臭假單胞菌中，以及在優選的克隆生物(如大腸桿菌)中可復制的任何載體中選擇。優選載體是寬宿主范圍載體，如粘粒載體(如pVK102)及其衍生物，和RSF1010及其衍生物，以及這樣的載體，其含有在葡糖桿菌屬中有功能的復制起點及另一個在大腸桿菌中有功能的復制起點。為了穩定和有效表達克隆基因及有效培養攜帶有該克隆基因的宿主細胞，應仔細考慮該載體的拷貝數量及其穩定程度。含有轉座因子如Tn5的DNA序列也可被用作載體，以將目的基因引入適宜的宿主細胞中去尤其是其染色體中去。含有從優選宿主細胞中分離出來的任一DNA的DNA序列與目的基因一起對于在優選宿主尤其是染色體上引入目的DNA序列是非常有用的。該DNA序列可以通過轉化、轉導、轉接合或者電穿孔技術轉移進入優選宿主。
可以作為宿主的有原核或真核起源的，且可包括生物體，哺乳動物細胞和植物細胞等。作為優選的生物體，這兒可能提到的細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，氧化葡糖桿菌，及其他任何可以生產重組細胞色素C氧化酶的革蘭氏陰性菌。功能等同物，傳代培養物，突變體，及所述生物體的變異體也可被用于本發明。優選的菌株為大腸桿菌K12及其衍生物，惡臭假單胞菌或者氧化葡糖桿菌DSM 4025及具有菌株DSM 4025鑒定特征的微生物的生物學或分類學上的同源培養物。
由本技術領域所熟知的方法，將編碼本發明細胞色素C氧化酶的DNA序列連接到含有控制區域如啟動子和核糖體接合位點及轉錄終止子的適宜載體中，所述控制區域在上述宿主細胞中可操作以產生表達載體。
為了構建攜帶有表達載體的宿主細胞，可使用多種DNA轉移方法，包括轉化，轉導，接合交配(14及15章，普通及分子細菌學方法，Philipp Gerhardt等編，美國微生物學會，1994)，及電穿孔技術。構建轉化宿主細胞的方法可以從分子細菌學領域熟知的方法中進行選擇。一般的轉化系統可用于大腸桿菌，假單胞菌屬及醋桿菌屬，轉導系統可同樣用于大腸桿菌接合轉移系統，接合交配系統被廣泛用于革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。在WO 89106688已描述了優選的接合交配方法。接合可發生在液體介質或固體表面，生產細胞色素C氧化酶的優選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。生產2KGA的優選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌，其可以用適宜重組表達載體產生活性的AADH及細胞色素C。生產2KGA的優選受體是氧化葡糖桿菌DSM4025。對于接合交配受體，經常增加一個選擇性標記，例如，萘啶酮酸或利福平抗性被經常用到。
下述實施例進一步證明了本發明，但并不作為對本發明的任何限制。
具體的實施方式實施例1氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞色素C氧化酶的鑒定和純化末端氧化酶的活性可以通過使用人工底物(電子供體)TMPD((N，N，N′，N′-四甲基-對-苯二胺二鹽酸鹽)用分光光度法對其進行測量。反應混合物由2.5mM TMPD，0.05％ Tween-20及0.1M 3(N-嗎啉)丙磺酸鈉(Na-MOPS)(pH6.5)組成。TMPD氧化酶活性可以通過520nm的吸光度增加來測量，TMPD的摩爾系數認為是6.1/mM/cm。一單位酶活性被定義為在室溫下每分鐘氧化1微摩爾的TMPD。通過分析還原型減去氧化型的差別光譜檢測在605nm峰周圍的特征性正峰，分光光度法鑒定和定量α-型血紅素。每一樣品用連二亞硫酸鈉還原，用過硫酸銨氧化。a-型血紅素吸收峰的摩爾系數(605nm-630nm)認為是11.7/mM/cm。
氧化葡糖桿菌DSM 402530℃下有氧培養在5升FYC培養基中27小時，培養基組成為10％L-山梨糖(分別消毒)，0.05％甘油，1.6％尿素(分別消毒)，0.25％MgSO4x7H2O，6.25％面包酵母細胞，1.5％CaCO3(生產級，nacalai tesque，Kyoto，日本)及3.0％玉米漿，pH7.5(滅菌前)經過培養，固體物質如CaCO3及酵母細胞用低速離心進行沉淀并棄去(1,000rpm，5分鐘)。存留在培養液上清液中的氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞在8,000rpm下離心20分鐘收集，并用含有0.25M NaCl及2mM MgCl2的25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺酸]鈉(Na-HEPES)(pH7.5)進行一次清洗。
最終的細胞(大約35g濕重)懸于大約200ml的含有0.5mM乙二氨四乙酸(EDTA)，0.5mM乙二醇-雙-β-氨基乙醚(EGTA)，0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素，10微克/毫升DNaseI及10微克/毫升RNaseA的25mM Na-HEPES(pH7.5)中。懸浮細胞用French細胞壓碎勻漿器在1500kg/cm2下處理兩次。所得懸浮液在10,000rpm下離心10分鐘以去除細胞碎片，收集上清液作為無細胞抽提液(424.0mg蛋白)。無細胞抽提液在55000rpm下進行超速離心1小時，以回收粗膜級分沉淀。粗膜級分在含有1.2％Tween 20，0.25M NaCl，2mM MgCl2，0.5mM PMSF，1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素的50ml之25mM Na-HEPES(pH 7.5)中重懸浮，孵育1小時后洗去細胞膜。