專利名稱：治療絕經后骨質疏松癥的植物雌激素類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療絕經后骨質疏松癥的植物雌激素類似物及其制備方法，也涉及含有所述化合物的藥物組合物以及所述化合物在制備治療絕經后骨質疏松癥的藥物中的應用。具體來說，所述化合物是2，3-二氫-6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-縮氨硫脲(XY9906)和3-(4’-二甲氨基苯亞甲基)-6-甲氧基-4H-1-苯并二氫吡喃-4-酮(XY2004)。
背景技術：
骨質疏松癥是以骨量減少，骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特征的一種系統性、全身性代謝性骨病，多見于絕經期婦女，其發生率為男性骨質疏松癥的6-8倍，主要與內源性雌激素水平的降低有關。骨質疏松所造成的危害不僅是腰背疼痛、四肢無力，如果繼續發展，還會出現身高降低、體態變形，最嚴重的后果是骨折，其中尤以髖部骨折最甚，是致殘和死亡的最重要原因，其中10～20％的病人在一年內死亡，50％的病人生活不能自理。據1993年世界銀行全球發展報告中估計，從1990年到2030年，全世界50歲以上的婦女將從4.67億上升到12億，今后患絕經后骨質疏松的人數將不容忽視，骨質疏松癥已成為全球矚目的公共衛生問題。
女性一生的1/3時間是在絕經后度過，絕經后骨質疏松癥嚴重影響了絕經后婦女的生活質量。傳統臨床實踐的重要手段是雌激素替代療法(ERT)。然而，由于人類平均壽命的顯著延長，在婦女絕經后的足夠長時間的ERT可能增加發生乳腺癌和子宮內膜癌的危險性，這種威脅與擔憂與人們要求高質量的老年生活之間的矛盾日益普遍和突出。在經過大量的臨床評價后，最近美國等發達國家已停止或提出停止實施ERT。因此，人們迫切要求現代醫學能拿出安全、有效的對策來解決這樣的矛盾。理想的藥物是既可保持雌激素對骨和心血管系統的保護作用，又無雌激素對子宮和乳腺的副作用。
1998年針對ERT的副作用，由美國Lilly公司開發上市的選擇性雌激素受體調節劑雷洛昔芬(raloxifene)，雖能夠有效地防治絕經后骨質疏松癥，對子宮和乳腺亦無副作用，但其對心血管系統的保護作用尚待長期的臨床評價，且存在惡心、潮熱、頭痛、藥疹、腹痛、視力模糊、瘙癢以及乳房腫痛等副作用，特別值得注意的是，一些藥物不良反應報告反映該藥可增加血栓形成的危險，導致深靜脈血栓形成和腦血管疾病發生(Australian Adverse Drug ReactionsBulletin，2001，12，Vol 204)，并不令人十分滿意。
流行病學調查結果顯示并非所有的絕經后女性都罹患骨質疏松，以富含異黃酮類植物雌激素的素食為主的東方婦女絕經后骨質疏松和骨折發生率明顯低于以動物脂肪和肉類為主食的西方婦女，如染料木黃酮(genistein)，因此，尋找無副作用的植物雌激素療法取代雌激素治療骨質疏松癥，是當前國際醫藥界共同關注的熱點研究課題。然而，genistein對絕經后骨質疏松的治療效果遠遠弱于雌激素和raloxifene，不能滿足人們的需要。如何改善和提高植物雌激素對絕經后骨質疏松癥的防治作用呢？目前科學家們發現雌激素受體(ER)存在α和β兩種亞型，不同組織中這兩種受體的分布比例不同，通常生殖器官(如子宮、乳腺組織)富含ERα；而非生殖器官(如骨、心血管系統)以ERβ為主。雌二醇(E2)是ER的完全激動劑，它激動ERα所導致的生物效應是激動ERβ的35-60倍，所以E2在對骨和心血管系統具有保護作用的同時，對子宮、乳腺產生嚴重的副作用。而異黃酮類植物雌激素genistcin具有較弱的ER激動劑/拮抗劑作用，但它對ERβ的親和力是對ERα的30倍，且激動ERβ產生的效能是ERα的4-5倍，說明genistein對ERβ具有高度的選擇性。根據以上分析，我們提出設計選擇性更好、作用更強、副作用更小的婦女絕經后骨質疏松癥治療新藥，應該以ERα和ERβ為靶點，以genistein為先導化合物，著眼于提高配基對ERβ的親和力，使配基能夠選擇性激動ERβ而拮抗ERα。
