專利名稱：用梔子果實制備梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷的方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是一種從梔子果實中分離純化高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法。
背景技術：
梔子又名山梔子，是茜草科植物山梔Gardenia jasminoides Ellis.的果實，性苦寒，無毒。梔子始載于《神農本草經》，具有利膽、促胰腺分泌、降壓、鎮靜、降溫、抗菌抗炎作用。臨床主要用于治療小兒發熱、食管炎和口瘡、扭挫外傷、冠心病、急性病毒性肝炎高膽紅素血癥、急性卡他性結膜炎等。其主要的化學成分為環烯醚萜、黃酮、三萜、有機酸酯等，此外還有d-苷露醇、甾醇類、三萜皂苷類、長鏈烷烴、醇以及色素等，梔子苷(geniposide)和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷(genipin-1-β-D-geniobioside)屬于環烯醚萜苷類化合物，是梔子果實中的主要活性成分[王鋼力，陳德昌等.梔子屬植物化學成分研究進展.中國中藥雜志，1996，21(2)67；黃勝陽.中國梔子屬植物的研究概況.江西中醫學院學報，1991，3(1)59]，它們的結構式如下 梔子苷
京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷目前，國內外用梔子果實制備梔子多采用柱色譜法和重結晶等傳統方法分離純化梔子果實中的有效單體，這類方法或需使用有毒有機溶劑，如硅膠柱層析使用氯仿、甲醇，會造成環境污染；或成本高且操作繁瑣，如中性氧化鋁填料，價格昂貴[Inouye H，et al.Chem Pharm Bull.1970，18(5)1066；Inouye H，et al.Phytochemistry.1974，132219；Endo T，et al.ChemPharm Bull.1973，21(12)2684]，而且所用固定相對樣品有不可逆性吸附作用。也有采用制備液相色譜法分離純化梔子苷的[王蘭，張鑒.RP-HPLC制備色譜法分離梔子苷單體.2003，25(9)764]，但其前處理仍需借助上述傳統柱層析法，并且采用多次重復制備進行純化造成梔子苷損失較多。高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一種較新的液液分配色譜技術，它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統分離方法對樣品的不可逆性吸附作用，因而樣品回收率高，同時還具有應用范圍廣、儀器操作簡單、分離量大等優點，但目前國內外還未見有將高速逆流色譜應用于梔子中單體化合物的分離純化。
發明內容
本發明提供一種制備工藝簡單快速、回收率高、純度高且適于工業化生產的用梔子果實制備梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法。
梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷是梔子果實中的主要成分，鑒于其極性在環烯醚萜苷類成分中相對較弱，故本發明先用大量水將雜質和強極性環烯醚萜苷類成分洗去，再以低濃度乙醇選擇性洗脫，得到梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷含量占95％以上的提取物。然后再用高速逆流色譜和制備液相色譜進行分離和純化。
本發明方法包括如下步驟1.制備梔子果實粗提物按常規將干燥梔子果實粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，過濾，將濾液減壓濃縮至稀浸膏，再真空干燥得梔子果實粗提物，得率為25％～30％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化將上述制得的梔子果實粗提物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂柱。先用水充分洗脫直至洗脫液無色，水的洗脫體積通常不少于4倍樹脂量，棄去洗脫液，再用10％～30％低濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥，即得提取物，經高效液相色譜(HPLC)檢測，含有95％以上梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷，得率為4％～6％；(2)用高速逆流色譜和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機轉動，再泵入流動相，取步驟(1)中所得的提取物溶于少量下相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收流分“I”、“II”。采用高效液相色譜法對所得流分進行純度檢測(峰面積歸一化法)，測得流份“II”純度高于99％，流份“I”純度高于85％。再應用制備液相色譜對流份“I”分離純化，得流份“III”，按上述高效液相色譜法檢測，純度高于99％。揮干溶劑后對流分“II”“III”進行MS、1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認，流分“II”為梔子苷，流分“III”為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。
本發明采用大孔吸附樹脂對樣品進行前處理，只使用水和低濃度乙醇洗脫，成本低廉，不污染環境；在洗脫過程中，由于京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和梔子苷在環烯醚萜類化合物中極性偏小，故首先以大量水洗脫除去其它強極性環烯醚萜苷類成分，再以低濃度乙醇洗脫，得到含京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和梔子苷95％以上的提取物，操作簡單。最后采用高速逆流色譜和制備液相色譜對該提取物中的梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷進行分離純化，方法簡單快速且回收率高，克服了傳統制備方法操作繁瑣、分離周期長等缺點，并具有分離效率高、產品純度好、簡便、適于工業化生產等優點。
