專利名稱：溴代二氫青蒿素的制作方法
技術領域：
本發明涉及化學合成物技術領域，具體的說，是涉及二氫青蒿素的一種衍生物-溴代二氫青蒿素。
背景技術：
現有從植物中提取的天然抗癌藥物，由于其療效有限和毒副作用強限制了其臨床應用，始終不能成為抗癌的主力藥物。
例如紫杉醇被當今世界上公認為廣譜、活性最強的抗癌藥物，尤其是對子宮癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的療效，它的問世被譽為90年代國際上抗癌藥三大成就之一；目前治療婦女乳腺癌的常見用藥有歐洲紫杉醇和太平洋紫杉醇；可以延長惡化時間兩個月和增加存活時間3個月。
但兩種紫杉醇都有副作用，病人會出現手腳麻痹的現象，太平洋紫杉醇毒性最常見且致命的副作用就是有15-20％的患者發生急性過敏性休克；副作用抑制造血細胞，過敏，胃腸不適，以及輕度的肝臟損傷；歐洲紫杉醇常見的副作用是骨髓抑制、血球低下、疲倦等。
又如喜樹堿喜樹堿是從我國喜樹中提取的一種生物堿，應用于臨床如消化系統腫瘤，黑色素瘤等之治療并有部分成效；其作用機理經動力學的研究證明，喜樹堿是屬于細胞周期特異性藥物，能使癌細胞停留于S期(DNA合成期)，阻止其進一步分裂。動物實驗證明對Erlich腹水瘤細胞DNA、RNA的合成均有較明顯抑制作用，上海地區用喜樹堿治療胃癌435例，有效率61％；但有嚴重副作用如骨髓抑制，出血性膀胱炎及消化系統之癥狀。
青蒿素是我國藥學工作者1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物；青蒿素及其衍生物是含過氧橋的倍半萜內酯類新型抗瘧藥，具有高效、快速、低毒、安全等特點；研究表明，青蒿素對瘧原蟲配子體有殺滅作用，其強度和劑量與配子體成熟度相關。
早期的研究表明，青蒿素選擇性殺滅紅內期瘧原蟲的機理主要是作用于瘧原蟲的膜系結構，使核膜、質膜破壞，線粒體腫脹皺縮，內外膜剝離，對核內染色物質也有一定影響，青蒿素及其衍生物通過影響線粒體的功能，阻斷瘧原蟲營養的供應，從而達到抗瘧目的；青蒿素類藥應用十多年來尚未見有關抗藥性的報道，在對多重抗藥性惡性瘧疾的治療上，青蒿琥酯和蒿甲醚也有良好的療效。
青蒿素及其衍生物還有以下作用抗卡氏肺孢子蟲肺炎作用動物實驗證實，青蒿素對大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎有效；用雙氫青蒿素60毫克/千克治療大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎，大鼠存活數、存活率均高于感染組；治療后大鼠平均肺重、平均肺重/體重比和包囊數均低于感染組，肺組織炎癥反應明顯減輕；進一步的研究表明，雙氫青蒿素主要破壞卡氏肺孢子蟲膜系結構，引起孢子蟲滋養體胞漿及包囊內出現空泡，線粒體腫脹，核膜破裂，內質網腫脹，囊內小體溶解破壞等超微結構的改變。
抗孕作用青蒿琥酯和雙氫青蒿素對小鼠、金黃地鼠、大鼠及兔均有抗孕作用，金黃地鼠和豚鼠表現為流產，小鼠、大鼠和兔表現為胚胎吸收。青蒿琥酯(40毫克/千克)×5天可使妊娠大鼠血清孕酮含量下降并損傷胎膜和胎盤使胚胎壞死而終止妊娠；二氫青蒿素對體外培養的人胎膜細胞亦有直接殺傷作用；二氫青蒿素類藥對胚胎有較高的選擇性毒性，較低劑量即可使胚胎死亡而導致流產，但對母體子宮、卵巢和一般健康狀況無明顯影響，此類藥有可能被開發為人工流產藥物。
