專利名稱：制備單克隆抗體的方法
技術領域：
本發明屬于免疫學和基因工程領域。具體而言，本發明提供一種新的制備單克隆抗體的方法，該方法包括用能夠表達特定抗原的重組腺病毒對動物進行免疫，由該動物獲得產生抗該抗原的抗體的細胞以制備雜交瘤，由雜交瘤獲得單克隆抗體。
背景技術：
長期以來，人們制備的特異性免疫血清抗體，不論是從人還是從動物獲得的，也不論是主動免疫獲得的還是被動免疫獲得的，都是由許多B淋巴細胞克隆所產生的非均質性抗體，也稱多克隆抗體，它們實際上都是由許多種具有不同特性的抗體所組成的混合抗體。
1975年8月7日，英國劍橋大學分子生物學研究室的Kohler和Milstein發表了“分泌預定特異性抗體的融合細胞的持續培養”這一著名論文[參見Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature，1975，256(5517)495-7]，從而創立了具有劃時代意義的新技術——利用B淋巴細胞雜交瘤產生單克隆抗體。這一技術的創立和迅速推廣，為所有需要制備和使用抗體的研究領域提供了全新的手段和制劑，促進了細胞生物學、免疫學、遺傳學、微生物學、生物化學及基礎與臨床醫學等眾多學科的發展。它和遺傳工程技術一樣，被認為是具有巨大生命力和發展前途的新技術，Kohler和Milstein也由于這一杰出貢獻而榮獲1984年諾貝爾醫學和生理學獎。
與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有以下顯著特點(1)高度均一性單克隆抗體是由起始于一個B淋巴細胞的單克隆系所分泌，因此是每一個抗體分子的結構都相同的均一抗體；(2)高度特異性單克隆抗體只專一地針對抗原分子上單個抗原決定簇起反應，一般不會發生交叉反應；(3)來源穩定，可大量生產當得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系后，可以通過體外培養的方法制備單克隆抗體，也可以將雜交瘤細胞注入同系小鼠腹腔內，然后從荷瘤小鼠的腹水中收獲大量單克隆抗體。
由于單克隆抗體具有上述優點，大大推動了對生物活性物質在分子水平上的研究，如對微生物的分子流行病學調查、快速診斷、抗原物質和致病因子的分析、以及對傳染病的預防和治療等方面，都提供了強有力的手段。
但是單克隆抗體的制備一般至少歷時幾個月，涉及到很多實驗環節，并且受很多因素的影響。在諸多的影響因素中，抗原的制備、動物免疫及免疫方法等是能否獲得雜交瘤及其特異性單克隆抗體的先決因素。在制備單克隆抗體的過程中，一般所用的抗原多為可溶性的蛋白質抗原，有時用細菌、病毒等顆粒性抗原，也可用細胞或組織抗原。用蛋白質作為免疫用抗原時，往往存在制備時間較長、純化方法繁瑣等缺點。有很多蛋白在細胞或組織中含量很低，難以純化獲得，給免疫和篩選帶來困難。而直接用細菌或病毒作為免疫用抗原時，可能存在下列問題(1)有些微生物為致病性微生物，如SARS病毒，具有較強的感染性，在生物安全上存在一定問題；(2)有的細菌或病毒本身表達抗原水平較低，免疫動物后往往不易獲得良好的免疫效果，這也是單克隆抗體技術工作中經常遇到的極為棘手的問題。
發明內容
因此，本發明提供一種新的制備單克隆抗體的方法，該方法包括用能夠表達特定抗原的重組腺病毒對動物進行免疫，由該動物獲得產生抗該抗原的抗體的細胞以制備雜交瘤，由雜交瘤獲得單克隆抗體。
在本發明的方法中，重組腺病毒粒子中可以添加常規佐劑，或者不添加佐劑，直接以病毒粒子進行免疫。免疫途徑可以是任何常規的免疫方式，優選的免疫途徑是經鼻或者口服。
本發明的方法中，所述抗原可以是任何由重組腺病毒可以表達的抗原形式。在本發明的具體實施方案中，所述抗原是一種蛋白。更具體而言，所述蛋白是GGII1、GGII3、GGII4或GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白或其混合物。
在優選實施方案中，本發明方法中使用的重組腺病毒為rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C或rvAdGGII7C。
本發明方法中，所述表達特定抗原的重組腺病毒是通過將外源基因插入腺病毒載體制備得到的。所述插入外源基因的重組腺病毒最好經過擴增和純化后再用于免疫動物。腺病毒擴增和純化可以采用本領域技術人員熟知的常規手段進行。
為了方便地獲得單克隆抗體，可以將本發明中獲得的產生單克隆抗體的雜交瘤接種到動物體內.由荷瘤動物腹水獲得單克隆抗體。
在本發明的具體實施方案中，所述動物為小鼠，所述產生抗體的細胞為脾細胞。
本發明用表達特定抗原的重組腺病毒免疫動物，可成功制備針對所述抗原的單克隆抗體，與傳統的制備單克隆抗體的方法相比，整個過程可縮短3～5倍。
圖1重組腺病毒及病毒樣顆粒分別免疫小鼠后抗體產生的抗體滴度比較。
圖2單克隆抗體的特異性-Western-blot鑒定結果。
(A.V1E3雜交瘤細胞株分泌抗體的特異性1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；B.V1E9雜交瘤細胞株分泌抗體的特異性1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；C.V1D6雜交瘤細胞株分泌抗體的特異性1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；D.V6D6雜交瘤細胞株分泌抗體的特異性1.rvBacFB1；2.rvBacGGII7C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII3C；5.rvBacGGII1C)圖3V1E3雜交瘤細胞株與GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白反應的免疫熒光結果(A.rvBacGGII4C；B.rvBacFB1；C.Sf9細胞)。
