N－端化學修飾的蛋白質組合物及方法

專利名稱：N－端化學修飾的蛋白質組合物及方法
技術領域：
本發明總的來說是涉及蛋白質修飾領域，而且，更具體地說是涉及對蛋白質及其類似物附著水溶性多聚物的領域(本文所用的術語“蛋白質”與“多肽”或“肽”這些術語，如未作其它說明均指同一意思)。本發明還涉及用于N端修飾蛋白質或其類似物的新方法和所得的組合物。另一方面，本發明涉及新N端化學修飾的G-CSF組合物和有關制備方法。本發明還涉及化學修飾的共有的干擾素。
背景技術：
目前，治療用蛋白質之所以能以適當的形式及充足的數量獲得主要是由于重組DNA技術的進展。重組蛋白質的可用性導致蛋白質配方及化學修飾方面的進展。這種化學修飾的目的之一就是蛋白質保護。化學附著可有效地阻止蛋白水解酶與蛋白質骨架本身的接觸，從而阻止了蛋白質的降解。其它的優勢包括在特定環境條件下，增加治療蛋白質的穩定性及循環時間并且減小其免疫原性。描述蛋白質修飾及融合蛋白質的綜述性文章是Francis Focus on Growth Factors，34-10(1992年5月)(由Mediscript，Morntview Court，Friern Barnet Land，London N20，OLD，UK出版)。
聚乙二醇(“PEG”)就是一種這類化學修飾部分，它用來制備治療用蛋白質產品(動詞“PEG化”(pegylate)意指附著至少一個PEG分子)。例如Adagan即為腺苷脫氨酶的PEG修飾形式，已被獲準用于治療嚴重復合型免疫缺陷疾病；PEG化的超氧歧化酶已進入治療頭部損傷的臨床試用階段；PEG化的α-干擾素已在治療肝炎的I期臨床試驗中進行了測試；另據報導PEG化的葡萄糖腦苷脂酶和PEG化的紅血蛋白也已進入臨床前試驗階段。附著聚乙二醇對蛋白水解的保護作用已見報道(Sada，等J.Fermentation Bioengineering 71137-130，1991)，附著特定的聚乙二醇部分的方法參見美國專利No.4,179,337，Dayis et al.，“無免疫原性多肽”，于1979年12月18日公布。以及美國專利No.4,002,531，Royer，“聚乙二醇對酶的修飾及其生產的產品”，1977年1月11日公布。如果想對此領域有更全面的了解，可參見Abuchowski等“Enzymes as Drugs”(J.S.Holcerbergand J.Roberts，eds.pp.367-383頁(1981))。
已使用的其它水溶性多聚物如乙二醇、丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環(poly-1，3-dioxolane)，聚-1，3，6-三烷，乙烯馬來酸酐共聚物，多聚氨基酸(或者是單一聚體或者是隨機共聚體)。
對于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質上。總的來說，聚乙二醇分子是通過一個在蛋白質分子上發現的反應基團而聯到蛋白質分子上的。氨基，如賴氨酸殘基上的或N-末端上的氨基通常用于這類附著。例如，Royer(美國專利號4,002,531，見上述)認為可利用還原性烷基化反應將聚乙二醇分子附著到酶上。Wright于1993年4月28日公開的EP 0 539 167，“Peg Imidates and ProteinDerivates Thereof”中認為帶有自由氨基的肽及有機復合物可被PEG的直接衍生物或有關的水溶性有機多聚體所修飾。Shaw在1990年2月27日公開的美國專利號4,904,584中涉及修飾蛋白質中用于通過反應性氨基基團附著聚乙二醇分子的賴氨酸殘基的數目。
“G-CSF”，粒細胞集落刺激因子即為一種經過化學修飾的具體治療用蛋白質。G-CSF誘導嗜中性粒細胞的快速增殖并釋放到血液中，從而在抗感染中提供治療效應。
歐洲專利公開EP 0 401 384于1990年12月12日公開的題為“化學修飾的粒細胞集落刺激因子”中描述了用于制備附著有聚乙二醇分子的G-CSF的材料和方法。
1992年3月4日公開的題為“連續性釋放包含一個多肽分子共價結合上一水溶性多聚體的藥用組合物”的EP 0 473 268中報道了修飾的G-CSF及其類似物，描述了各種G-CSF及其共價結合上一水溶性顆粒多聚體如聚乙二醇所產生的衍生物的使用。
于1989年10月4日公開的EP 0 335 423報道了一種修飾的具有人類粒細胞集落刺激因子活性的多肽。
另一個例子是PGE化的IL-6，在題為“修飾的hIL-6”(參見共同未決的U.S.S.N.07/632,070).的EP 0 442 724中公開了將聚乙二醇分子附著到IL-6分子上。
于1985年9月11日公開的EP 0 154 316報道了一淋巴細胞活素(Lymphokine)與一聚乙二醇的醛發生反應。
許多給蛋白質分子附著多聚物的方法涉及使用某一部分作為聯接基團。然而這些部分往往具有抗原性。可進行一種不涉及聯接基團的tresylChloride法，但由于tresyl chloride的使用會產生毒副產品，故很難用該方法生產治療用產品。參見Francis等蛋白質藥物的穩定性體內的降解途徑及蛋白質穩定化的策略(Eds.Ahern.，T.and Manning，M.C.)(plenum，New York，1991)。同時還可參見Delgado等.，“通過Tresyl chloride激活偶聯PEG到蛋白質在免疫親合細胞制備中的應用”。Fisher等eds.，水相系統分離在細胞生物學及生物技術中的應用，Plenum Press，N.Y.N.Y.，1989pp.211-213。
Chamow等(BioconjugatēChem.5133-140(1994))報道了CD4免疫吸附素(immanoadhesin)通過與單甲氧基多聚乙二醇醛發生還原性烷化作用進行修飾。作者報道50％的CD4-Ig在PEG化反應程度可控的條件下進行MePEG修飾。出處同上，見137頁。作者還報道了在體外，修飾的CD4-Ig結合(對蛋白gp120)的能力與其MePEG化的程度呈負相關。出處同上，同樣也可參見Rose et al.，Bioconjugate Chemistry 2154-159(1991)，文中報道了連接基團卡巴肼(carbohydrazide)選擇性地附著到蛋白質底物(胰島素)的C-末端羧基上。
然而，在整個領域內或涉及特定蛋白質的領域內還沒有一種方法能夠讓水溶性多聚物選擇性地附著到蛋白質如G-CSF的N-末端上。更有甚者，目前存在的方法在任何反應基團上提供非選擇性附著反應，無論這些基團是在蛋白質內(例如，賴氨酸側鏈基團)，還是在N-末端上。這將會導致產物的不均一。例如，PEG化的G-CSF分子，有些分子中含有數目不同于其它分子的聚乙二醇部分。比如一個含5個賴氨酸殘基的分子在上述反應中可能會形成一種不均一混合物，一些分子含有6個聚乙二醇分子，一些分子中具有5個，一些分子中具有4個，一些分子中具有3個，一些分子中具有2個，以及具有1個甚至一個聚乙二醇分子也沒有。并且在帶有一些聚乙二醇的分子中，聚乙二醇分子在不同的分子中可能不會附著于相同的位置。
以上這些都是開發治療用PEG化蛋白質產品不中利因素。開發這類藥物時，產品生物活性的可預見性顯得分外重要。例如，在超氧化物歧化酶非選擇性地與聚乙二醇分子結合的情況下，一部分修飾的酶完全喪失活性(P.McGoff et al.Chem.Pharm.Bull.363079-3091(1988))。如果這些治療性蛋白質在組合物中各批量間有區別，人們將無法對其生物活性進行預測。不同位點結合的聚乙二醇分子穩定性不同，這一情況可能導致這些分子從蛋白質中解離出來。當然，如果這些分子是隨機附著而因此隨機解離，那么治療用蛋白質的藥物動力學就不可能準確預測。從消費者的角度考慮，不同批量的循環時間不盡相同，因此劑量上也可能是不準確的。從生產者角度考慮，獲準進入市場的治療用蛋白質的保存將增添麻煩。此外，上述方法沒有一個提供無連接部分(蛋白質和多聚體之間)的選擇性N-末端化學修飾。如果合用連接部分，由于可能的抗原性，可能產生不利影響。
因此，仍需要能選擇性N端化學修飾蛋白質及其類似物，包括G-CSF及共有干擾素(以下就以這兩種化學修飾的蛋白質為例加以說明)的方法本發明從諸多方面闡述了這一需要。