對腫瘤的作用二氫青蒿素及其衍生物對鼠艾氏腹水瘤細胞和人HeLa細胞有細胞毒活性；用青蒿琥酯處理的HeLa細胞可見梯狀DNA和凋亡小體。Beekman等對從9種不同組織中培養的60株腫瘤細胞進行檢測發現，雙氫青蒿素對白血病、黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌和乳腺癌細胞株高度敏感，而對非小細胞肺癌、中樞神經系統腫瘤、卵巢癌和腎癌細胞株的活性較低；其抗腫瘤作用可能同二氫青篙素與Fe2+反應產生大量自由基以及烷基化作用有關。
抗血吸蟲作用青蒿素及其多種衍生物均有抗血吸蟲作用，在整個服藥階段對幼蟲期的血吸蟲都有殺滅作用，因此具有良好的預防效果，二氫青蒿素還能殺滅進入宿主體內的幼蟲，對疫水接觸者具有保護作用，用于感染日本血吸蟲尾蚴后的早期治療，可降低血吸蟲感染率和感染程度，并可預防血吸蟲病發生。其抗血吸蟲活性基團是過氧橋，作用機理是影響蟲體的糖代謝。在大規模應用青蒿琥酯預防性治療接觸疫水的人群時發現，17031人在服藥后無急性血吸蟲病發生，因此認為二氫青蒿素預防血吸蟲病具有高效、安全、方便等特點，是目前比較理想的預防藥。
治療弓形蟲感染作用體外實驗證實，青蒿素(蒿甲醚)能抑制弓形蟲侵入細胞。青蒿素主要作用于蟲體細胞膜、線粒體及細胞核，繼而廣泛損傷其膜系結構，造成核膜斷裂、線粒體腫脹、空泡樣變性、內質網擴張甚至出現核碎裂、核溶解現象。
對心血管的作用青蒿素有減慢心率，抗心律失常，抑制心肌收縮力等作用。二氫青蒿素能明顯對抗結扎冠脈引起的心律失常，可使氯化鈣、氯仿引起的心律失常發作時間明顯推遲，室顫明顯減少，其作用與其抑制內向整流鉀電流和浦肯野纖維瞬間外向鉀電流有關。
對免疫系統的作用雙氫青蒿素、青蒿琥酯均對超適劑量免疫法誘導的供體鼠T細胞的產生有顯著抑制作用，且兩者都能增強受體鼠反應階段細胞的活性。
其他雙氫青蒿素對杜氏利什曼原蟲有顯著抑制作用并呈劑量相關性。其機理系影響杜氏利什曼原蟲前鞭毛體DNA合成，使蟲體變形，核、動基體不完整，胞質內出現多個空泡，鞭毛脫落。青蒿提取物還可殺滅陰道毛滴蟲和溶組織阿米巴滋養體。青蒿琥酯能松弛豚鼠氣管平滑肌并非競爭性拮抗乙酰膽堿、組織胺的收縮氣管作用，機理與激活腺苷酸環化酶關，且不被β腎上腺素受體噻嗎洛爾所阻斷。
近年來，各國的藥物學家對青蒿素及其衍生物的抗癌作用進行了更廣泛的研究，深層次藥理、藥效、毒副作用和藥物動力學研究表明藥理用青蒿素及其衍生物對付血癌和乳腺癌細胞，發現青蒿素的選擇性是其他化學療法的100倍，而且，青蒿素可以殺死癌細胞，但不傷害周圍健康細胞。“癌癥細胞分裂時需要大量鐵質才能復制DNA，因此癌細胞的鐵質含量比正常細胞高出許多。”這些攜帶青蒿素衍生物的蛋白進入癌細胞后，青蒿素中的3-C位上的氧原子和12-C位上的氧原子之間形成氧橋，鐵離子就被釋放并與青蒿素衍生物反應，從而破壞癌細胞，氧橋斷裂釋放出自由基(氧原子)，自由基攻擊癌細胞膜，使膜破裂而癌細胞死亡；這是把青蒿素轉為抗癌藥物的關鍵。由于癌細胞對鐵的貪婪，使得藥物具有很高的選擇性；實驗表明青蒿素標記的鐵傳蛋白選擇和殺死癌癥細胞的效率是殺死正常細胞的效率34000倍(資料出處)。
