一種制備丹參酚酸b的方法

專利名稱：一種制備丹參酚酸b的方法
技術領域：
本發明涉及一種丹參酚酸B的制備方法。
背景技術：
丹參Salviamiltiorrhiza是具有活血化瘀功效的傳統中藥，對心腦血管疾病具有顯著療效，自古以來就廣泛應用于臨床。藥理研究表明水溶性的酚酸成分是丹參活血化瘀的有效成分，具有顯著的抗脂質過氧化，清除自由基和抗血栓作用。
隨著人口老齡化進程的加速以及生活方式的改變，心腦血管病已成為一個全球性的健康問題，冠心病、卒中的死亡率在世界范圍分別居第1、3位。新型有效的防治心腦血管病藥物的開發已刻不容緩。隨著中藥現代化進程的日益深入，具有顯著抗脂質過氧化、清除自由基和抗血栓作用的丹參酚酸類成分越來越引起人們的注意。目前已有不少以丹參酚酸為主要藥效成分的藥物制劑，如丹參注射液、香丹注射液等。
研究表明，在丹參的干燥根中，酚酸B含量在5％左右，個別產地所產丹參中酚酸B的含量高達8％-10％。丹參酚酸B是丹參中主要的酚酸類成分，也是丹參具有活血化瘀功效的主要活性成分。但在目前的丹參藥物制劑中，其酚酸類成分主要由丹參素和原兒茶醛組成，丹參酚酸B的含量很低。這是由于丹參酚酸B是二分子丹參素與一分子原紫草酸縮合而成的四聚咖啡酸類化合物，其化學結構中存在的酚羥基和羧基很不穩定，低濃度的丹參酚酸B水溶液在常溫下經24小時后酚酸B即損失30％左右。現有的丹參提取過程中往往經過多次加熱處理，使大部分丹參酚酸B降解為丹參素和寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產物或進一步氧化成原兒茶醛、原兒茶酸。丹參素雖然也是丹參具有活血化瘀作用的有效成分之一，但在加熱條件下同樣易氧化分解。總而言之，丹參作為一種療效顯著的傳統中藥，在目前的制劑工藝中，其利用度是很低的。
現有的丹參注射液的的制備方法是取丹參藥材，加10倍量的注射用水煎煮2小時，過濾，保留第一次煎液；藥渣再用8倍量的注射用水煎煮2小時，過濾，保留第二次煎液；藥渣再加5倍量的注射用水煎煮1小時，過濾，保留第三次煎液；藥渣再加5倍量的注射用水煎煮1小時，過濾，保留第四次煎液，去除藥渣。然后合并四次煎煮液，蒸發濃縮至含丹參為2克/毫升的濃縮液。濃縮液中加入乙醇至含醇量為70％-80％，于0℃-5℃條件下放置12-36小時，過濾去除沉淀；濾液蒸餾濃縮至含丹參為3克/毫升的濃縮液，再加入乙醇至含醇量為80％-90％，于0℃-5℃條件下放置48-72小時，過濾去除沉淀；濾液蒸餾濃縮至含丹參為3克/毫升的濃縮液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃條件下放置12-36小時，過濾去除沉淀；濾液加熱濃縮至含丹參為5克/毫升的濃縮液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃條件下放置48-72小時，過濾去除沉淀，濾液加熱濃縮至含丹參為5克/毫升的濃縮液，加入活性碳，加熱煮沸，制得丹參精制液。在這一工藝中，經過多次加熱處理，丹參酚酸B損失90％以上，由丹參酚酸B降解產生的丹參素也損失巨大。
如何在提取工藝中保持丹參酚酸B的穩定性，最大限度地利用丹參中的有效成分，是藥物研究工作者努力的方向。目前已有以丹參酚酸B提取對象的工藝和方法。如專利公開號為CN 1425659A的國家發明專利中公開了一種丹參酚酸B的制備方法。其工藝步驟為1.水提取；2.用鹽酸或硫酸酸化提取液；3.采用非極性或弱極性的大孔樹脂或MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C18鍵合相色譜柱填料通過柱層析法分離純化丹參酚酸B；4.冷凍干燥。通過該方法可獲得純度在90％以上的丹參酚酸B制品。但我們在研究中發現，采用酸化處理丹參水提液時，丹參酚酸B的損失達20％，采用60％-85％乙醇沉淀處理時丹參酚酸B損失達30％以上；由于丹參酚酸B具有較大的極性，丹參水提、酸化后上非極性或弱極性的大孔樹脂，直接以不同濃度醇(或其它有機溶劑)洗脫時層析柱的處理能力較低，按該專利說明書中所述大孔樹脂處理丹參水提液中上柱樣品(以原藥材干重計算)與樹脂量之比僅為1∶4(W∶W)，以丹參酚酸B計僅約5.5mg/ml大孔樹脂；如果采用MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C18鍵合相色譜柱填料，則生產成本將大幅度提高。
本發明提供了一種新的丹參酚酸B的制備方法，該方法在處理過程中盡可能地保持了丹參酚酸B的穩定性，并在保證產品質量的同時使單位體積大孔樹脂對丹參酚酸B的處理能力提高了4倍以上，非常適于大規模的工業化生產。

