乳腺癌相關(guān)蛋白、編碼該蛋白的基因和診斷乳腺癌的方法

專利名稱：乳腺癌相關(guān)蛋白、編碼該蛋白的基因和診斷乳腺癌的方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的乳腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)(BCRP)，其編碼基因，和具有固定BCRP基因片段的微陣列。并且，本發(fā)明涉及通過(guò)使用特異性識(shí)別BCRP的抗體診斷乳腺癌的方法和通過(guò)確定是否表達(dá)BCRP基因診斷乳腺癌的方法。
2.相關(guān)領(lǐng)域的說(shuō)明考慮到晚期癌癥的時(shí)候，乳腺癌僅次于肺癌被最常診斷并且在女性中發(fā)生。在過(guò)去50年以來(lái)乳腺癌的發(fā)生率穩(wěn)定增加，尤其正在韓國(guó)泛濫。一些危險(xiǎn)因素會(huì)增加?jì)D女發(fā)生乳腺癌的機(jī)會(huì)。這些因素包括衰老，以往的乳腺癌病史，暴露于射線，乳腺癌家族史，社會(huì)和經(jīng)濟(jì)階層，懷孕，月經(jīng)初潮，絕經(jīng)，或在30歲后第一次懷孕。
雖然已知乳腺癌是不均一的疾病而且雌性激素誘導(dǎo)不同的乳房腫瘤，但還有許多其它公認(rèn)的因素和未知的因素。致癌基因中已鑒定的變化包括HER-2與上皮生長(zhǎng)因子受體基因的擴(kuò)增和細(xì)胞周期蛋白D1的過(guò)度表達(dá)。致癌基因的過(guò)度表達(dá)與相當(dāng)輕的預(yù)后相關(guān)。相似地，腫瘤抑制基因，例如p53的遺傳改變或丟失，已證明與乳腺癌相關(guān)并且與更輕的預(yù)后相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)稱作BRCA1和BRCA2的兩種基因，是絕經(jīng)前的家族乳腺癌預(yù)測(cè)因子。乳腺癌的早期診斷對(duì)保證最好的治療結(jié)果是重要的。許多具有先進(jìn)的醫(yī)療保健系統(tǒng)的國(guó)家有篩選乳腺癌的程序。與治療的選擇和預(yù)后相關(guān)的信息，例如，測(cè)量雌激素和孕酮受體的狀態(tài)同樣包括在該程序中。
治療乳腺癌的主要目標(biāo)在于提高早期檢測(cè)成功率，發(fā)現(xiàn)能夠追蹤疾病進(jìn)程和鑒別復(fù)發(fā)的新型非侵入性標(biāo)記，和發(fā)現(xiàn)對(duì)仍然具有非常低的5年生存率的進(jìn)展疾病的改進(jìn)治療。需要鑒定癌細(xì)胞的更多特異性靶位，理想的是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的靶位，以通過(guò)新的前矚性的方法，例如免疫療法和導(dǎo)向毒素，來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞。
研究乳腺癌特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌特異性表達(dá)的蛋白，藉此完成了本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明提供在乳腺癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的分離的蛋白。
本發(fā)明還提供了編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列，和固定有編碼上述蛋白的核酸序列或其片段的微陣列。
本發(fā)明還提供通過(guò)使用與該蛋白特異性結(jié)合的抗體診斷乳腺癌的方法。
本發(fā)明還提供通過(guò)確定蛋白的編碼基因是否在乳房組織中表達(dá)來(lái)診斷乳腺癌的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供具有SEQ ID No.4的氨基酸序列和特異性對(duì)乳腺癌表達(dá)的分離的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供檢測(cè)乳腺癌存在的方法，該方法包括將特異性結(jié)合于本發(fā)明的蛋白的抗BCRP抗體與從人乳房組織分離的多肽樣品反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供用于乳腺癌的診斷或治療的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸，包括至少10個(gè)源于本發(fā)明的多核苷酸的連續(xù)核苷酸，固定有所述多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸的微陣列，和包括該多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸的試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供診斷乳腺癌的方法，該方法包括從樣品中獲得乳房組織樣品；測(cè)定在乳房組織樣品中本發(fā)明蛋白的表達(dá)水平并且根據(jù)結(jié)果判斷乳腺癌的存在。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的上述和其它的特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)參照附圖描述其詳細(xì)的示范性的實(shí)施方案將會(huì)變得更顯而易見

圖1顯示用乳腺癌關(guān)聯(lián)蛋白(breast cancer related protein)(BCRP)基因特異性探針對(duì)不同正常細(xì)胞的Northern印跡結(jié)果；
