專利名稱：知母皂苷bⅱ的制備方法
技術領域：
本發明涉及知母皂苷BII的分離制備方法。
背景技術：
中藥知母為百合科(Liliaceae)知母屬多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的根莖，主產于河北、內蒙古、山西及東北等地，中醫用作苦寒清熱藥，有清熱瀉火，滋陰潤燥的功效，主要治療外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內熱消渴和腸燥便秘等。知母的主要成分是甾體皂苷(steroidal saponin)，其次還有黃酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。藥理研究表明知母主要有抗菌抗病毒、退熱、降血糖、鎮靜、抑制血小板聚集、抗腫瘤以及輻射防護等作用。
知母皂苷BII(Timosaponin BII)，又名原知母皂苷AIII(Prototimosaponin AIII)等，是知母中的主要成分，結構為(25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷[(25S)-26-0-β-D-glucopyranosyl-22-hydroxy-5β-furostane-3β，26-diol-3-0-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranoside]。結構如下
1963年川崎敏男等首次分出知母皂苷BII，但并未闡明其結構。1991年南云清二等首次闡明了知母皂苷BII的化學結構(Seiji NAGUMO etal，藥學雜志(日)，1991；111(1)306-310)。以后Noboru Nakashima(NOBORU NAKASHIMA et al，Journal of Natural Products，1993；56(3)345-350)、馬百平(馬百平等，藥學學報，1996；31(4)271-277)、Masayasu Kimula(Masayasu KIMURA et al，Biol.Pharm.Bull，1996；19(7)926-931)和Jianying Zhang (Jianying ZHANG et al，ClinicaChimica Acta，1999；28979-88)等先后報道了知母皂苷BII的分離及活性。研究表明，知母皂苷B II具有降血糖、抑制血小板聚集、清除自由基、以及抗癡呆的活性。在知母皂苷B II的分離制備上，已有文獻基本均應用正丁醇萃取、正相硅膠柱層析，同時結合大孔吸附樹脂或高效液相色譜制備獲得。正丁醇萃取皂苷乳化嚴重；硅膠柱層析上樣量有限，硅膠填料不易再生利用，洗脫溶劑應用氯仿-甲醇-水混合溶劑系統，回收利用較難。所以現有文獻報道的知母皂苷B II的制備方法往往過程復雜，制備量小，純度不高，不適于工業化制備。即使使用大孔吸附樹脂及反相液相色譜，也往往使用甲醇-水洗脫劑，知母皂苷B II的C-22羥基在含甲醇的溶劑中可以甲氧基化，生成一定比例的甲氧基化物(知母皂苷BI)(Seiji NAGUMO et al，藥學雜志(日)，1991；111(1)306-310)，這樣在制備中就會損失一部分樣品，同時回收溶劑得到的也是知母皂苷B II和知母皂苷B I的混合物，很難得到知母皂苷B II的單體化合物。
因此，改進知母皂苷B II的制備方法是十分必要的。
發明內容
本發明的目的是提供一種改進的知母皂苷BII的制備方法，該方法避免在提取純化中使用正丁醇、應用硅膠柱層析，以及避免在洗脫中使用甲醇，從而保證了知母皂苷BII的純度和收率。
因此，本發明涉及一種改進的知母皂苷BII的制備方法，其包括a)將市售的中藥知母飲片或者新鮮采集的知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)根莖或須根為原料，用選自水、丙酮、乙醇、丙醇或它們的至少兩種混合物溶劑提取，b)將a)中提取物通過選自樹脂吸附、聚酰胺層析、反相柱層析法或Sephadex LH-20柱層析法的一種或者多種方式分離，用水、丙酮、乙腈、乙醇、丙醇或它們的至少兩種混合物作洗脫劑洗脫，c)合并b)中洗脫液，然后干燥得知母皂苷BII。
根據本發明，在步驟a)中，可選用水、丙酮、乙醇、丙醇中的一種溶劑，也可選用其中的任意兩種或多種溶劑以任意比例所組成的混合溶劑，在室溫下浸潤提取或者超聲波振蕩儀超聲振蕩提取，或者在加熱狀態下浸潤提取或回流提取，提取次數可以是一次，也可以是多次。其中，優選水煎煮；或10-95％的乙醇水溶液回流、滲漉或超聲提取；或10-80％的丙酮水溶液回流、滲漉或超聲提取。
根據本發明，在步驟b)中，針對樹脂吸附法，樹脂可選用D-101型吸附樹脂、AB-8型吸附樹脂、XAD-2型吸附樹脂、HP20型吸附樹脂、SP825型吸附樹脂、SP700型吸附樹脂、CHP-20P型吸附樹脂或者SP70型吸附樹脂以及其他型號的聚苯乙烯型大孔吸附樹脂，洗脫溶劑用水、丙酮、乙醇、丙醇中的一種或多種，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
