專利名稱：中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其所編碼的抗菌肽與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其所編碼的抗菌多肽與應用，尤其涉及一種中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其所編碼的抗菌多肽與應用；屬基因工程技術領域。
背景技術：
中國對蝦是我國重要的海產養殖品種，但90年代以來，對蝦病大規模暴發，使海產養殖業遭受嚴重損失。國內許多學者在對蝦病防治方面作了大量的工作，并且取得了很多進展，對蝦的養殖產量也逐年回升；但到目前為止，對蝦病仍是困擾對蝦養殖業的一個難題。解決這一問題主要應從控制病原和提高對蝦免疫力等方面入手，對蝦的防御機制主要依賴血細胞的活動，包括吞噬外來物質或形成包涵體，血細胞合成抗菌物質(抗菌肽或多肽)并釋放到血淋巴；另外酚氧化酶系統導致局部黑化和凝集，也起著一定的作用。
Deatoumieux等對凡納對蝦的抗菌肽進行了研究，從中分離得到了對蝦抗菌肽(稱為對蝦素，Penaeidins)并克隆到其基因，同時還對其進行了性質、基因表達和定位以及重組表達等方面的研究(Destoumieux D，Bulet P，Loew D et al.Penaeidin，a new familyof antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei.J Biol Chem，1997，27228398-28406)。我們也從中國對蝦中克隆得到了對蝦素基因，并對其進行了性質、基因表達和定位以及重組表達等方面進行了研究，獲得到了有廣譜抗菌活性的重組對蝦素。
許多研究表明，對蝦中含有多種可以對抗外界病原微生物的蛋白或肽類。包括對蝦素(penaeidins)、殼質素(crustins)、抗脂多糖因子(ALF)和來自對蝦血藍蛋白C-端的陰離子抗菌肽。但是，在諸多的相關報道中，未見有中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因的報道，本發明從中國對蝦中克隆得到一種含單一乳清酸性蛋白結構域(peptide containing single whey acidic protein(WAP)domain)的抗菌肽基因，雖然國外在凡納對蝦中也發現了類似基因，但至今沒有所述中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因重組表達和功能研究的報道。
發明內容
針對目前研究現狀的不足，本發明的目的是提供一種中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其核苷酸序列，并提供其克隆方法與載體。
本發明所述的中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度390堿基對
*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源對蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atggtgaaca tcaaggaagt tctgatcgtg tccgtgttgg tggccgcggt ggctgtttct 60cccgccgatg ctgttccaac gagacacgct aggccccgtc ctcagcccag gccgaggcca 120gggacgtgtc cggacacgag cgacatcgtc tccatctgcg tcgtgacgga acgcaactgc 180ttctcggacg gcgagtgcgg agccggccag aagtgctgtc cgattggctg cgggagagag 240tgcctggctg tgggatctcc ctacggaaaa tgaagatcgt aggaggggga cgaaatttcc 300tcgatgggct cacagtctcc ctggaaatat tattgaagcg tgttgattca ttgataataa 360aattgtgttg tttcaaaaaa aaaaaaaaaa 390本發明的另一個目的是提供一種由中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因編碼的抗菌肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度90氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Val Asn Ile Lys Glu Val Leu Ile Val Ser Val Leu Val Ala5 10 15Ala Val Ala Val Ser Pro Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg His Ala20 25 30Arg Pro Arg Pro Gln Pro Arg Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Asp35 40 45Thr Ser Asp Ile Val Ser Ile Cys Val Val Thr Glu Arg Asn Cys50 55 60Phe Ser Asp Gly Glu Cys Gly Ala Gly Gln Lys Cys Cys Pro Ile65 70 75Gly Cys Gly Arg Glu Cys Leu Ala Val Gly Ser Pro Tyr Gly Lys80 85 90
其中，還包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的變異體，它編碼具有少于8個氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變。
本發明的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA的克隆方法是采用一步法或RNAkit從對蝦中提取總RNA，或者用mRNA kit分離提取mRNA；然后利用總RNA或mRNA反轉錄合成cDNA；其中根據對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因的保守序列設計的引物為正向引物F1 5’GTG TTG GTG GCC GCG GTG GC 3’反向引物R1 5’CAC AGC CAG GCA CTC TCT CC 3’PCR反應條件為首先94℃變性2分鐘，然后進入下列循環94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共進行30個循環，最后72℃延伸10分鐘。