圖4V1E9雜交瘤細胞株與GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白反應的免疫熒光結果(A.rvBacGGII4C；B.rvBacFB1；C.Sf9細胞)。
圖5V1D6雜交瘤細胞株與GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白反應的免疫熒光結果(A.rvBacGGII1C；B.rvBacGGII3C；C.rvBacGGII4C；D.rvBacGGII7C；E.rvBacFB1；F.Sf9細胞)。
圖6V6D6雜交瘤細胞株與GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白反應的免疫熒光結果(A.rvBacGGII1C；B.rvBacGGII3C；C.rvBacGGII4C；D.rvBacGGII7C；E.rvBacFB1；F.Sf9細胞)。
具體實施例方式
腺病毒(Ad)載體是目前被廣泛應用的一種載體，已發現人類腺病毒有50多個血清型，其中分子生物學特性研究得最為詳細的是2型和5型，大多數腺病毒載體就是以Ad5為基礎構建的。腺病毒具有眾多優點(1)作為真核基因調控研究的模式系統之一，人類對腺病毒在分子水平已有相當的認識；(2)腺病毒有中等大小的基因組，適合于用最少的病毒序列構建高容量的載體，同時也易于進行重組基因技術操作；(3)腺病毒可感染的宿主細胞范圍廣泛，包括成纖維、上皮、內皮、基質細胞等；(4)外源基因表達量高；(5)安全、可靠；(6)病毒滴度高，容易培養純化，生產成本較低；(7)病毒基因組存在于細胞染色體外，避免了因整合引起的基因突變。由于腺病毒載體具有上述特點，使其在基因疫苗、基因治療及蛋白功能等的研究中受到人們的青睞，成為當今使用最多的病毒載體之一。
在本發明中，用表達目的蛋白的重組腺病毒作為免疫原免疫小鼠，是基于以下原因(1)抗原制備快，操作安全。用腺病毒載體把一個目的蛋白基因包裝成重組腺病毒，用于免疫動物，大約需2周時間。而傳統的方法制備單克隆抗體時是用基因工程生產蛋白或細胞或微生物作為免疫原，或者費時費力，或者存在安全風險。例如用原核表達系統表達蛋白，首先把基因克隆到原核表達載體上，進行誘導表達，再根據表達蛋白的性質對其進行純化，欲獲得純化的蛋白，常常需要數周乃至數月的時間。采用微生物作為免疫原時，需要大量培養和純化該微生物。但是，對于高致病性細菌、病毒等微生物，如SARS病毒、埃博拉病毒等，通過大量培養、純化獲得抗原存在實驗室感染的風險，需要生物安全3級或4級實驗室，一般單位難以具備，而腺病毒通常在生物安全2級實驗室就可以操作，容易實現。
(2)抗原純化方法簡單。以重組腺病毒作為抗原，只需擴增病毒后進行超速離心這一步驟即可達到純化目的；而用蛋白作為抗原時，純化步驟繁瑣，需經過離子交換、親和層析、凝膠過濾和疏水相互作用等一系列純化步驟，才可以獲得純化的抗原。
(3)重組腺病毒滴度高。我們制備的重組腺病毒滴度可達108～109以上，免疫時抗原用量少，只需100μl左右病毒液。而用蛋白或病毒(細菌)作為免疫原，首次免疫即需100μg左右的純化蛋白或病毒，這使得在制備抗原時工作量加大。
(4)重組腺病毒作為免疫原時不需要佐劑，免疫方式簡單。重組腺病毒抗原為顆粒性抗原，免疫動物時不需要添加佐劑，可以直接進行經鼻或口服免疫。而用蛋白或病毒(細菌)抗原作為抗原免疫動物時，需要添加佐劑以增加其抗原性，再進行免疫，一般通過皮下注射、腹腔注射等途徑。用細胞抗原則免疫原性較弱。
目前已知杯狀病毒科主要分為4個屬Lagovirus，Vesivirus，Norovirus(諾如病毒)和Sapovirus(札如病毒)，后兩種屬于人類杯狀病毒[參見Green KY，et al.The role of human caliciviruses in epidemicgastroenteritis.Arch.Virol.Suppl.1997，13153-165；Green KY，et al.Taxonomy of the caliciviruses.J.Infect.Dis.2000，181(Suppl.2)S322-S330.]，其中，諾如病毒有3個遺傳組(GG)GGI，GGII和GGIII，札如病毒有4個遺傳組SGI，SGII，SGIII和SGIV，但只有GGI、GGII組諾如病毒和SGI、SGII、SGIV組札如病毒感染人類(參見Katayama K，et al.Phylogenetic analysis of the complete genome of 18Norwalk-like viruses.Virology.2002，299225-239；Okada M，et al.Molecular epidemiology and phylogenetic analysis of Sapporo-like viruses.2002，Arch.Virol.1471445-1451.)。近來的研究表明，GGI、GGII型諾如病毒分別有14和17個遺傳型(參見Kageyama T，et al.Coexistenceof multiple genotypes，including newly identified genotypes，in outbreak ofgastroenteritis due to norovirus in Japan.J.Clin.Microbiol.2004，422988-2995.)。
