前列腺素還原酶的制作方法

專利名稱：前列腺素還原酶的制作方法
相關申請的交叉引用本申請要求2005年3月22日提交的美國臨時申請No.60/664,473的優先權，而No.60/664,473要求2004年6月10日提交的美國臨時申請No.60/651,469的優先權。上述兩個臨時申請以其全部在此并入作為參考。
背景技術：
過氧化物酶體增殖因子活化的受體(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)屬于調節脂質和葡萄糖代謝的核受體家族。已經鑒定了三種哺乳動物的PPAR，即PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ。當被膳食中的脂肪酸或其代謝衍生物激活后，PPAR觸發一連串的轉錄事件，導致脂質和葡萄糖的代謝改變。例如，被激活后，PPAR-γ，其在脂肪組織中高表達，促進葡萄糖攝取并降低血糖水平。
除了其在脂質和葡萄糖代謝中的作用，PPAR也是一些疾病的有前途的治療靶位，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。一種合成的PPAR-γ激動劑AVANDIA已經用于治療II型糖尿病。另一種合成的PPAR-α激動劑Fibrates已經用于治療血脂異常。見Lehmann等，J Biol Chem，(1995)27012953-12956；Fruchart等，Curr.Opin.Lipdol.(1999)10245-257。不過，大多數PPAR治療劑的功效很有限且具有明顯的不良反應。
因此需要開發更加有效的用于通過調節PPAR活性而調控脂質和葡萄糖代謝的藥物。

發明內容
本發明涉及用于通過調節對象的PPAR活性而治療PPAR相關性疾病的方法。
在一方面，本發明公開了一種分離的多肽，所述多肽還原15-酮前列腺素而不還原白三烯B4。前列腺素(PG)是一類生理學介質，其特征為具有中心環和不同不飽和程度的側鏈。15-酮前列腺素的實例包括但不限于15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α和15-酮PGF1α。白三烯是另一類生理學介質，其與前列腺素的部分不同之處在于不具有中心環。
在另一方面，本發明公開了一種特異性地結合到上述多肽上的抗體。該抗體，或是多克隆抗體或是單克隆抗體，可以結合到該多肽的一個片段上。
在另一方面，本發明公開了一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及編碼它的DNA載體，以抑制具有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性的多肽的表達。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是指一種通過還原前列腺素的Δ13雙鍵來催化15-酮前列腺素轉化為13，14-二氫-15-酮前列腺素的酶。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的例子包括15-酮前列腺素-Δ13-還原酶/白三烯B4 12-羥基脫氫酶(PGR/LTB4DH)和鋅結合醇脫氫酶1(PGR2/ZADH1)。dsRNA包含兩條多聚核糖核苷酸鏈。第一鏈等同于編碼15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的核酸的19至49個連續的核苷酸。第二鏈與第一鏈互補。優選地，至少該dsRNA的一端具有一1至4個核苷酸的突出端。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶可以是PGR/LTB4DH或PGR2/ZADH1。
本發明還公開了一種治療PPAR相關性疾病的方法，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。該方法包括給對象施用有效量的15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調節物。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調節物是指影響15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達的一種分子或者一種分子復合體。調節物可以是15-酮前列腺素。它也可以是一種抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達的抑制劑，例如，上述dsRNA。
在以下說明書中記載了本發明的一個或多個實施方式的詳細描述。本發明的其它特征、目的和優點根據說明書和權利要求書的內容將是顯而易見的。
具體實施例方式
本發明是基于發現了15-酮前列腺素-Δ13-還原酶家族的一個成員，15-酮前列腺素-Δ13-還原酶2(PGR-2)。本發明人出乎意料地發現，PPAR活性可以通過其底物和抑制劑來控制。這些底物和抑制劑對于治療PPAR相關性疾病是有用的，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。
預期屬于本發明范圍內的是一種如SEQ ID NO1所示的分離的多肽或其功能性等價物，該多肽還原15-酮前列腺素但不還原白三烯B4。如下所示是其氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其編碼核苷酸序列(即SEQ IDNO2)。