圖2顯示用BCRP基因特異性探針對(duì)不同癌細(xì)胞的Northern印跡結(jié)果；圖3至5顯示細(xì)胞中表達(dá)BCRP的部位，通過(guò)在用BCRP-pFLAG載體DNA轉(zhuǎn)染的各結(jié)腸癌細(xì)胞系克隆A(CA)，原代培養(yǎng)的正常腎細(xì)胞和HEK 293細(xì)胞系中觀察到的FITC熒光進(jìn)行鑒定；圖6顯示在用BCRP基因轉(zhuǎn)染的CA細(xì)胞系中BCRP的表達(dá)水平和在BCRP過(guò)度表達(dá)時(shí)，不同細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，其經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定；圖7顯示在HEK 293，CA和CX-1(分別稱作A，B和C)細(xì)胞系中BCRP基因的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞系的增殖的作用，其通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定法(MTT測(cè)定)鑒定；圖8至圖10顯示用BCRP-pFLAG載體DNA轉(zhuǎn)染的HEK 293，CA和CX-1的FACS分析結(jié)果，其通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定來(lái)確定轉(zhuǎn)染BCRP的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞系的作用；圖11和圖12顯示BCRP的表達(dá)水平，其通過(guò)從兩位患者的乳腺癌組織和正常組織分離RNA，并用SEQ ID Nos.4和5的寡核苷酸作為引物進(jìn)行RT-PCR來(lái)鑒定；圖13是BCRP的Northem印跡測(cè)定的結(jié)果，是采用來(lái)自三位患者乳房腫瘤組織的總RNA以分析BCRP的表達(dá)水平；圖14顯示當(dāng)使用抗癌劑紫杉醇(Taxol)處理MDA-MB-231細(xì)胞系誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞形式的變化；和圖15顯示紫杉醇對(duì)BCRP基因表達(dá)的作用，其使用從圖14中細(xì)胞提取的RNA通過(guò)RT-PCR進(jìn)行鑒定。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的分離的蛋白具有SEQ ID No.4的氨基酸序列和具有特異性對(duì)乳腺癌表達(dá)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的蛋白(在下文中，也稱作乳腺癌相關(guān)蛋白(BCRP))是在正常組織的心臟組織中特異性表達(dá)的膜蛋白質(zhì)。并且，該BCRP在各種癌組織中以乳腺癌組織中特異性表達(dá)。因此，通過(guò)確定是否表達(dá)BCRP，可以檢測(cè)乳腺癌。
當(dāng)BCRP在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)時(shí)，它能增強(qiáng)p53和p21中的至少一種蛋白的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)乳腺癌的方法，包括將特異性結(jié)合于BCRP的抗-BCRP抗體與源自人乳房組織的多肽樣品反應(yīng)。當(dāng)BCRP的表達(dá)水平高于正常組織中的表達(dá)水平時(shí)，優(yōu)選高于3％、5％、10％或高于15％時(shí)，判斷為乳腺癌。產(chǎn)生針對(duì)特定蛋白抗原的抗體的方法是本領(lǐng)域所公知的，并且本發(fā)明中抗-BCRP抗體同樣可以通過(guò)常規(guī)方法生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的多核苷酸編碼具有SEQ ID No.4氨基酸序列并且具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的分離的蛋白。該多核苷酸可以具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。該多核苷酸用于表達(dá)BCRP和通過(guò)研究是否表達(dá)BCRP來(lái)判斷乳腺癌的存在。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的用于乳腺癌的診斷或治療的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸，包括至少10個(gè)源于具有SEQ ID No.3核苷酸序列的多核苷酸的連續(xù)核苷酸。多核苷酸長(zhǎng)度可以是10-100個(gè)，優(yōu)選10-50個(gè)核苷酸。這種多核苷酸可以作為引物或探針使用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的用于診斷乳腺癌的微陣列，具有固定有用于乳腺癌的診斷或治療的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸的基質(zhì)，其該多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸包含至少10個(gè)源于具有SEQ ID No.3核苷酸序列的多核苷酸的連續(xù)核苷酸。多核苷酸的長(zhǎng)度可以是10-100個(gè)，優(yōu)選10-50個(gè)核苷酸，但是不限于此。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的用于乳腺癌的診斷或治療的試劑盒，包括至少10個(gè)源于具有SEQ ID No.3核苷酸序列的多核苷酸的連續(xù)核苷酸。