杯狀病毒為單股正鏈RNA病毒，無包膜，直徑約27～40nm，基因組約為7.4～8.3kb，由3個開放讀碼框架(ORF)組成。ORF1編碼非結構蛋白，包括螺旋酶、3CL蛋白酶和RNA多聚酶蛋白，ORF2和ORF3編碼結構蛋白，其中ORF2編碼一個主要結構蛋白——衣殼蛋白，ORF3編碼與衣殼蛋白相關的一個小蛋白，可能與起始基因組的殼體化有關。由于目前缺乏有效的細胞培養系統，通過基因工程方法制備病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)是目前杯狀病毒抗原制備的主要方法。單克隆抗體捕捉糞便中的病毒抗原是目前杯狀病毒檢測的主要方法。
衣殼蛋白是杯狀病毒的主要結構蛋白，其中GGII1型諾如病毒衣殼蛋白基因全長1608個核苷酸，編碼535個氨基酸，GGII3型Noro病毒衣殼蛋白基因全長1647個核苷酸，編碼548個氨基酸，GGII4型諾如病毒衣殼蛋白基因全長1620個核苷酸，編碼539個氨基酸，GGII7型諾如病毒衣殼蛋白基因全長1623個核苷酸，編碼540個氨基酸，這一結構蛋白包含杯狀病毒生命所需的多種功能，如結構整合、感染性、病毒和細胞的相互作用及其免疫原性等。
在本發明中，發明人利用表達人杯狀病毒衣殼蛋白的重組腺病毒免疫小鼠制備了抗衣殼蛋白的單克隆抗體。但是，本領域技術人員可以理解，本發明可用于針對任何抗原的單克隆抗體的制備。
在本發明中，術語“單克隆抗體的特異性”是指單克隆抗體識別抗原上的特定表位或抗原決定簇并與之結合的性質。
術語“單克隆抗體的反應性”是指在適宜的反應條件下，單克隆抗體與抗原結合的能力。
術語“細胞株”是指通過選擇或克隆法，從原代培養物或細胞系所獲得的單細胞來源的培養物。
為了更清楚地理解本發明的實質，下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例是示例性的，僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，通常按照常規條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(Sambrook，et al.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。
實施例本實施例的內容是用表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的重組腺病毒作為混合抗原免疫小鼠，取脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，用分別表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的昆蟲細胞裂解液作為篩選抗原，成功快速地制備了針對杯狀病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。
1、表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的重組腺病毒的制備(1)重組腺病毒載體的構建用限制性內切酶BglII和XhoI雙酶切穿梭質粒pShuttle-CMV(美國Stratagen公司)pShuttle-CMV 10μl，BamH I和XhoI各1μl，10×緩沖液2μl，H2O 6μl。37℃孵育2h，用TAKARA公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收載體片段。
用BamHI和XhoI分別雙酶切含有衣殼蛋白基因的質粒pUC57/GGII1C、pUC57/GGII3C、pUC57/GGII4C、pUC57/GGII7C，反應體系為質粒20μl，BamHI和XhoI各1.5μl，10×緩沖液5μl，H2O22μl。37℃孵育2h，用TAKARA公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。
Bgl II和BamH I為同尾酶，可以直接建立連接體系，酶切產物pShuttle-CMV分別與GGII1C、GGII3C、GGII4C、GGII7C進行連接反應載體片段pShuttle-CMV 0.5μl，目的片段GGII1C、GGII3C、GGII4C、GGII7C各3μl，連接緩沖液2ul；T4DNA連接酶(TAKARA公司產品)1μl；H2O 13.5μl，12℃連接16h。取10μl連接產物轉化E.coli DH10B感受態細胞。挑取卡那霉素(K+)抗性克隆，用含K+的LB培養液培養12～16h后，以堿裂解法小量制備質粒，用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，得到重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV/GGII1C、pShuttle-CMV/GGII3C、pShuttle-CMV/GGII4C和pShuttle-CMV/GGII7C。