1 - ATGATCATACAAAGAGTGGTATTGAATTCCCGACCTGGGAAAAATGGAAATCCAGTCGCA -60- M I I Q R V V L N S R P G K N G N P V A61 - GAGAACTTCAGGGTGGAAGAGTTCAGTTTACCGGATGCTCTCAATGAAGGTCAAGTTCAA -120- E N F R V E E F S L P D A L N E G Q V Q121 - GTGAGGACTCTTTATCTCTCGGTGGATCCTTACATGCGCTGTAAGATGAACGAGGACACT -180- V R T L Y L S V D P Y M R C K M N E D T181 - GGCACTGACTACTTGGCACCGTGGCAGCTGGCGCAGGTGGCTGATGGTGGAGGAATTGGA -240- G T D Y L A P W Q L A Q V A D G G G I G241 - GTTGTAGAGGAGAGCAAGCACCAGAAGTTGACTAAAGGCGATTTTGTGACTTCGTTTTAC -300- V V E E S K H Q K L T K G D F V T SF Y301 - TGGCCCTGGCAAACTAAGGCAATTCTAGATGGGAATGGCCTTGAAAAGGTAGACCCACAA -360- W P W Q T K A I L D G N G L E K V D P Q361 - CTTGTAGATGGACACCTTTCATATTTTCTTGGGGCTATAGGTATGCCTGGCTTGACTTCC -420
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15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性是指將15-酮前列腺素經酶促轉化為13，14-二氫-15-酮前列腺素。該特異性活性如下測定在37℃條件下，于含有0.1M Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mM NADPH和0.57mM 15-酮PGE2的反應緩沖液中對10μg待分析蛋白質制備物進行孵育。該反應在黑暗中于37℃進行10分鐘，并通過添加700μl含有50mM，pH3.0的鄰苯二甲酸氫鉀和1％Tween 20的緩沖液來終止反應。以200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑(indonitrotetrazolium chloride)、60μM吩嗪硫酸甲酯和1％Tween 20的顯色劑氧化任何未反應的NADPH。在490nm處的吸光度用ELISA分析儀進行測量。用含有NADPH的連續稀釋量的反應緩沖液產生標準曲線。至少90nmole/min/mg蛋白的特異性活性表明該多肽具有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性。
上述核苷酸序列，即SEQ ID NO2，能被用于表達本發明的多肽。核苷酸序列是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA類似物。DNA或RNA類似物可以自核苷類似物合成。該核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選為雙鏈的。為了表達蛋白，可以將該核酸可操作地連接到適當的調控序列上以制得表達載體。載體是指一核酸分子，它能轉運已被連接于其上的另一核酸。載體能夠自我復制或被整合到宿主DNA中。載體的例子包括質粒、粘粒或病毒載體。該載體可以包括以適于宿主細胞中的核酸表達的形式存在的核苷酸序列。優選地，載體包括一個或多個被可操作地連接到待表達的核酸序列上的調控序列。“調控序列”包括啟動子、增強子、和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。調控序列包括那些負責核苷酸序列的組成性表達的序列，以及組織特異性調控和/或誘導序列。該表達載體的設計可依賴于待轉化宿主細胞的選擇、所期望蛋白質的表達水平等這樣的因素。該表達載體能被導入宿主細胞以生產本發明的多肽。同樣，含有上述核酸的宿主細胞也落入本發明的范圍內。例子包括有E.coli細胞、Sf9昆蟲細胞(例如，利用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞。參見，例如，Goeddel，(1990)Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。為制備本發明的多肽，可以在允許由本發明的核酸編碼的多肽表達的條件下，于培養基中培養宿主細胞，并純化獲自培養細胞或細胞培養基的多肽。或者，該核苷酸序列可以在體外被轉錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。
上面所描述的多肽能被用于在動物體內產生抗體。能夠理解抗體也能自該多肽的片段產生。在動物體中制備單克隆和多克隆抗體及其片段的方法在本領域中是已知的。參見，例如，Harlow和Lane，(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork。術語“抗體”包括完整的分子及其片段，這些片段有例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(單鏈抗體)和dAb(結構域抗體；Ward等，(1989)Nature，341，544)。
