專利名稱：Sars中和性抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種非典型肺炎病毒(SARS-CoV)中和性抗體，尤其是SARS中和性單克隆抗體及其制備方法。
背景技術：
2002年秋季在中國廣東省爆發的傳染性非典型肺炎(SARS)疫情是一次嚴重的公共衛生危機。在短短的幾個月時間里，SARS迅速蔓延至超過25個國家和地區，給人們的身體健康和正常生活帶來了嚴重的影響，給中國的經濟建設及發展造成了巨大損失。2004年春季，由于實驗室科研人員的操作失誤致使非典型肺炎再次在京皖兩地造成人員感染，引起人們的極大關注。到目前為止，SARS在全世界總共造成8000人左右感染，死亡800多人，死亡率達10％左右。
目前已知，非典型肺炎是由一種新發現的冠狀病毒(SARS-CoV)所引起。冠狀病毒是因其在電子顯微鏡下形如王冠得名。這一獨特的外觀是由其膜表面的棒狀膜蛋白所形成。SARS病毒即是一類新型的冠狀病毒，主要由以下部分組成脂雙層膜及其上的棒狀膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜內部衣殼蛋白N和由N包裹的基因組RNA。其中S蛋白的主要作用是和宿主細胞膜表面受體相結合，從而介導病毒粒子侵入細胞，目前已經鑒定得到了SARS病毒宿主細胞上的功能性受體為血管緊縮素轉換酶2(ACE2)。
從感染免疫角度講，利用對病毒的中和性抗體對急性期感染的病人施加治療是目前已知的最有效的治療SARS的方法。其機理為利用中和性抗體阻斷病毒對正常宿主細胞的侵入，或阻斷其關鍵蛋白的生物學功能，從而達到治療感染的目的。在SARS流行時，曾經有通過注射含有大量中和性抗體的康復期病人血清的治療方法，使病人病情迅速緩解并治愈證明了中和性抗體抗SARS感染的巨大作用。但是，病人血清來源有限，而且存在安全性等問題。所以針對SARS的中和性抗體藥物便成為世界各國關注的熱點。
目前已知直接和宿主細胞受體接觸的區段位于S蛋白S1亞區上約318-510氨基酸之間，被命名為受體結合區(Receptor Binding Domain)含有重要的病毒中和表位。制備針對這一區段的單克隆抗體，有可能阻斷病毒粒子和細胞接觸，達到抗感染的目的。
雖然可以直接采用RBD肽段免疫，但是產生的抗體可能由于蛋白全長及部分肽段在結構上存在的差別而使得抗體在識別完整天然的SARS病毒S蛋白上產生缺陷，或者可能得到一些雖然可以識別受體結合區RBD但是卻和SARS S蛋白全長完整蛋白無結合作用的單克隆抗體，因此不僅獲得有效抗體的效率低，而且難以獲得活性很高的中和性抗體。
綜上所述，本領域尚沒有獲得活性很高的、特異性結合于SARS病毒S蛋白的抗體。因此本領域迫切需要開發具有良好中和病毒效果的高親和力的SARS中和性抗體，尤其是單克隆抗體。
發明內容
本發明的目的是提供一種針對非典型肺炎(SARS)的高親和力的中和性抗體，及其制備方法。
在本發明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白，它具有以下特性(a)特異性地結合于SARS病毒的受體結合區，所述的受體結合區是SARS病毒S蛋白的318-510位；(b)特異性地中和SARS病毒；(c)所述抗體與受體結合區結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000(較佳地為1∶100000-1∶800000，更佳地為1∶200000-1∶600000)。
(d)所述抗體與SARS病毒中和的裸鼠腹水效價為1∶4000-1∶10000(較佳地1∶5000-1∶8000)。
在另一優選例中，所述的免疫球蛋白所針對的受體結合區具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
在另一優選例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。
在另一優選例中，所述的免疫球蛋白由選自下組的細胞所產生小鼠雜交瘤細胞系N-176-15，CCTCC No.C200507；或小鼠雜交瘤細胞系S-9-11 CCTCC No.C200515。
在本發明的第二方面，提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物含有本發明上述的免疫球蛋白和特異性地結合于所述免疫球蛋白的選自下組的偶聯部分藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶。
在本發明的第三方面，提供了一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它選自下組小鼠雜交瘤細胞系N-176-15，CCTCC No.C200507；或小鼠雜交瘤細胞系S-9-11 CCTCC No.C200515。
在本發明的第四方面，提供了一種組合物，它含有本發明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯物以及可接受的載體。通常，免疫球蛋白或上述的免疫偶聯物的含量為組合物總重量的0.001-99.99wt％，較佳地為0.01-90wt％，更佳地為0.1-80wt％。
