專利名稱：鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物中與抗脅迫相關的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及鹽芥中的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽、抗旱性提高植物中的應用。
背景技術：
研究表明，擬南芥的一些近親具有極強的耐逆性，并且較適宜進行遺傳操作。其中，鹽生植物-鹽芥與擬南芥極為相似，基因序列同源性可達70-90％，不僅具有遺傳學模式植物令人滿意的形態、生長特性及遺傳特點，還對海水的高鹽濃度具有較強的耐受能力。因此，鹽芥不但是一種可供研究植物自然耐鹽機制的優異遺傳模式植物，更是一種分離優異耐鹽、抗旱相關基因的資源植物。
發明內容
本發明的目的是提供一個鹽芥的耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白。
本發明所提供的耐鹽、抗旱基因，名稱為eIF5A1，來源于十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由671個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-414位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。
本發明耐鹽、抗旱基因所編碼的蛋白eIF5A1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。序列表中的SEQ ID №2由137個氨基酸殘基組成。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增eIF5A1中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
利用植物表達載體，將本發明的耐鹽、抗旱基因導入植物細胞，可獲得對高鹽、干旱耐受力增強的的轉基因細胞系及轉基因植株。
所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的可參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
使用eIF5A1構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
攜帶有本發明eIF5A1的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻，小麥等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜等雙子葉植物。
本發明所提供的鹽芥的耐鹽、抗旱基因eIF5A1經和擬南芥基因組基因的序列比對發現，該基因實際上為翻譯其始因子5A(Translation initiation factor-5A，eIF5A)的編碼基因。通過對轉化本基因后所得到的轉基因擬南芥植株的進行各項脅迫試驗，證明本基因在轉入植物后可顯著提高植株的耐鹽，抗旱性。本發明為人為控制植物中抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物(特別是水稻、小麥、油菜等農作物)中發揮重要的作用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
圖1A為載體pCB2004的物理圖譜圖1為播種于含0mM NaCl的MS固體培養基上的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥的發芽及生長情況圖2為為播種于含100Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固體培養基上的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥的發芽及生長情況圖3為為播種于含150Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固體培養基上的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥的發芽及生長情況圖4為為播種于含200Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固體培養基上的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥的發芽及生長情況圖5為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經200Mm NaCl高鹽脅迫處理2周后的生長情況圖6為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經200Mm NaCl高鹽脅迫處理18天后的生長情況圖7為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經200Mm NaCl高鹽脅迫處理18天后植株高度的測量結果圖8為eIF5A1轉化體和野生型擬南芥發芽后經100mM NaCl高鹽脅迫處理8天后的根系生長情況圖9為eIF5A1轉化體和野生型擬南芥發芽后經100mM NaCl高鹽脅迫處理12天后繪制的根系生長曲線圖10為eIF5A1轉化體和野生型擬南芥發芽后經100mM