專利名稱：表皮生長因子受體靶向短肽與力達霉素構成的抗腫瘤基因工程融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種強化的基因工程重組融合蛋白及其制備方法和在抗腫瘤靶向藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類生命和健康的疾病。其中，消化道癌癥和呼吸道癌癥在我國發病率最高，主要有胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、大腸癌等，而且隨著人類生存環境的日益惡化，這類腫瘤的發生率呈逐年上升趨勢。
針對上述腫瘤，目前臨床采用的治療方案主要有外科手術治療、放射治療、化學藥物治療、介入放射學治療、免疫學治療和導向治療等。所說靶向治療，是利用對腫瘤有特異性親和力的抗體或化合物；或者利用有物理導向作用的磁性；或者通過腫瘤血管特異性導向的碘油作為載體，與具殺傷腫瘤作用的“彈頭”(放射性核素、化療藥物、毒蛋白等)制成偶聯物，以達到較多殺傷腫瘤而較少損害正常組織的目的。單克隆抗體作為“載體”由來已久，但是完整抗體分子量大約為150kDa，對腫瘤組織的滲透能力有限，導致單抗偶聯物較難穿過細胞外間隙到達實體瘤的深部。因此，分子小型化已成為單抗靶向藥物發展的必然趨勢。
表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)由53個氨基酸組成，分子量為6045KDa。EGF的生物活性十分廣泛，雖然其名為表皮生長因子，但后來的研究表明，它對多種來源的上皮細胞都有促增殖活性，并與創傷愈合有關。EGF還可作為腫瘤促進因子增強病毒或致癌物的致癌作用。許多轉化細胞分泌TGF-α并表達表皮生長因子(EGFR)形成自泌機制。EGFR的激活已經顯示有助于增強腫瘤的生長和發展的進程，包括促進增生，血管生成，腫瘤的侵襲/轉移，和抑制凋亡。腫瘤細胞中EGFR的表達與疾病的發展、低存活率、低治療效果以及對細胞毒、化療藥物耐受的發展都有關系。已經在許多種腫瘤包括前列腺癌，乳腺癌，胃癌，結腸癌和子宮癌中觀察到EGFR的高水平表達。抑制EGFR和EGFR的相關通路，包括使用抗EGFR胞外配體結合域的單抗和針對于EGFR的酪氨酸激酶活性的抑制劑等治療策略已進入臨床實驗。酪氨酸激酶抑制劑ZD1839和OSI-774目前正進行III期臨床研究。2004年2月12日，美國FDA批準了抗EGFR單抗ErbituxTM(cetuximab，又稱為IMC-C225)用于治療晚期結腸癌患者。Erbitux是一個同時含有人和鼠基因片段的基因工程嵌合抗體，它是以腫瘤細胞表面的EGFR為靶點而起作用，干擾腫瘤細胞的生長。
力達霉素(lidamycin，LDM，又稱C1027)是從我國湖北潛江縣土壤分離得到的一株放線菌(Streptomyces globisporu，s菌種保藏號為CGMCC No.0704)產生的對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。體內動物試驗表明，LDM對小鼠結腸癌26，移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種腫瘤均有顯著療效(中國抗生素雜志1994，19(2)164-168)。LDM包括兩個部分一部分為烯二炔結構的發色團(activeenediyne，AE)，具有極強的細胞毒作用，但是不穩定；另一部分為110個氨基酸殘基組成的輔基蛋白(lidaprotein，LDP)，對發色團的穩定性起保護作用。發色團與輔基蛋白通過非共價鍵結合，兩者結合是特異的，并且經過拆分后可以重建(中國醫學科學院學報2001，23(6)563-567)。力達霉素具有獨特的可拆分重建的分子結構特點，便于DNA重組以及分子強化；另一方面，LDM輔基蛋白LDP分子量只有10.5kDa，當LDP與不同來源的生長因子制備得到的融合蛋白，其分子量僅為15-20kDa，將大大低于目前已知的其它免疫毒素融合蛋白。本發明構建的以力達霉素為“彈頭”藥物，以EGFR靶向特異性結合短肽SG為“載體”的高效、小型化的強化融合蛋白SG-LDP-AE，迄今尚未見有相關報道。
本發明的目的在于提供一種抗腫瘤藥物強化融合蛋白SG-LDP-AE。
本發明的另一目的在于提供所說強化融合蛋白SG-LDP-AE制備方法。
本發明的又一目的在于提供一種強化融合蛋白SG-LDP-AE在腫瘤靶向治療中的應用。
發明內容