級分再一次在55000rpm下進行超速離心1小時以回收洗過的膜級分沉淀物質。洗過的膜級分在含有1.5％單月桂酸蔗糖(DOJIN Laboratories，Kumamoto，日本)，2mM EDTA及5％甘油的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中孵育1小時，以溶解膜結合蛋白，所得的懸浮液在55000rpm下進行超速離心1小時，以獲得溶解的膜級分之上清液(50ml)。溶解膜級分的還原型減去氧化型差別光譜在605nm附近處顯示出特征性正峰；該峰對應于每毫克粗蛋白內容物0.41nmole的a-型血紅素。然后，溶解的膜級分中的膜結合蛋白被上樣到DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH，Tokyo，日本)柱(ID 2.2×5cm)中，其已經用含有0.5％單月桂酸蔗糖及5％甘油的25mM Na-HEPES進行平衡。用相同的緩沖液條件中線性梯度為0-0.35M的NaCl進行分級分離。顯示a-型血紅素光譜的級分(在還原型減去氧化型差別光譜上的605nm周圍的正峰)及TMPD氧化酶活性在大約0.28M濃度的NaCl處洗脫。然后收集這些級分(64ml)，用含有45mM NaCl，5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的45mM磷酸鉀緩沖液[KPB](pH7.6)進行透析，酶溶液上樣到羥基磷灰石(TONEN Co.，Tokyo，日本)柱(ID 1.5×6cm)，其己用相同的緩沖液進行平衡。柱子用相同的緩沖液洗滌，然后用含有500mMNaCl，5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的500mM KPB(pH7.6)洗滌，活性級分用含有900mM NaCl，5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的900mM KPB(pH7.6)進行洗脫且收集。來自羥基磷灰石柱的該級分(8.6mg蛋白)用含有0.5％單月桂酸蔗糖和5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)進行透析，使用YM-30膜(Amicon Inc.，MA，美國)經超濾濃縮，且以純化蛋白儲于-30℃。
在0.5％單月桂酸蔗糖存在下，該純化蛋白用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)進行分析，該蛋白顯示出一條呈綠色的可見條帶(不經過蛋白染色)，其相應于單一的蛋白帶(經過蛋白染色)。純化蛋白具有2.6單位/毫克的TMPD氧化酶活性，且顯示出aa3型細胞色素C氧化酶的典型的吸收光譜譜型(圖.1)。a-型血紅素的量估計為19.2nmole/mg純化蛋白。就來自于洗滌膜的a-型血紅素含量而言純化倍數大約為100倍，回收率90％。這些結果表明純化蛋白是在氧化葡糖桿菌DSM 4025中具有TMPD-氧化酶活性的主要成分(其可作為呼吸系統中的末端氧化酶)。在SDS-PAGE分析中，純化蛋白被分解為兩個蛋白組份一條顯示出一個寬帶，其表觀分子量大約為43,000(命名為CO I)，另一條顯示出一條窄帶，其表觀分子量大約為36,000(命名為CO II)(圖.2)。
實施例2氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞色素C氧化酶的氨基酸序列及與其它細胞色素C氧化酶復合體的同源性純化的氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞色素C氧化酶的兩個組份(CO I及CO II)用制備型SDS-PAGE進行分離。并未從這兩個組份獲得天然N-端氨基酸序列。為了獲得內部氨基酸序列，每一組份用賴氨酰內肽酶進行消化，所得片段用制備型SDS-PAGE進行分離，然后在氨基酸序列儀(應用生物系統470A型，The Perkin Elmer Corp.，Conn.，美國)上進行氨基酸測序。結果，從CO I片段(略低于初始分子量)中獲得了部分氨基酸序列，KDIGLLYLVAAGWGF[SEQ ID NO11]，從CO II片段(比初始分子量低大約10000)獲得了部分氨基酸序列，KASQFTHNTPLEIVWTIVPV[SEQ ID NO14]。由于在SDS-PAGE及分光光度特征上CO I及CO II與脫氮副球菌(B.Ludwig和G.Schatz，美國國家科學院院報，77，196-200，1980)的細胞色素C氧化酶的這些指標相似，通過序列對比(圖3至圖4)將CO I及COII亞基的部分氨基酸序列與脫氮副球菌和類球紅細菌及牛線粒體之細胞色素C氧化酶復合體的總氨基酸序列進行比較。在這三種細胞色素C氧化酶復合體中的氨基酸序列的總體同源性在先前已經被報道了(C.Jianli等，生物化學雜志，267，24273-24278，1992).正如圖3及圖4所示，氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞色素C氧化酶的CO I及CO II的氨基酸序列與其他復合體的序列進行了部分的同源性對比。特別是，在兩種細菌序列(脫氮副球菌和類球紅細菌)中觀察到明顯的同源性。