本發明概述本發明涉及N-端化學修飾的蛋白質的基本上均一的制品及其所用的方法。出乎意料的是N-末端化學修飾的G-CSF顯示出在該分子的另一位點上含一個化學修飾的其它G-CSF各類所未發現的在穩定性方面的優勢。更出人意料的是在用于制備N-末端化學修飾的G-CSF的本方法中，發現使用還原性烷基化反應能夠提供選擇性地修飾N-末端的條件，并且該方法可廣泛地應用于其它蛋白質(或其類似物)以及G-CSF。令人驚奇的是，利用還原性烷基化反應，其終產物-以胺鍵與水溶性多聚體結合的蛋白質，要比具有酰胺鍵(amide link age)的相同多聚物/蛋白質連接物穩定得多。另外一個這樣修飾的蛋白質(如下就以此為實施例加以描述)是共有干擾素(consensus interferon)。因此，正如上面所要詳述的，本發明具有涉及化學修飾蛋白質(或其類似物)以及特定蛋白質的特殊修飾的諸多方面的內容。
一方面，本發明涉及N-末端化學修飾的G-CSF(或其類似物)的基本上均一的制品及有關方法。在下面實施例中說明了N-末端單個PEG化的mono-PEG的G-CSF要較其它類型的單個PEG化的G-CSF更穩定。另外，由于G-CSF分子的N-末端在反應過程中較易與聚乙二醇分子接近，N-末端PEG化比例較高，因此該方法操作起來比較具有優勢。
本發明還涉及一種還原性烷基化反應類型。該反應可選擇性地激活蛋白質或其類似物N-末端殘基的氨基基團，從而使水溶性多聚體部分選擇性附著到N端。這樣提供了多聚體/蛋白質結合分子的基本上均一的制品以及(如果應用聚乙二醇的話)具有聚乙二醇部分直接偶聯到蛋白質部分上的PEG化蛋白質分子的制品。下面描述了用于G-CSF及共有干擾素的這一方法，這些內容提供了本發明的其它方面。
附圖簡述

圖1A為一PEG化的G-CSF離子交換色譜峰的色譜圖復制品。
圖1B各種類型單PEG化G-CSF的SDS-PAGE圖。
圖2線A為重組人類甲二磺酰G-CSF標準樣的SEC-HPLC圖；線B為SCM-PEG-GCSF反應混合物；線C為N-末端PEG化的G-CSF；線D為35賴氨酸單個PEG化的G-CSF；線E為賴氨酸41單個PEG化的G-CSF。
圖3A、3B及3C為經內蛋白酶(endoproteinase)SV8肽酶切后的HPLC圖，3A為N-末端PEG化的G-CSF；3B為35賴氨酸單個PEG化的G-CSF；3C為賴氨酸41單個PEG化的G-CSF。
圖4是一條形圖，圖示在體外，單個PEG化的G-CSF種類與未PEG化的標準樣生物活性的比較。
圖5A及5B顯示了在體內單個PEG化的G-CSF衍生物生物活性的分析結果，圖5A顯示倉鼠經皮下注射N-末端PEG化的G-CSF，35賴氨酸單個PEG化的G-CSF或賴氨酸41單個PEG化的G-CSF后白血球計數的平均值，圖5B顯示經單次皮下注射上述各種單個PEG化的G-CSF衍生物后曲線下的最終平均白血球數面積。
圖6A、6B及6C為研究N-末端PEG化的G-CSF或35賴氨酸單個PEG化的G-CSF的穩定性所得的SEC-HPLC圖。圖6A為在pH 6.0，4℃條件下研究N-末端單個PEG化的G-CSF穩定性的SEC-HPLC圖，圖6B為相同條件下35賴氨酸單個PEG化的G-CSF圖。圖6C顯示在pH6.0及4℃下進一步對35賴氨酸單個PEG化的G-CSF穩定性研究結果。時間(“T”)表示天。
圖7顯示了rh-G-CSF與甲氧聚乙二醇醛(MW6kDa)發生還原性烷基化反應的過程中反應混合物的篩析(size exclusion)HPLC分析結果。
圖8顯示了用MPEG(也在MW＝6kDa)N-羥基琥珀酰酯的反應混合物篩析(size exclusion)HPLC分析圖。
圖9為單次皮下注射劑量的單N-末端MPEG-GCSF接合物(由rh-G-CSF不同分子量的MPEG醛經過還原性烷化反應制得，其中MPEG的分子量為6kDa、12kDa以及20kDa)后總的白血球反應情況。
詳細描述本發明涉及N-末端化學修飾蛋白質的基本上均一的制品及其所用的方法。
一方面，本發明涉及N-末化學修飾的G-CSF的組合物及其所用的方法。
本方法(用于N-末端修飾G-CSF以及還原性烷基化反應法)提供了單聚體/蛋白質連接物的基本上均一的混合物。本文所用的“基本上均一的”意指觀察到的每個聚合物/蛋白質連接物分子中均只含一個聚合物部分。制品中也許會包含未反應(即缺乏聚合物部分)的蛋白質。在下面的一個實施例中，通過肽圖譜(peptide mapping)及N-末端測序證實，制備出的制品中至少含90％的單聚體/蛋白質連接物，表反應蛋白質含量最多不超過10％。優選的是，N-末端單個PEG化物質含量至少應達到制品的95％(正如在下面實施例中所述)，最優選的是，N-末端單個PEG化物質占制品的99％或更高。這種單聚體/蛋白質連接物具有生物活性。本文提供的“基本上均一”的N-末端PEG化的G-CSF制品意指這些制品的均一性足以能夠顯示出均一制品所具有的優越性，例如，易于在臨床應用中預測不同批量的藥物動力學。
人們可以選擇制備聚合物/蛋白質連接物分子混合物，本文提供的優勢在于，人們可以選擇單聚體/蛋白質連接物在混合物中的比例。這樣，如果需要的話，人們便可以制備出帶有不同數目附著的聚合物分子(比如2個、3個、4個等等)的各種蛋白質混合物，并與利用本發明方法制備出的單聚體/蛋白質連接物結合，便可得到預定單聚體/蛋白質連接物比例的混合物。
下面提供使用G-CSF的實施例，如上所述，G-CSF是用于治療造血障礙的治療用蛋白質。一般來說，在本發明實施中有用的G-CSF可以是從哺乳動物有機體中分離的，或者作為選擇是化學合成方法的產品，或者是通過原核生物或真核生物宿主表達外源性DNA序列而得到的產品，其中這些DNA可從基因組或cDNA克隆或通過DNA合成得到。合適的原核生物宿主包括各種細菌(如，E.coli)；合適的真核生物宿主包括酵母(如S.cerevisiae)及哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞，猴細胞)。依據所用的宿主的不同，G-CS F表達產物可能會被哺乳動物或其它真核細胞中的碳水化合物所糖基化，或非糖基化。G-CSF表達產物中也可以包括一個起始的甲硫氨酸殘基(在第-1位)。雖然優選重組G-CSF(特別是來自E.coli)，本發明預測了使用任意或全部其它生物中G-CSF的這類形式的最大商業實用性。
已有報道一些G-CSF類似物具有生物學功能，這些分子也可以是化學修飾的，例如，添加上一個或多個聚乙二醇分子。G-CSF類似物在美國專利No.4,810,643中已有報道。具報道有生物活性的其它G-CSF類似物的例子有AU-A-76380/91，EP 0 459 630，EP 0 272703，EP 0 473 268以及EP 0 335 423中所描述的那些，雖然文中沒提供報道公開的每種類似物的活性。還可參見AU-A-10948/92，PCTUS 94/00913以及EP 0 243 153。
一般來說，本發明中有用的G-CSF及其類似物可以通過進行本文提供的化學修飾程序以選擇性地修飾N-末端α-氨基，試驗所得產品的所需生物學特征，例如本文提供的生物活性試驗來確定。當然，如果需要對非人類哺乳動物進行這類治療，可以使用重組非人類的G-CSF，如重組鼠、牛及犬等的G-CSF產品。例如，參見PCT WO 9105798及PCT WO 8910932。
因此，本發明的另一個方面包括N-末端化學修飾的G-CSF類似物的組合物。如上所述，G-CSF類似物可包括具有氨基酸添加、缺失和/或替代(與下面實施例1中所述的G-CSF氨基酸序列相比較而言)的產物。那些當N-末端被PEG化時預期發揮功能以選擇性刺激中性粒細胞的產生的G-CSF類似物是為結合到G-CSF受體上并非必要的N-末端的類似物，見Hill et al.，PNAS-USA 905167-5171(1993)；也可參見PCT US 94/00913。
使用的聚合物分子可選自水溶性多聚體。(對于本文描述的還原性烷基化方法，多聚體應具有單個反應醛基)。選擇性聚合物分子應是水溶性的，使其要結合的蛋白質分子在水環境中不會發生沉淀現象，例如生理環境中。從還原性烷基化反應角度考慮，選擇的聚合物分子應具有一個反應醛基，這樣就可以根據本發明方法對聚合程度進行控制。多聚體可以是分枝或不分枝的。對于終產物制品的治療用途，優選的聚合分子應是藥用上可接受的。本領域的技術人員應能夠根據該聚合物/蛋白質連接物是否在治療上使用來選擇所需的聚合物，如果是在治療上使用，則應考慮其劑量，循環時間，對蛋白水解的抵抗力以及其它一些因素。對于G-CSF來說，可用本文中提供的測試手段加以探知，本領域的技術人員還應針對其它治療性蛋白質選擇合適的測試手段。水溶性多聚體可選自如上面所列出的(背景部分)各種分子以及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化丙烯/氧化乙烯(prolypropylene oxide/ethylene oxide)共聚物，聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