依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的診斷乳腺癌的方法，包括從樣品的乳房組織獲得核酸樣品，并在乳房組織樣品中測(cè)定具有SEQ ID No.4氨基酸的蛋白的表達(dá)水平，然后根據(jù)結(jié)果確定乳腺癌的存在。
在該方法中，蛋白的表達(dá)水平可以用本領(lǐng)域已知的各種方法測(cè)定。在該方法中，BCRP基因是否表達(dá)可以使用BCRP基因特異性探針通過(guò)Northern印跡法在mRNA水平測(cè)定。可選擇地，可通過(guò)提取包括mRNA的總RNA，用BCRP基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR，并鑒定獲得的產(chǎn)物，來(lái)測(cè)定是否表達(dá)BCRP基因。然而，測(cè)定乳腺癌是否被表達(dá)的方法不限于此。源自乳房組織的核酸樣品不必須就只是純粹純化的核酸樣品，而且在任何分析方法中僅需要能用于該分析的核酸的存在。例如，用PCR鑒定BCRP基因的表達(dá)的時(shí)候，可以使用具有裂解細(xì)胞的樣品，它沒有進(jìn)行核酸的分離。
當(dāng)BCRP的表達(dá)水平高于在正常乳房組織細(xì)胞中的表達(dá)水平時(shí)，可以判斷為乳腺癌。
通過(guò)對(duì)選自商業(yè)上可得到的核酸或蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)的不同核苷酸序列搜索在乳腺癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的核酸或蛋白。結(jié)果，鑒定為僅在乳腺癌細(xì)胞特異性表達(dá)的核酸或由其推測(cè)的蛋白，篩選到了BCRP核酸或蛋白。接下來(lái)，通過(guò)搜索cDNA文庫(kù)鑒定BCRP全長(zhǎng)基因并分析其核苷酸序列。通過(guò)Northern印跡法測(cè)定鑒定了該基因在患者的乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞中的特異性表達(dá)(圖11和圖12)。還通過(guò)重復(fù)測(cè)定鑒定了在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于在正常細(xì)胞中的兩倍(圖12)。用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定了由BCRP基因編碼的蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的位置。一種方法，該蛋白的基因與pFLAG載體重組，用獲得的重組載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系，然后，用pFLAG熒光系統(tǒng)鑒定表達(dá)(圖3，4和5)。更進(jìn)一步地，在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)BCRP，并研究BCRP對(duì)細(xì)胞的影響以鑒定BCRP的功能。為此，用編碼BCRP的基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系，從其提取包括mRNA的總RNA，并用它作為模板進(jìn)行RT-PCR。通過(guò)RT-PCR監(jiān)控BCRP基因和與細(xì)胞凋亡相關(guān)的其它基因例如p53和p21的表達(dá)水平(圖6)。還鑒定了BCRP基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。
參照下列實(shí)施例本發(fā)明將被更詳細(xì)地描述。下列的實(shí)例用于說(shuō)明的目的而并不意欲限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1基于SNP數(shù)據(jù)搜索BCRP基因1.BCRP基因的搜索通過(guò)分別的研究在SNP上找到與乳腺癌相關(guān)的基因所定位的位點(diǎn)的堿基序列，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)檢索和分析進(jìn)行搜尋，從而獲得能設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增基因的引物的信息。
2.BCRP基因片段的擴(kuò)增采用獲得的堿基序列信息(SEQ ID Nos.1和2)設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增圍繞搜尋到的SNP的DNA。
然后，用基因組DNA作為模板和合成的引物組為引物進(jìn)行PCR以擴(kuò)增239bp的BCRP基因片段。在PCR中，使用正向引物和反向引物各10pmol和基因組DNA模板200pg-1μg，然后分別以在95℃ 40秒，在57℃40秒，和在72℃ 1分鐘，重復(fù)35次反應(yīng)。經(jīng)由1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果并鑒定239bp的預(yù)期DNA片段的擴(kuò)增。用擴(kuò)增到的DNA片段作為探針來(lái)搜索BCRP全長(zhǎng)基因。
3.經(jīng)由cDNA文庫(kù)搜索BCRP的全長(zhǎng)基因用人胎兒腦cDNA文庫(kù)(λtriplrEx庫(kù)，從Clontech公司可以得到)作為cDNA文庫(kù)，并且研究程序遵照制造商(PT3003-1)的實(shí)驗(yàn)指南。簡(jiǎn)要地研究程序如下。