1997年Brzozowski對E2、raloxifene在ERα晶體結構上結合位點(圖1)的闡明，為藥物化學家設計新的植物雌激素類似物提供了理論依據。對比分析E2、raloxifene、genistein的化學結構(結構如下)1)三者含有相似的A、B環(圖2虛框內顯示)。研究發現raloxifene的A/B環(苯并噻吩)與E2的A/B環在ERα上的結合位點相似，兩者A環上的酚羥基均結合在ERα的353位谷氨酸和394位精氨酸上。由于ERα和ERβ的配基結合區有53.5％的同源性，因此我們分析A、B環可能是不同配基與ERα/ERβ結合的基本結構單元。2)genistein和raloxifene的結構不同點在于raloxifene環上帶有堿性側鏈。研究發現該側鏈與ERα351位上的天門冬氨酸結合，改變了ERα羧基端構型，阻斷了配基受體復合物與協活化因子結合，使AF-2功能區不能激活雌激素反應元件(ERE)驅動基因轉錄作用，使raloxifene表現出ERα拮抗劑的作用；同時該側鏈亦是raloxifene具有較強的抗骨質疏松活性的關鍵因素。試想，能否通過引入堿性側鏈結構優化異黃酮植物雌激素，以期改善和提高植物雌激素對絕經后骨質疏松癥的防治作用呢？
發明內容
為此，根據以上分析，本發明首次提出以genistein為先導化合物，以苯并吡喃環(A/B)為基本結構單元，根據電子等排原理設計合成了2個治療絕經后骨質疏松癥的新植物雌激素類似物的化合物(化學結構見圖3)本發明化合物XY2004的分子式C19H19NO3＝309本發明化合物XY2004的理化性質MP 182-184℃；不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、稀酸。
本發明化合物XY9906的分子式C11H13N3O2S＝251本發明化合物XY9906的理化性質MP 215-217℃；不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
本發明的化合物可以是無定型粉末或者是晶體形式。
本發明所述鹽是化合物XY2004的無機酸鹽或有機酸鹽，例如包括但不限于鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、檸檬酸鹽等，優選為鹽酸鹽、硫酸鹽或檸檬酸鹽。
本發明的另一目的是提供所述化合物或其鹽的合成方法。本發明中化合物XY2004和XY9906分別用Scheme1、2所述的兩種方法制備(見圖4)。
本發明化合物XY2004的鹽通常是由化合物中的堿性氮與酸發生成鹽反應得到的。所述酸通常可以是具有酸性的任何物質。例如包括但不限于無機酸如鹽酸、硝酸、硫酸、氫溴酸、磷酸等，有機酸如甲酸、乙酸、苯甲酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸等。
本發明的再一個目的是一種治療絕經后骨質疏松癥的藥物組合物，其中含有治療有效量的本發明式化合物XY2004或其鹽、XY9906和可藥用載體。所述的可藥用載體是對本發明化合物或其鹽不產生不利影響的在藥物領域可以使用的任何賦型劑、稀釋劑或添加劑。可以根據所期望的給藥途徑而制備的具體劑型來選擇使用的載體。本發明的化合物XY2004或其鹽、XY9906可以通過口服或非胃腸道給藥。非胃腸道給藥可包括注射、吸入、透皮或直腸給藥。所述藥物組合物的劑型包括但不限于片劑、膠囊、懸浮劑、溶液劑、脂質體、微球或者栓劑等。所述載體可例舉的是黏合劑、崩解劑、潤滑劑、等滲劑、表面活性劑、防腐劑、甜味劑、香味劑、著色劑等，例如淀粉、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、環糊精、硬脂酸鎂、磷脂、膽固醇、玉米油等。本發明化合物或其鹽在組合物中的含量可以在很大的范圍內變化，只要能夠達到治療的目的并便于藥物制劑的制備和患者的使用。例如，按組合物的重量計算，含有0.1-99.9％的本發明化合物或其鹽。優選1-99％。另外，本發明的組合物還可以含有其他可以與本發明化合物或其鹽聯合給藥的其他活性成分，例如有利于絕經后骨質疏松癥治療的活性成分。