為了提高融和蛋白的效果，本實驗室對“載體”和“彈頭”進行了研究和選擇，所用的“彈頭”藥物是力達霉素；選用的EGFR靶向特異性結合短肽SG是在構建表達載體時，將與EGFR特異結合的短肽GE7基因序列的上游加入一段大腸桿菌分泌表達信號肽基因片段，在此基因片段和短肽片段之間引入一個酶切位點NcoI。其中所述短肽GE7是依據配體和受體相互結合的原理，采用電腦圖象模擬設計合成的，它可與表達EGFR的腫瘤細胞特異結合(《中國科學(C輯)》1998，28(6)554-562)。在表達載體進行分泌表達時，切除信號肽后在短肽GE7的N端留下兩個氨基酸Met和Ala，從而得到短肽SG。該短肽是第一個用于與力達霉素融合的EGFR靶向特異性結合短肽，可以為探索新物種靶點特異性結合片段應用方面作出貢獻。
本發明所說的強化融合蛋白SG-LDP-AE是由EGFR靶向結合的短肽SG、力達霉素輔基蛋白LDP和羧基端的組氨酸六聚體尾形成的融合蛋白SG-LDP(分子量約為13.9kDa)與活化型烯二炔發色團AE(分子量為843Da)構成的，編碼SG-LDP的基因全長492bp，編碼141個氨基酸。其中SG基因全長54bp，編碼18個氨基酸(在SG基因前有66bp的信號肽基因序列)；LDP基因全長330bp，編碼110個氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因為18bp，編碼6個氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點基因為6bp，編碼2個氨基酸，終止密碼子為3bp。
具體步驟如下A.EGFR靶向結合的短肽SG與力達霉素輔基蛋白LDP的融合基因構建含EGFR靶向結合的短肽SG與力達霉素輔基蛋白LDP融合基因的表達載體pET30SGLDP的構建，是運用基因工程技術，分別克隆得到EGFR靶向結合的短肽SG基因和力達霉素輔基蛋白LDP基因，將二者與編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同時在SG基因前引入一段信號肽序列，該信號肽序列之后引入特異性酶切位點。
B.融合蛋白大腸桿菌重組表達質粒pET30SGLDP的構建將融合基因克隆至大腸桿菌表達質粒pET-30a(+)中，構建重組表達質粒pET30SGLDP。
C.融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌pET30SGLDP(保藏編號CGMCC No.1320)中的誘導表達融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中的誘導表達包括將pET30SGLDP轉化入大腸桿菌宿主菌中，經IPTG誘導表達獲得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。
D.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及分離融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及其分離制備是通過親和層析純化融合蛋白SG-LDP，再進行透析，濃縮，制備功能性融合蛋白。
E.強化融合蛋白SG-LDP-AE的制備及分離強化融合蛋白SG-LDP-AE的制備分離，是將純化分離得到的融合蛋白SG-LDP與經甲醇提取制備的力達霉素發色團的活性型烯二炔AE，以分子比為50∶1和強化時間為12小時，室溫下進行分子強化，獲得強化融合蛋白SG-LDP-AE。
通過融合蛋白SG-LDP對不同腫瘤細胞的免疫學活性檢測以及強化融合蛋白SG-LDP-AE對腫瘤細胞的細胞毒作用檢測結果表明，強化融合蛋白SG-LDP-AE在治療腫瘤的應用中優選治療EGFR高表達的腫瘤細胞或Her2高表達的腫瘤細胞。
EGFR高表達的腫瘤細胞包括人肝癌Bel-7402，人口腔鱗狀上皮KB細胞，人結腸癌HT-29細胞，子宮頸癌HeLa等細胞。
本發明的優點與積極效果在于，所說強化融合蛋白SG-LDP-AE穩定性好，不易脫落，可以應用基因工程手段進行發酵生產，成本低廉。以EGFR靶向結合的短肽為載體，分子量小，免疫原性弱，不易引起人體對外源抗體的免疫反應，副作用小，同時短肽作為靶受體的配基，對實體瘤的滲透力強，有助于迅速到達靶腫瘤細胞，充分發揮力達霉素對腫瘤細胞的強烈殺傷作用。本發明的強化融合蛋白SG-LDP-AE是一種新型高效小型化的靶向藥物，是第一個將EGFR靶向結合的短肽SG用于與力達霉素融合的抗腫瘤靶向藥物，該融合蛋白的腫瘤靶向性好，具有良好的臨床應用前景。