實施例3氧化葡糖桿菌DSM 4025細胞色素C氧化酶基因的克隆(1)通過PCR方法擴增部分細胞色素C氧化酶基因根據脫氮副球菌，類球紅細菌及牛線粒體的總氨基酸序列對比以及純化的CO I及CO II多肽的氨基酸序列(SEQ ID NOs11和14)，選擇下述氨基酸序列用于PCR引物以擴增CO I及CO II基因的部分DNA序列SEQ IDNO9及SEQ ID NO10用于CO I基因；SEQ ID NO15及SEQ IDNO16用于CO II基因。已被報道包括在細胞色素C氧化酶復合體中的第三種組份(CO III)并不存在于從氧化葡糖桿菌DSM 4025中純化的制品中；不存在的原因似乎是因為在純化過程中已解離。為了證實且擴增編碼推定的氧化葡糖桿菌DSM 4025的CO III基因的部分DNA序列(如果存在的話)，選擇在脫氮副球菌、類球紅細菌及牛線粒體的三個CO III基因編碼的多肽中保守的兩個氨基酸序列(圖5.)SEQ ID NO17及SEQ ID NO18用于CO III基因。設計CO I，CO II或CO III各自的引物對(圖-6)。使用GeneAmpTMDNA擴增試劑盒(Takara Shuzo，Kyoto，日本)且按照供應商的建議使用Parkin-Elmer Cetus Instruments熱循環儀進行PCR反應，反應包括30個這樣的循環1)在94攝氏度下熱變性一分鐘；2)在42或者50攝氏度下退火兩分鐘；及3)在72攝氏度下合成3分鐘。反應混合物(100微升)包含有200微摩爾的dNTP，2.9微摩爾(用于32簡并性)或5.8微摩爾的(用于64簡并性)的各引物，2.2ng氧化葡糖桿菌DSM 4025的染色體DNA及2.5單位在提供的緩沖液中的Taq聚合酶。用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)通過使用溴化乙錠染色來檢測PCR產物。結果，擴增了具有期望長度的DNA片段(CO I為大約180bp，CO II為大約180bp，CO III為大約300bp)。
(2)PCR擴增DNA片段的克隆和核苷酸測序從瓊脂糖凝膠中純化PCR擴增的DNA片段，且被直接克隆進入pCRTMII載體中(Invitrogen公司，美國)，DNA序列按照供應商的提示測定。由PCR產物的核苷酸序列推導出來的氨基酸序列與序列對比中目標位置的序列顯示出很大的同源性(圖3至圖5)。編碼CO I，CO II及CO III的部分氨基酸序列的PCR產物用32P進行標記，以分別獲得探針Pco1，Pco2，及Pco3。這些探針被用于Southern-或者集落雜交以檢測完整的CO I，CO II，及CO III基因。
(3)使用PCR產物作為探針進行氧化葡糖桿菌DSM 4025染色體DNA的Southern-印跡分析用多種限制性內切核酸酶消化的氧化葡糖桿菌DSM 4025染色體DNA通過使用探針進行Southern雜交。探針Pco1雜交于Pst I片段(8.0kb)，探針Pco2及Pco3雜交于EcoRI片段上(9.3kb)。
(4)在8.0kb PstI片段(CO I)及9.3kb EcoRI片段(CO II及CO III)中克隆完整的細胞色素C氧化酶基因氧化葡糖桿菌DSM 4025的染色體DNA用PstI或者ECoRI完全消化，對所得的片段進行瓊脂糖凝膠電泳。切出大約9.3kb(7-12kb)的EcoRI消化產物和大約8kb(6-10kb)的Pstl-消化產物，從凝膠中洗脫出來。回收的DNA片段與用PstI或者EcoRI消化的pUC19載體進行連接以轉化大腸桿菌JM109。大約獲得了1,000個轉化子作為PstI-或EcoRI-文庫。用探針Pco1對PstI文庫進行集落雜交，且對EcoRI文庫用探針Pco2及Pco3雜交。從每一文庫中，獲得幾個陽性克隆。從克隆中抽提質粒DNA，且用PstI或者EcoRI進行消化；8.0kb Pstl片段與探針Pco1顯示出強的信號，9.3kb EcoRI片段與探針Pco2及Pco3均顯示出強的信號。含有8.0kb PstI片段的質粒命名為pUCO01，含有9.3kb的EcoRI片段的質粒命名為pUCO23。
(5)8.0kb PstI和9.3kb EcoRI片段的物理圖譜8.0kb PstI及9.3kb EcoRI片段的物理圖譜可以通過使用探針Pco1，Pco2及Pco3對多種限制性內切核酸酶消化的片段進行Southern雜交分析來構建。編碼9.3kb EcoRI片段的CO II及CO III基因的方向與距離可以用來自于部分核苷酸序列的引物(圖7)通過PCR方法來確定。
(6)完整的CO I基因的核苷酸測序pUCO01上的COI基因的核苷酸序列可以通過雙脫氧鏈終止法進行測定。如圖7所示，一個來自于HindIII位點的上游的2.9kb的片段被測序，并在該片段上發現了一個開放閱讀框(1,674bp的CDS，存在于如SEQ ID NO1所示的序列中)。該ORF編碼558個氨基酸序列的蛋白(序列表SEQ ID NO2)，其包含一個與來自于純化的CO I的多肽片段的氨基酸序列(SEQ ID NO11)，及從CO I的大約180bp的PCR產物[參見3-(1)]之DNA序列推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO13)相一致的區段。氧化葡糖桿菌DSM 4025的COI氨基酸序列與類球紅細菌，脫氮副球菌及牛線粒體相比較，分別顯示出78.7％，76.0％及53.3％的同源性(圖8)(7)編碼全部CO I，CO II，及CO III基因的表達質粒的構建經過完全的HindIII及部分的EcoRI消化以一個3.5kb的片段從在pUCO01的8.0kb PstI片段中分離COI基因(圖7)。按照pUCO23上的9.3kbECORI片段的物理圖譜，CO II及CO III基因經過完全的KpnI消化及部分Psd消化以產生一個串聯形式的6.0kb的片段(圖7)。每一片段亞克隆進pBluescript II SK+載體以獲得含有CO I基因的3.5kb片段的質粒pBCO01及含有CO II和CO III基因的6.0kb片段的質粒pBCO23。