發明內容
本發明提供了一種丹參酚酸B的制備方法。
本發明提供的制備方法為丹參水提液上非極性或弱極性大孔樹脂，其特征為，丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％-10％，洗脫液酸化至PH＝1～4。具體為1.水提丹參中的酚酸類成分時加入抗氧劑。
所用水可為常水、純水、注射用水等，優選為純水；水溫應保持0-50℃，優選為室溫。提取方法可以是浸漬、滲漉或超聲萃取。上述浸漬法是取粉碎后可過三號篩的丹參加水一次性浸漬提取或多次浸漬提取。每次浸漬用5-20倍量水，浸漬時間為2-8小時。推薦方案為第一次浸漬用20倍量水，浸漬時間為2小時，第二次浸漬用10倍量水，浸漬時間為4小時。合并兩次提取液，過濾、離心或自然沉降初步去除提取液中的固體雜質。上述滲漉法是取粉碎后可過三號篩的丹參裝于一有機玻璃制成的滲漉柱或桶中，邊裝邊適當壓實，滲漉柱或桶上端留出約1/5體積，加水至所有藥材浸沒，靜止浸泡4小時。打開滲漉柱下端閥門，使滲漉液緩緩流出，每小時流出滲漉液約為丹參干重的一倍，同時不斷注入水至滲漉柱上端。以HPLC跟蹤檢測滲漉液中丹參酚酸B的含量，確定用12-16倍量水滲漉可比較完全地提取出丹參酚酸B。上述超聲法是取粉碎后可過三號篩的丹參，加水一次性提取或多次提取。每次提取用5-20倍量水，提取時間為0.5-2小時。推薦方案為第一次用20倍量水，提取時間為0.5小時，第二次浸漬用10倍量水，浸漬時間為1.5小時。合并兩次提取液，過濾、離心或自然沉降初步去除提取液中的固體雜質。
將上述水提液中加入抗氧劑，靜置4-24小時，溶液變混濁并逐漸析出沉淀，采用過濾、離心或自然沉降法去除沉淀。抗氧劑可以是亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉。優選為亞硫酸氫鈉和抗壞血酸。抗氧劑的用量為提取液體積的0.001％-10％，優選為0.005％-1％，再優選為0.005％-0.01％。加入抗氧劑的目的是延緩溶液中的溶解氧對丹參酚酸B的氧化作用。丹參酚酸B分子結構中的酚羥基和羧基很不穩定，尤其是在低濃度條件下極易氧化降解成丹參素和寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產物或進一步氧化成原兒茶醛、原兒茶酸；并且水提液中含有大量的膠質成分，加入抗氧劑后，可產生鹽析效果而去除這部分雜質。
本發明人設計了以下對比實驗來考察抗氧劑對丹參水提液中丹參酚酸B的保護作用并比較了醇沉、酸化去除雜質的效果取上述丹參水提液5份，其中四份分別加入0.01％的亞硫酸氫鈉、0.01％的抗壞血酸、以鹽酸調至pH2、以95％乙醇調至醇濃度為75％，另外一份不做任何處理。5份溶液在用HPLC檢測其中的丹參酚酸B含量后除菌、密封，室溫下放置兩天，觀察溶液狀態，HPLC檢測溶液中的丹參酚酸B含量并與兩天前比較。結果表明，處理過的丹參水提液均出現沉淀，目測沉淀的量基本相同，而加入抗氧劑的水提液中丹參酚酸B含量明顯比其它三種溶液穩定。
表一 不同方法處理丹參水提液后丹參酚酸B的變化

