專利名稱：化學合成多肽的新型大規模分離制備技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制品加工領域，涉及一種對化學合成多肽的新型大規模分離制備技術。
背景技術：
多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。人工方法合成多肽已有百年歷史，伴隨著分子生物學、生物化學技術的飛速發展，多肽的研究取得了驚人的劃時代的進展。人們發現存在于生物體的多肽已有數萬種，并且發現所有的細胞都能合成多肽。同時，幾乎所有細胞也都受多肽調節，它涉及激素、神經、細胞生長和生殖等各個領域。目前，多肽在醫藥中的應用主要集中在多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、多肽導向藥物、細胞因子模擬肽、抗菌活性肽、用于心血管疾病的多肽以及診斷用多肽等等，肽類藥物的應用已涉及24類臨床適應癥。隨著現代技術日新月異，多肽不僅作為新藥開發目標，同時也作為開發其它藥品的篩選目標。據不完全統計，多肽類藥物的年增長率達到19％。多肽藥物與小分子藥物相比，它具有機理明確、副作用小等優點。大量的研究發現，幾乎所有的病毒性疾病和許多疑難疾病都可以用多肽來預防和治療，因此，多肽技術將在預防和治療流行性傳染病和重大疾病等方面有所作為。
自20世紀70年代，隨著多肽的固相合成及高效液相純化、分析技術的發展，多肽作為一個潛在的新藥，越來越引起人們的興趣。目前，人工合成多肽主要以固相合成為主。但是由于在固相合成過程中，出現的各種副反應、消旋化等問題，使得合成此多肽是一種低純度的粗產品，這些雜質包括①非對映異構的(外消旋)多肽；②缺失(不完全)肽；③斷裂肽；④反應副產物；⑤去酰胺多肽；⑥氨基酸側鏈的不完全脫保護所形成的副產物；⑦氧化肽；⑧二硫鍵交換的產物；⑨低聚物和/或聚合物；⑩合成中所用的毒性試劑和溶劑。必須經過純化才能得到高純度產品，由此分離純化問題是化學合成多肽中的最大障礙。
目前，化學合成多肽常規分離方法是采用大分子如蛋白質等化合物的分離方法，其常用分離手段有三種凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜。凝膠過濾色譜多以交聯劑將葡聚糖和瓊脂糖交聯成網狀結構作為介質，根據被分離物的大小差別、形狀差異進行分離，主要用于多肽的脫鹽，凝膠過濾色譜具有介質不帶電荷，分離條件溫和，回收率高，生物活性好等特點；離子交換色譜的分離介質是由二乙胺乙基(DEAE)、季銨乙基(QAE)、羧甲基(CM)、磷酸基(P)、磺丙基(SP)等離子交換基團鍵合到葡聚糖或瓊脂糖凝膠載體而構成，根據帶電被分離物與離子交換劑之間靜電作用力的差異進行分離操作，離子交換色譜具有較高的分離容量，分辨率高，易于放大等特點，廣泛應用于生物大分子的分離純化。反相高效液相色譜的介質是以硅膠作為載體，通過硅烷化反應在硅膠表面鍵合C4、C8、C18烷基或苯基等非極性分子層，根據被分離物疏水性的差別進行分離純化，反相高效液相色譜具有分離效果好，分辨率高、回收率高等特點。目前，化學合成肽的分離最主要制備方法是反相高效液相色譜，其用于放大分離合成多肽，不易規模化，且分離成本過高。主要原因，一方面，由于反相載體擔載量低，本身造價高，規模放大設備要求精度高、投資大，而成為固相多肽分離純化放大的難點之一；另一方面，目前固相多肽分離純化手段單一，有機溶劑用量大，能耗高。目前國內尚無化學合成多肽大規模分離的工業化實例。
國外多肽制造領域蓬勃發展，已經形成一定的產業化規模。著名企業有Bachem公司、Novabiochem公司、Anaspec & ACT公司、Anaspec公司以及American Peptide公司等，其中以Bachem公司規模最大，采用固相合成技術和液相合成技術合成多肽，可以生產從毫克級多肽到幾百公斤級多肽以及噸級中間體的各類與多肽相關的產品，最大單批生產分離純化能力達到公斤級別以上，其分離純化手段主要是以反相高效液相色譜為主。國內多肽合成企業雖有不少，但多肽合成能力最大只達到公斤級，與之相配套的分離規模還停留在克級水平。從總體而言，國內無論在合成能力方面，還是分離能力方面與國外的差距相當巨大。就局部而言，國內現有分離水平也無法與合成能力相適應，已經成為制約固相多肽合成發展的瓶頸之一。
隨著膜技術的飛速發展，采用膜技術替代凝膠過濾色譜已成為可能。如果采用小分子分離純化手段，有效分離固相合成多肽中目標多肽與雜質，實現分離載體的國產化，減少工藝損耗，大幅度降低多肽成本，促進我國多肽藥物的發展，實現高效低成本多肽合成，這將帶來顯著的經濟效益和社會價值。
發明內容
本發明的目的在于克服目前化學合成多肽中分離純化技術的成本高、不易規模化的缺陷，提供一種將離子交換與納濾膜(Nanofiltration Membrane)分離相結合的化學合成多肽分離純化新工藝。