進(jìn)行PCR以獲得mRNA，同時(shí)用先前獲得的PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行cDNA文庫(kù)的搜尋。用于搜尋的細(xì)胞是本領(lǐng)域中普遍使用的大腸桿菌XL-1藍(lán)色細(xì)胞。
首先，在庫(kù)的效價(jià)測(cè)定時(shí)，兩組都設(shè)置為2.0×109pfu/ml。然后，把cDNA文庫(kù)涂布在大腸桿菌XL-1blue平板上。通常，涂布的cDNA文庫(kù)為2～5×104pfu/150mm。然后，把λ噬菌體(pharge)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜。使用通過(guò)標(biāo)記有放射性同位素標(biāo)記dCTP([α-32P]dCTP，3000Ci/mmol)的隨機(jī)引物DNA標(biāo)記的探針進(jìn)行濾膜雜交，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的探針的信號(hào)測(cè)量雜交結(jié)果。結(jié)果獲得陽(yáng)性克隆。
4.BCRP全長(zhǎng)基因堿基序列的分析和蛋白序列的預(yù)測(cè)通過(guò)用自動(dòng)序列分析儀(ABI 3700)分析，鑒定了由上述克隆獲得的BCRP全長(zhǎng)基因的堿基序列。更進(jìn)一步地，用NCBI和新GENSCANW網(wǎng)程序確定了該基因的推測(cè)蛋白質(zhì)序列。BCRP基因的核苷酸序列與SEQ IDNo.3相同，因此，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID No.4相同。用于搜索BCRP的SNP位于啟動(dòng)子區(qū)，BCRP基因組基因位于在16032和96546之間并且由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成。
實(shí)施例2在細(xì)胞和組織中BCRP基因表達(dá)的鑒定1.通過(guò)Northern印跡法鑒定在細(xì)胞中BCRP基因表達(dá)用從實(shí)施例1獲得的PCR產(chǎn)物作為探針，對(duì)多數(shù)的人正常組織和腫瘤組織(從Clontech公司可以得到)進(jìn)行Northern印跡法分析。在圖1和圖2中顯示了結(jié)果。參照?qǐng)D1和圖2，BCRP基因僅在正常組織的心組織中和在腫瘤組織的乳腺癌組織中特異性表達(dá)。因此，顯而易見BCRP基因表達(dá)的研究可以用于檢測(cè)乳腺癌的存在。圖1中，在Northern印跡法中使用的組織是腦心(brain heart)，心，骨骼肌，結(jié)腸，胸腺，脾臟，腎，肝，小腸，胎盤，肺和外周血白細(xì)胞。圖2中，在Northern印跡法中使用的癌組織是乳房，卵巢，子宮，肺，腎，胃，結(jié)腸和直腸的細(xì)胞系(由Clontech公司制造多個(gè)組織的Northern印跡)。1.00kb和1.2kb分別在圖1和圖2的頂端，表示標(biāo)記大小和印跡結(jié)果顯示在1.37kb。
如下進(jìn)行Northern印跡法的特異性操作。
(1)制備放射標(biāo)記的探針采用隨機(jī)引物的DNA標(biāo)記(Roche公司隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒，#1004760)制備探針。使用約25ng純化的BCRP PCR產(chǎn)物和同位素[α-32P]dCTP，250μCi(從BMS公司可以得到)。
(2)用雜交瓶預(yù)雜交尼龍膜在預(yù)先加熱到68℃的7ml ExpressHyb溶液(#8015-1，從BDClontech公司可以得到)中預(yù)雜交30分鐘。
(3)放射標(biāo)記的探針的變性放射標(biāo)記的探針在95-100℃加熱8-10分鐘，然后快速放置在冰中。
(4)雜交100ml的新鮮的ExpressHyb溶液同放射標(biāo)記的探針混合。從含有尼龍膜的雜交瓶除去預(yù)雜交溶液，并加入與放射標(biāo)記探針混合的新鮮的ExpressHyb溶液。然后，于68℃搖瓶培育1小時(shí)。
(5)洗滌用洗液1，在室溫洗滌瓶中的尼龍膜30-40分鐘，然后再用洗液2在50℃洗40分鐘。然后，從瓶中取出尼龍膜并干燥到保持少許水分的程度，然后用塑料包住。
(6)尼龍膜被放置在X射線膠片中并且曝露于-70℃。1-2天后，移開尼龍膜，鑒定條帶。
2.組織中BCRP基因表達(dá)的鑒定鑒定乳腺癌患者的病變部分和非病變部分中BCRP基因的表達(dá)。
圖11和圖12顯示用從兩個(gè)患者的乳腺癌組織得到的細(xì)胞分離的RNA，和用SEQ ID Nos.4和5的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行的RT-PCR的結(jié)果。參照?qǐng)D11和12，與正常組織中的相比，BCRP基因在乳腺癌組織中的表達(dá)增加，而p53的表達(dá)顯著性增加，其發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)并被選作對(duì)比性基因。
圖13顯示乳房腫瘤組織和正常組織RNA的Northern印跡法試驗(yàn)的結(jié)果。參照?qǐng)D13，BCRP基因的表達(dá)增強(qiáng)(約1.8kb)。圖13中，1至3泳道是不同供體的乳房腫瘤組織的結(jié)果，4泳道是正常乳房組織的結(jié)果。作為1至3泳道的平均表達(dá)水平同在正常乳房組織中表達(dá)水平比較的結(jié)果，可以看到BCRP基因在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織約2.05倍。