(2)重組腺病毒的獲得對于上述克隆有外源基因的重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV/GGII1C、pShuttle-CMV/GGII3C、pShuttle-CMV/GGII4C和pShuttle-CMV/GGII7C，分別取約500ng重組穿梭質粒，分別用Pme I(美國New England Biolabs公司)單酶切以線性化，無水乙醇沉淀，溶于6μl ddH2O中備用。
用線性化的重組穿梭質粒與約100ng pAdEasy-1腺病毒骨架質粒(美國Stratagen公司)共同電轉化E.coli BJ5183(美國Stratagen公司)感受態細胞(參見He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14)，取細菌懸液涂于含50μg/ml卡那霉素的LB培養板中，于37℃培養16～20h，挑選10～20個較小的菌落，接種于3ml含有卡那霉素(25μg/ml)的SOC培養液內，置37℃搖床，培養12～16h，堿裂解法小量提取質粒DNA，獲得了重組腺病毒質粒pAdEasyGGII1C、pAdEasyGGII3C、pAdEasyGGII4C和pAdEasyGGII7C，用0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析后，用Pac I(美國New EnglandBiolabs公司)酶切進一步鑒定，可產生4.5Kb左右的片段。將所得的重組腺病毒質粒轉化以氯化鈣法制備的宿主菌DH10B(rec A1，end A1)(美國Invitrogen公司)感受態細胞，在此宿主菌中可產生高拷貝數的質粒，挑取目的克隆，經BamH I和Pac I酶切鑒定后，-70℃保存備用。
用QIAGEN Plasmid Midi Kit(德國Qiagen公司)提取重組腺病毒質粒，用Pac I酶切后，無水乙醇沉淀回收目的DNA片段，溶于無菌去離子水中。在轉染前24h將293細胞(美國Invitrogen公司)接種于T-12.5細胞培養瓶(美國BD公司)中，轉染時細胞的豐度為50％～70％。將Pac I酶切線性化后的20μl重組腺病毒DNA及3μl的Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)分別與100μl M液[無抗生素、無血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培養液(美國Invitrogen公司)]充分混勻，室溫孵育15min，混合兩種懸液室溫繼續作用30min。在上述等待的時間里，移去293細胞的原培養液，用2ml M液洗細胞2次。補加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的復合物中，輕輕混勻后加至洗滌過的293細胞上，37℃，5％CO2孵育5h，移去含DNA/脂質體復合物的培養液，補加含10％新生牛血清(美國Hyclone公司)的DMEM完全培養液，繼續培養，第二天換為含2％新生牛血清的維持液，繼續培養。在轉染后6～7d，細胞出現腫脹、變圓等細胞病變(CPE)。收集細胞與上清液一起-70℃、37℃反復凍融3次，取適量的凍融液接種293細胞，用含2％新生牛血清的DMEM培養液于37℃、5％CO2培養箱中培養，觀察細胞病變，按上述方法收病毒傳代一次。獲得的重組腺病毒命名為rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C和rvAdGGII7C。
2、表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白重組桿狀病毒的制備(1)桿狀病毒表達載體的構建用EcoR I和Xho I(TAKARA公司)雙酶切桿狀病毒表達載體pFastBac 1(美國Invitrogen公司，以下簡稱pFB 1)，體系為pFB1 10μl，EcoR I和XhoI各1μl，10×緩沖液2μl，H2O 6μl。37℃ 2h，用TAKARA公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收回收載體片段。
同時用EcoR I和Xho I雙酶切含有衣殼蛋白基因的質粒pUC57/GGII1C、pUC57/GGII3C、pUC57/GGII4C和pUC57/GGII7C。反應體系為質粒20μl，EcoR I和Xho I各1.5μl，10×緩沖液5μl，H2O22μl。37℃ 2h，用TAKARA公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收目的片段。
將上述線性化的載體pFB1分別與目的基因GGII1C、GGII3C、GGII4C及GGII7C進行連接反應，反應體系為載體pFB1 0.5μl；目的片段3μl，連接緩沖液2μl；T4 DNA連接酶(TAKARA公司)1μl；補H2O至20μl，12℃連接16h。取10μl連接產物分別轉化E.coli DH10B感受態細胞。挑取Amp抗性克隆，用含Amp的LB培養液培養12～16h后，以堿裂解法小量制備質粒，用EcoR I和Xho I分別進行雙酶切鑒定，得到重組桿狀病毒表達載體pFB1/GGII1C、pFB1/GGII3C、pFB1/GGII4C和pFB1/GGII7C。