本發明是建立在小分子定向分離思想之上的，其特點在于利用溶液中目標產物與共存雜質之間在物理、化學以及生物學性質的差異，使其在分離操作中具有不同的傳質速率和(或)平衡狀態，從而實現目標化合物分離的目的。
按照本發明的技術方案，本領域內的普通技術人員無需創造性勞動就能實施本發明。尤其是本領域中普通技術人員了解各個應進行的過程，可以獲得目標多肽。
本發明的目的可以通過以下措施來實現一種對化學合成多肽大規模分離的技術，該技術采用常壓或低壓離子交換色譜與納濾相結合的分離方法分離化學合成多肽，具體方法為粗肽溶于水時，采用超聲波振蕩輔助溶解，再以0.22μm微孔濾膜去除固形不溶物，得到澄清粗肽溶液；利用疏水性離子交換樹脂作為分離介質，高徑比為5∶1～20∶1；將粗肽溶液上柱進行離子交換吸附，再采用適當的洗雜與洗脫；根據被分離多肽的分子量大小，選擇不同截留分子量的納濾膜，將離子交換洗脫液進行納濾濃縮脫鹽；最后，將濃縮的多肽溶液經冷凍干燥得到純度95％以上的多肽凍干粉。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中粗肽溶于水時，粗肽與水的質量體積比為1∶5～1∶15。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中分離介質以聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯作為疏水作用骨架。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中分離介質的活性基團是二乙胺乙基、二乙胺基、三乙胺乙基、季銨乙基、磺酸基、磺丙基、磷酸基或羧甲基。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中采用0.001M～0.2M的無機鹽溶液進行洗雜。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中無機鹽為pH2～14的氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中采用0.5M～2M的無機鹽溶液進行洗脫。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中無機鹽為pH2～14的氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其中采用的納濾膜截留分子量為150～1000道爾頓，進行濃縮脫鹽。
本發明相比現有技術具有如下優點本發明突破國內外同行對化學合成多肽分離純化方式的死板和模式化，將離子交換與納濾膜分離相結合，使得本發明的分離純化技術簡便易行，效果佳，不僅其設備投資、運行成本低廉，可以實現百克級、公斤級化學合成多肽的分離，現有技術與本發明對比，如表1所示。通過本發明所得產品在產品收率和產品質量方面都獲得了極好的結果，保證了產品的高品質，本發明的分離成本只有現有技術的7％左右，大幅度降低了化學合成多肽的分離成本。
表1現有技術與本發明的對比
本發明的其他優點將在下面的說明實例中進一步闡述。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步的闡述。實施實例是為說明而非限制本發明。本領域中任何普通技術人員能夠理解這些實施實例不以任何方式限制本發明，可做適當的修改而不違背本發明的實質和偏離本發明的范圍。
實施例11.2千克胸腺五肽粗肽與純水(質量體積比為1∶5)混和，室溫條件下超聲波振蕩，并用0.22μm微孔濾膜過濾，得到澄清粗肽溶液。將6千克磺丙基聚苯乙烯離子交換樹脂裝柱(高徑比為7∶1)備用，然后將粗肽澄清溶液以10ml/min流速上柱吸附。以pH11、0.1M硫酸銨水溶液，20ml/min流速淋洗樹脂，至無雜峰出現；接著用1.0M氯化鈉溶液(pH＝10～12)，10ml/min進行洗脫，離子交換過程采用275nm波長檢測，操作壓力維持在0.2MPa以下，收集胸腺五肽離子交換洗脫液；以截留分子量為150道爾頓的納濾膜，在常溫條件下，對洗脫液進行納濾濃縮脫鹽，納濾操作條件壓力為2.0MPa，流量為3000ml/min；最后將濃縮液冷凍干燥，得到純度為99.1％胸腺五肽純品。