實(shí)施例3BCRP基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置的鑒定通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定BCRP基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置。為此，首先克隆BCRP基因到pFLAG載體中(Sigma，Amherst，NY)。克隆步驟如下。用Not I酶和Sal I酶消化SEQ ID No.3的BCRP基因，并用上述同樣的酶消化pFLAG載體，然后連接消化的BCRP基因和pFLAG載體。用Lipofectin 2000用克隆的BCRP-pFLAG載體DNA轉(zhuǎn)染各細(xì)胞系。在5％CO237℃條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞48小時(shí)以便BCRP基因能夠表達(dá)。然后，用3.5％的多聚甲醛在平板上固定培養(yǎng)的細(xì)胞。為進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部染色，通過(guò)0.1％的Triton X-100改變細(xì)胞具有滲透性。用1％BSA封閉液封閉空白區(qū)。使Flag特異性抗體與上面固定有細(xì)胞的平板進(jìn)行反應(yīng)，以使標(biāo)記特異性抗體(抗-FLAG M2)與BCRP-Flag特異性結(jié)合。最后，F(xiàn)ITC結(jié)合第二抗體(抗-小鼠IgG-FITC)與BCRP-Flag-初級(jí)抗體偶聯(lián)物發(fā)生反應(yīng)。采用熒光顯微鏡通過(guò)由FITC產(chǎn)生的熒光鑒定BCRP表達(dá)的位置。作為對(duì)照，用Flag特異性抗體，以上述相同的方法，對(duì)非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)。
結(jié)果顯示在圖3至圖5中。圖3至圖5顯示了觀察到的各BCRP-pFLAG載體DNA轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞系Clone A(CA)，原代培養(yǎng)正常腎細(xì)胞和HEK293細(xì)胞系的FITC熒光。在圖3至圖5中顯示，在所有三個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞膜中觀察到了BCRP。
因此，判定依照本發(fā)明的實(shí)施方案的BCRP在細(xì)胞膜中特異性表達(dá)。
實(shí)施例4BCRP基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞系中基因的表達(dá)的作用鑒定BCRP基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞系中基因的表達(dá)的作用。為此，首先通過(guò)Northem印跡法試驗(yàn)鑒定BCRP基因mRNA的存在。然后，在實(shí)際細(xì)胞系中研究BCRP基因的表達(dá)對(duì)與已知癌癥和細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)的基因在細(xì)胞中的表達(dá)的作用。首先，使用Lipofectin2000用如上述制備的BCRP-pFLAG載體DNA轉(zhuǎn)染CA(結(jié)腸癌Colon A)細(xì)胞系，，并在5％的CO2于37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系48小時(shí)。然后，提取包括mRNA的總RNA并進(jìn)行RT-PCR。β肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照使用。能分別擴(kuò)增BCRP，β肌動(dòng)蛋白，p53，p21，CytC，半胱天冬酶5(caspase 5)，半胱天冬酶3和Apaf 1基因的引物組用作引物(表1)。通過(guò)監(jiān)測(cè)從RT-PCR獲得的PCR產(chǎn)物的量鑒定各基因的表達(dá)水平。
表1用于在各基因擴(kuò)增中的引物序列

如下進(jìn)行RT-PCR采用Superecript II逆轉(zhuǎn)錄酶(從Invitrogen可以得到)逆轉(zhuǎn)錄從過(guò)度表達(dá)的BCRP基因的細(xì)胞系提取的包括mRNA總RNA，由此獲得cDNA。采用Taq聚合酶作為模板和采用正向引物和反向引物(參考表1)各自10pmol對(duì)5ng獲得的cDNA進(jìn)行PCR。在PCR中，分別以95℃40秒，根據(jù)要擴(kuò)增的基因于不同的退火溫度40秒，72℃ 1分鐘，重復(fù)反應(yīng)30次。適合于β肌動(dòng)蛋白，半胱天冬酶5和BCRP的退火溫度為58℃，適合于p53，p21，CytC，半胱天冬酶3和Apaf 1的為52℃。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果并且在圖6中顯示。參照?qǐng)D6，p53的表達(dá)增加，已知為p53依賴性生長(zhǎng)抑制的暫時(shí)介導(dǎo)子的p21的表達(dá)也增加。然而，其它的基因的表達(dá)沒有顯示特異性變化。
實(shí)施例5BCRP基因的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞系擴(kuò)增和細(xì)胞凋亡的作用1.MTT試驗(yàn)通過(guò)MTT試驗(yàn)鑒定在細(xì)胞中BCRP基因的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞系擴(kuò)增和細(xì)胞凋亡的作用。MTT試驗(yàn)是一種測(cè)量通過(guò)用活細(xì)胞中線粒體脫氫酶還原MTT所產(chǎn)生的甲臢(formazan)的吸光度的方法。測(cè)量的吸光度反映代謝旺盛細(xì)胞的濃度。該試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系是Clone A和CX-1(結(jié)腸癌細(xì)胞系)，和正常腎細(xì)胞系，HEK293。同在實(shí)施例4中一樣用Lipofectin2000轉(zhuǎn)染BCRP-pFLAG載體DNA。該試驗(yàn)中使用的對(duì)照是只用pFLAG轉(zhuǎn)染的載體對(duì)照，沒有轉(zhuǎn)染但是經(jīng)過(guò)同樣處理的空對(duì)照(nothing control)和沒有細(xì)胞的空白對(duì)照(blank control)。