圖1重組質粒pET-GLDP的限制性內切酶分析其中1.DNA Marker DL15000 2.pET-30a(+)3.pET-GLDP 4.pET-30a(+)/NdeI+XhoI5.pET-GLDP/NdeI+XhoI6.PCR擴增的GLDPgene7.DNA Marker DL2000圖2重組質粒pET-SGLDP的限制性內切酶分析其中1.MarkerDL15000+2000 2.PCR擴增的SGLDP gene3.pET-30a(+)/NdeI+XhoI 4.pET-30a(+)5.pET-SGLDP/NdeI+XhoI 6.pET-SGLDP圖3表達載體pET-SGELDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中誘導表達的SDS-PAGE分析其中1.空載體誘導前全菌蛋白組分2.空載體誘導后全菌蛋白組分3.37℃表達菌株誘導后全菌蛋白組分4.28℃表達菌株誘導后全菌蛋白組分5.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)6.空載體誘導前培養基中蛋白組分7.空載體誘導后培養基中蛋白組分8.37℃表達菌株誘導后培養基中蛋白組分9.28℃表達菌株誘導后培養基中蛋白組分圖4表達產物的SDS-PAGE和Western-blot分析其中1.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)2.誘導前細胞全菌蛋白組分3.誘導前培養基中蛋白組分4.誘導后細胞全菌蛋白組分5.誘導后培養基中蛋白組分6.周質空間蛋白組分7.可溶蛋白組分8.不可溶蛋白組分圖5金屬螯合層析分離純化融合蛋白SG-LDP的SDS-PAGE分析其中1.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)2.誘導后培養基中蛋白組分3.硫酸銨沉淀后透析后樣品4.未結合組分5.第一次洗滌組分6.第二次洗滌組分7.第一次洗脫組分8.第二次洗脫組分9.第三次洗脫組分圖6ASG-LDP對不同腫瘤細胞的免疫結合活性分析其中◆Bel-7402 ■MCF-7△MCF-7/Her2×KB*Hela ●HT-29圖6BLDP對不同腫瘤細胞的免疫結合活性分析其中◆Bel-7402 ■MCF-7△MCF-7/Her2×KB*Hela ●HT-29圖7強化融合蛋白對Bel-7402細胞的體外細胞毒作用其中■LDM◆SG-LDP-AE◆圖8ALDM對MCF-7細胞體外細胞毒作用其中■MCF-7◆MCF-7/Her2圖8B強化融合蛋白對MCF-7/Her2細胞的體外細胞毒作用其中■MCF-7◆MCF-7/Her2◆
圖9強化融合蛋白SG-LDP-AE對小鼠肝癌H22的生長抑制作用其中◆對照 ■SG-LDP-AE 0.2mg/kg△SG-LDP-AE 0.4mg/kg×SG-LDP-AE 0.8mg/kg*LDM 0.05mg/kg ●SG-LDP 1.6mg/kg|MMC 1mg/kg實施方式以下所舉實施例，對于本發明而言只是說明性的，而非限制性的。
實施例1.含EGFR靶向結合的短肽SG/力達霉素輔基蛋白LDP基因的表達載體pET30SGLDP的構建L1上游5’GACAT ATGAAC CCC GTG GTG GGC TAC ATC GGT GAA CGT CCT CAGNde ITAT CGT GAC CTG GGT GGA GGC GGT TCA GCG CCC GCC TTC TCC GTC3’R1下游5’GTTACTC GAGGCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’Xho IL2上游5’GAATCCACAT ATGAAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTGNde ICTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC ATG GCC AAC CCC GTGGTG GGC TAC3’R2下游5’GTTACTC GAGGCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’Xho I以質粒pIJ1027GRGDS(含有LDP基因，由本實驗室構建，本實驗室可向公眾提供并出具相關證明)為模板，以引物L1和R1(上海生物工程公司合成)按常規PCR反應條件進行擴增，得到長約0.4kb的GLDP基因片段。將PCR擴增反應產物GLDP進行1％瓊脂糖凝膠電泳，經染色后用BioDev公司的玻璃奶試劑盒回收GLDP基因片段。