專利名稱：高含支鏈氨基酸的小肽的設計與制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術與精細化工領域，特別涉及到高F值小肽(補正后稱高含支鏈氨基酸的小肽)的設計、生產方法以及應用這些方法生產制備的高F值小肽。
背景技術：
具有醫療效果的高F值小肽(High Fischer Ratio)是指肽內三種支鏈氨基酸(L，I，V)的分子量之和對該多肽內芳香族氨基酸分子量之和的比值大于20。因為支鏈氨基酸主要由肌肉同化，而芳香族氨基酸則由肝臟同化。所以高F值小肽適用于肝臟病人包括各型肝病、肝硬化、肝昏迷、肝癌等病人使用。同時也適合于運動員劇烈競賽后解除疲勞、恢復體力使用。自然界不存在游離高F值小肽，需要從天然存在的各種蛋白質中酶切制取；但至今沒有獲得化學結構明確、成份單一的高F值小肽。所以臨床上以混合支鏈氨基酸形式供給肝病病人使用。可是游離氨基酸在腸道的吸收速率低于小肽。
為了能夠提供化學結構清楚、化學成份單一的高F值小肽滿足市場需求，本發明通過人為設計并進一步采用化學合成法或基因工程菌發酵生產出高F值小肽。
發明內容
人造高F值小肽的設計、生產方法以及應用這些方法生產制備的高F值小肽。
1.設計可根據不同需要人為設計出長短不一、組成相異的高F值小肽。例如本發明中業已生產的高F值小肽(HFT)，其長度為5個氨基酸(ELVIR)，由三種支鏈氨基酸各一個和谷、精氨酸各一個組成，內無任何芳香族氨基酸。該小肽內氨基酸排列順序、長度可變換甚至僅由一種支鏈氨基酸組成。因此設計出的小肽是多種多樣。
2.生產2.1.化學合成法無論是手工合成或應用多肽自動合成儀合成，都可以生產出該小肽。
2.2.生物工程菌發酵法該法包含基因克隆、表達載體構建、宿主細胞選擇、重組子鑒定，發酵工藝條件和產品分離純化工藝等。其基因的核苷酸順序為GAATTCATGCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCTAAAAGCTT本發明中采用基因工程大腸桿菌。本發明使用表達載體為pET-28a(+)，受體菌為大腸桿菌BL21(DE3)。由于商品化pET表達載體有幾十種，市售的受體菌亦多種多樣；所以替換該表達載體或該表達載體上某一個遺傳元件如啟動子、抗性基因等都易于操作，也可獲得高F值小肽。
另外，采用大腸桿菌以外的宿主如酵母、真菌、動植物細胞也能發酵生產高F值小肽。
3.用途3.1.用于運動員解除疲勞。
3.2.用于肝炎、肝癌，體弱等病人輸液和口服液。
圖1.采用多肽合成儀生產的ELVIR的高效液相圖，圖中第四個峰為HFT，出峰時間是2.090，純度達98％圖2.ELVIR目的基因序列及表達載體構建圖3.重組ELVIR肽的高效液相圖，圖中第四個峰(2.065)為重組5肽ELVIR
具體實施例方式
實施例1.化學合成1.1.應用多肽自動合成儀將設計的氨基酸順序ELVIR輸入儀器，使用方法按儀器說明書進行。
1.2.手工合成采用固相合成法。
1.2.1.保護氨基酸的氨基。將E，L，V，I，R分別與叔丁氧羰基按等克分子投料，生成Boc-aa.