藥效比較IC50是體外癌細胞半數致死量，IC50能直觀地反應藥效強弱。
羥基喜樹堿IC50為206u mol～305u molng；紫杉醇IC50為8.6u mol；
二氫青蒿素IC50為24n mol(0.024u mol)。
毒副作用對神經系統、呼吸系統、心血管系統均無明顯藥理作用，僅在劑量大至40mg/kg時顯示一定的鎮痛、鎮靜作用。該藥安全性較大，LD50為834.5mg/kg，化療指數為834.0，大鼠20-180(MKD)連續30天給藥，對生理、生化指標及主要臟器病理學檢查均未見明顯變化。特殊毒性方面，致突變實驗陰性，生殖毒方面，在小鼠妊娠敏感期給藥，增加吸收胎的發生，未見致畸作用。
藥代動力學小鼠灌服3H-二氫青蒿素后，血液內放射性迅速上升，半小時至1小時達到高峰，隨后迅速下降，4小時降到峰值的一半，以后緩慢消失。胃腸道殘留量的測量表明，半小時殘留58％，1小時殘留35.3％，半量消失時間約為1.2小時。經口給藥后分布廣泛，1小時開始達到高峰，同位素法表明各組織中膽、肝、腎最多，心、肺、脾等次之。顯色法表明肌肉注射1～8小時達到高峰，肝、腦、骨、血液含量較高。口服后24小時內，80％放射性經糞、尿排出，顯色法結果類似。上述結果表明二氫青蒿素進入體內后吸收快、分布廣，排泄快。
1997年美國華盛頓大學生物工程系的賴亨利教授和納倫德拉星開始設想同樣的機理一定也能作用于癌癥癌癥細胞分裂時需要大量鐵質才能復制DNA，因此癌細胞的鐵質含量比正常細胞高出許多；經研究發現，癌細胞比正常細胞含鐵高5-15倍，高的達50倍，最高的白血病癌細胞居然達1000倍。賴教授稱“青蒿素不但有效，而且選擇性非常強；對癌細胞有很高的毒性，但對正常細胞的影響很小。”它有可能成為無毒的高效抗癌藥；哈醫大的黑龍江省生物醫藥工程重點實驗室楊寶峰、周晉教授研究發現，二氫青蒿素能有效抑制實體腫瘤細胞的增殖。他們發現，白血病細胞膜是二氫青蒿素攻擊的一個主要靶點，起抗瘤機制有“凋亡”和“脹亡”兩種。白血病細胞膜遭到破壞后，大量的鈣離子就會進入細胞內，一方面引起細胞程序化死亡，即“凋亡”，另一方面導致細胞內的滲透壓發生改變，吸收大量水分，使細胞膨脹直至死亡，即“脹亡”；這種推測在臨床實驗中得到了廣泛支持將若干組乳腺癌細胞和正常乳腺細胞與轉鐵蛋白接觸，8小時以后，只剩下25％癌細胞。16小時過去以后，幾乎所有癌細胞都死亡了，而正常細胞不受影響。例如一只患有嚴重骨癌的狗已經不能行走，在接受二氫青蒿素輔之以鐵的治療下，5天就完全恢復，賴教授的理論得到了驗證。
現有技術中，上海藥物研究所以二氫青蒿素酯、醚衍生物的方式來引進鹵素，虞佩琳等二氫青蒿素類似物的研究、藥學學報1985；20(5)357~365，在抗癌實驗(A549)中，對比物IC50是1227nM，引進溴元素的IC50是47nM，藥效增強約26倍(Ying Li et al.Novel Antitumor Artemisinin DerivativesTargeting G1 Phase of the Cell Cycle.Bioorg.& Med.Chem.Lett.11(2001)5-8)。