出于下面所述的最優化考慮，聚合物的分子量可以是任意大小，并且可以是帶有分枝或不分枝的。對于聚乙二醇來說，最優選的分子量是約為2kDa到大約100kDa之間(術語“大約”意指聚乙二醇制品中，一些分子大于所述分子量，另一些分子小于所述分子量)。下面的實施例1及實施例2涉及PEG6000，其選擇便于純化及提供一個合適的模式系統。其它大小的使用取決于所需的治療方案(情況例如所需的緩釋持續時間，效力如果在生物活性方面有效的話，處理的方便性，抗原性大小或缺乏以及其它一些PEG對治療性蛋白質及其類似物的已知效應。
本發明的一個具體方面就是N-末端單個PEG化的G-CSF分子，它由一個聚乙二醇部分和一個G-CSF部分組成。對于該組合物，人們可從多種聚乙二醇分子(以分子量及有無分枝等)，反應混合物中聚乙二醇分子對G-CSF蛋白質分子的比例，所進行的PEG化反應的類型，獲得選擇性N-末端PEG化的G-CSF的方法及所要使用的G-CS F的類型等方面進行選擇。此外，本組合物及方法還包括藥用組合物的配方，藥劑的治療和生產方法。
聚乙二醇分子對蛋白質分子的比例與它們在反應混合物中的濃度一樣，可以改變。一般來說，最佳比例(是指反應效率而言，即反應混合物中沒有多余未反應的蛋白質及聚合物分子)將根據所選聚乙二醇分子量進行測定。此外，正如本方法的一個實施例中涉及的非特異性PEG化反應和隨后的N-末端單個PEG化產物的純化，比例取決于可參加反應的可得到的反應基團數(典型的是∝或э氨基)。本文的一個實施例中涉及的蛋白質PEG分子的反應比例相當低以獲得基本上為單個PEG化的產品(每個蛋白質分子對1.5個PEG分子)。
為了獲得N-末端PEG化的G-CSF，也有多種如上所述的或者在下面實施例2中所述的還原性烷基化反應的PEG化反應方法可供選擇。有關聚乙二醇部分與蛋白質部分之間無連接基團的聚合方法在Franciset al在蛋白質藥品的穩定性體內降解途徑及使蛋白質穩定的策略(Eds.Ahern.，T.and Manning，M.C.Plenum，New York，1991)中已有過描述。另外，Delgado et al.，“通過TresylChloride激活方法偶聯PEG到蛋白質在免疫親合細胞制品中的應用”及Fisher et al.，eds.，水相系統分離在細胞生物學及生物技術中的應用，Plenum Press，N.Y.N.Y.，1989pp.211-213中涉及利用tresyl chloride，從而使聚乙二醇部分和蛋白質部分間沒有連接基團存在。該方法由于會產生毒副產品，故很難用于生產治療用產品。
本發明的一個實例中涉及使用羧甲基甲氧聚乙二醇的N-羥基琥珀酰脂。正如下面將會更為詳細地講座的另一實施例涉及使用還原性烷基化反應方法。
獲取N-末端PEG化的G-CSF制品的方法(即，如有必要，把該部分從其它單個PEG化的部分中分離出來)可以經過從PEG化的G-CSF分子群體中純化N-末端PEG化的產物。例如，在下面的實施例中，PEG化的G-CSF首先通過離子交換色譜分離以獲得具有電荷特征的單個PEG化物質(可能存在含有相同的表觀電荷的其它多個PEG化的物質)，然后使用分子篩層析(size exclusion chromatography)分離單個PEG化的產品。通過這種方法，將N-末端單個PEG化的G-CSF從其它類型的單個PEG化的物質及其它多個PEG化的物質中分離出來。其它方法已見報道。例如，PCT WO 90/04606，(1990年5月3日公開)中報道了一種分離PEG-蛋白質加合物混合物的方法，其中包括用含PEG的水性兩相系統PEG/分離(partitioning)蛋白質加合物。
在另一方面，本發明還提供了選擇性獲得N-末端化學修飾蛋白質(或其類似物)的方法。下述為一種利用還原性烷基化反應進行蛋白質修飾的方法，它利用可獲得的一價氨基(primary amino group)(賴氨酸對N末端)的不同類型的特異性反應來進行特定蛋白質的修飾。在適當的反應條件下，成功地用帶有聚合物的羰基將蛋白質的N-末端進行了選擇性的修飾。在能夠利用賴氨酸殘基上ε-氨基和蛋白質N-末端α-氨基的pKa差異的pH下進行該反應。通過這種選擇性修飾，控制水溶性聚合物附著到蛋白質上聚合物的連接主要發生在蛋白質的N-末端，而其它反應基團(如賴氨酸殘基上的側鏈氨基)則沒有明顯的修飾發生。
更為重要而且令人驚奇的是，本發明提供了一種制備單聚體/蛋白質連接物分子的基本上均一的制品的方法，不需使用其它化學修飾化學方法所需的進一步純化。此外，具有胺鍵的產物出乎意料地比以酰胺鍵形成的產物更穩定。這一點將會在下面的詳細研究中得到證明。更具體地說，如果使用聚乙二醇，本發明還提供了沒有可能的抗原性連接基團，并具有直接偶聯到蛋白質部分的聚乙二醇部分而無毒副產品的N-末端PEG化的蛋白質。
反應可見下圖描述(圖中氰基硼氫鈉為舉例性還原劑) 因此，本發明的一方面內容是制備聚合物/蛋白質連接物的方法，包括(a)在還原性烷基化反應條件下，將含多于一個氨基的蛋白質分子與水溶性聚合物分子反應，反應液的pH應適于選擇激活所說蛋白質分子氨基末端的α-氨基，所以所述水溶性聚合物附著于所述α-氨基基團，以及；(b)獲取反應產物。可從任選從未反應的分子中分離反應產物，但對于治療用產品來說，這是優選的。
本發明的另一方面內容是這種還原性烷基化反應，它能夠將聚合物分子選擇性地附著到任意在N-末端具有α-氨基的蛋白質上，并提供了一種單聚體/蛋白質連接物的基本上均一的制品。這里所用的術語“單聚體/蛋白質連接物”意指由一個聚合物部分附著到一個蛋白質部分上組成的組合物(也包括本文所述的使用蛋白質類似物的那些連接物)。單聚體/蛋白質連接物具有位于N-末端而不是側鏈氨基上(如賴氨酸側鏈的氨基)的一個聚合物部分。制品優選含大于80％的單聚體/蛋白質連接物，更優選大于95％的單聚體/蛋白質連接物。
對于基本均一的單聚體/蛋白質連接物分子群體，其反應條件應是讓水溶性聚合物分子選擇性地附著到所需蛋白質的N一末端上。這種反應條件一般造成賴氨酸氨基與N-末端α-氨基的pKa差異(pK是指氨基質子化和非質子化各占50％時的pH)。一般來說，對于不同的蛋白質，可使用不同的pH以使N-末端α-氨基得到最佳修飾。
pH往往也會影響所用的聚合物分子與蛋白質分子的比例。一般來說，如果反應液pH低于pK，聚合物分子比例應大大超過蛋白質分子為宜(即N-末端的α-氨基反應性越少，達到最佳條件所需的聚合物越多)。如果pH高于pK，則聚合物蛋白質分子的比例不必要太大(即得到的反應基團越多，所需的聚合物分子越少)。
另一個需要考慮的重要條件是聚合物的分子量。一般來說，聚合物的分子量越大，結合到蛋白質上的聚合物分子數越少。同樣，在優化這些參數時，聚合物分子是否有分枝也應加以考慮。總之，聚合物分子量越高(或分枝越多)，聚合物蛋白質的比例亦應越高。
對于這個還原性烷基化反應，其還原劑在水溶液應該比較穩定，最好僅能還原在還原性烷化反應初始階段所形成的西佛堿(Schiffbase)。優選的還原劑可選自硼氫化鈉，氰基硼氫鈉，硼酸二甲胺，硼酸三甲胺以及硼酸吡啶。在下面實施例中使用的是氰基硼氫鈉。
水溶性聚合物分子可以是上面描述的類型，其分子中應具備單個反應醛基使其偶聯到蛋白質分子上。對于聚乙二醇，使用用于與G-CSF偶聯及PEG12000用于和共有干擾素偶聯在下面描述。值得一提的是對于G-CSF，本方法中，PEG 12000，20000及25000均被成功地使用過。聚乙二醇丙醛(見美國專利No.5,252,714)由于其在水中有較好的穩定性而具有一定優勢。
如上所述，本方法廣泛適用于具有N-末端α-氨基的任何蛋白質及其類似物。例如，由細菌表達外源性DNA而獲得的蛋白質產品，由于細菌表達的結果，其N-末端的甲硫氨酸(methionyl)殘基上帶有一個α-氨基。如上所述，包括肽在內，均是一些肽類似物及其它的修飾蛋白質。蛋白質類似物，如上所述的G-CSF類似物及非天然存在的共有干擾素均適用于此方法。
因此，對于該N-末端化學修飾的G-CSF，本文所述的任意G-CSF或其類似物均合用(例如，出處同上的文章所描述的那些)。下面實施例中所用的是細菌中產生的重組G-CSF，具有174個氨基酸殘基及一額外的甲硫氨基酸殘基。如本文所述，化學修飾可使用本文描述的任何水溶性聚合物分子進行，下面的實施例中使用的是聚乙二醇。