在另一優選例中，所述的組合物是藥物組合物。
在本發明的第五方面，提供了本發明所述的免疫球蛋白的用途，它們被用于制備中和SARS病毒的組合物。
在本發明的第五方面，提供了制備本發明單克隆抗體的方法，它包括步驟(1)用非典型肺炎病毒(SARS-CoV)的重組假病毒疫苗免疫小鼠；(2)將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合后，(3)篩選分泌與S蛋白318-510氨基酸區段的非典型肺炎(SARS)病毒受體結合區結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，建株并得到單克隆抗體(4)運用細胞融合及病毒中和系統，從這些單抗中篩選得到具有高親和力的病毒中和作用的單抗。
在另一優選例中，所述的制備單克隆抗體的方法包括步驟(a)用非典型肺炎病毒的重組假病毒疫苗免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合后，獲得雜交瘤細胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細胞中，選出分泌與S蛋白318-510氨基酸區段的非典型肺炎病毒受體結合區結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，獲得與受體結合區結合雜交瘤細胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細胞中，選出產生的單克隆抗體與SARS病毒結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細胞；(e)從步驟(d)的雜交瘤細胞中制得單克隆抗體。
在另一優選例中，所述的雜交瘤細胞系是小鼠雜交瘤細胞系N-176-15，其亞型為IgG1、k型。
在另一優選例中，所述的雜交瘤細胞系是是小鼠雜交瘤細胞系S-9-11，其亞型為IgG2a、k型。
圖1是細胞融合阻斷實驗的示意圖。
圖2是報告基因系統的示意圖。
圖3顯示了S-9-11細胞株產生的抗體可以阻斷SARS病毒與細胞的融合。
圖4顯示了N-176-15細胞株產生的抗體可以阻斷SARS病毒與細胞的融合。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，發現SARS病毒S蛋白的重組假病毒疫苗可以誘導得到高滴度的中和性抗體，因此特別適合作為免疫原來制備SARS中和性單克隆抗體，同時發現S蛋白的受體結合區(RBD)段具有重要的中和性位點。在上述研究基礎上，本發明人利用雜交瘤技術制備了親和力極高的抗人SARS的單克隆抗體，從而完成了本發明。
如本文所用，術語“SARS受體結合區(RBD)”或“RBD”可互換使用，都指含有SARS病毒S蛋白第318-510位氨基酸序列的多肽。一種優選的SARS受體結合區(RBD)由SARS病毒S蛋白第318-510位氨基酸序列構成。更佳地，所述的RBD具有SEQ ID NO1或gi30173397所示的氨基酸。
本發明的SARS中和性單抗或其片段可用于免疫檢測SARS病毒，還可用于中和SARS病毒或用于治療SARS感染，例如通過直接或間接地將SARS中和性單抗或其片段與化學治療劑、或放療劑相連從而使其能阻斷SARS病毒與細胞的融合。
本發明包括具有SARS中和性單抗的相應氨基酸序列的單克隆抗體、具有SARS中和性單抗可變區鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。
如本領域技術人員所知，免疫偶聯物及融合表達產物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與SARS中和性單抗或其片段結合的而形成的偶聯物。本發明還包括與SARS中和性單抗或其片段結合的細胞表面標記物或抗原。
如本文所用，“免疫毒素”指對靶細胞有特異性親和力和殺傷力的物質，例如免疫偶聯物及融合表達產物包括藥物、毒素、細胞因子、放射性核素或其他治療分子與SARS中和性單抗或其片段結合的而形成的偶聯物。具體的例子有例如131I-SARS中和性抗體偶聯物等。
對于本發明SARS中和性單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。SARS中和性單抗V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與SARS中和性單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明還提供了編碼RBD的DNA。本發明的SARS中和性單抗的抗原的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據RBD的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，按本領域技術人員已知的常規方法制備模板，通過擴增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規技術，利用小鼠雜交瘤細胞系SARS中和性(CCTCC No.C200507或200515)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
