專利名稱：一種珍珠母蛋白提取物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物醫藥領域、本發明涉及一種從珍珠母中提取的珍珠母蛋白提取物，該蛋白提取物具有治療骨質疏松的作用。
背景技術：
骨質疏松一直以來都是臨床高發病癥，尋找各種治療或者輔助治療的藥物是醫藥研究者執著以求的事業。
中醫所說的“珍珠母”，它性味功能與珍珠近似，多用于眩暈耳鳴、心悸失眼、驚癇抽搐等癥。而現代醫學的研究表明，從珍珠母中得到的水溶性成分在高濃度時能夠誘導Wister鼠的大腿骨基質干細胞的細胞生長(M.Lamghari，M.J.Almeida，S.Berland，etc.Stimulation of Bone Marrow Cells and Bone Formation byNacreIn Vivo and In Vitro Studies，Bone，1999，25(2)91S-94S)。并且有學者利用造骨細胞系(Pre-osteoblast cell line)MC3T3-E1來檢測大珠母貝的水溶性成分對其生長的影響，并發現水溶性成分可以促進造骨細胞分化，而且會抑制堿性磷酸酶(ALP)的活性(Marthe Rousseau，Lucilia Pereira-Mouriès，Maria-JoséAlmeida.etc.The water-soluble matrix fraction from the nacre of Pinctada maximaproduces earlier mineralization of MC3T3-E1 mouse pre-osteoblasts.ComparativeBiochemistry and Physiology Part B，2003(135)1-7)。
另外，珍珠母被作為骨填充的材料的研究也取得了進展。生命起源于海洋，而珍珠母正是海洋生物身體的一部分，雖然珍珠母與骨的起源不同(前者起源于軟體動物，后者起源于脊椎動物)，但是它們的祖先卻具有相同的早期礦化骨。與骨的形成相似，珍珠母的形成也是在珍珠層有機質(Organic matrix)的機礎上進行礦化沉積而形成的。這種同質形成的文石結構在被植入的動物體內沒有相容性的問題。因此，用珍珠層粉制成的骨填充材料不會產生免疫反應并且植入的材料也不會被破碎(Yong Wan-Kim，Jae-Jin Kim，Yong Ha Kim，etc.Effect oforganic matrix proteins on the interfacial structure at the bone-biocompatible nacreinterface in vitro，Biomaterials，2002，232089-2096)。
目前，經研究，本發明人認為珍珠母內的蛋白對其鈣化結晶起著重要的作用，珍珠母蛋白不僅在珍珠(母)的形成中扮演著重要的角色，它在對人的骨科疾病的治療上也具有積極的意義。
本發明的目的是提供一種珍珠母蛋白提取物，該蛋白提取物在臨床上可應用于制備治療骨質疏松癥的藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一種珍珠母蛋白提取物，該珍珠母蛋白提取物具有治療骨質疏松的作用，可用于制備治療骨質疏松的藥物。
本發明的珍珠母蛋白提取物可通過以下方法制備取珍珠母，粉碎，裝入大燒杯里，然后量取已配好的5.5摩爾/升的醋酸溶液，磁力攪拌連續進行3小時。