圖1為經大孔吸附樹脂純化的提取物的高效液相色譜2為經大孔吸附樹脂純化的提取物的高速逆流色譜(HSCCC)的色譜3為本發明京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的制備液相色譜的色譜4為HSCCC分離流分“I”(高速逆流分離所得含京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的流份)高效液相色譜5為制備液相色譜流分“III”(京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷)高效液相色譜6為HSCCC分離流份“II”(梔子苷)高效液相色譜圖具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明進行詳細描述。
實施例11.制備梔子果實粗提物取干燥梔子果實藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實粗提物，得率為29.8％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經預處理過的1300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時。用6000ml水洗脫(棄去)。再用6000ml 20％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末29.51g，得率為5.9％，經HPLC檢測，其梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷總含量為95.3％。
(2)應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機轉動，再泵入流動相，逆流色譜柱體積為300ml，固定相保留率60％，流速2.0ml/min，轉速800rpm，檢測波長254nm，取步驟(1)所得提取物粉末300mg溶解于10ml下相中，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收流分“I”、“II”，見圖1。對該部分進行HPLC分析表明“II”為單一色譜峰，峰純度為99.7％，流份“I”純度為87.6％。再應用制備液相色譜分離純化流份“I”。HPLC制備條件為色譜柱YWG C18(10.0×200mm i.d.10μm)；流動相為乙腈∶水＝10∶90；流速2.0ml/min；柱溫25℃；檢測波長238nm。根據檢測器譜圖接收目標成份，得流分“III”，對該流分進行高效液相分析表明其為單一色譜峰，峰純度為99.8％。制備液相色譜圖見圖2。HPLC分析條件為色譜柱Lichrospher C18(4.6×250mm i.d.5μm)；流動相為乙腈∶1％醋酸水溶液＝10∶90；流速0.9ml/min；柱溫25℃；檢測波長238nm。在此條件下所得各高效液相色譜圖見圖3、圖4、圖5、圖6，其中峰1為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷，峰2為梔子苷。將分離得到的“II”、“III”流分揮干，得流分“II”黃色粉術209.4mg，得率為4.1％；流分“III”黃色粉末47.1mg，得率為0.9％。對流分“II”、“III”在VarianINOVA-500型核磁共振儀和Varian MAT-212型質譜儀上，進行1HNMR、13CNMR和MS分析，經結構解析確定流分II為梔子苷，流分III為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。所得數據為流分“II”UVλmax(nm MeOH)239。ESI-MS389(M+1)，227，209(M-glu)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.12(1H，d，J＝7.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.6(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ95.7(C-1)，151.5(C-3)，110.9(C-4)，45.9(C-5)，37.9(C-6)，125.4(C-7)，144.1(C-8)，51(C-9)，59.3(C-10)，166.9(C-11)，34.4(C-12)，98.6(C-1′)，73.3(C-2′)，77.2(C-3′)，70(C-4′)，76.6(C-5′)，61(C-6′)。流分“III”UVλmax(nm MeOH)239。ESI-MS549(M-H)，573(M+Na)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.12(1H，d，J＝8.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.7(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)，4.24(1H，d，J＝8.0Hz，H-1″)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ96.4(C-1)，151.4(C-3)，110.6(C-4)，45.5(C-5)，37.9(C-6)，125.9(C-7)，143.9(C-8)，50.8(C-9)，59.2(C-10)，166.8(C-11)，34.6(C-12)，98.9(C-1′)，73.5(C-2′)，76.5(C-3′)，70.1(C-4′)，76.5(C-5′)，68(C-6′)，103.2(C-1″)，76.5(C-2″)，73(C-3″)，70(C-4″)，76.5(C-5″)，61(C-6″)。
實施例21.制備梔子果實粗提物取干燥梔子果實藥材粗粉500g，用10倍量水回流提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實粗提物，得率為28.7％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經預處理過的AB-8大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時。用7000ml水洗脫(棄去)。再用4000ml 30％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實大孔吸附樹脂提取物粉末32.88g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占94.5％)，得率為6.6％。
(2)應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1.5∶3。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測以及結構鑒定的方法、步驟同實施例1。梔子苷得率為4.3％，純度為99.6％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為1.1％，純度為99.7％。