此外，本發明還提供了一種檢測SARS病毒的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯物，或其活性片段。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯物，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。
本發明的藥物組合物可直接用于中和SARS病毒(尤其是用于阻斷SARS病毒與細胞的融合)，還可用于SARS病毒的治療。此外，還可同時使用其他治療劑，如抗體與干擾素、白細胞介素等。
本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的SARS中和性免疫偶聯物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
在本發明的一個實例中，用人工制備的非典型肺炎(SARS)S蛋白重組假病毒疫苗免疫小鼠，然后將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合后，篩選得到了與S蛋白318-510氨基酸區段的非典型肺炎(SARS)病毒受體結合區結合的雜交瘤細胞。從所述的和RBD結合的若干株雜交瘤細胞中鑒定得到具有中和作用的單抗。
兩株優選的雜交瘤細胞系是分別命名為S-9-11和N-176-15；其中S-9-11為脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合而成，N-176-15為脾細胞和NS-1骨髓瘤細胞株融合而成。經亞型鑒定，S-9-11為IgG2a、k型，N-176-15為IgG1、k型。細胞融合及病毒中和檢測證明，上述兩株小鼠雜交瘤細胞株具有很好的病毒中和作用。
本發明的主要優點在于(a)重組假病毒疫苗可以誘導高滴度的針對RBD的中和性抗體，非常適合作為制備SARS中和性抗體的免疫原。
(b)本發明的中和性抗體對SARS病毒有極其優異的中和活性，裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000或更高。
(c)與采用的SARS病毒受體結合區肽段RBD免疫并用其篩選單抗的方法相比，本發明的方法具有的效率高，即篩選到的單抗只要和RBD結合就必然可以識別完整天然狀態下的SARS S蛋白，而且中和活力高。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1動物免疫抗原為SARS假病毒疫苗，為減毒的安卡拉病毒通過重組SARS S全長蛋白基因于其基因組中得到。該病毒膜表面表達了SARS病毒S蛋白，濃度2×109pfu/ml，Balb/c小鼠免疫劑量5×107pfu每只每次。肌肉多點注射。使用時用PBS或生理鹽水稀釋。免疫程序0，3，6周三次免疫。融合前三天取5×107pfu疫苗原液PBS稀釋至0.5ml腹腔注射，做回憶刺激。
SARS重組假病毒疫苗簡介載體病毒為改造后的活減毒安卡拉疫苗病毒(MVA)，制備方法如下用常規方法，將SARS病毒S蛋白全長基因插入該病毒的基因組的III號刪除區(Deletion III Region)而成為改造后的SARS疫苗，改造后的SARS重組假病毒疫苗被命名為ADS-MVA。該疫苗抗原能在小鼠、兔、猴等動物體內誘導高滴度的中和性抗體。并且經研究表明中和抗體針對的表位有很大一部分位于RBD區域。
實施例2雜交瘤細胞株的構建及單克隆抗體的制備回憶刺激后三天做融合。取免疫后小鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞NS-1和SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常規的融合法做融合。融合后加HAT選擇性培養基，將非雜交瘤細胞全部殺死。具體步驟后述。
然后，進行雜交瘤的篩選工作。篩選采用ELISA法(具體步驟后述)，所用篩選用抗原為真核表達的位于S蛋白318-510氨基酸區段的SARS病毒受體結合區(Receptor Binding Domain)(接人IgG恒定區Fc段作為蛋白標簽)。將長出的雜交瘤細胞樣品孔中的細胞上清取出，作為樣品做ELISA實驗，看是否含有和RBD結合的抗體。如果有，則進一步做雜交瘤細胞的克隆化。
克隆化過程采用有限稀釋法，具體實驗步驟后述。
經過三次連續的ELISA檢測及克隆化后，得到若干株和RBD抗原結合的單克隆抗體。進一步做分析試驗。從親和力和功能實驗方面考察，最后篩選得到兩株抗體被發現為親和力極高、中和實驗效果非常好，分別命名為S-9-11和N-176-15。其中S-9-11為脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合而成，N-176-15為脾細胞和NS-1骨髓瘤細胞株融合而成。經亞型鑒定，S-9-11為IgG2a、k型，N-176-15為IgG1、k型。兩株抗體分別按常規方法制備了腹水。腹水效價經檢測，約1∶256000-1∶512000。