正如圖9所示，含有COI基因的3.5kb片段及含有CO II及CO III基因的6.0kb片段被共同整合入一個表達載體中去，用于功能性表達細胞色素C氧化酶復合體(CO I，CO II，及CO III)的基因。首先，通過平端連接，將含有來自于pBCO23的CO II及CO III基因的6.0kb XbaI-KpnI片段插入質粒載體pVK101的EcORI位點。然后，將含有來自于pBCO01的CO I基因的3.5kbXbaI-HindIII片段插入具有6.0kb的XbaI-KpnI片段的pVK1O1的BgI II位點。所得質粒載體被命名為pVKcoxes。
實施例4氧化葡糖桿菌DSM 4025衍生物中的細胞色素C氧化酶基因的過度表達使用三親接合交配法將攜帶有在pVK1O1，pVKcoxes中的細胞色素C氧化酶基因的質粒引入氧化葡糖桿菌DSM 4025的利福平抗性衍生物，GOS2RPM[一個GOS2R的單菌落分離株；T.Hoshino等，歐洲專利公報832974A2]中。GOS2RPM的細胞培養在30攝氏度10ml的T培養基中，該培養基由3％胰酶解大豆肉湯(Bacton Dickinson，Cockeysville，Md.，美國)及0.3％酵母提取液(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)和100微克/毫升的利福平組成(TR培養基)。供體菌株，(攜帶有pVKcoxes(Tcr，Kmr)或者pVK102(Tcr，Kmr)的大腸桿菌HB)及輔助菌株(攜帶有pRK2013(Kmr)的大腸桿菌HB101)被培養在含有合適抗生素的Luria Bertani培養基中37攝氏度過夜培養。這些過夜培養物(10ml的GOS2RPM培養物及2ml的大腸桿菌培養物)被分別離心，細胞沉淀懸浮在2ml的T培養基中。混和100微升的細胞懸液，取50微升混合的細胞懸液點入置于NS2瓊脂培養基的表面的硝酸纖維濾膜上，所述培養基含有5.0％D-甘露醇，0.25％MgSO4.7H20，1.75％玉米漿，5％面包酵母(東方酵母公司，東京，日本)，0.5％CaCO3，0.5％尿素(分別滅菌)，及2.0％瓊脂，pH7.0(滅菌前)。平板在27攝氏度下過夜培養。所得的細胞涂布到含有100微克/毫升利福平及3微克/毫升四環素的T瓊脂培養基中(TRT瓊脂平板)。由此獲得的轉化接合子通過在TRT瓊脂平板上劃線進行純化以去除大腸桿菌及不含質粒的GOS2RPM細胞。
培養所得的轉接合子GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK102)，兩種轉接合子細胞按照實施例1的方法制備。通過下列實驗測定，GOS2RPM(pVKcoxes)中的細胞色素C氧化酶水平類似于GOS2RPM(pVK102)。從這兩個菌株中，溶解的細胞膜級分按照實施例1的方法制備。首先，通過還原型減去氧化型差別光譜法(實施例1)，對應于GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK102)a-型血紅素含量分別為0.031及0.022hmole/毫克細胞蛋白。其次，測量細胞色素C(購買于Sigma，馬心臟VI型)比氧化速率。還原型的細胞色素C以連二亞硫酸鈉作為還原劑制備，過量的還原劑由PD-10柱(Pharmacia)處理兩次去除。反應混合物由33mM還原型細胞色素C，25mM Na-HEPES(pH7.2)，2％蔗糖單月桂酸及0.5mM EDTA組成。還原型細胞色素C的氧化速率由在550nm處吸收峰的減少來進行測量，摩爾系數認為是21.1/mM/cm。分別對應于GOS2RPM(pVK102)及GOS2R(pVKcoxes)的還原型細胞色素C的比氧化速率分別為1.58及2.00nmole/毫克細胞蛋白每分鐘。第三，CO I及CO II組份的含量通過針對組份CO I或COII的抗體之Western-blot分析比較獲得。在GOS2RPM(pVKcoxes)上可以觀察到更強的條帶強度(使用CCD照相機，對于CO I增加60％，對于CO II增加41％)。這些結果提示，引入pVKcoxes導致在產生2KGA的氧化葡糖桿菌DSM 4025衍生物中細胞色素C氧化酶復合體水平的功能性擴增。
序列表<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>細胞色素C氧化酶及其基因<130>細胞色素C氧化酶及其基因<140>
<141>
<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1674<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1674)<400>1atg gca gac gcc gcc att cac ggc cat gac cac cat gag aag caa ggc48Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15ttc ttc acg cgc tgg ttc atg tcg acc aac cac aaa gac atc ggt ctg96Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30cta tac ctt gta gcg gct ggt gtt gtt ggt ttc att tcc gtc ctg ttc144Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45acc gtc tac atg cgc ctt gag ctg atg gat ccg ggt gtt cag tac atg192Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60