然后把混濁的溶液倒入離心管中，在4℃下，14,000轉/分鐘冷凍離心。所得的上清液需要進行雙層濾紙過濾，得到蛋白質混合粗提液，將其過交聯葡聚糖凝膠柱分離，以50mM的Tris-HCl液(鹽酸調節pH值到7.2)洗脫。所用儀器為Bio-Rad LP system，流速為15ml/min，檢測OD280，并且收集電導值在4.00以下的含蛋白質成分。將所分得到的蛋白濃液在-80℃超低溫冰箱中預凍過夜，然后移入已預冷至-30℃的凍干機中，-30℃10h，-25℃10h，-20℃10h，-15℃10h，-5℃8h真空冷凍干燥。即得。
珠母蛋白提取物體外礦化實驗將30ml-50ml的NaHCO3溶液與120ml CaCl2溶液混合，不斷攪拌至溶液渾濁。用1M NaOH調整到pH8.2，14,000rpm離心10min，用0.22μm濾膜過濾得飽和CaCO3溶液。配制以上所提取的珍珠母蛋白溶液，濃度為50μl 0.1mg/ml，與150μl飽和CaCO3溶液混合，取10μl滴在充分干凈的蓋玻片上。加蓋，4℃冰箱干燥7天。用Tris-HCl溶液作陰性對照。干燥的蓋玻片置載物臺上，噴白金，于JEOL JSM-6330F Field Emission ScanningElectron Microscope場發射掃描電境下觀察并拍照。結果表明未加珍珠母蛋白提取物的陰性樣品顆粒比較分散。顆粒形狀不規則，方型居多；加入了珍珠母蛋白提取物樣品的碳酸鈣晶體，方形小晶粒粘合成堆，形成“磚墻”結構，這部分的晶粒大小勻稱，且在加入珍珠母蛋白樣品的碳酸鈣結晶樣品中還發現方形晶粒粘連成串和聚集成堆的不規則晶體。表明珍珠母蛋白具有促進礦化結晶的作用。
珍珠母蛋白提取物對成骨細胞和骨髓基質細胞礦化能力的影響實驗結果表明骨髓基質細胞是成骨細胞的前體細胞，在一定的誘導條件下可被誘導為成骨細胞，并形成鈣化結節。加入了珍珠母蛋白的MSCs細胞被染成黑色的礦化結節，但陰性對照并未發現礦化結節，這說明了珍珠母蛋白提取物具有促進MSCs細胞分化為成骨細胞的作用，并且能促使其形成礦化結節。
因此，本發明的珍珠母蛋白提取物具有治療骨質疏松的作用，可用于制備治療骨質疏檢的藥物。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的說明。
實施例1. 珍珠母蛋白提取物的制備取珍珠母粉20g，置1L燒杯中，緩慢加入5.6M醋酸200ml，室溫下磁力攪拌器緩慢攪拌脫鈣3h。將脫鈣液移入50ml離心管，4℃，14,000rpm離心5min，取上清液，0.45μm微孔濾膜濾過。濾液4℃冰箱保存。
每次取濾液40ml，以Tris-HCl(pH7.2，50mM)為流動相，過Sephadex G-15凝膠柱(15cm×Φ50mm)，收集電導值在4.00以下的含蛋白質成分，合并收集液，得珍珠母蛋白液。
將蛋白液置Φ15cm培養皿中，每個培養皿蛋白液控制液高1-1.5cm。在-80℃超低溫冰箱中預凍過夜，然后移入已預冷至-30℃的凍干機中，-30℃ 10h，-25℃10h，-20℃ 10h，-15℃ 10h，-5℃ 8h真空冷凍干燥，即得。
實施例2 天然凝膠電泳分析珍珠母蛋白提取物純度取含1mg珍珠母蛋白提取物，加蒸餾水1ml溶解，配制成1mg/ml的蛋白質溶液。取蛋白液40μ1于0.5ml離心管中，加入天然凝膠電泳5×加樣緩沖液10μl，混勻，14,000rpm離心5min，小心吸取上清液作為電泳樣品。
恒壓電泳，濃縮膠電壓為80V，待樣品液中溴酚藍遷移至濃縮膠與分離膠界面時將電壓調為120V，直到溴酚藍遷移至凝膠前沿。
電泳結束后將凝膠從電泳槽中取出，轉移到染色液中染色30-60min，隨后再轉移到脫色液中脫色至凝膠背景清晰。全過程在慢速振蕩器上進行。