實驗方法(a)細胞融合1.無菌操作，做好實驗前準備；2.小鼠眼球取血。泡入酒精缸中。固定于解剖板上。用一套剪刀鑷子剪開小鼠外皮向上撕開露出胸、腹腔，用另一套剪刀鑷子剪開腹膜，并取出脾臟。置于預先盛有培液的6孔板內；3.用RDF培液帶尼龍網燒杯上的尼龍網，將脾臟置于其上用鑷子剪刀剪碎、擠壓，使細胞過濾入尼龍網下的燒杯中；4.將燒杯中脾細胞置于50ml離心管內，離心1500rpm，3min；5.再用無血清培液洗一下，計數，分5×107細胞若干份，備用；6.收集NS-1及SP2/0細胞，離心1500rpm，3min；7.RDF培養液洗一下，計數，取骨髓瘤細胞，每種107；8.將脾細胞一份和取好的一種骨髓瘤細胞混合，離心，2000rpm，5min，倒光培液，用無菌濾紙吸干離心管內殘余液體，彈松細胞塊；9.加PEG0.8-1ml，需1min之內加完，邊加邊搖晃；10.靜止1.5min；11.加10ml準備好的RDF培液，2.5min內加完，邊加邊搖晃；12.靜止5min；13.離心，1000rpm，3min；14.用滴管將上清液吸出；
15.加25ml，12％BS的培養液，輕輕吸打混勻；16.用排槍加入做好飼養層的96孔板內，50ul/孔。
(b)ELISA1.抗原包被取抗原用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)配制成0.05mol/L濃度的包被液，混勻，加入塑料96孔檢測板，50ul/孔，置于4℃冰箱內過夜；2.Block洗板，加Block液(稀釋液即PBS配制的10％新生牛血清+0.1％Tween20或3％明膠)，100ul/孔，37℃溫箱溫育2小時；3.加一抗洗板，將處理好的一抗(即雜交瘤細胞上清)溶液加到孔內，50ul/孔，37℃溫箱溫育2小時；4.加二抗洗板，稀釋好的二抗(羊抗小鼠IgG(H+L)HRP酶標記的抗體，Calbiochem-Novabiochem)加入孔內，50ul/孔，37℃溫育1小時；5.顯色洗板，配好TMB底物，加入孔中，50ul/孔，顯色5-10min，加2M硫酸，50ul/孔，終止反應；6.檢測用酶標儀(Thermo)檢測孔溶液的OD(450nm)值，得到數據。
(c)有限稀釋法實驗步驟1.用吸管小心吸取吹打陽性孔至細胞完全混入培養液；2.加1滴至一玻璃離心管內，補加9滴HT培養液，混勻，其余加到96孔板(做好飼養層)前排幾孔內；3.第一次稀釋將混勻的培養液吸出，加一滴至第二個帶刻度的10ml玻璃離心管內，補加9滴培液，混勻；4.第二次稀釋其余加前排幾孔，吸出培液，再加2滴于這個離心管內，補加HT培液至10ml，混勻后加入96孔板內，50ul/孔，96孔板置于培養箱內。
實施例3細胞融合阻斷實驗本實施例用細胞融合阻斷實驗用來模擬病毒和細胞的膜融合過程，從而檢測抗體的中和性作用。這一系統通過對細胞分別轉染并表達SARS病毒的膜蛋白Spike及其相應宿主細胞膜受體ACE2來實現受體配體介導的細胞融合過程，并通過共轉染在細胞融合后才發生表達的報告基因系統定量表示其融合效果，即表示發生融合的細胞的多少。在這一系統中加入抗體或多肽，如果其對細胞融合有阻斷作用，則這一阻斷作用的大小可由報告基因表達量的下降程度來表示(如圖1)。pSpike、pACE2分別為含S蛋白及ACE2蛋白基因全長的表達質粒，p13-luc及p15-1為組成報告基因系統的兩種質粒，rellina為一種表達海膽熒光素酶的內參質粒。
細胞融合阻斷實驗的示意圖如圖1所示。被轉染細胞為HEK293T細胞系。分為等量兩組，一組共轉染S蛋白(Spike)、p13-luc、和rellina內參質粒；另一組共轉染ACE2和p15-1質粒(質粒均由上海生化細胞研究所朱學良老師惠增)。其中Spike和ACE2介導細胞膜融合，p15-1和p13-luc為報告基因系統，表達報告基因luciferase熒光素酶。Rellina質粒為內參。
報告基因系統采用的為BD Bioscience公司的四環素調節報告基因系統(Tet-Off系統)。表達機理為p15-1為調節質粒，在pCMV啟動子作用下本底表達一種起調節作用的蛋白tTA，該蛋白由兩種蛋白亞基TetR和VP16融合表達而成。它結合到目標質粒p13-luc的四環素(Tet)操縱子上誘導下游啟動子啟動表達luciferase蛋白(如圖2)。檢測采用Promega公司的雙通道Luciferase檢測系統。
實驗流程為(1)按實驗設計轉染兩組293T細胞，37℃培養；(2)24小時后收細胞，分別計數，調節密度。Spike組加入腹水10ul、20ul、40ul/0.5ml體系，冰上孵育30分鐘。兩組細胞等量混合，37℃培養；(3)24小時后，按Promega公司雙通道Luciferase檢測系統說明所示處理檢測Luciferase。
2、實驗結果S-9-11細胞株腹水細胞融合阻斷實驗對照腹水抗鼠CD4抗原細胞株的腹水，經檢測其濃度和S-9-11細胞株腹水濃度相同。
+組無抗體阻斷組-組不轉ACE2受體組血清抗原免疫小鼠多克隆抗血清
S-9-11細胞株腹水細胞融合阻斷實驗的結果如圖3所示。可以看出待檢測腹水對細胞融合有明顯的阻斷作用，且其作用為劑量依賴型，可以判斷S-9-11細胞株腹水對這一膜融合過程有阻斷效果。