本發明的藥物組合物可通過常規方法來制備，例如將組合物的各組分進行混合，或者按照本領域常規方法按一定順序混合制備。如在制備片劑時，可以將活性組分與黏合劑混合制粒，加入崩解劑和潤滑劑并壓制成片。這對于本領域技術人員來說是公知的。
本發明的另外一個目的是提供化合物XY2004或其鹽、XY9906在制備治療絕經后骨質疏松癥的藥物中的應用。正如本說明書中所證實的那樣，本發明的化合物XY2004或其鹽、XY9906具有良好的治療絕經后骨質疏松癥的作用。給藥途徑是多種多樣的，如口服、注射、吸入等。給藥劑量可以在很大的范圍內變化，這取決于給藥的途徑、患者的身體狀況、年齡、性別等。一般來說，本發明化合物或其鹽的給藥劑量為0.1-200mg/天，kg體重，優選1-100mg/天，kg體重，更優選10-50mg/天，kg體重。
經細胞體外MTT試驗篩選，化合物XY2004能夠顯著促進人成骨細胞HOS TE85的增殖，有助于骨形成，其強度高于genistein；XY2004能夠顯著促進人血管內皮細胞ECV-304的增殖，且顯著減輕H2O2對血管內皮細胞的損傷程度，表現出一定的血管保護作用；此外，XY2004對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖無明顯影響，動物體內藥效學結果顯示XY9906具有明顯對抗去卵巢雌性大鼠骨質丟失的作用，提示本課題設計的植物雌激素類似物XY2004、XY9906既保留了雌激素對骨和心血管系統的保護作用，又沒有雌激素對子宮和乳腺組織的副作用，故有益于婦女絕經后骨質疏松癥的治療，優于雌激素替代療法。
圖1 E2(A)、raloxifene(B)在ERα晶體結構結合位點圖2 genistein、raloxifene和E2的化學結構圖3 XY2004和XY9906的化學結構圖4 XY2004和XY9906的制備方法圖5 XY2004對人成骨細胞HOS TE85的增殖的影響圖6 XY2004與雌二醇聯合用藥對人成骨細胞HOS TE85增殖的影響圖7 XY2004對人血管內皮細胞ECV-304的增殖的影響圖8 XY2004對人血管內皮細胞ECV-304的增殖的影響圖9 XY2004對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖的影響圖10 XY2004與雌二醇聯合用藥對人乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響具體實施方式
簡寫注釋PPA多聚磷酸實施例一β-對甲氧基苯氧基-丙腈(I1)的合成將80g(0.64mol)對羥基苯甲醚，339mL新蒸內烯腈及催化量鈉加入反應瓶中，升溫回流反應48h以上，TLC監控反應進程(氯仿展開，紫外燈下觀察)。反應濃縮液中加入碳酸鉀飽和水溶液，析出固體，過濾，水洗至濾液呈中性，干燥，無水乙醇重結晶得β-對甲氧基苯氧基-丙腈72.5g(白色結晶)，mp 63～64℃。收率64％(文獻收率50％，mp 63～64.5℃)。
β-對甲氧基苯氧基-丙酸(I2)的合成將10)g(0.56mol)β-對甲氧基苯氧基-丙腈(I1)和236mL濃鹽酸加入反應瓶中，升溫回流4h，冷卻后析出固體，反應液過濾，水洗固體。產品干燥后用石油醚重結晶，可得β-對甲氧基苯氧基-丙酸100g(白色針狀結晶)，mp104～106℃C。收率91％(文獻收率91％，mp103～105℃)。