tgc ctt gaa ggc gca cgt ctg atc gcg gat gcc tcg cag aca tgt acg240Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 75 80gcg aac gga cac ctg tgg aac gtc atg gtt acc tac cat ggt att ctg288Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile Leu85 90 95atg atg ttc ttt gtg ggt atc ccc gca ttg ttc ggt ggt ttt ggt aac336Met Met Phe Phe Val Gly Ile Pro Ala Leu Phe Gly Gly Phe Gly Asn100 105 110tat ctg atg ccg ctg caa atc ggc gct ccg gat atg gcc ttc ccg cgg384Tyr Leu Met Pro Leu Gln Ile Gly Ala Pro Asp Met Ala Phe Pro Arg115 120 125atg aac aac ctg tcg ttc tgg ctg ttc att gcc ggt acc gcg atg ggc432Met Asn Asn Leu Ser Phe Trp Leu Phe Ile Ala Gly Thr Ala Met Gly130 135 140gtg gct tcg ctg ttc gca ccg ggc ggt gac ggt cag ctg ggt tcg ggc480Val Ala Ser Leu Phe Ala Pro Gly Gly Asp Gly Gln Leu Gly Ser Gly145 150 155 160gtt ggt tgg gtt ctg tac ccg ccg ctg tcg acc cgc gaa gct ggc tat528Val Gly Trp Val Leu Tyr Pro Pro Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gly Tyr165 170 175tcg atg gac ctc gcg att ttc gcg gtt cac ttg tcg ggt gcc tcc tcg576Ser Met Asp Leu Ala Ile Phe Ala Val His Leu Ser Gly Ala Ser Ser180 185 190
atc atg ggc gcg atc aac atg atc acg acc ttc ttg aac atg cgc gcc624Ile Met Gly Ala Ile Asn Met Ile Thr Thr Phe Leu Asn Met Arg Ala195 200 205ccc ggc atg acg ctg cac aaa gtg ccg ttg ttc tcg tgg tcg atc ttt672Pro Gly Met Thr Leu His Lys Val Pro Leu Phe Ser Trp Ser Ile Phe210 215 220atc acg gct tgg ctg atc ctg ctg gcg ctg ccg gtt ctg gct ggt gca720Ile Thr Ala Trp Leu Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Gly Ala225 230 235 240atc acc atg ctg ctg acc gac cgt aac ttc ggc acg acc ttc ttc aat768Ile Thr Met Leu Leu Thr Asp Arg Asn Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn245 250 255cct gct ggc ggc ggt gac ccg att ctg tac caa cac atc ctg tgg ttc816Pro Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ile Leu Tyr Gln His Ile Leu Trp Phe260 265 270ttt ggg cac ccg gaa gtg tac atc atc att ctg ccc ggc ttt ggc atc864Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe Gly Ile275 280 285atc agc cat gtc gtg tcg acc ttc tcg aaa aag ccg gtc ttc ggt tac912Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe Gly Tyr290 295 300ctg ccg atg gtc tat gca atg gtg gca atc ggt gtt ctg ggc ttt gtc960Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Val Ala Ile Gly Val Leu Gly Phe Val305 310 315 320