純化通過鏈式聚合酶反應(PCR)擴增獲得DNA片段；取上述純化產物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega公司產品)或pMD 18-T載體(TaKaRa公司產品)，轉化DH5α細胞(常用載體宿主細胞)，平板培養；提取并純化質粒，擴增質粒并測序；再經過3’和5’末端快速擴增，將3’和5’端序列拼接，即得SEQ ID NO.1所示中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因全長核苷酸序列。
本發明的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。
其中，上述應用的方法是通過基因重組技術使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進行表達，獲得具有抗菌活性的重組蛋白(圖1)。
例如將獲得的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因克隆到pET-30a(Novagen公司)表達載體，轉化大腸桿菌BL21 DE3細胞，進行誘導表達，純化；并利用獲得重組蛋白進行抑菌實驗。
實驗結果表明，重組的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽具有抗革藍氏陰性菌和陽性菌的活性(圖2)。
利用本發明的方法通過現有基因工程方法修飾中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因，還可用于其他研究和生產。
利用本發明獲得的重組的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動植物基因轉化和藥物開發。
圖1中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽的重組表達與純化其中A不同菌株的誘導表達1誘導前菌株I，2誘導前菌株II，3誘導后菌株I，4誘導后菌株II。
B重組抗菌肽的純化1誘導后細胞破碎后的上清液電泳結果，2細胞破碎后的沉淀，3純化的對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽。
圖2重組的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽的抑菌實驗其中A為不同濃度的抗菌肽對大腸桿菌的抑菌效果；B為不同濃度的抗菌肽對藤黃微球菌的抑菌效果。
具體實施例方式
實施例1中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA的克隆1)總RNA的提取采用現有技術一步法提取總RNA。
2)cDNA第一鏈合成6微克總RNA，加反應液20微升，反應液是50毫摩爾氯化鉀和3毫摩爾氯化鎂混合液，10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT)，5微摩爾寡聚脫氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩爾脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25單位RNA酶抑制劑，8單位AMV逆轉錄酶，42℃反應90分鐘，70℃10分鐘終止反應。
3)PCR反應鏈式聚合酶反應(PCR)試劑與條件首先將下列試劑混在一起·10xTaq DNA聚合酶緩沖液 5微升(μl)·模板cDNA1μl·正向引物(1.25μg/μl) 1μl·反向引物(1.25μg/μl) 1μl·脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶 0.25μl·滅菌水 37.75μl·總體積 50μl根據對蝦對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽的保守序列設計的引物為正向引物F1 5’GTG TTG GTG GCC GCG GTG GC 3’反向引物R1 5’CAC AGC CAG GCA CTC TCT CC 3’PCR反應條件為首先94℃變性2分鐘，然后進入下列循環94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共進行30個循環，最后72℃延伸10分鐘。
4)反應產物純化利用德國奎因(QIAGEN)公司產品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步驟按產品說明書進行。
5)對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA克隆取純化產物3微升，連接于pGEM-T Easy載體(Promega公司產品)。轉化到大腸桿菌DH5α菌株，在含有氨芐青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩爾/毫升)的平板生長過夜，挑取3個白斑，在LB液體培養基(5毫升，含100微克/毫升安芐青霉素)中培養過夜。
6)質粒純化收取過夜培養菌液2毫升，離心(10000轉/分，1分鐘)收集細胞。用微量DNA純化試劑盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美國普洛麥格Promega公司)純化質粒，純化步驟按說明書進行。
7)序列測定與同源檢索取純化質粒4微升，用載體引物T7進行全自動測序(本工作在上海生工公司完成)。將所得序列與基因庫序列比較。
8)對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA 3’端快速擴增根據得到的抗菌肽基因片段，再設計一條特異性正向引物F1 5’GTG TTG GTG GCCGCG GTG GC 3’，進行cDNA 3’端快速擴增，操作步驟按寶生物3’RACE試劑盒說明書進行。
取血細胞總RNA約20μg，其他試劑的調制和反應條件按說明書進行。用特異性引物F3與3’接頭進行3’端PCR擴增，采用56℃退火，其余與上述的PCR擴增程序相同，對所得產物按前述方法進行克隆、驗證和測序。