6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(I3)的合成將60g(0.42mol)五氧化二磷投入250mL反應瓶中，外用冰浴冷卻，啟動機械攪拌，緩慢滴加40mL(0.58mol)磷酸，升溫至100℃，控制內溫在100～105℃，攪拌1h，得到無色透明粘稠液即PPA。向其加入10g(0.05mol)β-對甲氧基苯氧基-丙酸(I2)，控制內溫80～81℃反應1h，反應液由白色至淺黃色直至血紅色，反應完畢加入適量冰冰解。置于冰箱冷卻，有淺黃色固體析出，過濾，水洗至中性，固體用水蒸氣蒸餾純化。餾液置于冰箱冷凍，冰化后析出白色針狀結晶，過濾，低溫干燥得6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮7.1g(白色針狀結晶)，mp66～68℃，收率78％。(文獻[91]收率65％，mp 66～68℃)。
2，3-二氫-6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-縮氨硫脲(XY9906)的合成將100mg(0.56mmol)化合物6-甲氧基-4H-1-苯并二氫吡喃-4-酮溶于適量無水乙醇液中，攪拌加熱；103.3mg(1.12mmol)氨硫脲加熱溶于85％乙醇液中，趁熱加入反應液中，滴加冰乙酸數滴，回流4h，濃縮得固體，適量水洗，過濾，無水乙醇重結晶，得2，3-二氫-6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-縮氨硫脲121mg(白色針狀晶體)，mp215～217℃，收率86％。1HNMR(CDCl3，δppm)8.79(s，1H，NH)，7.35～6.84 (m，3H，phH)4.25(t，2H，OCH2)，3.78(s，3H，OCH3)2.75(t，2H，CH2)，1.69(s，2H，NH2).MS(EI)251(M+).該化合物未見文獻報道。
實施例二3-(4’-二甲氨基苯亞甲基)-6-甲氧基-4H-1-苯并二氫吡喃-4-酮(XY2004)的合成將2.5M氫氧化鈉溶液1mL、95％乙醇1.5mL及300mg(1.7mmol)6-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(I3)依次加入5mL反應瓶中，攪拌，固體溶解，反應液呈黃色，再加入231mg對二甲氨基苯甲醛，室溫攪拌36h，生成黃色固體，過濾，用冰凍95％乙醇洗3次，95％乙醇重結晶，得3-(4’-二甲氨基苯亞甲基)-6-甲氧基-4H-1-苯并二氫吡喃-4-酮100mg(黃色針狀結晶)，mp182～184℃，收率16％。該化合物未見文獻報道。1HNMR(CDCl3，δppm)7.81～6.70(m，7H，phH)，5.37(s，1H，-CH＝)，3.82(s，3H，OCH3)，3.03(s，6H，N(CH3)2)，1.55(s，2H，CH2)；MS(EI)309(M+).該化合物未見文獻報道。
實施例三XY2004對人成骨細胞HOS TE85的增殖的影響由圖5可見XY2004能夠顯著促進人成骨細胞HOS TE85的增殖，表現出一定的成骨作用(1.0nmol/L，P＜0.05；0.1μmol/L，P＜0.01)。作用強度與陽性對照藥物raloxifene相當，而是genistein的100倍。
實施例四XY2004與雌二醇聯合用藥對人成骨細胞HOS TE85增殖的影響由圖6可見與雌二醇相比，XY2004(1.0nmol.L-1、0.1μmol.L-1)可明顯拮抗雌二醇對HOS TE85的增殖作用(P＜0.05)。
實施例五XY2004對人血管內皮細胞ECV-304的增殖由圖7可見，XY2004可顯著促進正常ECV一304的增殖(10nmol/L，P＜0.01；0.1μmol/L，P＜0.05＝。
由圖8可見與溶劑組相比，XY2004可顯著減輕H2O2對血管內皮細胞的損傷程度，表現出一定的血管保護作用。(1μmol/L，P＜0.05)。
實施例六XY2004對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖的影響由圖9可見XY2004可顯著抑制MCF-7細胞增殖(10μmol/L，P＜0.001)，其余劑量組對MCF-7的增殖沒有影響。
