專利名稱：固相多肽合成特利加壓素的制備方法
技術領域：
本發明涉及特利加壓素的制備方法，具體涉及固相多肽合成特利加壓素的制備方法。
背景技術：
特利加壓素，英文名為Terlipressin，結構式 分子式為C52H74N16O15S2，分子量為1227.4。特利加壓素臨床用于治療嚴重急性食管靜脈曲張破裂出血，嚴重急性胃、十二指腸潰瘍出血，急性糜爛性胃炎或出血性胃炎，胰、膽和腸屢的輔助治療以及糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療。
目前，特利加壓素為人工合成的三甘氨酸-賴氨酸-加壓素，是合成的血管加壓素類似物，本身無活性，在體內經氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個甘氨酰殘基后，緩慢地轉化為有活性的賴氨酸加壓素，用于治療肝硬化門脈高壓引起的急性食道靜脈曲張出血，是一種安全有效的治療急性靜脈曲張出血的藥物。
特利加壓素最早由Ferring公司開發，于1977年首先在荷蘭作為止血藥上市，商品名為Glypressin。之后又以商品名Glypressine在法國、德國、英國上市，用于治療消化道靜脈曲張出血，劑型皆為凍干粉針劑，規格為1mg/支。我國于1999年進口Ferring公司的該品種，有兩種劑型，凍干粉針劑和注射液。目前的特利加壓素的制備方法均為液相合成法，如捷克斯洛伐克專利(CZP281589)公開的方法，采用固相合成方法中的Boc路線，以Boc-Gly-氯甲基樹脂(DVB1％，0.9mmol/g)為起始原料，依次接上Boc-Lys(Tos)、Boc-Pro、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Asn、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Tyr(Z)、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Gly、Boc-Gly、Z-Gly，再經氨解、鈉氨、氧化等反應制得特利加壓素，接肽收率僅為75％。由于該工藝三廢較嚴重，收率也較低，反應時間長，不具備規模生產能力，工藝復雜，成本高，環境污染嚴重，質量較差，不能滿足臨床的需要。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的方法包括如下步驟以Rink Amide樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18柱進行分離純化，獲得目標產物。
按照本發明優選的方案以Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹脂的預處理將Rink Amide樹脂(0.93mmol/g)用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃反應10～60分鐘，氮氣吹去六氫吡啶，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，獲得(A)；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹脂的重量濃度為5～20％；(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)的(A)加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，(A)的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；(3)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，
加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW468.5)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Por-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(5)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(6)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gln(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Phe-OH(FW387.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(7)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Phe-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(8)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(9)的樹脂重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(11)Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(10)的Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(10)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(12)Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(11)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(11)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；(13)Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(12)獲得的樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應10～60分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。
加入Boc-Gly-OH(FW175.2)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，將混合物20～30℃接肽反應0.5～1.5小時，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，再用甲醇洗滌，干燥，得保護12肽樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(12)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Boc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；按照本發明優選的方案，加入切肽試劑進行切肽包括如下步驟將上述保護的12肽樹脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，20～35℃反應1.5～2.5小時，過濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品；保護的12肽樹脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g；
按照本發明優選的方案，還原型粗品氧化(二硫鍵的形成)的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下緩慢加入0.5～1.5mol/L的氨水，調節pH至7.5-10.0，過濾，收集濾液；按照本發明優選的方案，純化包括如下步驟濾液經C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為100-650ml/min；檢測波長為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規的方法凍干，獲得目標產物。總收率約為21％。
由上述公開的技術方案可見，本發明的方法，采用Rink Amide樹脂(包括Rink AmideMBHA樹脂、Rink AmideAM樹脂)為起始原料，步接肽收率≥99％，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH，簡化了工藝，降低了生產成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)進行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少，切肽收率高達92％，采用弱堿性氧化(pH7.5-10.0)的方法，氧化收率高，反應時間短，采用C18(或C8)柱進行分離純化，避免使用三氟乙酸，減少三廢，純化收率高達25％，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為92％，分離純化收率為25％，總收率約為21％。由此可見，本發明的方法生產成本低，工藝簡單，收率高，便于工業化實施。
具體實施例方式
實施例和前述過程中所采用的原料列表如下
<p>表9
加108.9g(585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加111.0g(596.7，186mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加113.6g(610.7，186mmol)Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加72.1g(FW387.4，186mmol)Fmoc-Phe-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加75.0g(403.4，186mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加108.9g(FW585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加55.3g(FW297.3，186mmol)Fmoc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加55.3g(FW297.3，186mmol)Fmoc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
加32.6g(FW175.2，186mmol)Boc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。
再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護12肽樹脂。
切肽保護的12肽樹脂轉移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，25℃攪拌2小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀。
氧化(二硫鍵的形成)將還原型特利加壓素粗品溶于純化水中，在攪拌下緩慢加入1mol/L氨水，調節PH至7.5-10.0，攪拌過夜(HPLC跟蹤反應進程)，過濾。
純化濾液經C18柱(10×30cm)純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為300ml/min；檢測波長為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后凍干，獲得目標產物，總收率約為21％。
權利要求
1.一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18或C8柱進行分離純化，獲得目標產物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以Rink Amide樹脂，包括Rink AmideMBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂的預處理將Rink Amide樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃反應10～60分鐘，氮氣吹去六氫吡啶，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹脂的重量濃度為5～15ml/g；(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)的預處理的樹脂加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(1)的預處理的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(1)的預處理的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(3)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW468.5)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，Fmoc-Lys(Boc)-OH的重量體積濃度為5～15ml/g；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Por-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；然后獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(5)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液。脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(6)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gln(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Phe-OH(FW387.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(7)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Phe-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF。接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(8)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(9)的樹脂重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(11)Fmoc-Gly-Cys(Trt)-TytBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(10)的Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(10)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(12)Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(11)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液.脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(11)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(13)Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(12)獲得的樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液.脫帽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干；加入Boc-Gly-OH(FW175.2)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，將混合物接肽反應，氮氣吹干，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮氣吹干，再用甲醇洗滌，干燥，得保護的12肽樹脂；NMM和DMF中，步驟(12)的樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g，Boc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2～6倍。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，接肽反應溫度為15～40℃，時間為0.5～3小時。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，脫帽反應溫度為15～35℃，時間為10～60分鐘。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，NMM和DMF中，TBTU或HBTU的摩爾數為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數為樹脂的2～6倍，NMM的摩爾數為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，加入切肽試劑進行切肽包括如下步驟將上述保護的12肽樹脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，15～35℃反應1.5～2.5小時，過濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，保護的12肽樹脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還原型粗品氧化的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下加入0.5～1.5mol/L的氨水，調節pH至7.5-10.0，過濾，收集濾液。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，純化包括如下步驟將權利要求9獲得的濾液經C18或C8柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為100-650ml/min；檢測波長為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規的方法凍干，獲得目標產物。
全文摘要
本發明公開了一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，包括如下步驟以RinkAmide樹脂(包括Rink Amide MBHA樹脂、Rink AmideAM樹脂)為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc－Gly－OH；然后加入切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品，加入堿性物質，在pH為7.5－10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品，最后采用C18(或C8)柱進行分離純化，獲得目標產物。本發明的方法，生產成本低，工藝簡單，環境污染低，收率高，便于工業化實施。
文檔編號C07K1/04GK1865282SQ20051002592
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月18日 優先權日2005年5月18日
發明者周達明 申請人:周達明