1.2.2.第一輪將Boc-R與氯甲基化聚苯乙烯樹脂(固相)反應，得Boc-R-芐酯樹脂。然后用HCl-HAc洗脫去Boc保護基團及未反應的Boc-R，得R-芐酯。
1.2.3.第二輪將Boc-I與R-芐酯樹脂在縮合劑DCCI(N，N-二環己基羰基亞胺)作用下生成Boc-I-R-芐酯樹脂。然后用HCl-HAc洗脫去Boc保護基團及未反應的Boc-I。
1.2.4.第三輪至第五輪將Boc-V，Boc-L，Boc-E依順序按第二輪操作逐一縮合得到ELVIR-芐酯樹脂。
1.2.5.獲取(5肽)產物將ELVIR-芐酯樹脂懸浮在無水三氟乙酸中通入干燥的溴化氫或在甲醇中通入干燥的氨氣進行氨解，使5肽從樹脂上解離下來，同時除去保護基得合成5肽ELVIR。
分析結果表
實施例2.生物工程菌發酵法2.1.基因克隆將設計好的高F值小肽的氨基酸順序轉換為其編碼的DNA順序，轉換需依照遺傳密碼表進行，且顧及宿主密碼偏愛性；然后在其5’端與3’端分別加上限制性內切酶EcoR I和Hind III的編碼序列GAATTC和AAGCTT；將此段DNA序列輸入DNA自動合成儀合成第一條DNA模板鏈；繼之合成其互補鏈。所得DNA經電泳或層析純化后再用2倍體積冷乙醇沉淀備用。其基因的核苷酸順序為GAATTCATGCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCTAAAAGCTT2.2.表達載體的構建選擇Novagen公司商品化的質粒pET-28a(+)為載體，將目的基因和載體DNA進行雙酶切(Eco R I+HindIII)后用T4DNA連接酶連接，連接反應的產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，再用化學法轉化進感受態大腸桿菌BL21(DE3)。轉化反應之后平鋪于含卡那霉素(30ug/ml)的LB固體平板上，置37℃恒溫箱培養，隨后從該平板上挑選10個單菌落進行搖瓶培養，依堿法制備各菌落的質粒DNA，采用Sanger雙脫氧末端終止法測定目的基因的核苷酸排列順序。保存序列正確的菌落待用。
2.3.挑選生產菌株將陽性克隆接種于含卡那霉素(30ug/ml)的LB培養液的搖瓶，置于培養箱37℃震蕩培養，待菌細胞密度達OD600＝0.6左右加入誘導劑IPTG達1mM，繼續培養3小時。然后離心收集菌體，7000g，10min。再用20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗滌菌泥2次。經超聲波(600Hz，20min，5sec間隔)破細胞后離心獲得胞含體(12krpm，10min)。洗滌胞含體后用6xSDS上樣緩沖液混勻，經SDS-PAGE鑒定，挑選出符合試產要求的菌落。
2.4.發酵生產以LB培養基為基礎培養基，發酵液體積視需求而定，裝罐料液不超過罐體60％，若生產需要可設一級、二級種子罐和發酵罐。裝料后通入高溫濕熱水蒸汽滅菌(121℃，30’)，滅菌后待料液溫度降至37℃時，按10％比例接進種子液，并加進卡那霉素(30ug/ml)和葡萄糖(0.05％)，控制溫度37℃、溶氧(DO)40％以上，用氨水維持pH7.5，攪拌速率與通氣量調節由溶氧濃度決定。當發酵液中菌密度達到OD值為1.0時加入誘導劑IPTG達1mM，繼續培養8-16h左右。發酵過程需在線或離線監測發酵動態。
2.5.獲得胞含體發酵完畢，下罐并采用離心收集菌體，照2.3.操作。
2.6.獲取融合蛋白干凈的胞含體稱重后，按1∶10的質量體積比加入6M鹽酸胍水溶液，在冰浴條件下磁力攪拌4小時。變性完畢透析脫鹽，采用尿素梯度濃度(4M，2M，0.5M，0M)的Tris-HCl(pH 7.5)的復性液邊透析邊復性，每種尿素濃度液中透析復性時間不少于3小時。逐步復性之后離心(12Krmp，10’)去沉淀物。SDS-PAGE檢測。如果電泳膠上主帶雖明顯雜帶也存在，可通過金屬螯合柱或離子交換層析柱純化出目標融合蛋白。
2.7.獲取目標高F值小肽按質量比1∶200用酶量，將胰蛋白酶加入上述融合蛋白液中，在25℃酶解4小時以上。酶解后樣品需冷凍干燥。冷干樣品重溶于小體積水中，過SephadexG10層析柱(10×100mm)，流速為，收集第4峰。再冷干后用HLPC檢測，并以化學合成品為對照，兩者出峰時間相同。
分析結果表
實施例3實驗材料1.動物健康昆明種小鼠雄性，體重19-22g。
2.樣品本發明所生產的高F值小肽(ELVIR)。
3.儀器、玻璃缸、膠泥、線繩、秒表。