NaCl高鹽脅迫處理12天后側根數量統計結果圖11為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經2周干旱處理后的生長情況圖12為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經2周干旱處理后恢復正長生長條件后收獲的果莢圖13為播種于土壤中的eIF5A1轉化體和野生型擬南芥經2周干旱處理后恢復正長生長條件后收獲的果莢的長度測量結果圖14為eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型擬南芥RT-PCR檢測結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、鹽芥耐鹽、抗旱基因eIF5A1的獲得一、鹽芥cDNA文庫的構建提取鹽芥總RNA，反轉錄得到鹽芥全基因組的cDNA，采用高通量構建載體的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，鄭文嶺，馬文麗；通路克隆系統DNA重組技術的新進展.中國生物工程雜志(2003)，第23卷第7期)，將鹽芥cDNA先重組克隆到pDONR207載體(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文庫，然后再以重組克隆將整個cDNA文庫穿梭至含有35S啟動子的植物過量表達雙元載體pCB2004(物理圖譜如圖1A所示)中，得到鹽芥cDNA文庫。上述重組反應完全按照Invitrogen提供的實驗指南進行。
二、將鹽芥cDNA文庫轉化野生型擬南芥將步驟一構建的鹽芥cDNA文庫穿梭到雙元載體pCB2004中，電轉化至農桿菌C58C1，采用擬南芥花序浸花轉化的方法(floral dip method)(Steven J.Cloughand Andrew F.BentFloral dipa simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant JournalVolume 16 Issue6 Page 735-December 1998)大規模轉化擬南芥。
三、擬南芥耐鹽轉化體的篩選1、擬南芥轉化體庫的創建在土壤中大規模播種步驟二獲得的轉化有鹽芥cDNA文庫的擬南芥轉化體的種子，在種子發芽后約5天，表面噴灑濃度為0.2％的除草劑(glufosinate ammonium，商用名為Liberty，法國Aventis作物科學公司)進行篩選，以野生型擬南芥為對照。約1周后可以觀察到轉化體植株和野生型植株具有明顯差別，野生型植株在0.2％除草劑glufosinate條件下不能存活，而轉化體植物不受影響，可以正常生長。以200株轉化體植株為一單位進行收種。
2、高通量方法初篩耐鹽轉化體植株下述各實驗中所用的種子均用如下方法進行表面滅菌處理用50％消毒液(廣州藍月亮有限公司)在室溫下滅菌15分鐘，再用經滅菌的純凈水沖洗4-5遍。
將經消毒的步驟1收獲的種子在4℃下放置3天，以使種子發芽一致。然后將種子播種于MS基本培養基(含2％蔗糖，1.5％瓊脂粉，pH值5.8，高溫蒸汽滅菌15分鐘)上使其發芽，種子發芽生長條件為22℃，光照培養。發芽后，再將其播種于含有220mM NaCl和25mg/L除草劑glufosinate的MS培養基上高通量篩選耐鹽轉化體，每個培養皿播3,000粒種子。待植株生長10天后，將存活下來的轉化體植株移栽到土中，并單株收種。
3、耐鹽轉化體的復篩對每一可能的耐鹽轉化體，選取其大約25至30粒種子用上述步驟2的方法進行表面滅菌后，播種于不同濃度的含鹽的MS培養基上，鹽濃度在0-200mM NaCl之間。種子生長一周左右后進行觀察并記錄相應數據，觀察10天后，統計存活的植株數量，計算存活植株數量和死亡植株數量，兩者之間比例高于3∶1的符合分離比例，可能為耐鹽株系，將存活植株移入含有25mg/L除草劑glufosinate的MS培養基上，一周后觀察小苗存活情況。如果小苗全部存活，表明上述可能的耐鹽株系的耐鹽性狀和抗除草劑基因連鎖，符合篩選要求。最后，移栽以上耐鹽株系到土壤中，單株收種，將種子保存備用。
四、耐鹽、抗旱基因eIF5A1的獲得根據鹽芥cDNA在載體pCB2004中插入位點的上、下游序列設計引物擴增cDNA序列，引物序列如下Omega5’TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA3’；attB25’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’提取步驟三篩選得到的耐鹽轉化體的基因組DNA，并以此為模板，在引物Omega和attB2的引導下進行PCR擴增，50uLPCR擴增體系為，0.25uL ExTaq聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)，2uL基因組DNA，10*PCR緩沖液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用雙蒸水將反應體系補充至50uL。用PCR技術擴增轉入的鹽芥cDNA。PCR反應條件為先95℃ 1min，再66℃ 1min，最后72℃ 2min，共40個循環。反應結束后，對PCR產物進行測序，測序結果表明該基因具有序列表中的SEQ ID№1的核苷酸序列，由671個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-414位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。在網站TAIR(www.arabidopsis.org)上和擬南芥基因組基因組序列進行序列比對，比對結果表明該基因與擬南芥中翻譯其始因子5A(Translation initiation factor-5A，eIF5A)的編碼基因同源，將該耐鹽、抗旱基因命名為eIF5A1。