將此基因片段用Nde I/XhoI雙酶切用T4DNA連接酶和經過Nde I/Xho I雙酶切的質粒pET-30a(+)連接得到質粒pET30GLDP，將連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，37℃培養后挑取單克隆，小量培養后提取質粒進行Nde I/Xho I雙酶切鑒定(圖1)。將能切下約0.4kb基因片段的重組表達質粒轉入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司產品)的感受態細胞中，篩選獲得重組轉化子并提取轉化子。用T7通用引物測序，結果表明，該融合基因與預期相符(上海博雅北京分公司進行序列測定)。
以質粒pET30GLDP為模板，以引物L2和R2(上海生物工程公司合成)按常規PCR反應條件進行擴增，得到長約0.5kb的SG-LDP基因片段。其余操作同上，得到表達質粒pET30SGLDP，進行酶切鑒定(圖2)。將能切下約0.5kb基因片段的重組表達質粒轉入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司產品)的感受態細胞中，篩選獲得重組轉化子并提取轉化子。用T7通用引物測序，結果表明，該融合基因與預期相符(上海博雅北京分公司進行序列測定)。SG基因全長54bp，編碼18個氨基酸(在SG基因前有66bp的信號肽基因序列)；LDP基因全長330bp，編碼110個氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因為18bp，編碼6個氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點基因為6bp，編碼2個氨基酸。本發明使用的表達質粒pET-30a(+)，在其多克隆位點的3’端融合有一段編碼組氨酸六聚尾(His×6-Tag)的基因序列，經翻譯表達后，His×6-Tag便于融合蛋白的表達鑒定和分離純化。
實施例2.融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中的誘導表達本發明使用的表達載體是大腸桿菌表達體系E.coli BL21(DE3)starTM，為Invitrogen公司產品。以構建好的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)starTM獲得重組轉化菌，從LB平板上挑取單克隆菌落接種到含50μg/ml的卡那霉素的LB培養基中，37℃，180rpm振蕩培養過夜。次日按2-3％接種量轉種，37℃，振蕩培養2-3小時至OD600約0.8-1.0，向培養物中加入終濃度為0.05mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導8個小時。15％的SDS-PAGE分析結果(圖3)表明，在培養液中經誘導的大腸桿菌約14kDa處有明顯的外源蛋白表達條帶，表達量占培養基組分的70％以上，而培養液中未經誘導的菌體則無此帶，細胞漿中也有少量的外源蛋白的表達。說明表達的蛋白主要存在于培養液上清中。在37℃和28℃的誘導溫度下均有外源蛋白的表達，且在37℃的誘導溫度下表達量比28℃的誘導溫度下表達量高。然后分別從全菌蛋白、培養液上清、細胞周質、胞漿中制備樣品，同時以帶空載體的pET-30a的菌株的樣品和未進行誘導的重組表達菌體樣品作為陰性對照。進行SDS-PAGE和Western-blot檢測(圖4)(半干電轉，電轉條件為恒電流0.85mA/cm2，時間約2小時)。一抗為抗His-Tag單抗(Novagen公司產品)，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG(Santa Cruz公司產品)，進行顯色反應(Western Blotting Luminol Reagent為Santa Cruz公司產品)，也證實在14kDa處有帶his-tag尾的外源蛋白的表達，并且外源蛋白主要在培養液上清中表達。將最終挑選出的最優表達融合蛋白的轉化菌株，其中含有能表達融合蛋白SG-LDP的質粒pET30SGLDP，命名為pET30SGLDP，于2005年3月3日送交位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號1320。