N-176-15細胞株腹水細胞融合阻斷實驗對照腹水抗鼠CD4抗原細胞株的腹水，經檢測其濃度和N-176-15細胞株腹水濃度相同。
+組無抗體阻斷組-組不轉ACE2受體組血清抗原免疫小鼠多克隆抗血清。
N-176-15細胞株腹水細胞融合阻斷實驗結果如圖4所示。可以看出N-176-15細胞株腹水對細胞膜融合過程也有較好的阻斷作用。且S-9-11和N-176-15兩細胞株的抗體有協同作用。
實施例4病毒中和實驗病毒中和實驗1、SARS病毒毒株GZ50由廣州2003年SARS疫情中被感染的病人樣本中分離得到。GenBank上的序號為AY304495。將抗體腹水做系列的兩倍稀釋(1∶80至1∶10，240)。分別與100TCID50(病毒半數感染劑量)的SARS病毒(GZ50)混合，在37℃溫育1小時。然后將其分別加到FRhK-4細胞培液中。培液做系列稀釋并和病毒混合作為陽性對照。每個稀釋度做10個復孔。每天觀察樣品孔狀態，細胞病理效應(CPE)結點在加入病毒3天后讀取。各樣品孔的TCID50由里得-明奇(Reed-Muench)法計算得到。中和性抗體的滴度由能夠抑制病毒引起CPE的單抗腹水的最大稀釋度決定(10個復孔中至少有5孔)。
結果如下
由表中可見，抗體腹水樣品在1∶5120稀釋時各樣品孔沒有CPE效應，而在1∶10240稀釋時由7孔出現CPE效應，說明樣品腹水抗病毒的最大稀釋度為1∶5120左右。
經檢測，S-9-11克隆的腹水有明顯的病毒中和效果。其稀釋效價可達1∶5000。另外，N-176-15稀釋效價可大于1∶5000。說明這些抗體可以很有效地阻斷病毒對細胞的入侵，起到保護作用。
實施例5分離純化抗體純化分離抗體的方法飽和硫酸銨沉淀法結合Protein G親和層析法可以從腹水或細胞上清中得到純化的抗體(IgG)，方法如下具體步驟1.飽和硫酸銨沉淀1體積腹水或細胞上清樣品加1體積PBS或生理鹽水緩沖液，在振蕩的情況下逐滴加入2體積的飽和硫酸銨溶液，離心得沉淀，透析，去除離子；2.Protein G親和層析法用5倍柱體積的PBS洗柱；(2)加透析好樣品；(3)用5倍柱體積PBS洗柱；(4)用1-3倍柱體積甘氨酸洗脫抗體；(5)用Tris復性抗體溶液；
(6)20％乙醇再生Protein G柱；(7)檢測抗體濃度，保存。
Protein G層析柱Hi-Trap Protein G Column(Pharmacia Biotech#17-0404-01)所需試劑為PBS緩沖液-1.084g NaH2PO4，3.273g Na2HPO4.7H2O，ddH2O定容至1升0.1M甘氨酸，pH 2.8-3.75g Glycine 1.4ml HCl，ddH2O定容至1升1M Tris-141.1g Tris base ddH2O。定容至1升20％乙醇結果獲得了純度大于95％的單克隆抗體S-9-11和N-176-15。
實施例6含SARS中和抗體的組合物SARS治療注射劑實驗前的準備1.空安瓿的處理安瓿在鋸口前，應先經外觀檢查、清潔度實驗、耐熱性能實驗、中性實驗、耐熱耐堿等實驗。合格者可切割、圓口，然后洗滌，在100以上烘干備用；2.實驗用具的處理調配器具使用前，先用肥皂、洗衣粉等刷洗，玻璃器具可用洗液處理，然后用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，瀝干，臨用前新鮮注射用水蕩洗。新橡皮、橡皮塞先用0.5-1％氫氧化鈉煮沸30分鐘，然后再用1％鹽酸煮沸30分鐘，水洗，加蒸餾水煮沸30分鐘，再用蒸餾水洗，最后用注射用水沖洗即可使用。
處方無菌純化的SARS中和抗體免疫球蛋白(生理鹽水溶液)50g，加無菌生理鹽水定容至100ml，用HCl調節pH值為7。用3號重熔玻璃漏斗過濾至澄明，灌注于2ml安剖，熔封，即得。
成品做澄明度、熱源、藥品含量、含菌等檢查，所得產品應符合《中國藥典》及有關國家標準對注射劑藥品的要求。
菌種保藏本發明的小鼠雜交瘤細胞系N-176-15和小鼠雜交瘤細胞系S-9-11，于2005年6月29日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)，保藏號為中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)CCTCC No.C200507和C200515。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>SARS中和性抗體及應用<130>055503<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>193<212>PRT<213>SARS冠狀病毒(SARS coronavirus)<400>1Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys1 5 10 15Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val20 25 30Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys35 40 45Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn50 