專利名稱：一種生產重組人骨形態發生蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及生產重組人骨形態發生蛋白的方法，屬于生物技術和制藥領域。
背景技術：
大塊骨缺損的修復治療一直是臨床骨科的難題。由于其自行愈合的可能性極小，故臨床上長期以來主要采用自體、異體骨移植或人工生物材料植入等方法進行修復治療。但是所有這些方法都存在某些不可克服的缺點，因而使他們臨床應用受到了極大限制。近年來的研究表明，一些生長因子如轉化生長因子-β，胰島素樣生長因子-II等對骨和軟骨的生長發育有著特異性作用，尤其是骨形態發生蛋白的發現給臨床醫師修復骨缺損帶來了新的希望，為臨床治療骨缺損開拓了一條新的途徑。
骨形態發生蛋白是1965年由美國科學家Urist MR在脫鈣的骨質提取物中研究發現的一類蛋白質。現已經證明這類蛋白屬于轉化生長因子-β超家族成員，已經發現了十余個家族成員。在對猴、狗、大鼠等多種動物實驗研究中證實，骨形態發生蛋白不僅能促進骨缺損的修復，而且在神經損傷的修復、牙周病和急性腎功能衰竭等治療領域都有很好的治療效果，是一種具有廣泛臨床使用價值的細胞因子。
人骨形態發生蛋白-2活性分子由相同的2條各含114個氨基酸的肽鏈組成同二聚體。分子量約30kd，等電點為7.9。人骨形態發生蛋白-2與轉化生長因子-β超家族的其他成員都有的共同的特征是每一亞基都含有非常保守的7個半胱氨酸殘基，其中6個形成三對鏈內二硫鍵，另1個形成鏈間二硫鍵。人骨形態發生蛋白-2分子結構中還有一個肝素結合位點和一個糖基化位點。研究已經證明糖基化作用對骨形態發生蛋白-2的生理活性無明顯影響。采用基因工程技術在大腸桿菌中生產重組的人骨形態蛋白一直是各國科學家探索的領域。但是，國內、外報告的重組的人骨形態蛋白原核制備技術都只能實驗室內完成活性組分的微量回收，無法實現規模化生產。
發明內容
本發明的目的是為克服現有基因工程技術不能實現在大腸桿菌工程菌中大量生產重組人骨形態蛋白的不足。提供了一種工藝簡單、成本低廉、能大規模生產有生物活性的重組人骨形態發生蛋白的方法。
本發明的生產重組人骨形態發生蛋白的方法，包括以下步驟1)當含編碼重組人骨形態發生蛋白成熟肽序列的質粒轉化細菌并誘導表達之后，離心收集細菌；2)將細菌破碎，離心收集包涵體，用洗滌緩沖液反復洗滌包涵體，去除雜質；3)用含變性劑和還原劑的裂解緩沖液連續攪拌裂解包涵體2-8小時；4)將裂解好的包涵體溶液離心，取上清連續緩慢地加入復性緩沖液中做稀釋復性，在0-28℃的環境中使之逐步恢復生物活性，復性液蛋白質的終濃度調節在0.02-0.3mg/ml的范圍內；5)用層析法分離純化有生物活性的二聚體。
本發明中，破碎細菌可以采用各種方法，如超聲破碎、高壓分散和研磨等破碎菌體，使之釋放出包涵體，由于包涵體密度高比重大，經離心即可得到較純的包涵體。
本發明中，洗滌包涵體的緩沖液由變性劑、表面活性劑、金屬離子螯合劑以及緩沖鹽組成，所說的變性劑是1-3M尿素或0.5～1M的鹽酸胍、表面活性劑為0.01-1％曲通100、金屬離子螯合劑為1-5mM乙二胺四乙酸二鈉，緩沖鹽為20mM-50mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷pH7.5-9.5。
本發明中，裂解包涵體所用的裂解緩沖液由50mM三羥甲基氨基甲烷pH7.5-9.5、6-7M鹽酸胍、5-20mM二硫蘇糖醇和1-5mM乙二胺四乙酸二鈉組成。