9)對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA 5’端克隆利用上述獲得的總RNA，按CLONTECH公司(美國)SMARTTMPCR cDNA文庫構建試劑盒說明書進行進行第一鏈cDNA合成。
以上述cDNA為模板，以試劑盒提供的5’PCR引物和反向引物R1 5’CAC AGC CAGGCA CTC TCT CC 3’為引物進行PCR擴增，獲得對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA的5’序列。
將3’和5’端序列拼接，即獲得SEQ ID NO.1所示中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽cDNA基因全長核苷酸序列。
實施例2重組表達載體構建、表達與抑菌功能測定(1)根據中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因的序列和表達載體pPET30a(Novagen公司)的克隆位點，設計引物Wap FCGC GATGAA TTCATG GTG AAC ATC AAG GAA G(EcoR I)Wap RTAG ATCCTC GAGTTT TCC GTA GGG AGA TCC CAC(XhoI)本發明選擇了pET30 a克隆位點的EcoR I和Xho I酶切位點，因此，設計引物時在上游引物引入了EcoR I酶切位點，下游引物上引入了Xho I酶切位點。
(2)基因擴增、克隆與重組質粒篩選以pMD-18T-Wap為模板，用上述引物進行PCR反應，擴增條件為94℃，2min預變性；94℃，30s，55℃，45s，72℃，45s，35個循環；72℃延伸10min。
2％的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物檢測。
將PCR產物作制備電泳，用UNIQ-5Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工產品)回收、純化PCR產物，經過EcoR I和Xho I內切酶酶切，切下兩端帶有Xho I和EcoR I內切酶位點的家蠅防御素成熟肽cDNA片段，同樣表達載體pET30a經過EcoR I和XhoI內切酶酶切，暴露出多克隆位點兩端的Xho I和EcoR I內切酶位點。然后，將酶切后的擴增產物與表達載體用T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞，LB+Amp平板PCR篩選陽性克隆。挑取PCR篩到的菌落，37℃振蕩擴增培養并抽提質粒，EcoR I和XhoI雙酶切與測序驗證后，即為重組表達質粒pET30a-Wap。接轉化E.coli表達菌株BL21 DE3感受態細胞，涂布LB+Amp平板，37℃倒置過夜培養。
(3)篩選表達菌株從上述LB+Amp平板上挑取8個單克隆菌落，2ml LB+Amp液體培養基37℃振蕩過夜培養，次日，取20μl過夜培養液加入到2ml LB+Amp液體培養基中轉培養，37℃振蕩培養3h，至OD600在0.5～0.7之間，然后加入IPTG至終濃度為1mmol，繼續37℃振蕩培養誘導表達4h。誘導前，隨機從一個樣品中取出0.5ml菌液，電泳檢測時作未誘導對照。
表達完后，各取0.5ml菌液，5000r/min離心5min收集細胞，包括未誘導的樣品，重懸于100μl去離子水中，以此為電泳樣品作15％的SDS-PGAE。根據電泳結果，鑒定表達菌株。
(5)重組對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽表達與純化挑取表達菌株單克隆在LB+Amp液體培養基中37℃過夜振蕩培養，次日，按照體積比1∶100加入到100ml LB+Amp培養基中轉培養，37℃振蕩培養3h后，再加入IPTG至終濃度為0.5mmol，再37℃振蕩誘導培養4h。誘導前取出0.5ml的菌液，作為誘導前對照樣品。誘導培養完后，菌液在合適的離心管中7000r/min離心10min收集細胞，細胞重懸于5ml預冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混勻后冰浴30min。超聲波破碎細胞，超聲循環為超聲1s；間隔1s；全程40s。重復4次，每次間隙時將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質變性。最后，將破碎后的菌液10000r/min離心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分別留樣、備用。
重組蛋白以包含體的形式存在，以常規方法經過包含體純化、復性和親和層析，即獲得到了重組蛋白——重組對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽(見圖1A，B)。
(6)重組蛋白抑菌活性測定以管碟法檢測抑菌活性，方法如下固體平板制備固體平板的下層膠為一層0.5～1cm厚度的1.5％的瓊脂，上層膠為0.5～1cm厚度的含有5μL對數生長期細菌的8mL固體低營養細菌培養基(1％tryptone，0.5％NaCl，1.5％Agar，pH7.5)。水平靜置，冷卻，備用。
在上述固體平板上設計放置多個經過滅菌的牛津小杯(如圖2)，在平板的底面做好標記，分別取50μL待測樣品，加入相對應的牛津小杯中，28℃正面靜置培養過夜，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。
實驗結果本發明所述的重組的中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽對對大腸桿菌或藤黃微球菌有明顯的抑菌效果(見圖2)。