55 60Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile65 70 75 80Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro85 90 95Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp100 105 110Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His115 120 125Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser130 135 140Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro145 150 155 160Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro165 170 175Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr180 185 190Val
權利要求
1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它具有以下特性(a)特異性地結合于SARS病毒的受體結合區，所述的受體結合區是SARS病毒S蛋白的318-510位；(b)特異性地中和SARS病毒；(c)所述抗體與受體結合區結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000；(d)所述抗體與SARS病毒中和的裸鼠腹水效價為1∶4000-1∶10000。
2.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的受體結合區具有SEQID NO1所示的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
4.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由選自下組的細胞所產生小鼠雜交瘤細胞系N-176-15，CCTCC No.C200507；或小鼠雜交瘤細胞系S-9-11 CCTCC No.C200515。
5.一種免疫偶聯物，其特征在于，該免疫偶聯物含有權利要求1所述的免疫球蛋白和特異性地結合于所述免疫球蛋白的選自下組的偶聯部分藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶。
6.一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，它選自下組小鼠雜交瘤細胞系N-176-15，CCTCC No.C200507；或小鼠雜交瘤細胞系S-9-11 CCTCC No.C200515。
7.一種組合物，其特征在于，它含有權利要求1所述的免疫球蛋白或權利要求5所述的免疫偶聯物以及可接受的載體。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物。
9.如權利要求1所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，用于制備中和SARS病毒的組合物。
10.一種制備單克隆抗體的方法，其特征在于，它包括步驟(a)用非典型肺炎病毒的重組假病毒疫苗免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合后，獲得雜交瘤細胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細胞中，選出分泌與S蛋白318-510氨基酸區段的非典型肺炎病毒受體結合區結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，獲得與受體結合區結合雜交瘤細胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細胞中，選出產生的單克隆抗體與SARS病毒結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細胞；(e)從步驟(d)的雜交瘤細胞中制得單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種高親和力的非典型肺炎(SARS)中和性單克隆抗體及制備方法。本發明還提供產生了所述SARS中和性抗體的小鼠雜交瘤細胞系N－176－15CCTCC－C200507和S－9－11CCTCC－C200515。本發明的SARS中和性抗體具有非常好的SARS病毒中和作用。
文檔編號C07K16/10GK1911963SQ20051002863
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月10日 優先權日2005年8月10日
發明者孫兵, 邊超, 張林琦 申請人:中國科學院上海生命科學研究院