一般地，本發明的多肽可以與載體蛋白例如KLH偶聯，可以與佐劑混合并可注射入宿主動物體內。然后在該動物體內產生的抗體可以通過肽親和層析法純化。通常使用的宿主動物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可用于增加免疫反應的各種佐劑取決于宿主的物種，所述佐劑包括弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油化乳化液、鑰孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin)和二硝基酚。有用的人類佐劑包括BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體即抗體分子的異質性群體存在于免疫對象的血清中。單克隆抗體，抗本發明多肽的抗體的均質性群體，可以使用標準雜交瘤技術制備(參見例如Kohler等，(1975)Nature 256，495；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，511；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，292；以及Hammerling等，(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)。具體地，利用通過連續的細胞系培養生產抗體分子的任何技術可以獲得單克隆抗體，如Kohler等，(1975)Nature 256，495和美國專利No.4,376,110；人類B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，(1983)Immunol Today 4，72)；Cole等，(1983)Proc.Natl.Acad Sci.USA 80，2026；和EBV-雜交瘤技術(Cole等，(1983)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁)所述的技術。這些抗體可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD的免疫球蛋白類及其任何亞類。產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤可以在體外和在體內培養。體內生產高滴度單克隆抗體的能力使其成為特別有用的生產方法。
另外，可以使用用于生產“嵌合抗體”的技術。參見例如Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851；Neuberger等，(1984)Nature 312，604；以及Takeda等，(1984)Nature 314452。嵌合抗體是一種該分子中的不同部分來源于不同動物種的分子，例如具有來源于鼠單克隆抗體的可變區和人免疫球蛋白恒定區的分子。或者，可以采用生產單鏈抗體的技術(美國專利No.4,946,778和4,704,692)來生產單鏈Fv抗體的噬菌體文庫。通過經氨基酸橋將Fv區的重鏈片段和輕鏈片段連接形成單鏈抗體。此外，可以通過已知的技術產生抗體片段。例如，這些片段包括但不限于F(ab′)2和Fab片段，F(ab′)2片段可通過抗體分子的胃蛋白酶消化來生產，Fab片段可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產生。通過本領域已知的方法還可以將抗體人源化。例如，具有所需結合特異性的單克隆抗體可以通過商業途徑人源化(Scotgene，Scotland；和OxfordMolecular，Palo Alto，Calif.)。完全人抗體如在轉基因動物中表達的抗體也是本發明的特征(參見，例如Green等(1994)Nature Genetics 7，13；以及美國專利No.5,545,806和5,569,825)。
雙鏈核糖核酸(dsRNA)也在本發明的范圍內。這種dsRNA可用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的表達。因此通過給對象施用dsRNA可治療PPAR相關性疾病。術語“dsRNA”指通過靶RNA序列的降解沉默基因表達的雙鏈核糖核酸，這一過程被稱作RNA干擾(RNAi)。RNAi已用于在多種動物模型中(包括秀麗線蟲，斑馬魚和鼠胚胎)以及在其它生物系統中(包括外植的雞神經細胞和哺乳動物細胞培養)沉默基因表達。參見WO99/32619，WO00/44914，WO00/44914，WO00/44895，WO00/63364和WO01/36646A1。
本發明的RNA可以通過本領域熟知的技術合成。參見，例如Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，以及Brennan，美國專利No.6,001,311。RNA也能從表達載體轉錄和使用標準技術分離。使用同樣是本領域熟知的方法可以將本發明的RNA或載體輸送到靶細胞。參見，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.2，139。例如，可以使用脂質體、水凝膠、環糊精、可生物降解的納米囊或生物粘著微球將其引入細胞。或者，通過直接注射或使用輸注泵可以局部輸送RNA或載體。其它的方法包括各種轉運和載體系統的使用，例如使用綴合物和可生物降解的聚合物。