共有干擾素是本實施例中所用的另一種蛋白質。下面要描述的是用本發明中的還原性烷化的反應進行蛋白質N-末端的單個PEG化修飾，從而制備出化學修飾的共有干擾素。因此，本發明的另一方面涉及這些制品。正如本文所用的，共有人淋巴細胞干擾素在此稱為“共有干擾素”，或“IFN-con”，意即為一個非天然多肽，它主要包括所有天然人白細胞干擾素亞型序列共有的那些氨基酸殘基，而且它還包括在所有亞型無共同氨基酸的一個或多個位置上，主要發生于該位置一個氨基酸，并且在任何情況下，不包括在至少一個天然存在的亞型中不出現于該位置的任意氨基酸殘基。IFN-con包括三個氨基酸序列，分別命名為IFN-con1、IFN-con2及IFN-con3，它在共同擁有的美國專利4,695,623及4,897,471中公開，本文引用其全文以供參考。(美國專利Nos.4,897,471及4,695,623中使用“α”命名，而本文未用)。編碼IFN-con的DNA序列可按上述專利或其它標準方法進行合成。IFN-con多肽最好是通過轉化或轉染合成的DNA序列到細菌宿主中，尤其是E.coli表達產生。即IFNcon是重組IFN-con。以本領域的技術人員已知的方法和在Klein et al.，J.Chromatog.454205-215(1988)中描述的用于IFN-con1的方法可純化優選在E.coli中生產出的IFN-con。純化的IFN-con可能包括其異構體的混合物，如純化的IFN-con1中可能包含有甲硫酰IFN-con1，去甲硫氨酰IFN-con1及N-末端封閉的去甲硫氨酰IFN-con1(Klein et al.，Arc.Biochem.Biophys.276531-537(1990))。作為選擇，IFN-con可包括特異性分離的異構體，可用本領域技術人員已知的諸如等電點聚焦的技術來彼此分離IFN-con的異構形式。
因此，本發明的另一方面內容是化學修飾的共有干擾素，其中所說的共有干擾素是選自IFN-con1，IFN-con2，及IFN-con3。化學修飾時用本文所述的水溶性聚合物例如PEG，以及用于N-末端選擇性化學修飾的還原性烷基化方法。本文的實施例3中描述了IFN-con1的化學修飾，包含將IFN-con1分子在N-末端與聚乙二醇分子(PEG12000)相結合。
另一方面，本發明方法生產出的PEG化蛋白質是聚乙二醇部分直接與蛋白質部分相連接，沒有聯接基團存在，也不產生任何毒副產品。實施例中包括G-CSF及本文所述的共有干擾素。對于PEG化G-CSF蛋白質分子的群體，其中聚乙二醇部分是直接偶聯到G-CSF蛋白質部分上(但并不一定是N-末端PEG化的G-CSF分子的群體)，還原性烷基化反應可以在酸性或非酸性環境中進行。
本發明還有一方面是關于上述有關藥用組合物。這種藥用組合物可適于注射，或者是口服，作用于肺、鼻腔以及其它形式的施用。一般來說，包含于本發明中的藥用組合物包含有效量的本發明的單聚體/蛋白質連接物產物以及藥用上可接受的稀釋劑，保存劑，增溶劑，乳化劑，佐劑及/或載體。這類組合物中包括各種緩沖液組份(如Tris-HCl，醋酸鹽，磷酸鹽)，pH及離子強度的稀釋劑；添加劑諸如去污劑及增溶劑(如Tween 80，多聚山梨醇酯80)，抗氧化劑(如抗壞血酸，偏亞硫酸氫鈉)，保存劑(如水楊乙汞，苯甲醇)以及填充物質(如乳糖，甘露醇)；將這些物質摻入聚合物分子如聚乳酸(polylacticacid)，聚乙二醇酸等做成的顆粒狀制品中或摻入脂質體中。這些組合物可能會影響本發明的N-末端化學修飾的蛋白質的物理狀態穩定性，在體內的釋放速度及體內清除速度。例如參見Remington’s《藥物學》第18版。(1990，Mack出版公司.，Easton，PA18042)pp.1435-1712。本文引用以供參考。
本發明再有一個方面是涉及藥品的治療和生產方法。施用本發明生產的聚合物/G-CSF連接物(或具有天然G-CSF的促血細胞生成活性的類似物)來緩和或調理的癥狀的典型特征在于，造血或免疫功能的減退，而且更具體地說是中性粒細胞數的減少。這些癥狀也許是因為治療其它疾病過程中(例如化療或放療)引起的。這也可能是由于患感染性疾病，比如細菌、病毒、真菌或其它一些感染疾病。例如，由于細菌感染所致敗血癥。或者，這種癥狀由遺傳或環境因素造成的，如嚴重慢性嗜中性粒細胞減少癥或白血病。年齡因素也很重要，在老年病學中，病人的嗜中性白細胞數目會減少或嗜中性白細胞活動性降低。一些這類癥狀見Filgrastim(r-met HuG-CSF)in clinical Practice，Morstyn，G.及T.M.Dexter編.，Marcel Dedder Inc.，N.Y.(1993)，pp.351。其它一些研究不多的可經過施用本發明的聚合體/G-CSF連接物來緩和和調節的癥狀還有血液中脂類(或膽固醇)的減少，一些心血管癥狀，因為G-CSF可誘導產生纖維蛋白溶酶原激活因子。截止目前，G-CSF(或類似物)在這些情況中的激活模式還不十分清楚。水溶性聚合物分子(如聚乙二醇)的添加，可給施用的病人帶來好處，因為生物活性的延緩滯留可允許每個療程的G-CSF注射次數更少。
一般來說，施用本發明生產的聚合物/共有干擾素可緩解和調理的癥狀是那些可應用干擾素的癥狀，包括細胞增殖紊亂，病毒感染及自體免疫紊亂，如綜合性血管硬化癥。參考McManus Balmer，DICP，“藥物治療年鑒”24761-767(1990)(具有生物活性的修飾因子在癌癥治療中的應用回顧。第一部分，干擾素)。用共有干擾素治療細胞增殖紊亂的方法及其組合物可參見1992年4月30日公開的PCT WO92/06707，本文引用以供參考。例如，肝炎(A、B、C、D、E型)可用本發明生產的PEG化共有干擾素分子來治療。在下面的實施例中證明在體外，化學修飾的共有干擾素活性為非化學修飾的共有干擾素的20％。
上述的各種分子，由于進行了進一步的研究，因而獲得了有關不同病人中不同的癥狀的治療時所用的合適劑量水平的資料。普通技術人員在考慮治療方案，病人年齡及健康狀況后，可確定合適的劑量。一般來說，對于注射或灌注劑量應在每千克體重0.01μg至100μg之間(只計算蛋白質部分的重量，沒有計算化學修飾部分的重量)。
下面的實施例將說明以上提及各方面。在實施例1中，通過N-末端PEG化的G-CSF與35賴氨酸或41賴氨酸(為met+174氨基酸G-CSF變體)單個PEG化的G-CSF相比較來證實前者的優點。實施例2中描述了在N-末端PEG化G-CSF過程中的還原性烷基化反應。本方法能夠制備N-末端PEG化G-CSF的基本均一的制品。實施例3中討論了在共有干擾素N-末端PEG化中的還原性烷基化反應。
實施例1A.重組人類met-G-CSF制備重組人類met-G-CSF(本文有時稱為“rh-G-CSF”或“r-met-hu-G-CSF”)按照Souza專利，美國專利No.，4,810,643(本文引用以供參考)的。方法合用的rhG-CSF是來自E.coli的重組表達產物其氨基酸序列(由DNA序列編碼)所示如下(SEQ.ID.NO.1和2)ATG ACT CCA TTA GGT CCT GCT TCT TCT CTG CCG CAA AGC TTT CTGM T P L G P A S S L P Q S F LCTG AAA TGT CTG GAA CAG GTT CGT AAA ATC CAG GGT GAC GGT GCTL K C L E Q V R K I Q G D G AGCA CTG CAA GAA AAA CTG TGC GCT ACT TAC AAA CTG TGC CAT CCGA L Q E K L C A T Y K L C H PGAA GAG CTG GTA CTG CTG GGT CAT TCT CTT GGG ATC CCG TGG GCTE E L V L L G H S L G I P W ACCG CTG TCT TCT TGT CCA TCT CAA GCT CTT CAG CTG GCT GGT TGTP L S S C P S Q A L Q L A G CCTG TCT CAA CTG CAT TCT GGT CTG TTC CTG TAT CAG GGT CTT CTGL S Q L H S G L F L Y Q G L LCAA GCT CTG GAA GGT ATC TCT CCG GAA CTG GGT CCG ACT CTG GACQ A L E G I S P E L G P T L DACT CTG CAG CTA GAT GTA GCT GAC TTT GCT ACT ACT ATT TGG CAAT L Q L D V A D F A T T I W QCAG ATG GAA GAG CTC GGT ATG GCA CCA GCT CTG CAA CCG ACT CAAQ M E E L G M A P A L Q P T QGGT GCT ATG CCG GCA TTC GCT TCT GCA TTC CAG CGT CGT GCA GGAG A M P A F A S A F Q R R A GGGT GTA CTG GTT GCT TCT CAT CTG CAA TCT TTC CTG GAA GTA TCTG V L V A S H L Q S F L E V STAC CGT GTT CTG CGT CAT CTG GCT CAG CCG TAA TAGY R V L R H L A Q P * *(這也是用于對照動物的非PEG化的組合物)。作為選擇，也可選用市場上的Neupogen進行下面的PEG化反應(本文引用其包裝說明書以供參考)。