從兩次重復(fù)的試驗(yàn)獲得結(jié)果。在CA和CX-1細(xì)胞系中比在對(duì)照中發(fā)生的細(xì)胞擴(kuò)增少。換言之，相比于對(duì)照，在CA和CX-1細(xì)胞系中的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。同樣，相較于其它兩個(gè)對(duì)照，細(xì)胞擴(kuò)增在HEX 293細(xì)胞系中比在結(jié)腸癌細(xì)胞系(CA和CX-1)中更少發(fā)生。結(jié)果在圖7中顯示，其顯示在HEK 293，CA和CX-1(分別用A，B和C代表)細(xì)胞系中BCRP的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞系擴(kuò)增的作用的評(píng)價(jià)結(jié)果。
2.細(xì)胞凋亡試驗(yàn)用HEK 293，CA和CX-1細(xì)胞系通過(guò)流式細(xì)胞儀研究BCRP基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。使用只轉(zhuǎn)染pfFLAG載體的載體對(duì)照作為對(duì)照。
兩次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果，在兩個(gè)試驗(yàn)中CA和CX-1都顯示比對(duì)照輕的細(xì)胞凋亡，而HEK 293顯示弱的或沒有細(xì)胞凋亡。圖8至圖10顯示試驗(yàn)結(jié)果。圖8至圖10，分別顯示HEK 293，CA和CX-1的FACS分析結(jié)果。
實(shí)施例6人乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡對(duì)BCRP基因表達(dá)的作用常規(guī)已知當(dāng)用抗癌劑紫杉醇處理人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)施例中，為研究當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)BCRP基因的表達(dá)水平，用紫杉醇處理MDA-MB-231細(xì)胞系以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并以與上述相同的方法進(jìn)行RT-PCR。
圖14顯示當(dāng)用紫杉醇處理MDA-MB-231細(xì)胞系時(shí)細(xì)胞形式的變化。從圖14的B可以看到紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
圖15顯示通過(guò)RT-PCR鑒定紫杉醇對(duì)BCRP基因表達(dá)的作用。參照?qǐng)D15，紫杉醇增強(qiáng)BCRP基因的表達(dá)。
根據(jù)上述結(jié)果同樣是顯而易見地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的BCRP基因抑制細(xì)胞增殖。此外，雖然BCRP沒有強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但和對(duì)照相比有輕度誘導(dǎo)。除此之外，考慮到把BCRP在紫杉醇處理細(xì)胞系中表達(dá)的結(jié)果作為間接證明，假定BCRP與細(xì)胞凋亡相關(guān)。同樣，也在實(shí)施例4中證實(shí)，BCRP基因增強(qiáng)p53和p21的表達(dá)。因此，判定BCRP基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)p53的表達(dá)水平，而p53的活化增強(qiáng)p21的表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分離的蛋白和編碼其的核酸，可以用于診斷乳腺癌和開發(fā)靶向蛋白的藥物。
診斷乳腺癌的方法，使用特異性結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的BCRP的抗體，可以用于有效地診斷乳腺癌。
診斷乳腺癌的方法，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的BCRP基因的表達(dá)水平，可以用于有效地診斷乳腺癌。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的微陣列可以在各種檢驗(yàn)方法例如檢測(cè)乳腺癌存在的分析中使用。
雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)參考其示范性實(shí)施方案進(jìn)行了特別的顯示和描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可在形式和細(xì)節(jié)中進(jìn)行各種改變，而不背離如下權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>三星電子株式會(huì)社(Samsung Electronics Co.LTD.)<120>乳腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)，其編碼基因，和使用該蛋白和基因診斷乳腺癌的方法<130>PN060423<160>20<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1acggacgagg gtgacaatag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2aggtaaaaga agggcatggg 20<210>3<211>672<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3atgaggctcc aaagaccccg acaggccccg gcgggtggga ggcgcgcgcc ccggggcggg 60cggggctccc cctaccggcc agacccgggg agaggcgcgc ggaggctgcg aaggttccag120aagggcgggg agggggcgcc gcgcgctgac cctccctggg caccgctggg gacgatggcg180ctgctcgcct tgctgctggt cgtggcccta ccgcgggtgt ggacagacgc caacctgact240gcgagacaac gagatccaga ggactcccag cgaacggacg agggtgacaa tagagtgtgg300tgtcatgttt gtgagagaga aaacactttc gagtgccaga acccaaggag gtgcaaatgg360acagagccat actgcgttat agcggccgtg aaaatatttc cacgtttttt catggttgcg420aagcagtgct ccgctggttg tgcagcgatg gagagaccca agccagagga gaagcggttt480ctcctggaag agcccatgcc cttcttttac ctcaagtgtt gtaaaattcg ctactgcaat540ttagaggggc cacctatcaa ctcatcagtg ttcaaagaat atgctgggag catgggtgag600agctgtggtg ggctgtggct ggccatcctc ctgctgctgg cctccattgc agccggcctc660agcctgtctt ga 672
<210>4<211>223<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Arg Leu Gln Arg Pro Arg Gln Ala Pro Ala Gly Gly Arg Arg Ala1 5 10 15Pro Arg Gly Gly Arg Gly Ser Pro Tyr Arg Pro Asp Pro Gly Arg Gly20 25 30Ala Arg Arg Leu Arg Arg Phe Gln Lys Gly Gly Glu Glu Ala Pro Arg35 40 45Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu50 55 60Leu Leu Val Val Ala Leu Pro Arg Val Trp Thr Asp Ala Asn Leu Thr65 70 75 80Ala Arg Gln Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gln Arg Thr Asp Glu Gly Asp85 90 95Asn Arg Val Trp Cys His Val Cys Glu Arg Glu Asn Thr Phe Glu Cys100 105 110Gln Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val Ile Ala115 120 125Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Val Ala Lys Gln Cys Ser130 135 140Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe145 150 155 160Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile165 170 175Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn Ser Ser Val Phe Lys180 185 190Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala195 200 205Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser210 215 220<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BCRP擴(kuò)增的正向引物<400>5cggacgaggg tgacaatag 19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>BCRP擴(kuò)增的反向引物<400>6aggtaaaaga agggcatggg20<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增的正向引物<400>7aggactttga ttgcacattg ttgttt26<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增的反向引物<400>8gagaccaaaa gccttcatac atctca26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53擴(kuò)增的正向引物<400>9atttgcgtgt ggagtatttg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53擴(kuò)增的反向引物<400>10ggaacaagaa gtggagaatg 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21擴(kuò)增的正向引物<400>11gtgagcgatg gaacttcgac tt22