可通過調節15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達來治療PPAR相關性疾病。術語“治療”指將上述15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調節物的一種或幾種，即15-酮前列腺素-Δ13-還原酶底物和抑制劑，施用給患有PPAR相關性疾病、此類疾病的癥狀或具有患這種疾病的傾向的對象，其目的是產生一種治療效果例如治愈、緩解、改變、影響、好轉或預防PPAR相關性疾病、它的癥狀或對它的易患性。“有效量”指對治療對象產生一種治療效果所需的量。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的底物包括15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α、15-酮PGF1α及其結構類似物。
PPAR相關性疾病(失調或病況)的例子包括，但不限于II型糖尿病、高血糖、糖耐量降低、X綜合癥、胰島素抵抗、肥胖癥、血脂異常、高脂血癥、高血糖、高甘油三脂血癥、高膽固醇血癥、低HDL水平、高LDL水平、動脈粥樣硬化(及其引起的病癥如心絞痛、跛行、心臟病發作或中風)、血管狹窄、腸激惹綜合癥、炎癥性疾病(例如炎癥性腸病、類風濕性關節炎、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、骨關節炎、多發性硬化癥、哮喘、脈管炎、缺血/再灌注損傷、凍傷或成人呼吸窘迫綜合癥)、胰腺炎、神經變性性疾病、視網膜病、致瘤性病變、癌癥(例如前列腺、胃、乳房、膀胱、肺或結腸的癌癥或脂肪細胞癌如脂肪肉瘤)、血管發生、阿耳茨海默病、皮膚疾患(例如痤瘡、牛皮癬、濕疹或角化癥)、高血壓、卵巢雄激素過多癥、骨質疏松癥以及骨質減少。
為治療PPAR相關性疾病，可以將含有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調節物和藥學上可接受的載體的藥物組合物施用給需要的對象。可以口服或靜脈輸注，或皮下、肌內、鞘內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內和肺內注射或植入。
藥物組合物可以是無毒的可接受的稀釋劑或溶劑的溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。可以使用的可接受的載體和溶劑為甘露醇、水、林格氏液和等張氯化鈉溶液。另外，可以將不揮發性油類常規用作溶劑或懸浮介質(如甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物在制備血管注射劑是有用的，如天然藥學上可接受的油例如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙烯化形式。這些油溶液或懸浮液也可含長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似的分散溶劑。根據配方的目的，也可使用其它通常使用的表面活性劑例如Tweens或Spans或通常用于藥學可接受的固體、液體的制備的其它類似的乳化劑或生物利用度增強劑，或其它劑型。
所需的劑量取決于給藥途徑的選擇；配方的性質；對象疾病的性質；對象的大小、體重、表面積、年齡和性別；施用的其它藥物；以及主治醫師的判斷。合適的劑量可以是0.01-100.0mg/kg范圍內。鑒于可獲得多種組合物以及多種給藥途徑的不同效能，可以預期所需的劑量有一個寬的變異。使用本領域熟知的對優化的標準經驗常規可以調整這些劑量水平的變異。組合物包囊化在合適的輸送載體中(例如聚合微粒或可植入裝置)可以增加輸送的效率，尤其是對于口服輸送。
利用常規的方法可以將上述藥物組合物配制成用于不同給藥途徑的劑型。例如，可以配制成口服給藥的膠囊、凝膠密封劑或片劑。膠囊可含有任何標準的藥學可接受材料如明膠或纖維素。按照常規的程序通過壓縮所述組合物與固體載體和潤滑劑組成的混合物而配制片劑。固體載體的例子包括淀粉和糖膨潤土。組合物還可以以含有粘合劑如乳糖或甘露醇、常規填充劑和壓片劑的硬殼片劑或膠囊形式給藥。藥物組合物還可以通過胃腸外途徑給藥。胃腸外劑型的例子包括活性藥物或其它熟知的藥學可接受的賦形劑的水溶液，等張鹽水或5％葡萄糖。本領域普通技術人員熟知的環糊精或其它增溶劑可用作治療藥物輸送的藥學賦形劑。
可以在體外和體內評價如上所述的藥物組合物的效能。簡單地說，可以測試本發明藥物組合物體外抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達的能力。對于體內研究，可以將藥物組合物注射進動物(例如，小鼠模型)體內然后評價其治療效果。根據這些結果，可以確定合適的劑量范圍和給藥途徑。
下面具體的實施例應該理解為僅僅是例證本發明，而不是以任何形式限制本發明的其它部分。不需要進一步詳細描述，相信本領域普通技術人員基于本文的描述，可以最大限定的利用本發明。本文所引用的全部出版物以其全部內容并入本文作為參考。
實施例鑒定新的15-酮前列腺素-Δ13-還原酶為鑒定脂肪生成過程中上調的基因，使用小鼠3T3-L1細胞進行mRNA差異展示分析。為誘導脂肪生成，用1μM地塞米松處理3T3-L1細胞并在37℃生長10天。分離了一個199個核苷酸的片段并發現其在誘導后第10天收獲的3T3-L1細胞中高表達。確定這個片段的序列與兩個GenBank的序列，即AK021033和AK020666的片段相同。