B.PEG化的G-CSF的制備100mM pH 8.0的N-二羥乙基甘氨酸，內含10mg/ml的上述rh-G-CSF的溶液，加入到平均分子量為6000道爾頓的固態SCM-MPEG中(羧甲氧聚乙二醇N-羥琥珀酰酯)(Union Carbide)。這里的SCM-MPEG要比rh-G-CSF多1.5摩爾。輕輕攪動1小時后，混合物以無菌水稀釋至2mg/ml，pH以稀鹽酸調至4.0。反應在室溫下進行。此時反應混合物主要由三種形式的單個PEG化rh-G-CSF，一些雙PEG化的rh-G-CSF和未修飾的rh-G-CSG及反應副產品(N-羥琥珀酰亞胺)組成。
C.N-末端PEG化rh-G-CSF的制備三種形式的單個PEG化的rh-G-CSF可用離子交換色譜加以分離。反應混合物上樣于(1mg蛋白質每毫升樹脂)Pharmacza SSepharose FF柱(Pharmacia XK50/30庫，柱床體積440ml)，以緩沖液A(20mM的醋酸鈉，pH 4.0)加以平衡。然后以3倍于柱床體積的緩沖液A清洗。蛋白質樣品用15倍于柱床體積的緩沖液B(20mM醋酸鈉，pH 4.0，1M NaCl)，其濃度梯度從0～23％進行線形梯度洗脫。洗脫后柱床以等體積100％的緩沖液B加以清洗再以3體積的緩沖液A重新平衡。整個過程的流速應維持在8ml/min。洗脫液在280nm處加以監測，以5ml每管分部收集。按照圖1A合并含各單PEG化rh-G-CSF種類的餾分。將這些合并物用帶YM10 76mm膜350mL Amicon攪拌室(stirred cell)濃縮。
將來自離子交換色譜的合并液進行分子篩層析，以使雙PEG化的蛋白質產物從單PEG化的蛋白質得以分離。大多數情況下，2-5ml溶液中含5-10mg樣品的混合物上柱，柱為120ml Pharmaeia Superdex75HR 16/60，以20mM的pH 4.0的醋酸鈉將柱平衡。以1,5ml/min流速洗脫100分鐘。以2ml每管分部收集。洗脫液中蛋白質含量在280nm處加在監測。合并不同峰的餾分并進行下一步的分析。下表中比較每個峰處產量的相對比例。
表1相對產量和修飾位點修飾位點 參考圖1A 相對產量N-末端峰1A 3Lys-35峰2A 2Lys-41峰3A 1在這種反應條件下，17及24位的賴氨酸可能不會發生明顯的PEG化反應。
D.特征描述為了鑒定每個樣品的特征，從五個方面加以分析(1)SDS-Page(圖1B)，(2)分子篩層析HPLC(“SEC HPLC”)(圖2)，(3)肽(酶切)分離圖譜分析(圖3A、3B及3C)，(4)在體外對G-CSF生物活性的測試(圖4)及(5)在體內(倉鼠體內)對其生物活性的測試(圖5A及5B)。
對于每個樣品組合物，結果顯示，對于N-末端單個PEG化G-CSF來說，樣品中被PEG化的比例已超過95％，余下的也許是未PEG化的物質(盡管樣品中余下的低于試驗檢測極限)。至于三種形式單個PEG化產物(N-末端、賴氨酸41和賴氨酸35)的各自百分含量，結果顯示，N-末端及賴氨酸41PEG化產物已超過單個PEG化總產物的97％，PEG化的賴氨酸35產率較低，可能是由于其在被測試條件中不穩定造成的。
表2N-末端PEG化G-CSF組合物的百分比非還性SDS PAGE SEC HPLD N-末端測序*單個PEG化的G-CSF 97.4499.43 96.6未修飾的G-CSF 2.56 0.57 3.4*下面討論的N-末端測序在此不能認為是定量試驗，因為在進行N-末端測序時，可能會造成聚乙二醇分子從蛋白質分子N-末端脫落下來。
表3三種形式的單個PEG化產物百分比N-末端PEG- Lys 35 PEG-Lys41 PEG-GSCF GSCF** GSCF(RI/UV＝.96)*(RI/UV＝.72) (RI/UV＝1.12)非還原性97.4477.41 100.00SDS-PAGESEC HPLC99.4393.38 99.96*RI/UV為折射光與紫外光吸收比例的指數，其主要用來估計每個蛋白質分子中含有聚乙二醇的分子數。應用聚乙二醇分子的折射和反映蛋白質分子的紫外光吸收的指數，從SEC HPLC數據計算。
**這種形式G-CSF在測試條件下不穩定。
方法1.SDS-PAGE.SDS-PAGE使用的是ISS Daiichi PureChemicals，Co.，Tokyo，Japan生產的非還原性4～20％的微膠，并以考馬斯亮藍染色。凝膠以分子動態顯像密度計(molecularDynamics Densitometer with Image Quant)加以掃描。結果如圖1B所示。1號泳道(左手一邊為一標準分子量蛋白(Novex Mork 12分子量標準品)。2道為3μg rh-G-CSF標準；3道為上樣10μgSCM-PEG-GCSF反應混合物電泳結果；4道內加的是10μg N-末端單個PEG化的G-CSF；5道內為10μg從N-末端met數起，第35位賴氨酸殘基單個PEG化的G-CSF；6道為10g從N端甲硫氨酸起第41位賴氨酸單個PEG化的G-CSF。從圖可以看出，3道中含有N-末端單個PEG化產物，并顯示出單條帶。
2.分子篩層析-高壓液相色譜SEC-HPLC使用的是Biosep SEC 3000柱，在水相HPLC系統中進行的，并使用100mM磷酸鈉，在pH 6.9條件下，以1ml/min流速洗脫20min。監測280nm處的信號。結果如圖2所示，線“C”，因為只含N-末端單個PEG化的rh-G-CSF，故只有一個峰，線“D”(賴氨酸35單個PEG化產物)和“E”(賴氨酸41單個PEG化產物)情況相同。這也顯示單個PEG化G-CSF在不同收集管中是基本上純的。
3.肽酶切分離圖譜。使用下述方法，對三種樣品(稱為“Mono-PEG-1”、“Mono-PEG-2”及Mono-PEG-3“)加以分析。(a)還原性烷基化反應。500μg的單個PEG化G-CSF等分樣品進行快速真空干燥，將其在含6M鹽酸胍及1mM EDTA的0.3M Tris-HCl中配制成1mg/950μl濃度，緩沖液pH 8.4。樣品中加碘乙酸進行S-羧甲基化，并在37℃孵育反應20分鐘。樣品然后用Sephadex G-25快速旋轉蛋白分離柱(Quick Spin Protein Columns)進行脫鹽處理，后更換緩沖液。經脫鹽和更換緩沖液后，樣品濃度用增加的緩沖液將其稀釋至0.5mg/ml。(b)蛋白質內切酶SV8消化。樣品以SV8(酶與底物比為1∶25)在25℃消化處理26小時。(c)HPLC肽酶切分離圖譜。消化后的蛋白質裝入Vydac C4柱(4.6×250mm，顆粒直徑5μ，孔徑300)，以0.1％TFA中乙腈的線性梯度進行洗脫，經HPLC作肽圖。肽段人工收集后置快速真空干燥器(Speed Vac)中將其干燥后以備測序之用。結果與對照標準樣相比，(i)(圖3A)為“Mono-PEG-1”(即N-末端單個PEG化產物)，57.3分鐘時峰值減小而在77.5分鐘時出現一新峰；(ii)(圖3B)為“Mono-PEG-2”，(賴氨酸35PEG化產物)，在30.3分鐘時峰的高度有所下降并在66.3分鐘時出現一新的洗脫峰；(iii)(圖3C)為“Mono-PEG-3”(賴氨酸41 PEG化產物)，30.3分鐘時的峰消失，而在66.4分鐘時出現一新的洗脫峰。這些肽段在分離圖譜中都顯示出顯著的差異。