2.采用大孔樹脂作層析介質，以酸性溶劑作洗脫用溶劑。
選用弱極性或非極性的大孔樹脂，如AB-8、DM-130等，洗脫用溶劑均用酸調至酸性。由于丹參酚酸B具有較大的極性，采用非極性或弱極性的大孔樹脂，層析介質與丹參酚酸B的結合較弱，單位體積樹脂對丹參酚酸B的處理量較低。若強制增大上柱樣品量，則用低濃度洗脫劑即可洗出丹參酚酸B，選擇性不高，并且由于丹參酚酸B在洗脫流出液中分布較為分散，導致洗脫劑用量過大，增大了后續濃縮工序的工作量。本發明中的洗脫液均用酸調至酸性，增大了丹參酚酸B與樹脂的結合能力，大大提高了單位體積樹脂對丹參酚酸B的處理量，正常上柱樣品量(以料液中丹參酚酸B量計算)達到25mg/ml大孔樹脂。具體方法如下將上述加入抗氧劑靜置4-24小時后的丹參水提物上清液加至大孔樹脂柱上；上樣量(以料液中丹參酚酸B量計算)10-40mg/ml大孔樹脂，優選為20-30mg/ml大孔樹脂。上樣完成后，用酸水(用酸調pH＝1-4的純水)沖洗柱子3-8個柱體積，至HPLC檢測流出液中雜質峰接近基線為止；先用低濃度的有機溶劑水溶液(用酸調pH＝1-4)洗去大部分雜質，再換用中等濃度的有機溶劑水溶液洗脫得到高純度的丹參酚酸B溶液，最后用高濃度的有機溶劑水溶液洗去層析柱上殘留雜質并對大孔樹脂進行再生處理。
所用有機溶劑為醇類、丙酮、乙腈等，優選為乙醇。
調節洗脫溶劑所用酸為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等，也可以是亞硫酸氫鈉、抗壞血酸等具有酸功能的抗氧劑。優選為鹽酸。
上述洗脫溶劑調至pH＝1-4，優選至pH＝2-3。
上述所用低濃度的有機溶劑水溶液，有機溶劑濃度為15％-45％，優選20％-25％，洗脫體積為3-15個柱體積，優選為5-10個柱體積。
上述所用中等濃度的有機溶劑水溶液，有機溶劑濃度為35％-85％，優選40％，洗脫體積為3-15個柱體積，優選為3-5個柱體積。
上述所用高濃度有機溶劑水溶液，有機溶劑濃度為85％-100％，優選95％，洗脫體積為3-5個柱體積，最后用純水洗10-20個柱體積，至流出液中無有機溶劑的味道為止。
3.干燥收集上述通過大孔樹脂層析所得高純度的丹參酚酸B溶液，在70℃、真空度-0.1Mpa的條件下減壓脫醇濃縮至含藥量5％左右，冷凍干燥，制品中丹參酚酸B含量在90％以上。通過HPLC跟蹤檢測各操作單元中丹參酚酸B的回收率，結果見表二。
表二 不同操作單元中丹參酚酸B的回收率*

*取干燥丹參，粉碎過三號篩，加50倍量水超聲提取30min，HPLC檢測上清液中丹參酚酸B的含量。以此確定丹參中酚酸B的量，定為100％。
在本發明所涉及的丹參酚酸B制備方法中，水提丹參時采用常溫或低溫，避免了丹參酚酸B的降解；水提液加入抗氧劑，不但有利于保持酚酸B的穩定性，同時產生的鹽析效果可有效去除膠質等雜質；洗脫過程采用酸性洗脫溶劑，增大了上柱丹參酚酸B與樹脂的結合能力，不但顯著提高了單位體積的大孔樹脂對丹參酚酸B的處理能力，還提高了洗脫條件的選擇空間。因此，本發明所涉及的丹參酚酸B制備方法不但可以得到高質量的丹參酚酸B制品，而且丹參酚酸B的收率和處理能力也大為提高，對降低生產成本，提高丹參的利用度，充分利用中藥材資源具有重要意義，極其有利于工業化大生產。