實施例3.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及其分離制備收集誘導表達的菌體發酵液上清，以113g/L的濃度在4℃，緩慢攪拌的條件下加入硫酸銨。4℃靜止放置1小時，4℃，10000g離心20分鐘，收集上清。將上清在4℃，緩慢攪拌的條件下加入硫酸銨，使其終濃度為390g/L。4℃靜止放置半小時，4℃，10000g離心20分鐘，收集沉淀。每100ml發酵液所得沉淀用2ml 1×Ni-NTA Binding Buffer(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH8.0)溶解后用相同溶液透析。
將Ni-NTA His-Bind樹脂(Novagen)裝入層析柱中，用1×Ni-NTA Binding Buffer平衡將透析后的樣品用0.45um的濾膜過濾后緩慢加入層析柱中。收集流出液，流速為10-15ml/小時；用8倍柱床體積的1×Ni-NTA Binding Buffer洗滌層析柱，收集流出液，流速為20-30ml/小時；用4倍柱床體積的1×Ni-NTA Elution Buffer(50mM NaH2PO4，300mMNaCl，200mM imidazole，pH8.0)洗脫結合到層析柱上的目的蛋白，收集流出液，流速為10-15ml/小時；將各部分流出液各取50ul和50ul 2×上樣緩沖溶液(100mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，5％2-ME，20％甘油，0.2％溴酚蘭)混合沸水浴5分鐘以變性蛋白，-20℃保存以備電泳分析。進行SDS-PAGE電泳分析(圖5)。收集含目的蛋白的洗脫液，將含目的蛋白的洗脫液用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4pH7.4)溶液透析，再經超濾濃縮得到高濃度的目的蛋白。
實施例4.強化融合蛋白SG-LDP-AE的制備分離取LDM凍干品(專利申請號001215272，公開號1284566)10mg，加5ml冷甲醇振搖5分鐘，-20℃放置1小時，中間振搖1次，在0℃，12000rpm/min，離心20分鐘，上清液富含AE，沉降物為肽鏈，重復提取2次。自然蒸發濃縮甲醇溶液，上述操作需要在4℃、避光條件下進行。取一定體積和濃度的SG-LDP溶于0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(體積比50∶1)，混和振搖，室溫放置12小時，將混和液以PD-10柱(商業化的Sephadex G-25柱，Pharmacia產品)層析分離，經A280nm紫外監測后棄過量未結合的AE，收集強化融合蛋白SG-LDP-AE。
實施例5.融合蛋白SG-LDP的免疫學活性檢測取對數生長期的腫瘤細胞按照2×104個/孔的密度鋪96孔板，培養24小時，經4℃預冷0.05％戊二醛固定15分鐘、1％的BSA封閉后，每孔加入倍比稀釋的融合蛋白，37℃孵育1-2小時后，先后用抗His抗體為一抗(Novagen公司產品，1∶2000倍稀釋)，HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗(Santa Cruz公司產品，1∶2500倍稀釋)37℃分別孵育半小時后，每孔加入100μl OPD底物反應液(鄰苯二胺∶底物緩沖液∶H2O2＝4mg∶10ml∶15ul)暗處進行顯色10分鐘，酶標儀測定492nm處吸光值。結果表明，靶向融合蛋白SG-LDP和不同的高水平表達EGFR的腫瘤細胞如KB，7402，HeLa，HT-29等都有較強的免疫結合活性，而力達霉素輔基蛋白LDP對上述腫瘤細胞幾乎沒有免疫結合活性(圖6A，6B)。
實施例6.強化融合蛋白SG-LDP-AE對腫瘤細胞的細胞毒作用的MTT檢測取對數生長期的細胞消化、計數，3×103個/孔鋪于96井板，在37℃含5％CO2的培養箱中培養24小時后吸棄上清，加入以RPMI1640稀釋的不同濃度的藥物，200ul/井，每個藥物濃度設3個平行井。繼續培養48-72小時后，每井加入以PBS溶解的MTT(2mg/ml)50ul，37℃繼續培養4小時后，吸棄上清，加入150ul DMSO，室溫下搖床振搖15分鐘，酶標儀上測定560nm的光吸收值。每次實驗均設無藥對照井和無細胞空白井各3井。按下列公式計算細胞的存活率及樣品的IC50值。
結果表明，SG-LDP-AE對高表達EGFR的KB，7402，HeLa，HT-29等腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，IC50值分別為8.9×10-11M、4.04×10-11M、1.14×10-9M、1.19×10-9M(圖7)，而LDM的IC50分別為3.66×10-11M、6.98×10-12M、1.74×10-10M、1.92×10-10M，和LDM相比，其IC50略高，其原因為SG-LDP-AE體外的發色團包裝效率要比天然的LDM的發色團包裝效率差。