本發明中，所用的復性緩沖液由25～100mM三羥甲基氨基甲烷pH7.5-9.5、0.5-3M尿素、0.1-2M精氨酸、0.5-2M氯化鈉、1～5mM乙二胺四乙酸二鈉和氧化型谷胱苷肽/還原型谷胱苷肽對等組分組成，其中氧化型谷胱苷肽/還原型谷胱苷肽的濃度比為1∶1-1∶10。
復性的溫度應恒定在0-28℃范圍內，使變性的重組人骨形態發生蛋白肽鏈逐步恢復其天然構像。為了保證最佳的復性效果，復性液蛋白質的終濃度應該調節在0.02-0.3mg/ml的范圍內。復性的時間可根據非還原SDS-PAGE電泳膠中二聚體的多少來判斷或根據其刺激小鼠成纖維細胞的堿性磷酸酶活性來判斷。
本發明復性過程結束后，使用陰離子交換層析或疏水層析將正確折疊的二聚體活性組分與各種雜蛋白、沒有正確折疊的多肽鏈、多聚體蛋白分開。
陰離子交換層析法選擇的層析介質為Q Sepharose FF，以用25～100mM2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1-3M尿素、10mM NaCl和5-20％二甲基甲酰胺組成的平衡緩沖液平衡柱子后上樣；再用25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1-3M尿素、0.1-1M氯化鈉和5-20％二甲基甲酰胺組成的洗脫緩沖液作鹽濃度遞增的梯度洗脫。
疏水層析法選擇苯基瓊脂糖凝膠作介質，以25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1-3M尿素、5-20％二甲基甲酰胺、1-4M氯化鈉組成的平衡緩沖液平衡柱子后上樣，用25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1-3M尿素和5-20％二甲基甲酰胺組成的洗脫緩沖液做鹽濃度遞減的梯度洗脫。
本發明與背景技術相比具有的有益的效果是本發明方法克服了現有基因工程技術不能在大腸桿菌中大量生產重組人骨形態蛋白的缺陷，實現了用大腸桿菌工程菌大規模地生產重組人骨形態發生蛋白。該方法工藝簡單、生產成本低廉，而且生產的重組人骨形態發生蛋白具有得率高(＞15％)、生物活性好(堿性磷酸酶活性＞105IU/ml)、純度高(＞95％)等優點。適用于工程細菌所表達的重組轉化生長因子-β超家族成員的生產制備。
具體實施例方式
以下結合實施例進一步說明本發明實例1以生產大腸桿菌表達的重組人骨形態發生蛋白-2為例，包括以下步驟1)當含編碼重組人骨形態發生蛋白成熟肽序列的質粒轉化細菌并誘導表達之后，離心和過濾收集細菌；2)超聲破碎菌體，使之釋放出包涵體，離心收集包涵體，以每克包涵體用100ml洗滌緩沖液的比例進行洗滌，洗滌緩沖液由2M尿素，1％曲通100，2mM乙二胺四乙酸二鈉和50mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷pH8.0組成。洗滌過程反復多次，盡量除去與重組人骨形態發生蛋白-2無關的細胞蛋白質、核酸和菌膜成分；3)裂解緩沖液由50mM三羥甲基氨基甲烷pH8.0、7M鹽酸胍、10mM二硫蘇糖醇和2mM乙二胺四乙酸二鈉組成。每1.5克包涵體用20ml的裂解緩沖液連續攪拌裂解2-8小時，然后25000xg離心20分鐘，棄沉淀。用考馬士亮藍法測定上清液的蛋白濃度，并將蛋白濃度調節為5-20mg/ml。
4)復性緩沖液組成100mM三羥甲基氨基甲烷pH8.5、0.5M精氨酸、2mM乙二胺四乙酸二鈉、1M氯化鈉、3M尿素、1mM氧化型谷胱苷肽和5mM原型谷胱苷肽。
將裂解好的包涵體連續而緩慢加入復性緩沖液中，使蛋白的終濃度為0.02-0.3mg/ml，然后在0-28℃恒溫環境中復性1-24天。用非還原的SDS-PAGE電泳來檢查復性的效果。