專利權人是中國科學院上海藥物研究所的中國專利02128494、名稱為叔丁氧羰基二氫青蒿素、其制備方法及藥物組合物，其發明提供結構式所示的叔丁氧羰基二氫青蒿素系以二氫青蒿素為起始原料，與雙叔丁基二碳酸酯在有機溶劑中進行酰化反應而制得；發明的抗寄生蟲病藥物組合物包含治療有效量的叔丁氧羰基二氫青蒿素和藥學上可接受的載體，與以前合成的二氫青蒿素衍生物相比，叔丁氧羰基二氫青蒿素有最大的治療指數(＞1700)，是高效、低毒的抗寄生蟲藥物，在防治血吸蟲病、瘧疾等寄生蟲病過程中可減少毒副作用的產生，尤其是在惡性瘧疾的治療中，對降低兒童死率有重大的意亡義。
申請人是浙江大學、申請號是03116762.4、發明名稱為青蒿琥酯和二氫青蒿素抗血管生成作用的藥物制劑及用途的中國專利申請公開了青蒿琥酯和二氫青蒿素在抗血管生成作用方面的藥物制劑及其用途；該藥物制劑主要含有青蒿琥酯或二氫青蒿素，其制劑形式主要為微球注射液；該發明提供的藥物制劑在抗腫瘤血管生成方面有活性，可用于腫瘤血管生成及其他與血管生成有關的疾病治療，還可用于腫瘤化療和/或輔助化療方面的治療。該制劑在給藥部位緩慢釋放藥物與吸收，延長藥物作用時間；該發明以血管生成理論為背景，研究并闡明中藥有效單體成分作用和機制，是發展中醫藥理論新的重要方向，為發現新的理論和藥物作用新的靶點提供重要依據，為二氫青蒿素類藥物的新用途開發提供依據。
綜上所述，現有技術有以下方面的不足首先是青蒿素及其衍生物的醫藥用途雖然得到驗證和肯定，但對癌癥的適應癥范圍不夠全面；其次是現有的二氫青蒿素及其衍生物治療癌癥的藥效還有待提高。
技術內容因此，人們期待著具有更為廣譜、特效、安全性高、毒副作用小和給藥方式更簡單的治療癌癥的藥物，本發明的目的就是旨在克服上述現有技術缺限，提供一類基于二氫青蒿素的新化合物，它具有極為廣譜的治療癌癥的醫學效果和特別的療效，且無任何毒副作用。
為了達到上述發明目的，本發明人研究了很多二氫青蒿素及其衍生物，并結合現有技術的教導，考慮到鹵族元素取代基對藥物效用有積極的影響，如溴化物具有加強藥效的功能，成為許多感冒糖漿中的最佳藥劑，通過無數次選擇、試驗，我們自主合成了溴代二氫青蒿素。
實際上，在二氫青蒿素的母核上引進雜原子是非常困難的，上海藥物研究所是以二氫青蒿素酯、醚衍生物的方式來引進鹵素。
溴代二氫青蒿素的化學名稱為(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氫-3-溴代亞甲基-6，9二甲基-3，12-橋氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10(3H)醇。
其結構式為 本發明的主要目的是將二氫青蒿素上的3-C位甲基鹵化。
合成溴代二氫青蒿素的步驟為將二氫青蒿素溶于酯溶性溶劑，在溶液中導入溴源，進行合成反應，并去除殘留溴源，后萃取提純，并脫水結晶，得到標的化合物。
由于二氫青蒿素具有過氧橋的倍半萜內酯類結構，其應選擇酯溶性溶劑對其溶解分散，較為優選的酯溶性溶劑是乙腈、二甲基甲酰胺、乙酸、氯仿、四氯化碳。
上述的合成工藝中，所述的溴源可是單一成份的氣體或液體，也可是溴化物。
液溴、溴氫酸、溴化氫氣體等都可作為標的化合物的溴源導入。