進一步講，提取液的離心上清液或過濾液通過大孔樹脂吸附，用水或低濃度的丙酮或低級醇的水溶液淋洗除去雜質，低級醇為乙醇或丙醇，其濃度為5-30％，用量為柱體積的2-7倍(2-7BV)；再用較高濃度的丙酮或低級醇的水溶液洗脫，低級醇為乙醇、丙醇，其濃度為20-70％，用量為柱體積的2-7倍(2-7BV)，根據檢測情況，收集此部分洗脫液或其中部分洗脫液，回收溶劑，濃縮，得到粗知母皂苷BII。
在本發明步驟b)選用的聚酰胺層析法中，可選柱層析法或靜態吸附過濾法，洗脫劑用水、丙酮、乙腈、乙醇、丙醇中的一種或多種，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
進一步講，含知母皂苷BII的水溶液通過聚酰胺柱，用水或低濃度的丙酮或低級醇的水溶液洗脫，低級醇為乙醇或丙醇，其濃度為0-15％，用量為柱體積的2-5倍(2-5BV)，根據檢測情況，收集此部分洗脫液或其中部分洗脫液，回收溶劑，濃縮，得到知母皂苷BII。或含知母皂苷BII的水溶液中加入聚酰胺，充分攪拌、放置，布氏漏斗過濾，用水或低濃度的丙酮或低級醇的水溶液進一步洗脫，根據檢測情況，收集此部分洗脫液或其中部分洗脫液，回收溶劑，濃縮，得到知母皂苷BII。再用高濃度的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液，或酸、堿再生。
在本發明b)中選用的反相柱層析中，可選用常壓或加壓反相柱層析，所用柱填料可選十八烷基鍵合相(ODS)或八烷基鍵合相，洗脫劑用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、丙醇中的一種或多種，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
進一步講，用洗脫劑溶解含知母皂苷BII的樣品，樣品溶液通入反相層析柱，用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、丙醇中的一種或多種洗脫，有機溶劑濃度為15-60％，分步收集，根據檢測情況，合并其中部分洗脫液，回收溶劑，濃縮，得到知母皂苷BII。
在本發明b)中選用的Sephadex LH-20柱層析中，可選用常壓或加壓柱層析，洗脫劑用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、含水丙醇中的一種或多種，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
進一步講，用洗脫劑溶解含知母皂苷BII的樣品，樣品溶液通入Sephadex LH-20層析柱，用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、含水丙醇等C2-C5醇類中的一種或多種洗脫，有機溶劑濃度為5-60％，分步收集，根據檢測情況，合并其中部分洗脫液，回收溶劑，濃縮，得到知母皂苷BII。
根據本發明，步驟c)中所述干燥為本領域中已知的干燥方法，舉例講，如減壓干燥，冷凍干燥或噴霧干燥。
本發明主要解決了已有工藝中方法復雜的問題，特別是解決了由于工藝中使用正丁醇、硅膠柱層析及甲醇，致使知母皂苷BII純度不高，收率損失的問題，本發明方法制備的知母皂苷BII的純度高于90％，而且工藝簡單實用，適宜于產業化生產。
具體實施例方式
下面的實施例用于進一步說明本發明，但其不意味著對本發明的任何限制。
實施例1知母皂苷BII的制備中藥知母飲片8Kg，適當粉碎，加50％乙醇48L，浸泡1小時，回流提取1小時，過濾；藥渣再同樣回流提取2次。合并醇提液，回收乙醇，減壓濃縮至40L。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP825(日本三菱公司)裝柱(18L)，水平衡。提取濃縮液過濾，濾液上樣，用水洗除去雜質。之后依次用3倍柱體積(3BV)的35％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮至小體積，加乙醇至35％備用。再生后的大孔吸附樹脂SP825柱(18L)用35％乙醇平衡，通入上述備用樣品，用45％乙醇6BV洗脫，分步收集，每份2000mL，HPLC檢測各份純度。將18-30份合并，回收乙醇，濃縮至小體積備用。此樣品通入處理好的聚酰胺柱中(6L，30-60目，臨江試劑化工廠)，水洗脫5BV，色帶部分舍去，分步收集，每份600mL，HPLC檢測，合并第6-23份，濃縮，噴霧干燥，得知母皂苷BII 56.5g，產品收率為藥材的0.71％，HPLC檢測純度為90.8％。