實施例2、轉化有基因eIF5A1的擬南芥在培養基上的耐鹽實驗將基因eIF5A1轉化擬南芥，方法為用實施例1的方法構建eIF5A1的過量表達載體，將eIF5A1克隆入含有35S啟動子的過量表達雙元載體pCB2004中，得到eIF5A1的過量表達載體，命名為pCB2004/eIF5A1。經測序鑒定正確后，將pCB2004/eIF5A1電轉化入農桿菌，再用花序轉化方法(floral dip method)轉化野生型擬南芥植株。用此種方法將基因eIF5A1轉化擬南芥，然后對轉基因植株進行耐鹽實驗，方法為選擇其中一株轉基因植株(命名為ST6-32)，將其種子分別播種于含0Mm NaCl、100Mm NaCl+25mg/L glufosinate、150Mm NaCl+25mg/L glufosinate、200Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固體培養基上，以野生型擬南芥為對照，在常規條件下培養，觀察并記錄發芽及生長情況，結果如圖1-圖4所示(圖中，黑線上方播種的是轉基因植株ST6-32，黑線下方播種的是野生型植株(WT))，eIF5A1轉化體和野生型植株的種子在無鹽培養基上皆可正常發芽；eIF5A1轉化體在含NaCl 100mM和除草劑glufosinate 25mg/L的培養基上可以完全存活，而野生型種子的發芽和幼苗的生長受到抑制；在含NaCl 150mM和除草劑glufosinate 25mg/L的培養基上，eIF5A1轉化體可以存活(有1/3未存活幼苗為WT)，也抗除草劑，而野生型種子的發芽及幼苗的生長受到強烈抑制；在含NaCl 200mM和除草劑glufosinate 25mg/L的培養基上，僅有eIF5A1轉化體可以部分存活。上述實驗證明耐鹽性狀和轉入的基因eIF5A1連鎖，eIF5A1可顯著提高植物的耐鹽性。
實施例3、轉化有基因eIF5A1的擬南芥在土壤中的耐鹽實驗將實施例2獲得的eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型擬南芥(WT)的種子播種于土壤中，在相同條件下培養，待生長至約10片葉子大小時，將兩種擬南芥植株移至含200mM NaCl的土壤中繼續進行培養，觀察并記錄其生長情況，經鹽脅迫處理2周后的植株的生長情況如圖5所示(每盆上方為ST6-32，下方為WT)，eIF5A1轉基因植株ST6-32在200mM鹽濃度脅迫下，仍然繼續生長，開花結果，而在同樣條件下，野生型植株的生長則受到抑制，生殖生長幾乎完全受到抑制；鹽脅迫18天后的植株生長情況如圖6所示，統計此時兩種植株的高度，結果如圖7所示(上方為ST6-32，下方為WT)，eIF5A1轉基因植株ST6-32顯著高于野生型植株。上述耐鹽實驗進一步證明eIF5A1轉基因植株的耐鹽性顯著強于野生型植株。
實施例4、轉化有基因eIF5A1的擬南芥在鹽脅迫下的根系發育將實施例2獲得的eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型擬南芥(WT)的種子播種于MS固體培養基中，在相同條件下培養，待發芽后，將兩種擬南芥植株移至含100mMNaCl的MS固體培養基中繼續進行培養，觀察并記錄根系的生長情況。經鹽脅迫處理8天后的根系的生長情況如圖8所示(圖中ST6-32為eIF5A1轉化體，WT為野生型擬南芥)，eIF5A1轉化體ST6-32的根系明顯優于野生型植株的根系；根據所記錄的經鹽脅迫處理12天的數據繪出eIF5A1轉化體ST6-32和野生型的根系生長曲線，如圖9所示，表明eIF5A1轉化體ST6-32根系的延伸速度顯著高于野生型，說明其耐鹽性顯著高于野生型；經鹽脅迫處理12天后eIF5A1轉化體ST6-32和野生型的側根數量的統計結果如圖10所示，eIF5A1轉化體ST6-32的側根數量顯著高于野生型。上述結果證明eIF5A1轉基因植株的耐鹽性顯著強于野生型植株。
實施例5、轉化有基因eIF5A1的擬南芥的干旱脅迫實驗將實施例2獲得的eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型擬南芥(WT)的種子播種于土壤中，在相同條件下培養，待生長至三星期大小時，對兩種擬南芥植株實施干旱脅迫，連續兩個星期不澆水，經鹽脅迫處理2周后的植株的生長情況如圖11所示，野生型植株出現萎焉，而eIF5A1轉化體ST6-32在相同的脅迫處理條件下則生長良好，表明該來源于鹽芥的基因eIF5A1可在擬南芥中表達，不但可增強轉基因植株的耐鹽性，還可增強其耐旱性。
經過上述干旱脅迫處理后，恢復澆水，兩種擬南芥植株雖然可以恢復生長，但野生型的結實受到嚴重影響，其果莢(圖12)和種子發育受到抑制，測量eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型植株所結的果莢的長度，結果如圖13所示，表明經干旱脅迫處理后，野生型植株的果莢大小顯著小于eIF5A1轉基因植株。
實施例6、RT-PCR檢測eIF5A1在擬南芥的表達情況提取eIF5A1轉基因植株ST6-32和野生型擬南芥的RNA，并分別以兩種RNA為模板，在引物attB15’-acaagtttgtacaaaaaagcaggct-3’和引物attB25’-tacaagaaagctgggtttttttttttt-3’的引導下，進行RT-PCR檢測，以Tubulin為參照(擴增Tubulin的引物序列為β-tubulinP15’-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3’和β-tubulinP25’-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3’)，結果如圖14所示(TH cDNA為擴增的目的產物eIF5Al，Tubulin為參照)，轉基因植株ST6-32可擴增出eIF5A1，表明eIF5A1轉入擬南芥后可在35S啟動子作用下過量表達。