gtc tgg gcg cac cac atg tac acc gtt ggt atg tcg ctg acc cag caa1008Val Trp Ala His His Met Tyr Thr Val Gly Met Ser Leu Thr Gln Gln325 330 335tcc tac ttc atg ctg gcc acc atg gtg atc gcg gtg ccg acc ggc att1056Ser Tyr Phe Met Leu Ala Thr Met Val Ile Ala Val Pro Thr Gly Ile340 345 350aag atc ttc tcg tgg atc gcc acg atg tgg ggc ggc tcg gtt gag ttc1104Lys Ile Phe Ser Trp Ile Ala Thr Met Trp Gly Gly Ser Val Glu Phe355 360365aaa tcg ccg atg ctc tgg gcc ttt ggc ttt atg ttc ctg ttc acc gtg1152Lys Ser Pro Met Leu Trp Ala Phe Gly Phe Met Phe Leu Phe Thr Val370 375 380ggt ggt gtg acc ggt atc gtg ctg gcc caa gcg ggt ctg gac cgt gca1200Gly Gly Val Thr Gly Ile Val Leu Ala Gln Ala Gly Leu Asp Arg Ala385 390 395 400tat cac gac acc tat tac gtg gtg gcg cac ttc cat tat gtg atg tcg1248Tyr His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His Phe His Tyr Val Met Ser405 410 415ctg ggt gcg atc ttt gcg atc ttc gcc ggt atc tac ttt tac atg ccg1296Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ile Phe Ala Gly Ile Tyr Phe Tyr Met Pro420 425 430aag ttc tcg ggc cgc gct ttc ccg gaa tgg gct gca aag ctg cac ttc1344Lys Phe Ser Gly Arg Ala Phe Pro Glu Trp Ala Ala Lys Leu His Phe435 440 445
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<400>2Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 7580Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile Leu85 90 95Met Met Phe Phe Val Gly Ile Pro Ala Leu Phe G1y Gly Phe Gly Asn100 105110Tyr Leu Met Pro Leu Gln Ile Gly Ala Pro Asp Met Ala Phe Pro Arg115 120 125Met Asn Asn Leu Ser Phe Trp Leu Phe Ile Ala Gly Thr Ala Met Gly130 135 140Val Ala Ser Leu Phe Ala Pro Gly Gly Asp Gly Gln Leu Gly Ser Gly145 150 155 160Val Gly Trp Val Leu Tyr Pro Pro Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gly Tyr165 170 175
Ser Met Asp Leu Ala Ile Phe Ala Val His Leu Ser Gly Ala Ser Ser180 185 190Ile Met Gly Ala Ile Asn Met Ile Thr Thr Phe Leu Asn Met Arg Ala195 200 205Pro Gly Met Thr Leu His Lys Val Pro Leu Phe Ser Trp Ser Ile Phe210 215 220Ile Thr Ala Trp Leu Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Gly Ala225 230 235 240Ile Thr Met Leu Leu Thr Asp Arg Asn Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn245 250 255Pro Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ile