實施例2知母皂苷BII的制備中藥知母飲片5Kg，適當粉碎，加30％丙酮30L，浸泡2小時，用超聲波振蕩器超聲提取0.5小時，過濾；藥渣再同樣超聲提取2次。合并提取液，回收丙酮，減壓濃縮至30L。將預先處理好的大孔吸附樹脂AB-8(天津南開化工廠)裝柱(18L)，水平衡。提取濃縮液過濾，濾液上樣，用水洗雜質。之后依次用3倍柱體積(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮至小體積，真空干燥得知母皂苷BII粗樣品286g。將粗樣品80g溶解于1000ml 25％丙酮溶液，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。依次用28％丙酮(20000ml)、30％丙酮(20000ml)洗脫，80％丙酮(13000ml)再生柱子。28％和30％丙酮部分分步收集，每份600mL，HPLC檢測各份純度。將6-21份合并，回收丙酮，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII12.9g，產品收率為藥材的0.92％，HPLC檢測純度為94.3％。
實施例3知母皂苷BII的制備中藥知母飲片5Kg，適當粉碎，加30％丙酮30L，浸泡2小時，用超聲波振蕩器超聲提取0.5小時，過濾；藥渣再同樣超聲提取2次。合并提取液，回收丙酮，減壓濃縮至30L。將預先處理好的大孔吸附樹脂AB-8(天津南開化工廠)裝柱(18L)，水平衡。提取濃縮液過濾，濾液上樣，用水洗除去雜質。之后依次用3倍柱體積(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮至小體積，真空干燥得知母皂苷BII粗樣品290g。將粗樣品80g溶解于1000ml 25％丙酮溶液，通入32％甲醇平衡好的C18柱(6.5L)。依次用32％甲醇(20000ml)、34％甲醇(20000ml)洗脫，90％甲醇(15000ml)再生柱子。32％和34％甲醇部分分步收集，每份600mL，HPLC檢測各份純度。將8-19份合并，回收甲醇，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII樣品9.7g，HPLC檢測純度為73.1％；此樣品溶解于30％丙酮中，95℃回流5小時，回收丙酮，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII 9.7g，產品收率為藥材的0.70％，HPLC檢測純度為93.9％。
實施例4知母皂苷BII的制備知母新鮮根莖4Kg，切薄片，加入10L水，煎煮1小時，過濾；藥渣再加入8L水，煎煮1小時，過濾。合并濾液，減壓濃縮至10L，加乙醇至25％，靜置備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂D101(天津農藥廠)裝柱(6L)，25％乙醇平衡。上述備用提取液過濾，濾液上樣，依次用3倍柱體積(3BV)的25％乙醇、3BV的35％乙醇和3BV的90％乙醇洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于35％乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮至小體積備用。此樣品通入處理好的聚酰胺柱中(6L，30-60目，臨江試劑化工廠)，5BV水洗脫，舍去有色部分，分步收集，每份600ml，HPLC檢測，合并第8-24份，濃縮，噴霧干燥，得知母皂苷BII脫色粗樣品51g。取其中粗樣品約40g樣品溶解于200ml35％乙醇溶液，通入35％乙醇平衡好的Sephadex LH-20柱(8.5L)，用35％乙醇(50000ml)洗脫，95％乙醇(20000ml)再生柱子。35％乙醇部分分步收集，每份800mL，HPLC檢測各份純度。將16-35份合并，回收乙醇，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII 11.2g，產品收率為新鮮根莖的0.36％(相當干藥材的1.07％)，HPLC檢測純度為92.3％。
實施例5知母皂苷BII的制備知母須根2Kg，切咀，加入16L水，煎煮1小時，過濾；藥渣再加入12L水，煎煮1小時，過濾。合并濾液，減壓濃縮至12L，加丙酮至15％，靜置備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(6L)，15％丙酮平衡。上述備用提取液過濾，濾液上樣，依次用3倍柱體積(3BV)的25％丙酮、3BV的35％丙酮和3BV的80％丙酮洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于35％丙酮部分，此部分洗脫液回收丙酮，濃縮，噴霧干燥，得知母皂苷BII粗樣品45.0g。取其中粗樣品約40g樣品溶解于200ml 10％丙酮溶液，通入10％丙酮平衡好的Sephadex LH-20柱(8.5L)，用10％丙酮(40000ml)洗脫，80％丙酮(20000ml)再生柱子。10％丙酮部分分步收集，每份800mL，HPLC檢測各份純度。將20-36份合并，回收丙酮，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII 9.2g，產品收率為須根原料的0.52％，HPLC檢測純度為91.7％。