(2)重組桿狀病毒表達載體的轉座反應a)Luria Agar選擇性培養基的制備稱取40g Luria Agar(美國Invitrogen公司)固體培養基溶于1L超純水，分裝至三角瓶中，10磅高壓20min，待冷卻至50℃左右，迅速加入下列物質的貯存液至終濃度分別為卡那霉素(美國Sigma公司)50μg/ml，慶大霉素(美國Sigma公司)7μg/ml，四環素(美國Sigma公司)10μg/ml，Bluo-gal(美國Invitrogen公司)100μg/ml，ITPG(美國Invitrogen公司)40μg/ml。
b)轉座反應從-80℃冰箱取出DH10Bac感受態細胞(美國Invitrogen公司)置于冰上溶化，分別加入2μl重組表達載體質粒pFB1/GGII1C、pFB1I/GGII3C、pFB1/GGII4C、pFB1I/GGII7C和pFB1/90C，輕彈eppendorf管，混勻，置冰浴30min。42℃熱休克90sec，置于冰浴穩定5min。加入900ul SOC培養液(美國Invitrogen公司)，置37℃緩慢振搖4-6h。分別取200ul菌液涂布Luria Agar選擇性培養平板，37℃避光培養至少48h，觀察藍白斑生長情況。
(3)重組Bacmid DNA的分離挑取上述平板上的白色菌落各3～4個，分別再在Luria agar平板上劃線培養過夜，挑取仍為白斑的菌落，加至3ml的LB(卡那霉素50μg/ml，慶大霉素7μg/ml，四環素10μg/ml)中，37℃振搖培養24小時。取1.0ml的培養物，離心收集菌體，加入0.3ml溶液I[15mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，10mmol/LEDTA，100μg/ml RNase A(美國Sigma公司產品)]重懸菌體，加入0.3ml溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)混勻，室溫放置5min，加入0.3ml 3mol/L的乙酸鉀(pH5.5)，混勻，冰浴5～10min。13,000rpm離心10min，取上清，加入0.8ml的異丙醇，混勻，冰浴5～10min，13,000rpm離心15min，沉淀用70％的乙醇洗滌，置室溫干燥，溶于50μl的TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中。
(4)重組桿狀病毒的獲得昆蟲細胞Sf9的培養采用含10％胎牛血清(杭州四季青公司)和P.S.(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，華北制藥廠)的Grace培養基(美國Invitrogen公司)。轉染前24h將細胞傳至6孔細胞培養板(美國Costar公司)中，待細胞長至約50～70％豐度時進行轉染。轉染時準備下列溶液溶液A1-2μg重組Bacmid DNA與100μl無血清無抗生素的Grace培養基混合，溶液B6μl Cellfectin轉染試劑(美國Invitrogen公司)與94μl無血清、無抗生素的Grace培養基(美國Invitrogen公司)混合；將上述溶液A與溶液B混合，輕彈管壁混勻，室溫孵育30min。在等待的時間內，用2ml無血清無抗生素的Grace培養基洗細胞2次，每孔加入0.8ml無血清、無抗生素的Grace培養基，在轉染混合物孵育結束后，逐滴加入轉染復合物。27℃孵育5h后，去除轉染液，換為含10％胎牛血清的細胞培養液繼續27℃培養。次日換為含2％胎牛血清的維持液，27℃培養72h。轉染72h后，收獲轉染上清，分裝至無菌凍存管中，此即為含重組病毒的原代毒種。獲得的病毒原種分別為rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C。將病毒原種置4℃或-80℃保存。將此病毒感染Sf9細胞進行擴增傳代。
3、小鼠的免疫用293細胞分別擴增表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的重組腺病毒rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C、rvAdGGII7C，重組腺病毒感染細胞72h后，收集細胞置-80℃、37℃反復凍融3次后，于4℃，12,000rpm離心10min，取上清混合，作為免疫原免疫6-8周齡的雌性BALB/c小鼠(購自中國醫學科學院動物學研究所)，每次免疫劑量為150μl/只，免疫途徑為經鼻免疫，每間隔2周免疫一次，累計免疫4次后脾內注射進行加強免疫，劑量為100μl/只，3d后取脾融合。每次免疫后下次免疫前通過尾靜脈取血收集血清，用ELISA方法測定血清IgG抗體滴度，細胞融合時通過眼球采血收集血清測定血清IgG抗體滴度。
同時用表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞Sf9，提取病毒樣顆粒[具體方法參見BALL JM，et al.Oral Immunization with Recombinant Norwalk Virus-LikeParticles Induces a Systemic and Mucosal Immune Response in Mice.JVirol.72(2)1345-1353.)作為免疫原聯合免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，每次免疫劑量為50μg/只(0.5ml)，首次免疫與等量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射，每間隔2周后與等量不完全福氏佐劑混勻免疫一次，劑量為25μg/只。以25μg/只劑量重復免疫2次后，用10μg/只劑量進行脾內注射進行加強免疫，3d后取脾融合。每次免疫后下次免疫前通過尾靜脈取血收集血清，用ELISA方法測定血清IgG抗體滴度。