實施實例2150克胸腺素α1粗肽與純水(質量體積比為1∶15)混和，室溫條件下超聲波振蕩，并用0.22μm微孔濾膜過濾，得到澄清粗肽溶液。將700克磺酸基聚丙烯酰胺離子交換樹脂裝柱(高徑比為12∶1)備用，然后將粗肽澄清溶液以1.5ml/min流速上柱吸附。以pH5、0.15M氯化鈉溶液，2ml/min流速淋洗樹脂，至無雜峰出現；接著用1.4M氯化銨溶液(pH＝7～10)，1.5ml/min進行洗脫，離子交換過程采用在常壓條件下，214nm波長檢測；收集胸腺素α1離子交換洗脫液；以截留分子量為1000道爾頓的納濾膜，在常溫條件下，對洗脫液進行納濾濃縮脫鹽，納濾操作條件壓力為1.5MPa，流量為1000ml/min；最后將濃縮液冷凍干燥，得到純度為97.8％胸腺素α1純品。
實施實例3500克亮丙瑞林粗肽與純水(質量體積比為1∶10)混和，室溫條件下超聲波振蕩，并用0.22μm微孔濾膜過濾，得到澄清粗肽溶液。將2500克二乙胺乙基聚丙烯酸酯離子交換樹脂裝柱(高徑比為15∶1)備用，然后將亮丙瑞林粗肽澄清溶液以2ml/min流速上柱吸附。以pH9 0.2M氯化銨水溶液，4ml/min流速淋洗樹脂，至無雜峰出現。接著用2.0M硫酸銨溶液(pH＝9～13)，1ml/min流速進行洗脫，離子交換過程采用220nm波長檢測，操作壓力維持在0.1MPa以下；收集亮丙瑞林離子交換洗脫液，以截留分子量為300道爾頓的納濾膜，在常溫條件下，對洗脫液進行納濾濃縮脫鹽，納濾操作條件壓力為0.6MPa，流量為800ml/min；最后將濃縮液冷凍干燥，得到純度為98.3％亮丙瑞林純品。
權利要求
1.一種對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征在于采用常壓或低壓離子交換色譜與納濾相結合的分離方法分離化學合成多肽，具體方法為粗肽溶于水時，采用超聲波振蕩輔助溶解，再以0.22μm微孔濾膜去除固形不溶物，得到澄清粗肽溶液；利用疏水性離子交換樹脂作為分離介質，高徑比為5∶1～20∶1；將粗肽溶液上柱進行離子交換吸附，再采用適當的洗雜與洗脫；根據被分離多肽的分子量大小，選擇不同截留分子量的納濾膜，將離子交換洗脫液進行納濾濃縮脫鹽；最后，將濃縮的多肽溶液經冷凍干燥得到純度95％以上的多肽凍干粉。
2.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是粗肽溶于水時，粗肽與水的質量體積比為1∶5～1∶15。
3.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是分離介質以聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯作為疏水作用骨架。
4.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是分離介質的活性基團是二乙胺乙基、二乙胺基、三乙胺乙基、季銨乙基、磺酸基、磺丙基、磷酸基或羧甲基。
5.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是采用0.001M～0.2M的無機鹽溶液進行洗雜。
6.根據權利要求5所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是無機鹽為pH2～14的氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
7.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是采用0.5M～2M的無機鹽溶液進行洗脫。
8.根據權利要求7所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是無機鹽為pH2～14的氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
9.根據權利要求1所述的對化學合成多肽大規模分離的技術，其特征是采用的納濾膜截留分子量為150～1000道爾頓，進行濃縮脫鹽。
全文摘要
本發明公開了一種化學合成多肽的新型大規模分離制備技術。該技術采用常壓或低壓離子交換色譜與納濾相結合的分離方法分離化學合成多肽，具體方法為粗肽溶于水時，采用超聲波振蕩輔助溶解，再以0.22μm微孔濾膜去除固形不溶物，得澄清粗肽溶液；利用疏水性離子交換樹脂作為分離介質，高徑比為5∶1～20∶1；將粗肽溶液上柱進行離子交換吸附，再洗雜、洗脫；根據被分離多肽的分子量大小，選擇不同截留分子量的納濾膜，將離子交換洗脫液進行納濾濃縮脫鹽；最后將濃縮的多肽溶液經冷凍干燥即可。本發明技術避免使用昂貴的設備和有毒的有機溶液洗脫。本發明分離介質擔載量大、設備投資少，易于規模化生產，生產成本低的優點。
文檔編號C07K1/18GK1800203SQ200510094770
公開日2006年7月12日 申請日期2005年10月13日 優先權日2005年10月13日
發明者應漢杰, 歐陽平凱, 李鑫, 姚忠, 朱頤申, 沈樹寶, 韋萍 申請人:南京工業大學