從圖還可以看出由于微小的消化差異在86.1分鐘肽的兩側出現一些小的不完全裂解物。(d)N-末端測序分析。上面圖譜中每個“新”肽段都要經過N-末端序列分析來鑒定。干燥后的肽段溶于0.1％TFA，在ABI蛋白質測序儀中進行測序。對于“Mono-PEG-1”(N-末端PEG化產物)，60％的“新”峰產物(77.5分鐘時)進行了10個循環的測序。起始得率5％，這意味著N-末端的甲硫氨酸殘基被聚乙二醇分子。封閉。必須注意到，象這種起始肽應該引起O起始得率，這里的小于5％值可能是由于在測序分析過程中造成聚乙二醇分子從N-末端甲硫氨酸上脫落下來所致。N-末端肽段序列測定結果為M-T-P-L-G-P-A-S-S。對于“Mono-PEG-2”(賴氨酸35PEG化產物)，收集了66.3分鐘處峰值總體積的80％，并對其進行9輪循環測序。賴氨酸35的回收率相當低，意味著PEG化發生在35位賴氨酸上。而41位的賴氨酸回收率與其它氨基酸殘基一樣，說明該殘基未發生修飾。肽在30.3分鐘處的峰高比相應標準參照圖要低，肽在30.3分鐘處的峰面積只為相應肽的57.5％，對其序列測定結果為K-L-C-A-T-Y-K-L。對于“Mono-PEG-3”(賴氨酸41PEG化產物)，對于在66.4分鐘洗脫的肽收集了峰總體積80％的樣品，并對其進行9個循環的測序，檢測的序列為K-L-C-A-T-Y-K-L，其中含35和41賴氨酸殘基。35位賴氨酸的回收率與其它殘基回收率一致，41位的賴氨酸的回收率相當低，意味著PEG化在該處發生。結果“Mono-PEG-1”為N-末端單個PEG化產物；“Mono-PEG-2”為35賴氨酸部分PEG化產物；“Mono-PEG-3”為41賴氨酸PEG化產物。通過比較對照標準樣(非PEG化G-CSF)和單個PEG化的G-CSF 1、2和3的圖譜，可以看出“Mono-PEG-2”(Lys 35)和“Mono-PEG-3”(Lys 41)二者圖譜N-末端肽峰高都略微有所下降。這說明賴氨酸35和賴氨酸41的產物中均混雜有少量的N-末端PEG產物，或者N-末端的甲硫氨酸有少部分被PEG化。
4.體外活性。該物質有活性。圖4顯示的為體外分析結果。從圖可以看出，N-末端單個PEG化產物具有未修飾的rhG-CSF活性的68％。方法G-CSF體外生物測定是合用鼠32D細胞G-CSF依賴性克隆的促有絲分裂試驗。細胞以含5％FBS和20ng/ml rhG-CSF的Iscoves培養基進行培養。在加樣品之前，細胞用不含rhG-CSF的生長培養基沖洗2次。以48至0.5ng/ml濃度范圍(相當于4800～50IU/ml)作12個點的rhG-CSF標準曲線。在標準曲線嘗試范圍內每份樣品制備估計落在標準曲線線型部分內(1000到3000IU/ml)的4種稀釋液，并以一式三份。由于這些樣品顯然在體外活性較低，PEG化rhG-CSF樣品一般稀釋不到4～10倍。每份40μl體積的樣品或標準樣稀釋液加到含10,000細胞/孔的96孔微滴度板的合適小孔中。在5.5％CO2，37℃培養48小時后，每孔加入0.5μmCi甲基-3H-胸腺嘧啶。18小時后，收獲平板細胞并計數，作出劑量反應曲線(logrhG-CSF濃度對CPM-背景)并對落在標準曲線線型部分范圍內的點進行線性回歸分析。用所得的線性方程及稀釋系數校正來測定未知試驗樣品的濃度。結果如圖4所示。從圖4可以看出，三種單個PEG化形式中，N-末端單個PEG化G-CSF在體外顯示最高生物活性。
5.體內活性。體內測定也證實了N-末端PEG化的G-CSF的活性。體內測定是給金黃地鼠皮下一次注射0.1mg/kg體重劑量的樣品而進行的。每組4只動物在每個時間點經尾部抽血。收集的血樣當天進行全血細胞計數，并計算出白細胞平均數目。從圖5A及5B可以看出，在皮下單次注射0.1mg/kg體重劑量樣品1天后出現作用高峰。兩種單個PEG化產物(N-末端及賴氨酸35)顯示出延長的反應，而對賴氨酸41PEG化的蛋白質的反應在體內并沒顯示出比未修飾的rhG-CSF活性增強(從圖5B可看出，其實活性還更差一些)。這些結果表明在蛋白質分子上附著聚乙二醇分子能顯著改變蛋白質的治療效果并且PEG化蛋白質的益處還取決于修飾位點。(單次皮下注射后曲線下的WBC凈平均面積(根據CRC標準數學表，26th Ed.(Beyer，W.H.，Ed.)CRC PressInc.，Boca Raton，FL 1981.p.125來計算)與Lys-35及N-末端單個PEG化產物一致)。
E.穩定性研究另外，對上面制備的N-末端及35賴氨酸單個PEG化G-CSF穩定性進行了研究。(41賴氨酸PEG化產物未被研究是因為已證實其沒有超出未修飾的G-CSF的額外活性)。研究表明N-末端PEG化的G-CSF在貯存時出人意料地要比單個PEG化的G-CSF的其它形式賴氨酸35單個PEG化產物更穩定。穩定性是以SEC-HPLC監測到產物裂解來測定的。方法N-末端PEG化G-CSF及賴氨酸35單個PEG化G-CSF研究在4℃2個pH條件下完成的，即pH 4.0和pH 6.0，每個周期16天。
將pH升至6.0是為了使穩定性研究得以更快地進行。pH 6.0時，上述所得的N-末端單個PEG化G-CSF和賴氨酸35單個PEG化G-CSF置于含20mM磷酸鈉、5mM醋酸鈉、2.5％甘露醇、0.005％Tween-80，pH為6.0的緩沖液中至蛋白質終濃度為0.25mg/m l。每毫升等份液貯于3ml無菌注射瓶中。每個注射瓶于4℃及29℃各保存16天。由SEC-HPLC繪圖來分析其穩定性。如果后來的測量結果與最初測量結果(時間＝0)保持一致(由肉眼觀察確定)，則樣品在那段時間內被認為是穩定的。
結果如圖6A-6C所示。
(a)4℃pH 6.0條件下比較。圖6A顯示pH 6.0，4℃條件下N-末端單個PEG化G-CSF經過一定時間段后的SEC-HPLC圖；圖6B所示為賴氨酸35單個PEG化G-CSF在pH 6.0，4℃條件下經過一定時間段后的SEC-HPLC圖。有一種解釋認為賴氨酸35PEG化產物的裂解物中，有的分子量正好與未修飾的G-CSF相近。
(b)pH 4.0，4℃條件下期限延長。pH 4.0，4℃條件下提供了的控制條件是一個相當穩定的條件，在該條件下N-末端PEG化G-CSF不降解。對于賴氨酸35PEG化產物，仍發生產物的降解，但其速率要緩慢得多。
(c)pH 4.0，4℃條件下的穩定性比較。圖6C顯示在這些條件下，延長時間期限時，G-CSSF的單個PEG化產物的SEC-HPLC圖。從圖可以看出，在pH 6.0，4℃條件下，PEG化的賴氨酸35在16天或35天時的去PEG水平增加不高于6天時所見水平(見圖6B)。這意味著去PEG化水平(不穩定性)有6天后，該條件下一直保持未變。
實施例2本實施例陳述了一種利用還原性烷基化反應來制備單個PEG化G-CSF的基本上均一的群體的方法，和該群體的特征鑒定。在此使用了上面實施例所述的重組G-CSF。可以看出，此方法不僅在制備N-末端化學修飾的蛋白質方面具有優越性，而且本還原性烷基化反應過程中的胺鍵產生實質上更穩定的產物，正如在貯存時聚集程度的較大差異所顯示的。
A.在N-末端α-氨基殘基上附著的單甲氧聚乙二醇-GCSF連接物的制備。
制備rhG-CSF反應溶液(1ml，濃度為5mg/ml，如上面實施例中所述)，內含100mM磷酸鈉，pH 5.0，還含有20mM NaCNBH3，將其充分攪拌冷凍(4℃)后，加入摩爾數超出5倍的甲氧聚乙二醇醛(MPEG)(平均分子量為6kDa)。反應混合物在相同溫度下持續攪拌。
反應過程中蛋白質的修飾程度用SEC-HPLC來對其監測，SEC-HPLC使用的是Bio-Sil SEC 250-5柱(BIO-RAD)，在pH 6.8條件下，用0.05M NaH2PO4，0.05M Na2HPO4，0.15M NaCl，0.01MNaN3，緩沖液以1ml/min流速進行洗脫。
10小時后SEC HPLC分析結果顯示，已有92％的蛋白質轉變成mono-MPEG-GCSF衍生物。這從圖7可以看出，其中記錄了蛋白質濃度(以在A280處的吸光率測得)，顯示了在8.72分鐘時出現的單個PEG化G-CSF產物的洗脫峰，在9.78分鐘出現的未發生反應的G-CSF的較小洗脫峰。
作為比較圖8顯示了用MPEG的N-羥琥珀酰脂所得的峰。其分子量也為6kDa。從圖可以看出，在反應混合物中有tri-MPEG-GCSF連接物(峰肩均在7.25分鐘)，di-MPEG-GCSF連接物(峰值在7.62min)，mono-MPEG-GCSF連接物(峰值在9.87min)。