4、抗體滴度的間接ELISA測定(1)篩選抗原(包被抗原)的制備在T75細胞培養瓶(美國NUNC公司)中，待Sf9細胞(美國Invitrogen公司)生長至80％～90％豐度時，分別接種等量(MOI＝5)表達GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白的重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，感染后72h刮下病變的細胞，PBS洗滌后，分別用1ml PBS重懸4種重組桿狀病毒，混合后進行超聲裂解，條件為功率100W；工作時間10s；間歇時間15S；共超聲10次。于4℃，12,000rpm離心10min后，收集上清作為篩選抗原包被96孔酶標板(美國NUNC公司)。
(2)間接ELISA測定抗體滴度以超聲裂解的重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C感染的Sf9細胞提取的胞漿蛋白作為混合抗原，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸餾水至1000ml)進行1∶500稀釋后包被酶標板，100μl/孔，4℃包被過夜。用PBST(NaCL 8.00g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，KCL0.20g，Tween 20 0.50ml，加蒸餾水至1000ml)洗板3次，每次3min。每孔加300μl 1％牛血清白蛋白(BSA)封閉液[牛血清白蛋白組分V(美國Amresco公司)1g，溶于100ml PBS緩沖液，pH 7.4]，置37℃孵育2h后，用PBST洗板3次，每次3min。將適當稀釋的免疫小鼠血清或雜交瘤培養上清加入酶標板中，100μl/孔，置37℃孵育1h后，用PBST洗板5次，每次3min，同時設空白對照和陰性對照。加1∶5,000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)，100μl/孔，置37℃孵育1h后，用PBST洗板5次，每次3min。加TMB(美國Sigma公司)底物緩沖液，100μl/孔，置37℃避光孵育10min。加2mol/L H2SO4終止反應，100μl/孔。用Moldel 550酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定A450值，以P≥0.2，樣本檢測值/陰性對照檢測值≥2.1時，結果判為陽性。結果顯示，第一次加強免疫后，抗體滴度為10,000，第二次加強免疫后，抗體滴度為100,000，三次加強免疫后抗體滴度可達320,000。從圖1可以看出，重組腺病毒免疫效果明顯好于重組蛋白免疫，其滴度相差1個數量級。
5、雜交瘤細胞株的獲得(1)飼養細胞的制備將老齡雌性BALB/c小鼠脫頸處死后，浸泡于75％酒精中，3～5min后腹部朝上放置于超凈工作臺。剝離腹部皮膚，無菌條件下用10mlRPMI 1640培養液(美國Hyclon公司)沖洗腹腔數次。吸出沖洗液，放入50ml離心管(美國Corning公司)，1,000rpm，離心10min，棄上清。用含20％小牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養液重懸細胞沉淀后，進行細胞計數，調整細胞濃度為105個/ml。加入96孔細胞培養板(美國Costar公司)，100μl/孔，置于37℃，5％CO2培養箱中培養。
(2)細胞融合取脾內加強免疫3d的小鼠，眼球取血后，將其脫頸處死，無菌取出脾臟，制成單細胞懸液后，按10∶1的比例將脾細胞與處于對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞混合，1,000rpm離心10min，棄上清，輕輕彈起細胞，置于37℃水浴中，于1min內將1ml 50％PEG 4000(美國Sigma公司)加入混合后的細胞，邊加邊旋轉離心管，使細胞保持混勻狀態。然后在37℃內靜置90s，立即緩慢加入20ml 37℃預熱的RPMI 1640重懸細胞，以終止反應，于1,000rpm離心10min，棄上清，加入含20％小牛血清(杭州四季青公司)、2％HAT(美國Sigma公司)、1％青鏈霉素(PS，美國Hyclon公司)的RPMI 1640培養液，輕輕混勻，調整細胞數為2×106個/ml，加入已生長有飼養細胞的96孔細胞培養板，100μl/孔，置于37℃，5％CO2培養箱中培養，1周后補加含20％小牛血清、1％HT(美國Sigma公司)和1％PS的RPMI 1640培養液。