對低表達EGFR的MCF-7細胞轉染Her2基因后用MTT法檢測細胞毒作用，以未轉染的MCF-7細胞作為對照，發現LDM對兩株瘤細胞的細胞毒作用變化不大(圖8A)，其IC50值分別為1.02×10-10(轉染前)和6.6×10-11(轉染后)；而SG-LDP-AE對轉染Her2基因后的MCF-7細胞的細胞毒作用要比未轉染的MCF-7細胞的細胞毒作用強(圖8B)，其IC50值分別為3.42×10-9(轉染前)和5.6×10-11(轉染后)，提示SG-LDP-AE可能對高表達Her2的腫瘤細胞也具有潛在的協同作用，而使其對高表達Her2的腫瘤細胞更敏感。
實施例7.強化融合蛋白SG-LDP-AE的動物試驗性治療方案根據劑量初篩結果，設計動物試驗治療的給藥方式和劑量。取體重為18-22g的昆明小鼠60只，隨機分組，每組10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理鹽水稀釋成細胞數為7.5×106個/ml，0.2ml/只，接種于昆明小鼠腋窩皮下。種瘤一天后，對照組靜脈注射生理鹽水，其余各組分別給予SG-LDP-AE，LDM，SG-LDP，絲裂霉素(MMC)。均為尾靜脈注射，0.2ml/只。實驗期間，每3天測量一次腫瘤長徑a和腫瘤短徑b，并記錄動物體重。以公式V＝1/2ab2計算瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，并計算抑制率。如圖9，表1所示。
表1.強化融合蛋白SG-LDP-AE對小鼠肝癌H22的生長抑制作用(實驗第21天)GroupDose No.of miceBody wt.(g) Tumor-size(cm3)Inhibition(mg/kg)Start/end Start/endX±s rate(％)
Control - 10/1040.6398.74±5.40 -LDM 0.0510/1030.4830.98±1.21 88.8**SG-LDP-AE0.8 10/1025.4620.36±0.66 95.8**0.4 10/1029.8291.81±2.05 79.3*SG-LDP 1.6 10/1039.5336.39±3.24 26.9MMC 1 10/1036.1575.82±4.06 33.4*P＜0.05 vs.control；**P＜0.01 vs.control。
試驗A第21天的結果表明(表1)，強化融合蛋白SG-LDP-AE體內有顯著療效，在0.4mg/kg、0.8mg/kg劑量，可明顯抑制H22皮下瘤的生長，從(圖9)中可以看到，SG-LDP-AE在0.8mg/kg劑量時療效尤其顯著，其第21天的抑制率達到95.8％。
序列表<110>中國醫學科學院醫藥生物技術研究所<120>表皮生長因子受體靶向短肽與力達霉素構成的抗腫瘤基因工程融合蛋白<140>
<141>
<160>2<170>
<210>1<211>492<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(1)…(66)<223>
<400>1atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60atggccatgg cgaaccccgt ggtgggctac atcggtgaac gtcctcagta tcgtgacctg120ggtggaggcg gttcagcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga180cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag240tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg300gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg360cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc420ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac480caccaccact ga492<210>2<211>141<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>