相應于該基因編碼區的全長cDNA序列被稱為小鼠PGR-2。這個序列如下分離克隆自3T3-L1脂肪細胞。PCR擴增PGR-2cDNA并通過T4DNA連接酶(Promega)連接入pGEM-T Easy Vector(Promega)。擴增PGR-2cDNA的正向和反向引物序列分別是5’-CGG TAT AGC TTGGGA CGC TA-3’(SEQ ID NO3)和5’-TGC ATG TTA AGA ATC TTTGTG G-3’(SEQ ID NO4)。然后所得構建體(pTE-PGR-2)通過T7和SP6聚合酶測序。然后將PGR-2開放讀框的編碼區亞克隆入表達載體pCMV-Tag2B(Stratagene)中。為構建pFLAG-PGR-2，進行PCR反應，使用pTE-PGR-2作為模板，以及兩個寡核苷酸作為引物，產生PGR-2的HindIII-SalI片段，所述引物為5’-AAC TGA AGC TTC AAG TGATGA TCA TA-3’(SEQ ID NO5)和5’-AGC TCT CCC ATA TGG TCGACC T-3’(SEQ ID NO6)。然后將如此獲得的PCR產物導入pCMV-Tag2B的HindIII-SalI位點，產生pFLAG/PGR-2的融合構建體。最后，通過將pFLAG/PGR-2的HindIII-XhoI片段連接到用SmaI和XhoI(Pharmacia)限制消化的pGEX-4T-3載體制備pGEX-PGR-2構建體。
小鼠PGR-2的推導氨基酸序列，即SEQ ID NO1如上所示。發現小鼠PGR-2與如下兩個蛋白質同源(1)人ZADH1(GenBank登錄號NM152444)，具有～92％同源性，及(2)PGR/LTB4DH或PGR-1，具有～54％同源性。
在3T3-L1細胞的脂肪生成過程中PGR-2表達增加。在誘導脂肪產生后的第6天觀測到最大表達。在這個時間點，觀測到脂滴廣泛積聚在脂肪細胞中。確定了PGR-2的組織分布。其在脂肪組織中高度表達。與野生型小鼠相比，在純合和雜合db/db小鼠中，PGR-2mRNA在網膜脂肪中的量明顯較高。
按照標準方法，將小鼠PGR-2在大腸桿菌中作為GST融合蛋白重組表達。如此獲得的重組PGR-2蛋白用于確定底物特異性和酶動力學。
如下確定酶活性將10μg重組小鼠PGR-2蛋白在37℃在含有0.1M Tris-HCl(pH7.4)，0.5mM NADPH，及0.57mM 15-酮PGE2的反應緩沖液中溫育。在37℃避光進行反應10分鐘，加入700μl含有50mM鄰苯二甲酸氫鉀，pH3.0和1％Tween 20的緩沖液終止反應。加入200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑，60μM吩嗪硫酸甲酯(phenazenemethosulfate)及1％Tween 20的顯色劑以氧化任何未反應的NADPH。用ELISA平板讀數器在490nm測定吸光度。使用含有系列稀釋的NADPH的反應緩沖液生成標準曲線。
使用如上述方法確定PGR-2的底物特異性，不同之處在于將15-酮PGE2用6個前列腺素底物的每一個、3個下游代謝物的每一個、或者白細胞三烯B4替代。15-酮PGE1、15-酮PGF1α和15-酮PGF2α與PGR-2特異反應。相反，6-酮PGF1α、PGF2α、11b-PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGD2、13，14-二氫-15-酮PGE2和白細胞三烯B4沒有檢測到特異活性。
動力學研究表明PGR-2催化15-酮PGE2轉化為13，14-二氫-15-酮PGE2最有效，然后是15-酮PGF1α、15-酮PGE1和15-酮PGF2α。不同于PGR/LTB4DH，PGR-2使用NADPH作為輔因子比NADH更有效。
在3T3-L1的脂肪生成過程中PGR-2的蛋白表達水平上調。在完全分化的脂肪細胞中檢測到最大的PGR-2蛋白水平。在脂肪生成的較早期階段顯著誘導了PPAR-γ。低PGR-2表達定位在前脂肪細胞的核中。高PGR-2表達分布在分化的脂肪細胞的胞質中。
還研究了在人Hep3B細胞中PGR-2表達對調節PPAR-γ轉錄的作用，Hep3B細胞表達內源性人PPAR-α及-γ。發現在Hep3B細胞中PGR-2的過表達抑制PPAR-介導的轉錄激活。即使Hep3B細胞被PPAR-γ激活劑(即BRL49653)刺激，轉錄激活也被抑制。在3T3-L1細胞中獲得了相似的結果。
前列腺素研究了脂肪細胞中前列腺素對PPAR-γ活性的影響。用誘導細胞分化的培養基處理后，在脂肪生成過程中，自第2-4天，3T3-L1細胞用14μM15-酮PGE2、13，14-二氫-15-酮PGE2、15-酮PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGF2α、或4.5μM的BRL49653，即一種PPAR-γ激動劑，進行處理。見Forman等，Cell(1995)83803-812。在第6天，積聚的脂滴用油紅O染色觀察。15-酮PGE2以與BRL49653相似的水平有效增強了脂肪生成。被誘導分化2天后，3T3-L1細胞用報道基因轉染。15-酮PGE2和15-酮PGF2α都顯著增強了內源性PPAR活性。相反，相應的下游代謝物，即13，14-二氫-15-酮PGE2和13，14-二氫-15-酮PGF2α，不能增強PPAR活性。