(3)陽性雜交瘤細胞株的篩選及克隆化桿狀病毒rvBacFB1為不含有外源基因的重組桿狀病毒，可用于篩選與昆蟲細胞成分及桿狀病毒載體成分有交叉反應的假陽性抗體。細胞融合7～14天后，待細胞克隆長至視野的1/2～1/3大時，用表達重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C的昆蟲細胞裂解液作為混合抗原包被酶標板，同時用表達rvBacFB1的昆蟲細胞裂解液包被酶標板，吸取細胞上清液進行首次“扣除法ELISA”篩選。這種方法的原理是表達杯狀病毒衣殼蛋白的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞與不含有外源基因的重組桿狀病毒rvBacFB1感染的昆蟲細胞相比，兩種細胞成分的差別是前者比后者多出杯狀病毒衣殼蛋白成分而少了多角體蛋白成分，因此當分別用雜交瘤細胞上清與這兩種細胞成分反應時，抗杯狀病毒衣殼蛋白的特異性抗體只能與前者反應，而不能與后者發生反應，與兩者都反應，或僅與后者反應，或與兩者均不反應的克隆均不是抗杯狀病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。通過這種方法，我們確保了所獲得的雜交瘤細胞分泌的抗體均是針對杯狀病毒衣殼蛋白的。篩選可識別杯狀病毒衣殼蛋白，但與陰性對照rvBacFB1感染的細胞不反應的雜交瘤克隆，采用有限稀釋法進行亞克隆，如此篩選3次，至細胞板上所有單克隆上清均只對杯狀病毒衣殼蛋白有抗性，而對昆蟲細胞成分及桿狀病毒載體成分無抗性，將細胞擴大培養。
ELISA多次篩選后得到雜交瘤細胞株V1E3、V1E9、V1D6和V6D6，結果見表1。
表1雜交瘤細胞株的克隆化結果
6、單克隆抗體的亞類鑒定用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液對羊抗鼠IgG(美國Sigma公司)進行1∶200稀釋后，包被96孔酶標板，100μl/孔，4℃包被過夜。加入1％BSA，300μl/孔，置37℃封閉2h。用PBS洗滌后，加入適當稀釋的V1E3、V1E9、V1D6和V6D6細胞上清，100μl/孔，置37℃孵育1h。用PBS充分洗滌后，分別加入1∶2000稀釋的HRP標記的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3(美國Sigma公司)，100μl/孔，置37℃孵育1h。用PBS充分洗滌后，以TMB 37℃避光顯色10min后，用2mol/L H2SO4終止反應，在Moldel 550酶標儀上測定OD450值。結果如表2所示，V1E3、V1E9和V1D6細胞株分泌的單克隆抗體為IgG1亞類，V6D6細胞株分泌的單克隆抗體為IgG2a亞類。
表2單克隆抗體的亞類鑒定結果
7、單克隆抗體的特異性鑒定(1)ELISA鑒定用表達重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C的昆蟲細胞裂解液分別包被酶標板，吸取細胞上清液進行ELISA篩選，觀察4株雜交瘤細胞V1E3、V1E9、V1D6和V6D6分泌的單克隆抗體與GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白反應的特異性。結果顯示(表3)，雜交瘤細胞株V1E3、V1E9分泌的抗體只對GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白有反應性；雜交瘤細胞株V1D6分泌的抗體對GGII1、GGII3和GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白有反應性，其中與GGII4型的反應最強，A450值最高；雜交瘤細胞株V6D6分泌的抗體對GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白均有反應性，且反應的強度相差不多。
表3單克隆抗體的特異性-ELISA鑒定結果
(2)Western-blot鑒定待Sf9細胞生長至80％～90％豐度時，分別接種等量(MOI＝5)重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，感染后72h刮下病變的細胞，PBS洗滌后，細胞沉淀用200μl含蛋白酶抑制劑(美國Roche公司)的RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1％SDS，1％NP40，0.5％脫氧膽酸鈉)冰上裂解1h，于4℃ 12,000rpm離心10min，將上清轉移至另一新的eppendorf管中，用Pierce公司的BCATMProtein Assay Kit對提取的胞漿蛋白按廠商說明書方法進行定量后，調整蛋白濃度至終濃度5000μg/ml，加入5×SDS-PAGE電泳緩沖液，100℃加熱變性后，取10μl總蛋白行12％SDS-PAGE電泳。電泳結束后，轉印硝酸纖維素膜，用5％脫脂奶室溫封閉2h后，分別用V1E3、V1E9、V1D6和V6D6雜交瘤細胞株的細胞上清室溫孵育2h，用含0.05％Tween-20的TBS緩沖液(TBST)洗滌3次后，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(美國Sigma公司)室溫孵育1h。TBST充分洗滌后，用SuperSignalWest Pico化學發光底物(Pierce公司)進行顯色。結果顯示，V1E3和V1E9細胞株分泌的單克隆抗體與rvBacGGII4C在約120kD處有濃集的特異性條帶出現，我們推斷為衣殼蛋白的二聚體形式；V1D6抗體與rvBacGGII4C在約120kD處也有濃集的特異性條帶出現，與rvBacGGII3C在約60kD處有特異性條帶出現，未檢測出與rvBacGGII1C和rvBacGGII7C的反應性；V6D6抗體與rvBacGGII1C和rvBacGGII4C在約120kD處有特異性條帶出現，與rvBacGGII3C在約60kD處有濃集的特異性條帶出現，未檢測出與rvBacGGII7C的反應性(圖2)。