在10小時時間點，92％的蛋白質已被轉化成單個PEG化產品，其反應混合物的pH以100mM HCl調至pH 4.0，并用1mM HCl將反應混合物稀釋5倍。
mono-MPEG-GCSF衍生物用離子交換色譜法合用以20mM的醋酸鈉緩沖液pH為4.0平衡的HiLoad 16/10 S Sepharose HP柱(Pharmacia)進行純化。反應混合物以1ml/min流速裝柱，未反應的MPEG以3倍于柱體積的相同緩沖液進行洗脫。然后進行400分鐘的線性梯度洗脫，20mM醋酸鈉濃度從0％-45％，pH 4.0，內含1M NaCl，在4℃洗脫蛋白質-聚合物連接物。
將含mono-MPEG-GCSF衍生物的收集管合并，濃縮和過濾滅菌。
用不同平均分子量(12、20和25kDa)的MPEG醛修飾rh-G-CSF而得到的各種形式mono-MPEG-GCSF連接物以相似方法制備。
B.單個PEG化G-CSF的分析1.分子量利用SDS-PAGE，凝膠過濾，基質輔助激光解析質譜分析(matrix assisted laser desorption)，以及平衡離心法測定單個PEG化連接物的分子量。結果如下表4所示。
表4
制備的N-末端mono-MPEG-GCSF連接物結構以N-末端蛋白質序列分析和肽酶切圖譜法加以證實。N-末端用硫氨酰殘基的溴化氰裂解導致聚乙二醇分子的除去。
2.生物活性PEG化MPEG-GCSF連接物的體外生物活性經過測定刺激鼠骨髓細胞對3H胸腺嘧啶的吸收來測定。
體內生物活性經過將MPEG-GCSF連接物或rhG-CSF(100mg/克體重劑量)皮下注射倉鼠后測量其總白細胞數目來測定。與未修飾的G-CSF相比，PEG化G-CSF生物活性的計算是以WB/時間曲線下面積減去載體對照曲線下面積而得到的。MPEG-GCSF衍生物的相對活性的表示是以其與未修飾的G-CSF相比的百分活性加以描述的。
如圖9所示，顯示了對用不同分子量(6kDa、12kDa及20kDa)的MPEG醛經還原性烷基反應而制得的mono-N-末端MPEG-GCSF連接物的總白細胞數目反應。從圖可以看出，所有單個PEG化產物均誘導反應。除了12kDa的PEG在第二天白細胞數目較20kDa PEG產物作用后白細胞數目稍大外，所用的聚乙二醇分子量越大，獲得的白細胞數目會越多。
3.穩定性研究比較了用兩種不同的化學方法(這里指胺及酰胺的還原性烷基化反應)制備的N-末端PEG化G-CSF的聚合程度。出乎意料的是，發現以胺鍵形成的N-末端PEG化G-CSF要比以酰胺鍵(實施例1中所述的NHS法)形成的N-末端PEG化G-CSF穩定得多。
方法兩種形式的N-末端PEG化G-CSF產物置于pH 4.0的10mMNaOac中，其中含5％的山梨醇，蛋白質分子終濃度為每ml溶液中含1mg蛋白質。G-CSF都用PEG6000PEG化。酰胺鍵連接物制備按實施例1，胺鍵連接物制備按實施例2進行。每種形式的6等份樣品在45℃保存8周。8周后，以分子篩層析及離子交換色譜測定聚集程度。
結果結果表明本發明的還原性烷基化反應產物要比乙酰化產物優越得多，因為，令人吃驚的是，在升高的溫度條件下產物經8周后，前者的聚集程度要比后者的要小得多。下表為兩種形式產物經分子篩層析(SEC)或離子交換色譜(IE)分析后各自未發生聚集的百分數表5樣本45℃下8周 ％主峰SEC/IE胺鍵產物 82％/84％酰胺鍵產物 37％/65％**該值相對較高是因為離子交換色譜不能夠進行聚集程度的徹底分析。
實施例3該實施例描述化學修飾的共有干擾素。更具體地說，該實施例描述了一種制備單個PEG化IFN-con1的基本上均一的群體的方法，及該群體的特征鑒定。
應該注意到，雖然本實施例中用的是IFN-con1，但上述的任一共有干擾素均可被化學修飾。盡管本實施例中使用了聚乙二醇進行修飾，但象這種化學修飾可用上述任一水溶性聚合物進行。對于PEG化作用，雖然本實施例中使用的是PEG12000，但其它任何形式的水溶性PEG均可使用(此處使用PEG12000是為了和易于處理和方便)。同樣，這里也有很多種化學修飾方法(諸如乙酰化反應)，但對于選擇性N-末端化學修飾(如N-末端PEG化反應)來說，最好還是用該實施例中所述的還原性化反應。
A.共有干擾素的制備干擾素IFN-αcon1(在這里指IFN-con1(可參見美國專利No.4,695,623圖2中的描述(引用其全文以供參考)它勝于制備單個PEG化共有干擾素。IFN-con1是在細菌中表達外源性DNA而產生的，其N-末端具有一個甲硫氨酰殘基。
B.共有干擾素的PEG化IFN-con1溶液(3.45mg/ml，含35.25％的N-末端封閉形式)溶于磷酸鈉濃度為100mM，pH 4.0內含20mM NaCNBH3的溶液中，4℃冷卻后充分混勻，加入超出8倍摩爾量的甲氧聚乙二醇醛(MPEG)(平均分子量為12kDa)。
在反應過程中蛋白質的修飾程度用反相HPLC來監測，HPLC以多聚(苯乙烯/二乙烯基苯)進行裝柱，如PLRP-S(PL SeperationSciences Polymer Labaratories)。
10小時后，反相HPLC分析結果表明，80％的N-末端具有未封閉的α氨基的蛋白質轉變成MPEG-IFN-con1衍生物。
在10小時時間點，反應混合物用水稀釋5倍，mono-MPEG-IFN-con1衍生物的純化用離子交換層析來完成，其所用的柱為Hiload16/10 S Sepharose HP柱(Pharmacia)，以20mM的醋酸鈉緩沖液pH 4.0加以平衡。反應混合物以1ml/min的流速裝入柱內，未反應的MPEG醛以3倍于柱體積的相同緩沖液加以洗脫。然后在4℃條件下進行蛋白質-聚合物連接物分子的洗脫，以0％～75％的20mM醋酸鈉緩沖液進行線性洗脫420分鐘。緩沖液pH為4.0，含有1M NaCl。
合并含mono-MPEG-IFN-con1衍生物的餾分，經濃縮后再過濾滅菌。
C.單個PEG化共有干擾素的分析1.均一性純化的mono-MPEG-IFN-con1連接物均一性通過SDS-PAGE加以檢測，SDS-PAGE用的是10-20％或4-20％的預制梯度膠(Integrated Separation System)。凝膠顯示主要帶在分子量為35kDa處。
各種形式mono-MPEG-IFN-con1的有效半徑(流體動力學半徑)測定用的是Superose 6HR 10/30(Pharmacia)凝膠過濾柱。在280nm處經紫外吸收測定蛋白質。BIO-RAD凝膠過濾標準品作為球狀蛋白質分子量標記。
純化的N-末端mono-MPEG-IFN-con1連接物結構采用N-末端蛋白質測序及肽酶切圖譜來加以證實。
在這里必須注意該IFN-con1制品中含有一些N-末端封閉物質，它們未發生PEG化。然而，PEG化的物質勻為N-末端單個PEG化。因而，在這種情況下，可考慮能用其它方法將末端封閉和未封閉的產物分開，如用離子交換層析或分子篩分析法。
2.生物活性mono-MPEG-IFN con1連接物體外生物活性是經過測定其抗病毒活性來測定的。mono-MPEG-IFN con1連接物的體外生物活性經過測定其在人(Hela)細胞中的抗病毒生物活性來確定。
發現mono-MPEG(12kDa)-IFN-con1連接物體外生物活性(U/mg蛋白質為未修飾IFN-con1活性的20％。正如前面所述的PEG化G-CSF，體外分析雖然對了解生物活性有一定作用，但由于特征性緩慢釋放，常測得的化學修飾蛋白質活性很低。體內生物活性要比體外高。
D.N-末端封閉分子去除后化學修飾的共有干擾素。
前面所述的IFN-con1經預先去除其中的N-末端封閉分子部分之后，也進行本發明的還原性烷基化反應。在上面所述的還原性烷基化反應。在上面所述的還原性烷基化方法中使用了PEG12000和PEG20000兩種分子。
該分子的表觀分子量如下連接物 凝膠過濾測得的SDS-PAG測得表觀分子量的表觀分子量monoMPEG(12kDa)104.0kDa 35.6kDaIFN-con1monoMPEG(20kDa)175.1kDa 55.4kDaIFN-con1IFN-con1 20kDa PEG連接物的FPLC離子交換色譜分析結果中出現3個峰MonoMPEG-IFN-con1占總面積的66％(洗脫至265.93ml)。
蛋白質聚集物(aggregate)及寡聚MPEG-IFN-con1連接物占總面積的24％(洗脫至238.42ml)以及未反應的IFN-con1占10％的總面積(洗脫至328.77ml)。