圖1為實施例1制備的丹參酚酸B制品色譜圖，各成分在色譜分析中保留時間、面積百分比等數值見表三。
表三 實施例1制備的各成分保留時間、面積百分比

圖2為丹參酚酸B對照品色譜圖，各成分在色譜分析中保留時間、面積百分比等數值見表四。
表四 對照品制備的各成分保留時間、面積百分比

具體實施方式
下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細說明，但并不意味著本發明僅限與此。
實施例1丹參酚酸B的制備水提取(浸漬法)取丹參粉碎可過三號篩，稱50Kg，按其重量的20倍量加純水，室溫浸泡4小時并適當攪拌，分離提取液，殘渣按原丹參重量的10倍加水，室溫浸泡6小時并適當攪拌，分離提取液。合并兩次提取液，用過濾方法去除其中的固體雜質。
在上述提取液中加入抗氧劑亞硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉的用量為提取液體積的0.005％。靜置6小時，溶液變混濁并逐漸出現沉淀，過濾去除沉淀，經HPLC測定，濾液中丹參酚酸B量為2.632Kg。
將上述濾液加至處理好的AB-8型大孔樹脂柱，先用5個柱體積的酸水(用鹽酸調pH＝2的純水)洗柱，去除大部分未與大孔樹脂結合的雜質，再用25％的乙醇水溶液洗5個柱體積，然后用40％乙醇洗脫5個柱體積，基本可將丹參酚酸B收集完全。最后用95％乙醇洗脫3個柱體積后用去離子水洗10-20個柱體積，再生柱子。
收集上述用40％乙醇洗脫時的流出液，在70℃、真空度-0.1Mpa的條件下減壓脫醇濃縮至含藥量5％左右，冷凍干燥，制得丹參酚酸B含量為95.45％的樣品2.461Kg，丹參酚酸B回收率為89.25％。
實施例2丹參酚酸B的制備與實施例1基本相同，所不同的是，水提過程采用滲漉法。具體方法如下取粉碎后可過三號篩的丹參50Kg裝于一有機玻璃制成的滲漉柱或桶中，邊裝邊適當壓實，滲漉柱或桶上端留出約1/5體積。加純水至所有藥材浸沒，靜止浸泡4小時。打開滲漉柱下端閥門，使滲漉液緩緩流出，每小時流出滲漉液約為丹參干重的一倍，同時不斷注入水至滲漉柱上端。滲漉13倍水量后以HPLC檢測滲漉液中丹參酚酸B的含量已降至很低，停止滲漉。合并滲漉液加入抗氧劑亞硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉的用量為提取液體積的0.01％。最終制得丹參酚酸B含量為93.38％的樣品2.455Kg，丹參酚酸B回收率為87.10％。
實施例3丹參酚酸B的制備與實施例1基本相同，所不同的是，水提液中加入提取液體積0.005％的抗壞血酸代替亞硫酸氫鈉。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為94.12％的樣品2.471Kg，丹參酚酸B回收率為88.40％。
實施例4丹參酚酸B的制備與實施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為20％的甲醇-水溶液洗5個柱體積，中濃度洗脫劑為40％的甲醇-水溶液洗4個柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為94.38％的樣品2.446Kg，丹參酚酸B回收率為87.74％。
實施例5丹參酚酸B的制備與實施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為20％的丙酮-水溶液洗5個柱體積，中濃度洗脫劑為40％的丙酮-水溶液洗3個柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為92.38％的樣品2.479Kg，丹參酚酸B回收率為87.04％。
實施例6丹參酚酸B的制備與實施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為15％的乙腈-水溶液洗5個柱體積，中濃度洗脫劑為40％的乙腈-水溶液洗3個柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為93.46％的樣品2.511Kg，丹參酚酸B回收率為89.20％。
權利要求
1.一種丹參酚酸B的制備方法，丹參水提液上非極性或弱極性大孔樹脂，其特征為，丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％-10％，洗脫液酸化至PH＝1～4。
2.根據權利要求2所述的制備方法，抗氧劑的加入量為提取液體積的0.005％-0.01％。
3.根據權利要求1或2的制備方法，抗氧劑為亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉。
4.根據權利要求3所述的制備方法，抗氧劑優選為亞硫酸氫鈉或抗壞血酸。
5.根據權利要求1或2的制備方法，優選為洗脫液酸化至PH＝2～3。
6.根據權利要求1或2的制備方法，其特征是，酸化所用溶劑為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸，或具有酸功能的抗氧劑如亞硫酸氫鈉、抗壞血酸。
7.根據權利要求6所述的制備方法，酸化所用溶劑優選為鹽酸。
8.根據權利要求1或2的制備方法，其特征是，洗脫液為醇類、丙酮、乙腈、氯仿中的一種或幾種。
9.根據權利要求8所述的制備方法，洗脫液優選為乙醇。
10.根據上述任一權利要求的制備方法，優選為丹參水提液加入抗氧劑亞硫酸氫鈉或抗壞血酸，抗氧劑用量為提取液體積的0.005％-0.01％，靜置4-6小時，溶液變渾濁并逐漸析出沉淀，采用過濾、離心或自然沉降法去除沉淀，將濾液加至處理好的AB-8或DM-130型大孔樹脂柱，先用鹽酸調PH＝2-3的純水洗脫5個柱體積，再用25％的乙醇水溶液洗5個柱體積，然后用40％乙醇洗脫5個柱體積，收集流出液，冷凍干燥即得。
全文摘要
本發明提供一種從丹參中提取丹參酚酸B的制備方法，該方法為丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％－10％，采用過濾、離心或自然沉降法去除沉淀，濾液上非極性或弱極性大孔樹脂，洗脫液酸化至pH＝1～4。
文檔編號C07D307/00GK1955171SQ20051010441
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月28日 優先權日2005年10月28日
發明者曲桂武, 岳喜典 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司