<223>
<400>2
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權利要求
1.一種強化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于它是由與表皮生長因子受體EGFR靶向結合的短肽SG、力達霉素輔基蛋白LDP和羧基端組氨酸六聚體尾形成的分子量為13.9kDa的融合蛋白SG-LDP以及分子量為843Da的活化型烯二炔發色團AE構成的，SG-LDP基因全長492bp，編碼141個氨基酸。
2.如權利要求1所述的強化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于其中的SG基因全長54bp，編碼18個氨基酸，在SG基因前有66bp的信號肽基因序列；LDP基因全長330bp，編碼110個氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因為18bp，編碼6個氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點基因為6bp，編碼2個氨基酸，終止密碼子為3bp。
3.一種制備如權利要求1所述強化融合蛋白SG-LDP-AE的方法，其特征在于所說方法主要采用DNA重組和分子強化的技術路線，具體步驟如下A.EGFR靶向結合的短肽SG與力達霉素輔基蛋白LDP的融合基因構建；B.融合蛋白大腸桿菌重組表達質粒pET30SGLDP的構建；C.融合蛋白SG-LDP在保藏編號為CGMCC No.1320的大腸桿菌pET30SGLDP中的誘導表達；D.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及分離；E.強化融合蛋白SG-LDP-AE的制備及分離。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征是步驟A中SG基因前運用基因工程技術引入一段信號肽序列。
5.如權利要求3所述的制備方法，其特征是步驟A中運用基因工程技術分別克隆得到EGFR靶向結合的短肽SG基因和力達霉素輔基蛋白LDP基因，將二者與編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同時在SG基因前的信號肽序列后引入特異性酶切位點。
6.如權利要求3或5所述的制備方法，其特征是步驟B中將所得到的融合基因克隆至大腸桿菌表達質粒pET-30a(+)中，構建重組表達質粒pET30SGLDP。
7.如權利要求3或6所述的制備方法，其特征是將pET30SGLDP轉化入大腸桿菌宿主菌中，經IPTG誘導表達獲得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。
8.如權利要求3或7所述的制備方法，其特征是通過親和層析純化融合蛋白SG-LDP，再進行透析，濃縮，制備功能性融合蛋白。
9.如權利要求3或8所述的制備方法，其特征是將純化分離得到的融合蛋白SG-LDP與經甲醇提取制備的力達霉素發色團的活性型烯二炔AE，以分子比為50∶1和強化時間為12小時，室溫下進行分子強化，獲得強化融合蛋白SG-LDP-AE。
10.強化融合蛋白SG-LDP-AE在制備新型抗腫瘤靶向藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種強化的基因工程融合蛋白SG－LDP－AE，其主要通過融合蛋白的基因工程構建和分子強化兩步技術路線制備而成，所說融合蛋白對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，在體外能與表達表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞特異性結合，動物實驗證明，其對小鼠移植性肝癌H22有非常顯著的療效，使用可耐受劑量，其抑制率可達95.8％(p＜0.001)，顯示了靶向藥物的小型化與高效化的特點，可望成為一種用于臨床治療腫瘤的新型靶向藥物。
文檔編號C07K14/005GK1687119SQ200510056489
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月24日 優先權日2005年3月24日
發明者陳紅霞, 甄永蘇, 師以康, 尚伯楊 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所