實施例6知母皂苷BII的制備知母新鮮根莖4Kg，切薄片，加入50％乙醇8L，浸泡2小時，用超聲波振蕩器超聲提取0.5小時，過濾；藥渣再同樣超聲提取2次。合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮至10L。將預先處理好的大孔吸附樹脂AB-8(天津南開化工廠)裝柱(6L)，水平衡。提取濃縮液過濾，濾液上樣，水洗除去雜質。之后依次用3倍柱體積(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脫，經檢測知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮至小體積，真空干燥得知母皂苷BII粗樣品59.3g。取粗樣品其中50g溶解于200ml 25％丙酮溶液，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。依次用28％丙酮(20000ml)、30％丙酮(20000ml)洗脫，80％丙酮(15000ml)再生柱子。28％和30％丙酮部分分步收集，每份600mL，HPLC檢測各份純度。將6-25份合并，回收丙酮，濃縮至小體積，冰干得知母皂苷BII15.6g。取其中14.1g樣品再溶解于70ml 25％的丙酮中，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。用28％丙酮(40000ml)洗脫，80％丙酮(1200ml)再生柱子。分步收集，每份600mL，HPLC檢測各份純度。將8-19份合并，回收丙酮，濃縮至小體積，冰干得知母皂苷BII 4.5g，產品收率為新鮮根莖的0.15％(相當干藥材的0.44％)，HPLC檢測純度為98.6％。
樣品為白色無定形粉末，mp＞243℃(dec)。Liebermann-Burchard反應和Molish反應呈陽性，對Ehrlich試劑亦呈陽性反應。
知母皂苷BII的結構鑒定利用紅外、質譜和核磁等手段進行了結構鑒定，結果如下。
IR(漫反射)cm-13348(OH)，2930，2850，1075，1044(苷鍵C-O)。
FAB-MS m/z 943(M+Na)+，903(M+H-H2O)+，741(M+H-H2O-Glc)+，579(M+H-H2O-Glc×2)+，417(M+H-H2O-Glc×2-Gal)+，399(苷元+H-H2O×2)+，255，185，145。
EI-MS m/z 740(M-H2O-Glc)+，578(M-H2O-Glc×2)+，416(苷元-H2O)+，415(苷元-H-H2O)+，357，273，217，181，139。
1H-NMR(C5D5N)δ0.85(3H，S，18-CH3)，0.96(3H，S，19-CH3)，1.00(3H，d，J＝6.4Hz，27-CH3)，1.30(3H，d，J＝6.8Hz，21-CH3)，4.79(1H，d，J＝7.8Hz，Glc 1-H)，4.90(1H，d，J＝7.8Hz，Gal 1-H)，5.27(1H，d，J＝7.8Hz，Glc 1-H)。
13C-NMR譜數據見表1。此化合物為(25S)-26-0-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-0-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷。
表1.知母皂苷BII的13C-NMR化學位移(C5D5N)
對比實施例1知母皂苷BII的制備中藥知母飲片1Kg，適當粉碎，加60％乙醇6L浸泡1小時，加熱回流提取1小時，過濾；藥渣再同樣回流提取2次。合并乙醇提取液，回收乙醇，減壓濃縮至4L。濃縮液中加入4L水飽和正丁醇振搖混勻后靜置分層，取上層正丁醇液；下層水液再加入水飽和正丁醇同樣萃取4次，合并5次萃取的正丁醇液濃縮至干，得到總皂苷33.1g。總皂苷用甲醇溶解，拌入硅膠60g，加熱揮干溶劑。將拌好的樣品上樣到干法裝好的硅膠層析柱(3L)中，氯仿-甲醇-水梯度洗脫，收集氯仿-甲醇-水(60∶40∶10下相)洗脫含知母皂苷BII的部分濃縮至干，得粗品2.3g；再經硅膠柱層析(500mL)，氯仿-甲醇-水洗脫，收集氯仿-甲醇-水(65∶35∶10下相)洗脫部分，每份50ml，第15-23份濃縮干得樣品0.67g。此樣品用32％甲醇溶解，進行C18反相柱層析(600ml)，依次用32％甲醇(1800ml)、34％甲醇(1800ml)洗脫，90％甲醇(1200ml)再生柱子。32％和34％甲醇部分分步收集，每份50mL。HPLC檢測各份純度，第13-21份合并，回收甲醇，濃縮至小體積，冰干，得知母皂苷BII樣品0.34g，HPLC檢測純度為75.5％；此樣品溶解于30％的丙酮中，95℃水浴回流加熱5小時，回收丙酮，濃縮，冰干得知母皂苷BII 0.33g，產品收率為藥材的0.033％，純度為93.4％。
