專利名稱：棉花金屬硫蛋白基因GhMT1序列及其克隆與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及棉花中金屬硫蛋白基因GhMT1的克隆、重組及耐鹽性功能的分析和應用，屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
高濃度的鹽引起植物體內的離子失衡和高滲脅迫，導致植物發育不良，生長緩慢特別是降低農作物產量。嚴重的鹽脅迫或滲透脅迫會引起植物體內的第二脅迫——氧化脅迫的發生，甚至導致植物死亡。因此，鹽脅迫受到人們的廣泛關注，提高作物的耐鹽性亦愈來愈受到人們的重視。通過轉基因提高作物的耐鹽能力是一條行之有效的辦法。因此，尋找與鹽脅迫有關的基因并研究其具體功能，以及調控途徑具有重要的理論和實踐意義。
本發明人通過構建棉花鹽脅迫cDNA文庫，利用差異篩選法獲得了立一條棉花的金屬硫蛋白基因GhMT1。進一步構建正義表達載體，轉化煙草和水稻，轉基因植株具有較高的耐鹽性，煙草耐鹽性可達200mM，水稻耐鹽性可達100mM。該基因可用于植物的遺傳轉化，提高植物的耐鹽能力。
發明內容本發明從棉花中分離出編碼某一金屬硫蛋白(GhMT1)的全長cDNA，連接到表達載體上，利用農桿菌侵染法轉化煙草，獲得的轉基因植株耐鹽性高達200mM。
從300mM NaCl處理的棉花幼苗和正常生長的棉花幼苗葉片中提取總RNA，然后將2微克總RNA反轉錄成cDNA，構建棉花鹽脅迫cDNA文庫和正常棉花cDNA文庫。使用反相Northern差異篩選法，獲得一條全長的cDNA為487bp，包括三端多聚A尾巴。開放閱讀框部分為192bp，由此推得具63個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行比較，表明與已發表的水稻、大麥、草莓、葡萄的金屬硫蛋白的氨基酸同源性71.4％，表明經過上述篩選步驟得到了編碼金屬硫蛋白的基因。該基因序列如下序列表
(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度414堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.11 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*長度63氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述1 MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC61 GSH用SmaI和SalI從pTriplEx2載體切下該片段，插入到表達載體PBI121的35S啟動子的下游。將構建好的表達載體轉入農桿菌EHA105.
轉化煙草，在含卡那霉素的LB固體培養基上篩選，將篩選出的抗性苗在10mM、100mM、200mM和300mM氯化鈉的培養基上培養。結果表明，與野生型相比，轉基因植株仍能較好的生長，具較高的耐鹽能力。
轉化水稻，在含卡那霉素的LB固體培養基上篩選，將篩選出的抗性苗在10mM、50mM、100mM和150mM氯化鈉的培養基上培養。結果表明，與野生型相比，轉基因植株仍能較好的生長，具較高的耐鹽能力。
根據上述技術，從棉花中分離出編碼金屬硫蛋白的基因GhMT1，該基因過量表達能導致轉基因煙草以及水稻具較高的耐鹽性。讓該基因在棉花中表達，將會提高棉花的耐鹽性；如果與特異啟動子連接，對其表達進行時空和脅迫誘導進行調控，將更具有針對性，具有非常重要的經濟效益和社會效益。
圖1是野生型和轉GhMT1基因煙草植株的鹽處理后拍攝的圖片橫排表示NaCl濃度梯度，1代表野生型，2代表轉基因植株。
圖2是野生型和轉GhMT1基因水稻植株的葉綠素含量的測定結果柱狀圖橫坐標表示NaCl濃度梯度，縱坐標表示葉綠素含量1代表野生型，2代表轉基因植株。
圖3是野生型和轉GhMT1基因水稻植株的鮮重的測定結果柱狀圖橫坐標表示NaCl濃度梯度，縱坐標表示植株鮮重；1代表野生型，2代表轉基因植株。
(五)具體發明實施方式實施例1棉花金屬硫蛋白基因GhMT1的獲得1.棉花幼苗的處理棉花支棉3號生長10天的幼苗。400mM NaCl處理18小時，收集子葉；2.總RNA的提取采用RNAeasy plant mini kit(promoga公司產品)提取總RNA。
3.使用SMART cDNA Library Construction Kit構建棉花鹽脅迫cDNA文庫以及對照cDNA文庫。
4.使用反相Northern差異篩選法篩選有表達差異的cDNA片斷。
5.將攜帶有表達差異的cDNA片斷的pTriplEx2載體轉入大腸桿菌BM25.8。
6.序列測定本工作在上海生工生物工程技術服務有限公司進行。獲得一條487bp的cDNA片斷。
7.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進行比較，確定它屬于棉花金屬硫蛋白基因。
實施例2棉花金屬硫蛋白基因GhMT1，如下序列