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學<120>中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其編碼的抗菌肽與應用<141>2005-9-6<160>2<210>1<211>390<212>cDNA<213>對蝦(Fenneropenaeius chinensis)<221>中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因<222>(1)…(390)<400>1atggtgaaca tcaaggaagt tctgatcgtg tccgtgttgg tggccgcggt ggctgtttct60cccgccgatg ctgttccaac gagacacgct aggccccgtc ctcagcccag gccgaggcca 120gggacgtgtc cggacacgag cgacatcgtc tccatctgcg tcgtgacgga acgcaactgc 180ttctcggacg gcgagtgcgg agccggccag aagtgctgtc cgattggctg cgggagagag 240tgcctggctg tgggatctcc ctacggaaaa tgaagatcgt aggaggggga cgaaatttcc 300tcgatgggct cacagtctcc ctggaaatat tattgaagcg tgttgattca ttgataataa 360aattgtgttg tttcaaaaaa aaaaaaaaaa390SEQ ID NO.2<210>2<211>90<212>PRT<221>中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因編碼的抗菌肽<222>(1)…(90)<400>2Met Val Asn Ile Lys Glu Val Leu Ile Val Ser Val Leu Val Ala5 10 15Ala Val Ala Val Ser Pro Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg His Ala
20 25 30Arg Pro Arg Pro Gln Pro Arg Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Asp35 40 45Thr Ser Asp Ile Val Ser Ile Cys Val Val Thr Glu Arg Asn Cys50 55 60Phe Ser Asp Gly Glu Cys Gly Ala Gly Gln Lys Cys Cys Pro Ile65 70 75Gly Cys Gly Arg Glu Cys Leu Ala Val Gly Ser Pro Tyr Gly Lys80 85 90
權利要求
1.一種中國對蝦的含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度390堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源對蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atggtgaaca tcaaggaagt tctgatcgtg tccgtgttgg tggccgcggt ggctgtttct 60cccgccgatg ctgttccaac gagacacgct aggccccgtc ctcagcccag gccgaggcca 120gggacgtgtc cggacacgag cgacatcgtc tccatctgcg tcgtgacgga acgcaactgc 180ttctcggacg gcgagtgcgg agccggccag aagtgctgtc cgattggctg cgggagagag 240tgcctggctg tgggatctcc ctacggaaaa tgaagatcgt aggaggggga cgaaatttcc 300tcgatgggct cacagtctcc ctggaaatat tattgaagcg tgttgattca ttgataataa 360aattgtgttg tttcaaaaaa aaaaaaaaaa 390
2.權利要求1所述中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因編碼的抗菌肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度90氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Val Asn Ile Lys Glu Val Leu Ile Val Ser Val Leu Val Ala5 10 15Ala Val Ala Val Ser Pro Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg His Ala20 25 30Arg Pro Arg Pro Gln Pro Arg Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Asp35 40 45Thr Ser Asp Ile Val Ser Ile Cys Val Val Thr Glu Arg Asn Cys50 55 60Phe Ser Asp Gly Glu Cys Gly Ala Gly Gln Lys Cys Cys Pro Ile65 70 75Gly Cys Gly Arg Glu Cys Leu Ala Val Gly Ser Pro Tyr Gly Lys80 85 90
3.權利要求2所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的變異體，它編碼具有少于8個氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變。
4.權利要求1所述中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。
5.如權利要求4所述中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用，其方法是通過基因重組技術使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進行表達，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因及其編碼的抗菌肽，還公開了所述中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。利用本發明獲得的重組的中國對蝦含單一乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動植物基因轉化和藥物開發。
文檔編號C07K14/435GK1810971SQ20051004458
公開日2006年8月2日 申請日期2005年9月13日 優先權日2005年9月13日
發明者王金星, 趙小凡 申請人:山東大學