在合成工藝中，當導入溴源進行溴化反應時，可加入催化劑對溴化反應進行催化。
所述的催化劑是二氧化錳、硅鋁酸鹽、鹵化亞銅；或是用鹵鎢燈直接進行照射。
本發明涉及的溴代二氫青蒿素在制備治療癌癥的藥物組合物中可得到極積的應用；本發明涉及的溴代二氫青蒿素可制成各種符合藥劑學要求的各種口服劑型；本發明涉及的溴代二氫青蒿素的可制成各種符合藥劑學要求的各種外用劑型；本發明涉及的溴代二氫青蒿素可制成各種符合藥劑學要求的各種注射劑型；所述的口服劑型包括滴丸、速釋滴丸、膠囊、顆粒、噴霧劑、口服液、片劑、骨架型緩釋制劑包括(1)不溶性(如乙基纖維素EC、聚乙烯、聚丙烯、聚硅氧烷、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯等)；(2)蠟質骨架(如脂肪、蠟類物質、硬脂酸、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、巴西棕櫚蠟、十八烷醇等)；(3)親水凝膠(如CMC、CMC-Na、MC、PVA、HEC、SCMC、海藻酸鈉、果膠、藻酸鹽、瓊脂、羥丙基甲基纖維素HPMC、脫乙酰殼多糖、殼多糖、半乳糖甘露聚糖等)；(4)胃內滯留片等；緩釋包衣制劑包括(1)膜控釋小片、(2)微孔膜包衣片、(3)小丸劑包括膜控小丸、骨架型小丸；所述的注射劑型包括注射液(普通)、凍干粉針、粉針(普通)、大輸液、高濃度注射液、注射用片劑；所述外用劑型包括膜劑、栓劑、氣霧劑、透皮制劑釋藥上述劑型中滴丸是在中藥丸劑基礎上發展起來的，具有傳統丸劑所沒有的多種特點，故發展非常迅速。由于片劑服用量大，崩解度差，對腸胃道有刺激作用，而滴丸用舌下含服，從而大大減少了對腸胃道刺激。與其它劑型(軟膠囊、沖劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液)比較，具有比表面積大，溶出速度快的特點，這是因為滴丸可提高難溶性藥物的生物利用度。由于滴丸是在驟冷條件下形成的固體分散體，藥物以極小的晶粒存在，故舌下含服經舌粘膜吸收，直接進入血循環，起效快；臨床應用適合于對口腔癌、喉癌的專用藥。
緩釋控釋制劑近年來緩釋、控釋制劑為開發研究熱點。緩釋制劑是指可以減少服藥次數，提供比較平穩的血藥濃度的制劑，以達到減少副作用，維持持久藥效的目的。控釋制劑是指通過制劑手段提供釋放藥物的程序，在預定的時間內藥物自動按某一速度從劑型中釋放與作用器官或特定的靶部位，使血藥濃度長時間恒定維持在有效濃度范圍內，釋藥均勻平衡，控釋體系釋藥速度與時間無關，避免了傳統常規制劑給藥頻繁所出現的“峰谷”現象，提高了臨床用藥安全性與有效性，可代替靜脈滴注，也可根據機體需要自動控制給藥速度。其目的在于尋求提供理想血藥濃度的途徑，提高藥物的安全性和有效性。口服緩釋控釋制劑的研究發展很快，其種類不斷增加，設計方法逐漸趨于半定量或定量化；臨床應用適合于對全身各種癌癥的用藥。