實驗方法1.小鼠游泳試驗分組及給藥挑選健康小鼠100只，隨機分成5組，每組20只，將本樣品分成4個劑量組，分別腹腔注射給藥，給藥劑量為12.8mg/kg、6.4mg/kg、6.2mg/kg、1.6mg/kg。連續給藥28天，空白對照組同體積的生理鹽水，給藥容量均為10mg/kg。
2.游泳時間的測定塑料桶裝水，深25cm、水溫20℃、10％負重(膠泥)。每次給藥后1h分別進行游泳試驗，每次每組取兩只小鼠置于水中，游泳記錄每只小鼠自投入水中頭部不浮出水面的時間不游泳時間，共觀察35分鐘，35分鐘尚未沉入水底者按35分鐘計算。
3.統計方法結果均以x±s表示，進行組間的顯著性檢驗，采用兩兩比較的t檢驗，全部數據均使用spss統計軟件處理，以p＜0.05為有統計學顯著差異。
實驗結果結果見表，各給藥組均能顯著延長小鼠的游泳時間。
樣品對正常小鼠游泳時間的影響。
X±S、n＝20、P＜0.05、p＜0.01、Compared with NS結論該樣品對小鼠游冰時間具有明顯的延長作用，但實驗結果差異顯著。動物體重差異不會影響結果，樣品有抗疲勞，提高耐力的作用。
權利要求
1.一種高F值小肽的生產方法，其特征在于，采用人工合成方法生產，而不是從天然存在的蛋白質中酶切制取。
2.如權利要求1所述的生產方法，其特征在于，所述的人工合成方法是化學合成法。
3.如權利要求2所述的生產方法，其特征在于，利用多肽自動合成儀進行化學合成。
4.如權利要求2所述的生產方法，其特征在于，所述的化學合成法采用一種固相合成法。
5.如權利要求4所述的生產方法，所述的固相合成法的具體步驟如下先將組成該肽的五種氨基酸分別用叔丁氧羧基保護各自氨基成BOC-AA，再取BOC-R與氯甲基苯乙烯樹脂反應得BOC-R-芐脂；經HCl-HAc脫去BOC成R-芐脂；繼續用BOC-I經縮合劑DCCI與R-芐脂成BOC-I-R-芐脂，再去BOC得I-R-芐脂。依此進入第三輪得VIR-芐脂，直至得ELVIR-芐脂；在甲醇中通入干燥氨氣進行氨解得ELVIR。
6.如權利要求1所述的生產方法，其特征在于，所述的人工合成方法是基因工程菌發酵法。
7.如權利要求6所述的生產方法，所述的基因工程菌發酵法包括a、高F值小肽相關基因設計與合成，b、構建高F值小肽表達載體，c、用所述表達載體轉化宿主構建基因工程菌，d、利用所述基因工程菌發酵生產高F值小肽。
8.如權利要求7所述的生產方法，其中高F值小肽為ELVIR。
9.如權利要求7或8所述的生產方法，所述相關基因結構為GAATTCATGCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCGAACTGGTGATTCGCTAAAAGCTT
10.如權利要求7所述的生產方法，所述的表達載體為pET-28a(+)。
11.如權利要求7或10所述的生產方法，所述的宿主為大腸桿菌為BL21(DE3)。
12.如權利要求7所述的方法，其中發酵生產高F值小肽的工藝流程如下挑選單菌落工程菌，進行種子液和放大培養，誘導表達，下罐收集菌體進行細胞破碎，離心得胞含體，破胞含體及目標蛋白變性與復性，過Ni螯合柱獲目標蛋白原，進行trypsin酶解后過Sephadex G10柱獲高F值小肽，再脫鹽及去雜，冷凍干燥樣品，質檢得最終樣品。
13.按照權利要求1-12任一項所述的生產方法所制備的高F值小肽。
14.如權利要求13所述的高F值小肽，其是ELVIR。
全文摘要
本發明涉及到高F值小肽的設計與制備方法，特別涉及到一個五肽(ELVIR)應用化學合成法和基因工程菌發酵法制備技術以及由此制備的高F值(ELVIR)小肽。應用化學合成法制備高F值小肽ELVIR，采用手工固相合成或以自動合成儀合成。應用基因工程菌發酵制備高F值小肽ELVIR，本發明首先設計并合成一個長度為96bp的DNA片段，通過雙酶切(EcoRI+HindIII)連接于pET28(+)a中，以大腸桿菌BL21(ED3)為受體菌，經發酵9小時菌體OD為0.42下罐，獲包含體為3.2g/L。采用6M鹽酸胍變性包含體蛋白后，經逐步復性獲得粗蛋白；用金屬螯合柱得目標蛋白原，再用trypsin酶切，切后上Sephadex G10柱，收集第四個峰；該峰樣上HPLC柱，出峰時間2.07分。樣品經動物實驗表明生物活性明顯。
文檔編號C07K1/00GK1891712SQ200510082710
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月7日 優先權日2005年7月7日
發明者陳勁春, 李冬冬, 劉元鋒 申請人:北京化工大學