實施例七XY2004與雌二醇聯合用藥對人乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響由圖10可見與雌二醇相比，XY2004可明顯拮抗雌二醇對MCF-7細胞的增殖作用(0.1μmol/L，P＜0.05；10μmol/L，P＜0.01)。
實施例八XY9906對去卵巢大鼠骨質疏松癥的影響由表1可見，成功建立了SD雌性大鼠雙側卵巢摘除3個月的骨質疏松動物模型。整體動物試驗顯示，XY9906可提高去卵巢SD雌性大鼠的骨密度、骨破壞應力及彈性模量，一定程度地對抗去卵巢大鼠骨質丟失，說明XY9906治療絕經后骨質疏松癥的方案是可行的，且作用強度與Raloxifene相當。
Tab.1 Effect of XY9906 on BMD、blood biochemical and bone biomechanical parameters of ovariectory rats(n＝10，x±s) -
*P＜0.05，**P＜0.01 vs Model#P＜0.05，##P＜0.01 vs NormalAthree-point bending test；Bcontraction test。
實施例九片劑(萬片量)
制備方法將XY9906粉碎并過100目篩，稱重后，與己過100目篩的淀粉混合均勻，加入10％淀粉漿制成軟材，以16目尼龍篩制粒，濕粒于60℃干燥，干顆粒與硬脂酸鎂混合均勻，再經16日篩整粒，經含量測定后，計算出片重，選擇6mm淺凹或平沖模壓片即得。
實施例十膠囊(萬粒量)
制備方法將XY2004粉碎并過100目篩，稱重后，與已過100目篩的淀粉混合均勻，加入10％淀粉漿制成軟材，以16目尼龍篩制粒，濕粒于60℃干燥，干顆粒再經16目篩整粒，分裝于3號硬膠囊殼，蓋上節，壓平，打光即可。
實施例十一注射劑
制備方法分別稱取XY2004的鹽酸鹽、氯化鈉，溶于適量注射用水中，添加注射用水至全量，攪勻，過濾，濾液灌裝于安瓿中，熔封，于100℃流通蒸汽滅菌30min即得。
權利要求
1.式I所示的化合物或其鹽
2.權利要求1的化合物或其鹽，是無定型粉末。
3.權利要求1的化合物或其鹽，是晶體形式。
4.權利要求1的化合物或其鹽，所述鹽是式I化合物XY2004的無機酸鹽或有機酸鹽。
5.權利要求4的化合物或其鹽，所述鹽是式I化合物XY2004的鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽或檸檬酸鹽。
6.權利要求1的化合物或其鹽的合成方法，需要時與可藥用酸成鹽。
7.權利要求6的方法，所述方法是通過進行的。
8.一種治療絕經后骨質疏松癥的藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1-5所述的任一化合物或其鹽和可藥用載體。
9.權利要求8的藥物組合物，為片劑、膠囊、懸浮劑、溶液劑、脂質體、微球或者栓劑。
10.權利要求8或9的藥物組合物，其中所述化合物或其鹽的含量按組合物的重量計算為0.1-99.9％。
11.權利要求1-5所述的任一化合物或其鹽在制備治療絕經后骨質疏松癥的藥物中的應用。
12.權利要求11的應用，所述藥物是口服、注射、吸入藥物。
全文摘要
本發明涉及絕經后骨質疏松癥的植物雌激素類似物及其制備方法，也涉及含有所述化合物的藥物組合物以及所述化合物在制備治療絕經后骨質疏松癥的藥物中的應用。具體來說，所述化合物是2，3－二氫－6－甲氧基－4H－1－苯并吡喃－4－縮氨硫脲(XY9906)和3－(4’－二甲氨基苯亞甲基)－6－甲氧基－4H－1－苯并二氫吡喃－4－酮(XY2004)，通過選擇性保留了對骨和血管組織的較強的保護作用，而沒有雌激素對乳腺的副作用，故有益于婦女絕經后骨質疏松癥的治療，優于雌激素替代療法。
文檔編號C07D311/00GK1699357SQ20051004181
公開日2005年11月23日 申請日期2005年3月17日 優先權日2005年3月17日
發明者熊曉云 申請人:西安仁仁藥業有限公司