<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21擴(kuò)增的反向引物<400>12ggcgtttgga gtggtagaaa tc 22<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CytC擴(kuò)增的正向引物<400>13tttggatcca atgggtgatg ttgag 25<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CytC擴(kuò)增的反向引物<400>14tttgaattcc tcattagtag cttttttgag 30<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>半胱天冬酶5擴(kuò)增的正向引物<400>15ctgacattga aggaagagg 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>半胱天冬酶5擴(kuò)增的反向引物<400>16gccaggtgat caaactttg 19<210>17<211>20
<213>人工序列<220>
<223>半胱天冬酶3擴(kuò)增的正向引物<400>17tggaattgat gcgtgatgtt 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>半胱天冬酶3擴(kuò)增的反向引物<400>18ggcaggcctg aataatgaaa 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Apaf 1擴(kuò)增的正向引物<400>19gggtttcagt tgggaaacaa 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Apaf 1擴(kuò)增的反向引物<400>20cacccaagag tcccaaacat 20
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白，其具有SEQ D No.4的氨基酸序列并對(duì)乳腺癌特異性表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的分離的蛋白，其與細(xì)胞凋亡相關(guān)。
3.權(quán)利要求1的分離的蛋白，其增強(qiáng)細(xì)胞中p53和p21中的至少一種蛋白的表達(dá)。
4.一種檢測(cè)乳腺癌存在的方法，該方法包括使特異性結(jié)合于權(quán)利要求1的蛋白的抗-BCRP抗體與源自人乳房組織的多肽樣品反應(yīng)。
5.編碼權(quán)利要求1蛋白的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。
7.用于乳腺癌的診斷或治療的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸，包含至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，該核苷酸來(lái)源于具有SEQ ID No.3的核苷酸序列的多核苷酸。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其長(zhǎng)度為10-100個(gè)核苷酸。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸，其為引物或探針。
10.用于診斷乳腺癌的微陣列，具有固定有權(quán)利要求8的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸的基質(zhì)。
11.用于診斷乳腺癌的試劑盒，包含權(quán)利要求8的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸。
12.診斷乳腺癌的方法，該方法包括從樣品中獲得乳房組織樣品和測(cè)定在乳房組織樣品中權(quán)利要求1的蛋白的表達(dá)水平并且根據(jù)結(jié)果判斷乳腺癌的存在。
13.權(quán)利要求12的方法，其中蛋白的表達(dá)水平通過(guò)Northern印跡法或電泳測(cè)定。
14.權(quán)利要求12的方法，其中當(dāng)所述蛋白的表達(dá)水平高于在正常乳房組織中的表達(dá)水平時(shí)，判斷為乳腺癌。
全文摘要
提供了具有SEQ ID No.4的氨基酸序列并具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的分離的蛋白和其編碼基因。并且，提供了具有固定有基因或其片段的基質(zhì)的微陣列。并且，提供了用特異性結(jié)合該蛋白的抗體診斷乳腺癌的方法和通過(guò)確定細(xì)胞中是否表達(dá)該基因診斷乳腺癌的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1696154SQ20051006415
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
發(fā)明者李娟受, 樸卿希, 安兌臻, 樸鐘勛 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社