將螢光素酶報道基因連同與酵母GAL4 DNA-結合結構域融合的PPAR-α、PPAR-γ或PPAR-S的配體結合結構域一起轉染入3T3-L1細胞。15-酮PGE2和15-酮PGF2α激活了PPAR-γ，而PPAR-α程度較低。
還檢測了15-酮PGE2誘導脂肪生成特異性的PPAR-γ靶基因，即IRS-1和-2的蛋白表達的能力。當用胰島素和地塞米松處理時，3T3-L1細胞中檢測到大量的PPAR-γ1和PPAR-γ2蛋白，而單獨用甲基異丁基黃嘌呤(methylisobutylxanthine，MIX)處理則沒有。加入15-酮PGE2和MIX及胰島素和地塞米松顯著增強了PPAR-γ1和PPAR-γ2的表達。15-酮PGE2和BRL49653即使在沒有MIX時也強力誘導了脂肪細胞特異標記aP2的表達。存在胰島素和地塞米松時，BRL49653處理顯著增加了IRS-2表達。15-酮PGE2以與MIX相似的水平增強表達。胰島素/地塞米松或MIX誘導IRS-1表達。PPAR-γ配體，包括15-酮PGE2和BRL49653，不增加IRS-1蛋白的量。
15-酮前列腺素-Δ13-還原酶抑制劑RNA干擾(RNAi)方法用于沉默PGR-2表達。兩個小干擾RNA(siRNA)雙鏈體，即gaguucaguuuaccggaug(SEQ ID NO7)和guucaagugaggacucuuu(SEQ ID NO8)，先退火，然后通過使用Oligofectamine(Invitrogen)的轉染方法導入3T3-L1成纖維細胞或分化的前脂肪細胞。siRNA雙鏈體的轉染降低了PGR-2表達。另一個實驗中，siRNA雙鏈體的轉染增加了PPAR-γ轉錄激活。因此，人們可以通過RNA干擾沉默PGR-2表達而調節PPAR-γ活性。
其它實施方案本說明書中的所有揭示的特征可以任何方式組合。本說明書中揭示的每個特征可以由相同、等價或相似的其它特征替代。因此，除非特別指出，每個揭示的特征只是一類等價或相似特征的例子而已。
根據上述說明，本領域技術人員可以容易地知道本發明的必要特征，并且在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可以根據用途和條件對本發明進行變化和修改。因此，其它實施方案也包括在權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO1的序列或其功能性等價物，其中所述多肽還原15-酮前列腺素但不還原白三烯B4。
2.權利要求1的分離的多肽，其包含與SEQ ID NO1具有至少90％相同性的序列。
3.權利要求2的分離的多肽，其包含與SEQ ID NO1具有至少80％相同性的序列。
4.權利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO1。
5.權利要求4的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
6.權利要求5的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
7.權利要求1的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
8.權利要求7的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
9.權利要求2的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
10.權利要求9的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
11.權利要求3的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
12.權利要求11的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
13.一種抗體，所述抗體特異性結合權利要求1的多肽。
14.權利要求13的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.權利要求13的抗體，其中所述多肽是SEQ ID NO1。
16.權利要求15的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
17.一種用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含一第一鏈多聚核糖核苷酸和一第二鏈多聚核糖核苷酸，其中第一鏈等同于編碼15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的核酸的19到49個連續的核苷酸，而第二鏈與第一鏈互補。
18.權利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是PGR/LTB4DH。
19.權利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是PGR2/ZADH1。
全文摘要
本發明公開了一種分離的多肽，其含有SEQ IDNO1的序列或SEQ ID NO1的功能性等價物，其中所述多肽還原15－酮前列腺素而不還原白三烯B4。本發明還公開了特異性結合所述多肽的抗體以及一種用于抑制15－酮前列腺素－Δ
文檔編號C07K16/40GK1837360SQ200510099218
公開日2006年9月27日 申請日期2005年9月9日 優先權日2005年3月22日
發明者莊立民, 常旭芬, 周文嶺 申請人:莊立民