掃描。天然凝膠電泳的結果顯示為一條主帶。
實施例3 凝膠過濾層析分析珍珠母蛋白提取物純度取含1mg珍珠母蛋白提取物，加蒸餾水1ml溶解，配制成1mg/ml的蛋白質溶液，用0.45μm濾膜濾過，作為供試品溶液。
儀器Bio-Rad BioLogic LP System，色譜柱Sephadex G-75，85cm×Φ1cm，流動相磷酸鹽緩沖液，25mM，pH7.2。流速0.5ml/min。
凝膠過濾層析結果顯示為一個主峰。
實施例4 陽離子交換層析分析珍珠母蛋白提取物純度取含1mg珍珠母蛋白提取物，加蒸餾水1ml溶解，配制成1mg/ml的蛋白質溶液，溶液置截留量為3K的透析袋中，用500倍體積的檸檬酸鹽緩沖液，25mM，pH5.0，磁力攪拌器緩慢攪拌，4℃透析過夜。透析后吸出樣品用0.45μm濾膜濾過，作為供試品溶液。
儀器Amersham AKTAbasic，色譜柱Amersham HiTrap CM FF，流動相檸檬酸鹽緩沖液(25mM，pH5.0)，0-1M NaCl梯度洗脫，流速1ml/min。
得到一個峰實施例5 陰離子交換層析分析珍珠母蛋白提取物純度取含1mg珍珠母蛋白提取物，加蒸餾水1ml溶解，配制成1mg/ml的蛋白質溶液，溶液置截留量為3K的透析袋中，用500倍體積的磷酸鹽緩沖液，25mM，pH7.2，磁力攪拌器緩慢攪拌，4℃透析過夜。透析后吸出樣品用0.45μm濾膜濾過，作為供試品溶液。
儀器Amersham AKTAbasic，色譜柱Amersham HiTrap DEAE FF，流動相磷酸鹽鹽緩沖液(25mM，pH7.2)，0-1M NaCl梯度洗脫，流速1ml/min。
洗脫只得到一個峰實施例6 珍珠母蛋白提取物體外礦化實驗將30ml-50ml的NaHCO3溶液與120ml CaCl2溶液混合，不斷攪拌至溶液渾濁。用1M NaOH調整到pH8.2，14,000rpm離心10min，用0.22μm濾膜過濾得飽和CaCO3溶液。
取50μl 0.1mg/ml的珍珠母蛋白提取物溶液與150μl飽和CaCO3溶液混合，取10μl滴在充分干凈的蓋玻片上。加蓋，4℃冰箱干燥7天。用Tris-HCl溶液作陰性對照。
干燥的蓋玻片置載物臺上，噴白金，于JEOL JSM-6330F Field EmissionScanning Electron Microscope場發射掃描電境下觀察并拍照。結果表明未加珍珠母蛋白提取物的陰性樣品顆粒比較分散。顆粒形狀不規則，方型居多；加入了珍珠母蛋白提取物樣品的碳酸鈣晶體，方形小晶粒粘合成堆，形成“磚墻”結構，這部分的晶粒大小勻稱，且在加入珍珠母蛋白提取物樣品的碳酸鈣結晶樣品中還發現方形晶粒粘連成串和聚集成堆的不規則晶體。表明珍珠母蛋白提取物具有促進礦化結晶的作用。
實施例7 珍珠母蛋白提取物對成骨細胞和骨髓基質細胞礦化能力的影響取所制得的珍珠母蛋白提取物，用無菌DMEM培養基溶解(MC3T3-E1細胞實驗用DMEM高糖培養基，MSCs細胞實驗用DMEM低糖培養基)，在超凈臺中用準備好的0.22μm的無菌濾器過濾。加入適量FBS和雙抗，使FBS濃度達到10％，雙抗濃度為100U/ml，珍珠母可溶性蛋白質濃度為0.1mg/ml，作為珍珠母蛋白提取物樣品培養基。
將溶于0.5M，pH7.2磷酸鹽緩沖液的10mg/ml BSA用0.22μm的無菌濾器過濾，取1ml加入到99ml完全培養基中作為陰性對照。
將地塞米松，β-甘油磷酸鈉，Vc，用完全培養基溶解后，用0.22μm的無菌濾器過濾，取適量加入到完全培養基中，使得Dex濃度為10-8mol/L，β-甘油磷酸鈉濃度為10mmol/L，Vc濃度為50μg/ml，作為陽性對照。