5)復性過程結束后，使用陰離子交換層析法分離純化有生物活性的二聚體層析介質采用美國通用(GE)公司的Q Sepharose FF。
平衡緩沖液100mM 2-環己胺基乙磺酸pH8.5、10mM NaCl、10％二甲基甲酰胺、3M尿素。
洗脫緩沖液100mM 2-環己胺基乙磺酸pH8.5、3M尿素，1M氯化鈉、10％二甲基甲酰胺。
用平衡緩沖液平衡好柱子后上樣，繼續用平衡緩沖液洗滌柱子至基線不再波動，然后用洗脫緩沖液進行鹽濃度遞升的梯度洗脫，收集主峰。
實例2生產重組人骨形態發生蛋白-2，步驟如下1)當含編碼重組人骨形態發生蛋白成熟肽序列的質粒轉化細菌并誘導表達之后，離心和過濾收集細菌；2)超聲破碎菌體，使之釋放出包涵體，離心收集包涵體，以每克包涵體用100ml洗滌緩沖液的比例進行洗滌，洗滌緩沖液由0.5M的鹽酸胍、1％曲通100、2mM乙二胺四乙酸二鈉和20mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷pH7.5組成。洗滌過程反復多次，盡量除去與重組人骨形態發生蛋白-2無關的細胞蛋白質、核酸和菌膜成分；3)裂解緩沖液由50mM三羥甲基氨基甲烷pH8.0、7M鹽酸胍、10mM二硫蘇糖醇和2mM乙二胺四乙酸二鈉組成。每1.5g包涵體用20ml的裂解緩沖液連續攪拌裂解2-8小時，然后25000xg離心20分鐘，棄沉淀。用考馬士亮藍法測定上清液的蛋白濃度，并調節裂解液的蛋白濃度為5-20mg/ml。
4)復性緩沖液組成100mM三羥甲基氨基甲烷pH8.5、0.5M精氨酸、2mM乙二胺四乙酸二鈉、0.2M氯化鈉、1M尿素、1mM氧化型谷胱苷肽和5mM原型谷胱苷肽。
將裂解好的包涵體連續而緩慢加入復性緩沖液中，使蛋白的終濃度為0.02-0.3mg/ml，然后放在0-28℃恒溫環境中復性1-24天。用非還原的SDS-PAGE電泳來檢查復性的效果。
5)復性過程結束后，再使用疏水層析法分離純化有生物活性的二聚體層析介質采用苯基瓊脂糖凝膠。
平衡緩沖液100mM 2-環己胺基乙磺酸pH8.5、1M尿素、3M氯化鈉和10％二甲基甲酰胺。
洗脫緩沖液100mM 2-環己胺基乙磺酸pH8.5、1M尿素和10％二甲基甲酰胺。
層析柱用平衡緩沖液平衡后上樣，直至出現流穿峰為止，繼續用平衡緩沖液洗滌柱子至基線不再波動，再改用洗脫緩沖液進行鹽濃度遞減的梯度洗脫。
收集的峰樣品進行SDS-PAGE電泳分析、細胞堿性磷酸酶活性檢測和小鼠股四頭肌的肌袋內異位成骨實驗。
本發明重組人骨形態發生蛋白的生物活性測定1、體外培養細胞測活用鼠2T3間質干細胞株測定堿性磷酸酶活性。堿性磷酸酶活性單位定義堿性磷酸酶比活力指每毫克蛋白質中含有的酶活力單位數，表示為U/mg，一個酶活力單位定義為在37℃，pH10.5條件下每分鐘轉化1umol對硝基苯磷酸所需酶量。檢測證明堿性磷酸酶活性與重組人骨形態發生蛋白-2劑量呈依賴性，即隨重組人骨形態發生蛋白-2的劑量增加而堿性磷酸酶活性也增加，說明本產品有明確的生物活性。
2、體內異位成骨實驗按照國際上通用方法制備鼠股四頭肌袋模型。每個小鼠股四頭肌陷窩內給予0.5mg重組人骨形態發生蛋白-2，加等量的I型膠原作為賦型劑；對照組植入1mg I型膠原。三周后，進行X-射線檢測，以顯示成骨的活性。對照組應沒有異位成骨現象，而植入重組人骨形態發生蛋白-2的實驗動物應有明顯的異位成骨可見。
雖然本發明是以重組人骨形態發生蛋白-2為例進行闡述。由于轉化生長因子-β超家族其他成員的結構相似。因此，可適應轉化生長因子-β超家族其他成員的生產。所以應用本發明方法對轉化生長因子-β超家族其他成員的生產都應包括在本發明的權利主張范圍內，受本發明的權利要求的保護和限制。