序列表<160>2<210>1<211>671<212>DNA<213>十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)<400>1gctggtaaca tccgtaaggg tggtcacatc gtcatcaagg gccgtccctg caaggttgtt 60gaggtttcga cttcgaagac tggcaagcac ggtcacgcga aatgtcactt tgttgccatt120gatatcttca ctgcgaagaa gctcgaggat atcgttccct cttcccacaa ttgtgatgtt180ccccatgtga atcgtgttga ttaccagttg attgatatct ccgaggatgg ctttgttagc240cttctgaccg acagtggtgg caccaaggac gatctcaagc ttcccaccga tgataatctg300gctgctctga tgaagagtgg attcgaggag ggtaaggatg ttgtggtgtc tgtcatgtcc360tccatgggag aggagcagat ctgtgccgtc aaggaagttg gtggtggcaa gtaaacaaag420tatcgttctc tttacacaga ggataatatt attaccagtt tgacgacagt tggtcaatgt480tataagaaca agaaaaaatg tttttttcct ttttctaatt tagaccattt gtgtgtgttt540cctgttgcaa gacaaacata tctattggtt ttggattgtt gaaaagtttg gtgttgaaac600agggaatatt tttcctttga tcctatgtta tctcttaatc ctttcacaaa aaaaaaaaaa660aaaaaaaaaa a 671<210>2<211>137<212>PRT<213>十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)<400>2Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro
1 5 10 15Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His20 25 30Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Thr Ala Lys Lys Leu35 40 45Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn50 55 60Arg Val Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser65 70 75 80Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Thr85 90 95Asp Asp Asn Leu Ala Ala Leu Met Lys Ser Gly Phe Glu Glu Gly Lys100 105 110Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys115 120 125Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys130 13權利要求
1.鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的耐鹽、抗旱基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權利要求1所述耐鹽、抗旱基因的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質。
4.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的表達載體。
5.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的轉基因細胞系。
6.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的宿主菌。
7.一種培育耐鹽、抗旱植物的方法，是利用植物表達載體將權利要求1或2所述的耐鹽、抗旱基因導入植物細胞，獲得對高鹽、干旱耐受力增強的的轉基因細胞系及轉基因植株。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述被轉化的植物宿主為水稻、小麥、擬南芥、油菜或大豆。
全文摘要
本發明公開了鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。本發明的基因將在培育耐鹽、抗旱性增強的植物(特別是水稻、小麥等農作物)中發揮重要的作用。
文檔編號C07K14/415GK1715411SQ200510083039
公開日2006年1月4日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者杜金, 向成斌 申請人:中國科學技術大學