Leu Tyr Gln His Ile Leu Trp Phe260 265 270Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe Gly Ile275 280285Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe Gly Tyr290 295 300Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Val Ala Ile Gly Val Leu Gly Phe Val305 310 315 320Val Trp Ala His His Met Tyr Thr Val Gly Met Ser Leu Thr Gln Gln325 330 335
Ser Tyr Phe Met Leu Ala Thr Met Val Ile Ala Val Pro Thr Gly Ile340345 350Lys Ile Phe Ser Trp Ile Ala Thr Met Trp Gly Gly Ser Val Glu Phe355 360365Lys Ser Pro Met Leu Trp Ala Phe Gly Phe Met Phe Leu Phe Thr Val370 375380Gly Gly Val Thr Gly Ile Val Leu Ala Gln Ala Gly Leu Asp Arg Ala385 390 395 400Tyr His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His Phe His Tyr Val Met Ser405 410415Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ile Phe Ala Gly Ile Tyr Phe Tyr Met Pro420 425 430Lys Phe Ser Gly Arg Ala Phe Pro Glu Trp Ala Ala Lys Leu His Phe435 440 445Trp Thr Phe Phe Ile Gly Ala Asn Val Thr Phe Phe Pro Gln His Phe450 455460Leu Gly Arg Gln Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ile Asp Tyr Pro Glu Ala465 470 475 480Phe Ala Leu Trp Asn Lys Val Ser Ser Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Phe485 490495Ala Ser Phe Leu Phe Phe Ile Val Ile Phe Val Tyr Thr Leu Val Ala500 505510
Gly Arg Arg Glu Thr Arg Pro Asn Pro Trp Gly Glu Phe Ala Asp Thr515 520 525Leu Glu Trp Thr Leu Pro Ser Pro Pro Pro Ala His Thr Phe Glu Thr530 535 540Leu Pro Lys Arg Ser Asp Trp Asp Lys His Pro Ser His545 550 555<210>3<211>132<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(132)<400>3ccg ctg gaa atc gtc tgg acg att gtt ccg gtt gtg att ctg gtc ttc48Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe15 10 15atc ggt gcg ttc tcg ctg ccg gtg ctg ttc aaa cag caa gag ttc ccc96Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro20 25 30gag ggt gac atc gtc atc aac gtc gag ggt cgt agc 132Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser35 40<210>4<211>44<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌
<400>4Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe15 1015Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro20 25 30Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser35 40<210>5<211>114<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(114)<400>5atc gtc cac ggc gac cgc aag aaa acc gcg att ggc cta gcg att gcc48Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala1 510 15atc ggc ctt ggc tgg atc ttt acc ctg tgc caa gcc tat gaa tat tat96Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr20 25 30gaa atc gtc cat acc gaa114Glu Ile Val His Thr Glu35<210>6<211>38<212>PRT