配好的培養基封好瓶口后，放4℃冰箱中保存。
培養基取少許置37℃CO2培養箱48～72h，檢查無菌方可用于試驗。
將MC3T3-E1細胞，MSCs細胞以5×104/孔接種于12孔板內，加完全培養基1.5ml。在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養24h，待細胞完全貼壁后，吸棄原培養基，加入陰性培養基，樣品培養基，陽性培養基，每孔1.5ml。每個樣品平行做6份。37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養。于第6天進行礦化結節VonKossa染色。
礦化結節Von Kossa染色步驟(1)將培養在孔板中細胞用PBS洗滌后，置中性甲醛磷酸緩沖液中進行固定60min。(2)浸入1％AgNO3水溶液中30～60min(在紫外光下進行)。(3)三蒸水中清洗。(4)5％硫代硫酸鈉水溶液中浸2min。(5)三蒸水清洗。(6)1％中性紅復染胞核30s。(7)三蒸水清洗。(8)倒置顯微鏡下觀察及照相。
結果骨髓基質細胞是成骨細胞的前體細胞，在一定的誘導條件下，在地塞米松，β-甘油磷酸鈉，Vc條件下可被誘導為成骨細胞，并形成鈣化結節。加入了珍珠母蛋白提取物的MSCs細胞也同樣發現了被染成黑色的礦化結節，但陰性對照并未發現礦化結節，這說明了珍珠母蛋白提取物具有促進MSCs細胞分化為成骨細胞的作用，并且能促使其形成礦化結節。
權利要求
1.一種珍珠母蛋白提取物，其特征在于采用以下方法由珍珠母中提取而制得取珍珠母粉，緩慢加入10倍量的5.6摩爾/升的醋酸溶液，室溫下磁力攪拌器緩慢攪拌3小時，然后于4℃，14000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，0.45微米微孔濾膜濾過，濾液用經鹽酸調節pH為7.2的50毫摩爾/升的Tris-HCl溶液為流動相，過交聯葡聚糖凝膠柱，收集電導值在4.00以下的含蛋白質成分，合并收集液，先在-80℃超低溫冰箱中預凍過夜，然后移入已預冷至-30℃的凍干機中，-30℃10小時，-25℃10小時，-20℃10小時，-15℃10小時，-5℃8小時真空冷凍干燥。即得。
2.權利要求1所述的珍珠母蛋白提取物在制備治療骨質疏松藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種珍珠母蛋白得取物及其在制備治療骨質疏松藥物中的應用。取珍珠母，粉碎后加入5.5摩爾/升的醋酸溶液，攪拌數小時，然后在4℃下，冷凍離心，上清液過濾，得到蛋白質混合粗提液，將其過交聯葡聚糖凝膠柱，以50毫摩爾/升的Tris－HCl液(鹽酸調節pH值到7.2)洗脫，收集電導值在4.00以下的含蛋白質成分，將所分得到的蛋白溶液在－80℃超低溫冰箱中預凍過夜，然后移入已預冷至－30℃的凍干機中，－30℃10小時，－25℃10小時，－20℃10小時，－15℃10小時，－5℃8小時真空冷凍干燥，即得珍珠母蛋白提取物。本發明的珍珠母蛋白提取物具有治療骨質疏松的作用，可用于制備治療骨質疏松的藥物。
文檔編號C07K14/435GK1785214SQ20051010100
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月11日 優先權日2005年11月11日
發明者王永剛, 刁飛宇, 馬卿云, 夏鋒, 鄧慧敏, 勞業興, 李詠華, 楊立偉, 賈強 申請人:中山大學