該條件尚未進一步優化，可用色譜或其它方法進一步分離單個PEG化的物質。
盡管用優選的實施例描述了本發明，但應明白對于本領域的技術人員而言可進行變動和修改。因此，在所附的權利要求書中試圖覆蓋所有落在所要求的本發明范圍內的等價變化。
序列表(1)一般信息(i)申請人AMGEN INC(ii)發明題目N-末端化學修飾的蛋白質組合物及方法。
(iii)序列個數2(iv)聯系地址(A)地址Amgen Inc.
(B)街道1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Daks(D)州California(E)國家USA(F)郵政區號91320(v)計算機可讀形式(A)貯存介質軟磁盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，#1.25.版(vi)當前的申請資料(A)申請號碼(B)申請日(C)分類(viii)代理人/代理信息(A)姓名Pessin，Karol M.
(B)參考/摘要號A-286(2)SEQ ID NOI信息(i)序列特征(A)長度531堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特征線形(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1
ATGACTCCAT TAGGTCCTGC TTCTTCTCTG CCGCAAAGCT TTCTGCTGAA ATGTCTGGAA 60CAGGTTCGTA AAATCCAGGG TGACGGTGCT GCACTGCAAG AAAAACTGTG CGCTACTTAC 120AAACTGTGCC ATCCGGAAGA GCTGGTACTG CTGGGTCATT CTCTTGGGAT CCCGTGGGCT 180CCGCTGTCTT CTTGTCCATC TCAAGCTCTT CAGCTGGCTG GTTGTCTGTC TCAACTGCAT 240TCTGGTCTGT TCCTGTATCA GGGTCTTCTG CAAGCTCTGG AAGGTATCTC TCCGGAACTG 300GGTCCGACTC TGGACACTCT GCAGCTAGAT GTAGCTGACT TTGCTACTAC TATTTGGCAA 360CAGATGGAAG AGCTCGGTAT GGCACCAGCT CTGCAACCGA CTCAAGGTGC TATGCCGGCA 420TTCGCTTCTG CATTCCAGCG TCGTGCAGGA GGTGTACTGG TTGCTTCTCA TCTGCAATCT 480TTCCTGGAAG TATCTTACCG TGTTCTGCGT CATCTGGCTC AGCCGTAATA G531(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度175氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特征線形(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu1 5 10 15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu20 25 30Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu35 40 45Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser50 55 60Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His65 70 75 80Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala100 105 110Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala115 120 125Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala130 135 140Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser145 150 155 160Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170 17權利要求
1.化學修飾的共有干擾素，由共有干擾素蛋白質部分連接到至少一個水溶性聚合物部分上組成。
2.權利要求1的化學修飾的共有干擾素，其中所說的共有干擾素部分選自IFN-con1、IFN-con2及IFN-con3。
3.權利要求2的化學修飾的共有干擾素，其中所說的水溶性聚合物是藥用上可接受的。
4.權利要求1的化學修飾的共有干擾素，其中所說的水溶性聚合物選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚體、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
5.根據權利要求4的化學修飾的共有干擾素，其中所說的水溶性聚合物部分是聚乙二醇。
6.根據權利要求1的化學修飾的共有干擾素，其中所說的水溶性聚合物部分不用另外的連接基團直接連接到所說的共有干擾素部分上。
7.一種化學修飾的共有干擾素由IFN-con1連接到至少一個聚乙二醇部分上組成。
8.PEG化的共有干擾素。
9.一種向共有干擾素上附著水溶性聚合物的方法，其中所說的水溶性聚合物具有單個反應醛基，所說的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在足夠酸性以選擇性激活所說的共有干擾素部分氨基末端α-氨基基團的pH值下，使共有干擾素部分與水溶性多聚體部分反應；(b)獲得反應產物和(c)可任選地從未發生反應的部分中分離反應產物。
10.權利要求9的方法，其中所說的聚合物是藥用上可接受的。
11.權利要求9的方法，其中所說的水溶性聚合物選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚體、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
12.權利要求11的方法，其中所說的聚合物為聚乙二醇。
13.權利要求9的方法，其中所說的還原性烷基化反應涉及使用選自硼氫化鈉、氰基硼氫鈉、硼酸二甲胺、硼酸三甲胺及硼酸吡啶的還原劑。
14.一種向共有干擾素分子上附著聚乙二醇分子的方法，其中所說的聚乙二醇分子具有單個反應醛基，所說的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在足夠酸性以選擇性激活所說的共有干擾素末端α-氨基基團的pH值下，使所說的共有干擾素與所說的聚乙二醇分子反應；(b)獲得PEG化的共有干擾素和(c)可任選地從未發生PEG化的共有干擾素中分離出PEG化的共有干擾素。
15.權利要求14的方法，其中所說的聚乙二醇分子具有大約2kDa到大約100kDa的分子量。
16.以權利要求14的方法所生產的PEG化共有干擾素產品。
17.單個PEG化的共有干擾素的基本均一的制品。
18.權利要求17的制品，包括大約90％單個PEG化的共有干擾素及大約10％的未PEG化的共有干擾素。
19.一種藥用組合物，包括(a)單個PEG化的共有干擾素的基本上均一的制品，所說的單個PEG化的共有干擾素由一個聚乙二醇部分連接到共有干擾素部分上組成，該連接通過胺鍵并僅在其N末端；(b)少于5％的未PEG化的共有干擾素分子；和(c)一種藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
全文摘要
本文提供了涉及給蛋白質附著水溶性多聚物的方法及組合物。提供了用于N端修飾蛋白質或其類似物的新方法及新得的組合物，包括新N端化學修飾的G－CSF組合物和相關制備方法。提供了化學修飾的共有干擾素。
文檔編號C07K1/107GK1896103SQ200510113768
公開日2007年1月17日 申請日期1995年2月8日 優先權日1994年10月12日
發明者O·B·金斯勒, N·E·加布里爾, C·E·發拉, R·B·迪普林斯 申請人:安姆根有限公司