權利要求
1.一種生產重組人骨形態發生蛋白的方法，其特征是包括以下步驟1)當含編碼重組人骨形態發生蛋白成熟肽序列的質粒轉化細菌并誘導表達之后，離心收集細菌；2)將細菌破碎，離心收集包涵體，用洗滌緩沖液反復洗滌包涵體，去除雜質；3)用含變性劑和還原劑的裂解緩沖液連續攪拌裂解包涵體2-8小時；4)將裂解好的包涵體溶液離心，取上清連續緩慢地加入復性緩沖液中做稀釋復性，在0-28℃的環境中使之逐步恢復生物活性，復性液蛋白質的終濃度調節在0.02-0.3mg/ml的范圍內；5)用層析法分離純化有生物活性的二聚體。
2.根據權利要求1所述的生產重組人骨形態發生蛋白方法，其特征是洗滌包涵體的緩沖液由變性劑、表面活性劑、金屬離子螯合劑以及緩沖鹽組成。所說的變性劑是1-3M尿素或0.5～1M的鹽酸胍、表面活性劑為0.01-1％曲通100、金屬離子螯合劑為1-5mM 乙二胺四乙酸二鈉，緩沖鹽為20mM-50mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷pH7.5-9.5。
3.根據權利要求1所述的生產重組人骨形態發生蛋白方法，其特征是裂解緩沖液由50mM三羥甲基氨基甲烷pH7.5-9.5、6-7M鹽酸胍、5-20mM二硫蘇糖醇和1-5mM乙二胺四乙酸二鈉組成。
4.根據權利要求1所述的生產重組人骨形態發生蛋白方法，其特征是復性緩沖液由25～100mM三羥甲基氨基甲烷pH 7.5-9.5、0.5-3M尿素、0.1-2M精氨酸、0.5-2M氯化鈉、1～5mM乙二胺四乙酸二鈉和氧化型谷胱苷肽/還原型谷胱苷肽對組分組成，其中氧化型谷胱苷肽/還原型谷胱苷肽的濃度比為1∶1-1∶10。
5.根據權利要求1所述的生產重組人骨形態發生蛋白方法，其特征是分離純化有生物活性的二聚體采用陰離子交換層析法，層析介質為Q Sepharose FF，以25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1～3M尿素、10mM NaCl和5-20％二甲基甲酰胺組成的平衡緩沖液平衡柱子后上樣；再用25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH7.5～9.5、1-3M尿素、0.1-1M氯化鈉和5-20％二甲基甲酰胺組成的洗脫緩沖液作鹽濃度遞增的梯度洗脫。
6.根據權利要求1所述的生產重組人骨形態發生蛋白的方法，其特征是分離純化有生物活性的二聚體采用疏水層析法，層析介質為苯基瓊脂糖凝膠，以25～100mM 2-環己胺基乙磺酸pH 7.5～9.5、1～3M尿素、5-20％二甲基甲酰胺、1～4M氯化鈉組成的平衡緩沖液平衡柱子后上樣，再用pH 7.5～9.5的25～100mM 2-環己胺基乙磺酸、1～3M尿素和5-20％二甲基甲酰胺組成的洗脫緩沖液做鹽濃度遞減的梯度洗脫。
全文摘要
本發明涉及一種生產重組人骨形態發生蛋白的方法。該方法包括以下步驟將發酵好的細菌破碎，分離包涵體并用變性劑裂解；將變性裂解的重組入骨形態發生蛋白復性，使其正確折疊成可溶的、并有生物活性的構象；用層析的方法純化即得高純度重組人骨形態發生蛋白。用本發明的方法生產重組人骨形態發生蛋白，具有得率高、生物活性好、純度高、工藝簡單、生產成本低廉等優點。
文檔編號C07K1/14GK1757723SQ200510050610
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月7日 優先權日2005年7月7日
發明者徐放 申請人:徐放