權利要求
1.一種改進的知母皂苷BII的制備方法，其包括a)將市售的中藥知母飲片或者新鮮采集的知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)根莖或須根為原料，用選自水、丙酮、乙醇、丙醇或它們的至少兩種混合物溶劑提取，b)將a)中提取物通過選自樹脂吸附、聚酰胺層析、反相柱層析法或Sephadex LH-20柱層析法的一種或者多種方式分離，用水、丙酮、乙腈、乙醇、丙醇或它們的至少兩種混合物作洗脫劑洗脫，c)合并b)中洗脫液，然后干燥得到知母皂苷BII。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于a)中提取是在室溫或加熱狀態下提取、超聲波振蕩儀超聲振蕩提取，提取次數可以是一次，也可以是多次。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于a)中所述溶劑提取是在水煎煮原料后，用下述方法之一提取10-95％的乙醇水溶液回流、滲漉或超聲提取；10-80％的丙酮水溶液回流、滲漉或超聲提取。
4.如權利要求1所述方法，其特征在于b)中所述樹脂吸附法中所用的樹脂為聚苯乙烯型大孔吸附樹脂，洗脫溶劑選自由水、丙酮、乙醇和丙醇組成的溶劑，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
5.如權利要求4所述方法，其特征在于b)中所述樹脂為D-101型吸附樹脂、AB-8型吸附樹脂、XAD-2型吸附樹脂、HP20型吸附樹脂、SP825型吸附樹脂、SP700型吸附樹脂、CHP-20P型吸附樹脂或者SP70型吸附樹脂。
6.如權利要求5所述方法，其特征在于所述樹脂吸附法為使溶劑提取液的離心上清液或過濾液通過大孔樹脂吸附，用水或5-30％的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液淋洗除去雜質，用量為柱體積的2-7倍，再用20-70％的丙酮或乙醇或丙醇的水溶液洗脫，用量為柱體積的2-7倍。
7.如權利要求1所述知母皂苷BII的分離制備方法，其特征在于b)所述聚酰胺層析為柱層析法或靜態吸附過濾法，洗脫劑選自由水、丙酮、乙腈、乙醇或丙醇組成的溶劑，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
8.如權利要求1所述方法，其特征在于b)中所述聚酰胺層析為使含知母皂苷BII的水溶液通過聚酰胺柱，用水或0-15％的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液洗脫，用量為柱體積的2-5倍。
9.如權利要求1所述方法，其特征在于所述反相柱層析法為常壓或加壓反相柱層析，所用柱填料為十八烷基鍵合相(ODS)或八烷基鍵合相，洗脫劑選自由含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水丙醇組成的洗脫劑，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
10.如權利要求1所述知母皂苷B II的分離制備方法，其特征在于所述Sephadex LH-20柱層析法為常壓或加壓柱層析，洗脫劑選自由含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水丙醇組成的洗脫劑，洗脫時可以等濃度洗脫，也可以梯度洗脫。
全文摘要
本發明涉及一種知母皂苷BII的分離制備方法。該方法以中藥知母或者新鮮采集的知母Anemarrhena asphodeloides Bge.根莖或須根為原料，采用溶劑提取法、樹脂吸附法、聚酰胺層析、反相柱層析法、Sephadex LH－20柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結合減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法分離制備知母皂苷BII。本方法制備的知母皂苷BII的純度高于90％，而且工藝簡單實用，適宜于產業化生產。
文檔編號C07J71/00GK1693310SQ20051005946
公開日2005年11月9日 申請日期2005年3月25日 優先權日2004年4月29日
發明者馬百平, 陳浩, 熊呈琦, 康利平, 張潔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所