(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度414堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.11 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa(3)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*長度63氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述1 MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC61 GSH實施例3表達載體的構建1.用SmaI和SalI兩個限制性內切酶將該基因從pTriplEx2載體上切下，與相同酶酶切的PBI121連接。連接產物轉化DH5α細胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑒定和質粒DNA的酶切分析。
2.將構建好的表達載體轉化農桿菌EHA105。
實施例4含有GhMT1轉基因煙草的再生以及耐鹽性鑒定1.培養野生型煙草。
2.挑取鑒定好的農桿菌單克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液體培養基中，28℃振蕩培養。
3. 3000rpm離心5分鐘，農桿菌沉淀用10×MS培養基懸浮。
4.將煙草葉片切成小塊，放入上述懸浮液浸泡10分鐘。
5.侵染后的葉片切塊置于分化培養基(1×MS鹽，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉膠，)上共培養2天，然后轉入選擇培養基(1×MS鹽，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉膠，卡那霉素100毫克/升，頭孢青霉素250毫克/升)篩選，得到抗性植株。
6.將抗性植株移入花盆，每兩天澆含10mmolL-1，100mmolL-1，200mmolL-1和300mmolL-1氯化鈉的1/2Hoagland營養液，20天后測定野生型和轉基因植株的光合速率和葉綠素含量。
實施例5含有GhMT1轉基因水稻的再生以及耐鹽性鑒定1.去殼的成熟種子用10％的次氯酸鈉消毒十分鐘，然后用無菌水沖洗5次。
2.將水稻種子置于N6D2的培養基中誘導愈傷組織，20天后將成熟盾片處長出的愈傷組織繼代于N6D2的培養基中。
3.在農桿菌侵染前將愈傷組織轉移到新鮮的N6D2的培養基中培養4天。
4.挑取鑒定好的農桿菌單菌落于含50毫克/升卡那霉素的LB液體培養基中，28℃振蕩培養。
5.3000rpm離心5分鐘，農桿菌沉淀用N6D2的液體培養基懸浮。
6.將預培養的愈傷組織用農桿菌侵染20分鐘。
7.用無菌濾紙洗去多余的農桿菌液，讓后置于N6D2培養基中，26℃，黑暗，共培養3天。
8.將共培養后的愈傷用含有250mg/L的頭孢霉素的N6D2液體培養基中，洗滌8次，再用無菌水洗干。
9.將愈傷組織轉移到N6D2CH固體篩選培養基中，26℃，暗培養，每2周換一次培養基。
10.將反復篩選獲得的抗性組織轉移到N6D2CH+S高滲培養基中，26℃，暗培養2周。
11.將抗性組織轉移到MSR分化培養基中，26℃，暗培養1周，再轉為26℃，光16小時/暗8小時培養。
12.將再生的芽轉到新鮮的MS培養基中，直至長出小植株。
13.將抗性植株移入花盆，每兩天澆含10mmolL-1，50mmolL-1，100mmolL-1和150mmolL-1氯化鈉的1/2Hoagland營養液，20天后測定野生型和轉基因植株的葉綠素含量和植株鮮重。
序列表<110>山東農業大學<120>棉花金屬硫蛋白基因GhMT1序列及其克隆與應用<140>
<141>
<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>414<212>cDNA<213>Gossypium hirsutum<221>1-487<400>11 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa
權利要求
1.一種權利要求一個克隆的棉花金屬硫蛋白基因GhMT1，其特征在于它具有下述所示的核甘酸序列1 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 。
2.根據權利要求1所述的一個克隆的棉花金屬硫蛋白基因GhMT1，其特征在于該基因編碼下述所的氨基酸序列1 MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC61 GSH 。
3.根據權利要求1所述的一個克隆的棉花金屬硫蛋白基因GhMT1的用途，其特征在于該基因在煙草和水稻中過量表達，能有效提高轉基因植株的耐鹽性。
全文摘要
本發明涉及棉花中金屬硫蛋白蛋白GhMT1基因的克隆、重組及耐鹽性功能分析，屬于分子生物學和生物技術領域。通過構建棉花鹽脅迫cDNA文庫和對照cDNA文庫，再進行差異篩選，獲得一系列表達有顯著差異的cDNA序列，其中有一條為棉花金屬硫蛋白基因，將其命名為GhMT1。進一步利用該基因轉化煙草，獲得的轉基因植株能在200mmol·L
文檔編號C07K14/415GK1818064SQ20051010430
公開日2006年8月16日 申請日期2005年10月14日 優先權日2005年10月14日
發明者鄭成超, 薛彤, 李新征, 朱瑋, 楊國棟, 吳長艾 申請人:山東農業大學