<213>氧化葡糖桿菌<400>6Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala1 5 10 15Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr20 25 30Glu Ile Val His Thr Glu35<210>7<211>87<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(87)<400>7gat tcg atc ttc ctg ctg gtc tgc ctg atc cgc atc ctg cgc ggt gcg48Asp Ser Ile Phe Leu Leu Val Cys Leu Ile Arg Ile Leu Arg Gly Ala1 5 10 15atg tcg gca aaa cag cac gtc ggt ttc gag atg gcc gca 87Met Ser Ala Lys Gln His Val Gly Phe Glu Met Ala Ala2025<210>8<211>29<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌<400>8Asp Ser Ile Phe Leu Leu Val Cys Leu Ile Arg Ile Leu Arg Gly Ala1 5 10 15
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<213>氧化葡糖桿菌<220>
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Gly Tyr Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Leu Gly35 40 45Phe Val Val Trp Ala His His Met50 55<210>14<211>20<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌<220>
<22l>PEPTIDE<222>(1)..(20)<400>14Lys Ala Ser Gln Phe Thr His Asn Thr Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr15 10 15Ile Val Pro Val20<210>15<211>6<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌<400>15Gln Phe Thr His Asn Thr15<210>16<211>7<212>PRT<213>類球紅細菌<400>16Trp Tyr Trp Gly Tyr Glu Tyr15
<210>17<211>6<212>PRT<213>類球紅細菌<400>17Thr Trp Ala His His Ala15<210>18<211>7<212>PRT<213>類球紅細菌<400>18Trp Tyr Trp His Phe Val Asp1權利要求
1.一種從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2-酮基-L-古洛糖酸的方法，該方法包括在合適的培養基中培養重組生物體并從培養基中回收2-酮基-L-古洛糖酸，所述重組生物體載有編碼多肽的重組DNA，所述多肽包含于具有細胞色素c氧化酶活性的細胞色素c氧化酶復合體中，它可獲自或來源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM 4025的微生物或具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒定特征的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物的生物學或遺傳材料。
2.根據權利要求1的方法，其中將所述2--酮基-L-古洛糖酸進一步轉化為維生素C。
全文摘要
本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶復合體，用于制備所述復合體的遺傳材料，例如包含在細胞色素C氧化酶復合體的重組多肽，重組DNA片段，表達載體，重組生物體及其類似物。這些新的細胞色素C氧化酶復合體及遺傳材料可起源于具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒定特征的微生物。本發明同樣也提供了一種制備所述新的重組細胞色素C氧化酶復合體的方法及一種生產2－酮基－L－古洛糖酸(2KGA)的方法。
文檔編號C07C59/347GK1807651SQ20051011432
公開日2006年7月26日 申請日期2000年11月17日 優先權日1999年11月17日
發明者淺倉昭, 星野長尾, 真城正子 申請人:Dsm Ip資產有限公司