(3)間接免疫熒光鑒定將已經預處理的無菌的蓋玻片置于24孔細胞培養板(美國BD公司)中，將Sf9細胞接種至24孔板，次日待細胞生長至80～90％豐度時，以MOI＝5接種重組桿狀病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，同時做rvBacFB1陰性對照和Sf9空白對照。72h后取出蓋玻片，細胞首先用4％多聚甲醛固定30min，再以0.3％Triton-X-100室溫作用20min，加1％BSA置37℃封閉1h后，用PBS(pH 7.4)洗細胞3次，每次3min。每蓋玻片細胞分別加100μl V1E3、V1E9、V1D6和V6D6抗體，置37℃孵育30min。用PBS洗去未結合的一抗后，每蓋玻片細胞加100μl FITC標記的抗鼠IgG二抗，置37℃孵育30min。用PBS洗去未結合的二抗后，以DAPI負染，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結果并照相。結果顯示，V1E3和V1E9抗體在rvBacGGII4C感染的Sf9細胞內可見特異性熒光，而在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII7C和rvBacFB1感染的Sf9細胞及空白Sf9細胞中均未見熒光(圖3，圖4)；V1D6抗體在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C和rvBacGGII4C感染的Sf9細胞內可見特異性熒光，而在rvBacGGII7C和rvBacFB1感染的Sf9細胞及空白Sf9細胞中均未見熒光(圖5)；V6D6抗體在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C感染的Sf9細胞內均可見特異性熒光，而在rvBacFB1感染的Sf9細胞及空白Sf9細胞中均未見熒光(圖6)。
據ELISA和間接免疫熒光結果，V1D6與GGII1、GGII3和GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白具有反應性，V6D6與GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白均有反應性；而Western-blot結果顯示，V1D6只與GGII3和GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白有反應性，V6D6只與GGII1、GGII3和GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白有反應性。這提示，V1D6和V6D6與杯狀病毒衣殼蛋白的反應可能存在構象依賴型表位，這可能與我們給動物的免疫原是具有完整結構的病毒蛋白有關；V1E3和V1E9與GGII4型杯狀病毒衣殼蛋白具有反應性的特異性，這從ELISA、Western-blot和間接免疫熒光試驗中均得到了證實。
以上結果可以看出，利用重組腺病毒免疫小鼠可以有效激發其表達外源蛋白的特異性抗體，并且其表達的抗原具有良好的免疫原性(可制備出構象依賴型抗體就是一個例證)。本發明的方法具有抗原制備簡單，節省時間；不需要特殊的實驗室設備；不需要免疫佐劑，免疫時間短；對于高致病性微生物可避免實驗室生物危險等優點，在單克隆抗體研制中具有良好的應用前景。
權利要求
1.一種制備單克隆抗體的方法，該方法包括用能夠表達特定抗原的重組腺病毒對動物進行免疫，由該動物獲得產生抗該抗原的抗體的細胞以制備雜交瘤，由雜交瘤獲得單克隆抗體。
2.權利要求1的方法，其中重組腺病毒中不添加任何免疫用佐劑。
3.權利要求2的方法，其中通過經鼻或者口服途徑對動物進行免疫。
4.權利要求1的方法，其中，所述抗原為一種蛋白。
5.權利要求4的方法，其中所述蛋白是GGII1、GGII3、GGII4或GGII7型杯狀病毒衣殼蛋白或其混合物。
6.權利要求5的方法，其中所述重組腺病毒為rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C或rvAdGGII7C。
7.權利要求1的方法，其中，所述表達特定抗原的重組腺病毒通過將外源基因插入腺病毒載體制備。
8.權利要求7的方法，其中所述插入外源基因的重組腺病毒經過擴增和純化后用于免疫動物。
9.權利要求1-8之一的方法，還包括將所述雜交瘤接種到動物體內，由荷瘤動物腹水獲得單克隆抗體。
10.權利要求9的方法，其中，所述動物為小鼠，所述產生抗體的細胞為脾細胞。
全文摘要
本發明提供了一種制備單克隆抗體的方法，該方法包括用能夠表達特定抗原的重組腺病毒對動物進行免疫，由該動物獲得產生抗該抗原的抗體的細胞以制備雜交瘤，由雜交瘤獲得單克隆抗體。
文檔編號C07K16/08GK1763099SQ20051011291
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月14日 優先權日2005年10月14日
發明者王健偉, 郭麗, 周紅莉, 洪濤 申請人:王健偉