實施例31.制備梔子果實粗提物取干燥梔子果實藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇浸泡提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實粗提物，得率為20.3％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經預處理過的1300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時。先用6000ml水洗脫(棄去)。再用8000ml 10％低濃度乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實大孔吸附樹脂提取物粉末23.47g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占97.5％)，得率為4.7％。
(2)應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為正丁醇∶水＝1∶1。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測以及結構鑒定的方法、步驟同實施例1。梔子苷得率為3.9％，純度為99.8％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為0.7％，純度為99.9％。
實施例41.制備梔子果實粗提物取干燥梔子果實藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實粗提物，得率為29.8％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經預處理過的D101大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時。先用7000ml水洗脫(棄去)。再用7000ml 30％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實大孔吸附樹脂提取物粉末30.23g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占97.2％)，得率為6.0％。
(2)應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測以及結構鑒定的方法、步驟同實施例1。梔子苷得率為4.1％，純度為99.7％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為0.9％，純度為99.8％。
權利要求
1.一種從梔子果實中制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，包括如下步驟1.1制備梔子果實粗提物按常規將干燥梔子果實粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，過濾，將濾液減壓濃縮至稀浸膏，再真空干燥得梔子果實粗提物；1.2純化1.2.1用大孔吸附樹脂純化將上述制得的梔子果實粗提物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂，先用水充分洗脫直至洗脫液無色，再用10％～30％低濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥，得提取物；1.2.2用高速逆流色譜和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化∶構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1，在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動相，先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機轉動，再泵入流動相，將步驟1.2.1中所得的提取物溶于少量下相中，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收流分“I”、“II”，再應用制備液相色譜對流分“I”分離純化，得流分“III”，流分“II”、“III”分別為梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。
2.按權利要求1所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于制備梔子果實粗提物時，用50％乙醇回流提取。
3.按權利要求1或2所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時，水的洗脫體積不少于4倍樹脂量。
4.按權利要求1或2所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時，所說的低濃度乙醇為20％乙醇。
5.按權利要求3所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時，所說的低濃度乙醇為20％乙醇。
6.按權利要求1或2或5所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
7.按權利要求3所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
8.按權利要求4所述的用梔子果實制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是一種從梔子果實中分離純化高純度梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷的方法。包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制備梔子果實粗提物，采用大孔吸附樹脂先用大量水充分洗脫直至洗脫液無色，再用低濃度乙醇洗脫，減壓濃縮得梔子果實大孔吸附樹脂提取物，再采用高速逆流色譜和制備液相色譜相結合的方法對該提取物進行分離純化，即得高純度梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷。本發明制備方法分離效率高、產品純度好、操作簡便，適于工業化生產。
文檔編號C07H17/00GK1706858SQ20051002614
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月24日 優先權日2005年5月24日
發明者范國榮, 周婷婷, 柴逸峰, 吳玉田, 洪戰英 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學