膜劑膜劑是近年來國內外研究和應用進展很快的劑型，臨床很受歡迎，可用于口服、口眼耳鼻喉、皮膚及婦科癌癥等。隨著TTS(即透皮治療系統)的不斷發展，一些膜劑尤其是鼻腔、皮膚用藥膜亦可起到全身作用，故在臨床應用上有取代部分片劑、軟膏劑和栓劑等的趨勢。且具有療程短、副作用小、藥膜釋放速度快的優點，是治療各種陰道癌、宮頸癌的首選藥物。由于膜劑本身體積小，重量輕，隨身攜帶極為方便；如將生物粘附技術引入食道癌治療的靶向制劑，所制成的磁性微球可很好地將藥物粘附在癌細胞上；臨床應用適合于口、咽、鼻、喉、皮膚、婦女陰道、宮頸癌的專用藥。
微囊微囊是利用天然或合成高分子材料或共聚物(囊膜材料)將藥物包裹而成的一種新的劑型。藥物微型包裹后利于攜帶，便于服用。它的優點在于可延長或控制藥物的釋放，制成長效制劑。囊膜有隔離外界與藥物接觸作用，可防止藥物氧化、水解和揮發，掩蓋不良氣味，減少復方制劑中的配伍禁忌。也可制備特殊性能微囊(磁性微囊、PH敏感微囊)起到靶向釋藥作用，采用明膠凍凝法將其包成微囊，其包囊率及溫室貯存穩定性較好。
微囊系利用天然的或合成的高分子材料將固體或液體藥物包裹而成的直徑1-500um的微小膠囊，其外型取決于囊心物質的性質和囊材凝聚的方式，微囊外面呈球狀實體或呈平滑的球狀膜殼形，葡萄患形及表面平滑或折疊的不規則結構等各種形狀，它常用于增加藥物的穩定性，掩蓋藥物的不良氣味，改良和延緩藥物的釋放；臨床應用適合于全身癌癥的用藥。
栓劑栓劑不僅可起到局部治療作用，而且還可通過直腸吸收到全身治療作用，直腸給藥后，藥物不直接通過肝臟，可防止或減少藥物在肝臟的代謝，減輕藥物對肝臟的毒副作用。栓劑具有吸收快，起效迅速，生物利用度高，能維持較長時間血藥濃度的優點。腔腸給藥用藥的有發展潛力的主渠道之一，這一領域的研究必定會推動栓劑的迅速發展；臨床應用適合于腸癌、前列腺癌等。
氣霧劑氣霧劑具有劑量小，分布均勻，奏效快，使用方便等特點。吸入時可減少胃腸道副作用，外用則避免對創面的刺激性，并可用定量閥門控制劑量，具有速效和定位作用。臨床上主要用于幼兒不能口服或不愿口服者；本劑型臨床應用適合于上皮膚癌、上呼吸道癌、肺癌等。
靶向制劑靶向給藥也是近年來國內外一個極為重要的開發熱點，尤其在抗癌藥物方面已取得重大發展，其原理為抗癌物與鐵磁性材料包封與高分子骨架材料中，制成的超微球控釋制劑在體外磁場導向下聚集滯留在靶區的癌組織上，緩慢釋放藥物，對癌細胞，進行有效的攻擊，既可避免傷害正常細胞，又可減少用藥量和降低毒性，提高療效。磁性靶位釋藥系統在靶位給藥方面提供了一個新的開發途徑，而脂質體仍為靶向制劑中研究的熱點；本劑型臨床應用適合于仝身各種癌癥的用藥。
微丸是指直徑小于2.5mm的各類丸劑，可根據不同需要將其制成速釋或緩釋微丸。速釋微丸可使藥物迅速釋放。本研究的重點是緩釋微丸，緩釋微丸是由藥物與阻滯劑混合制成或先制成普通丸芯而后再包控釋膜而成。微丸壓制成片，或將速釋微丸與緩釋微丸裝于膠囊殼中制成控釋膠囊劑。
微丸之有許多其他口服制劑無法相比的優點①可通過控釋微丸包衣制成緩控釋制劑；②在胃腸道分布面積大，生物利用度高，刺激性小；③由于粒徑小，受消化道輸送食物節律影響小(如幽門關閉等)；④控釋微丸可使血藥濃度迅速達到療效濃度，并維持平穩、長時間的有效濃度，血藥波動小；⑤微丸的流動性好，大小均勻，易于處理(如包衣、分劑量)；⑥改善藥物穩定性，掩蓋不良味道；⑦適合復方制劑的配伍；本劑型臨床應用適合于全身各種癌癥的用藥。
透皮制劑釋藥本透皮制劑主要為凝膠制劑，可持續維持本藥的血藥濃度24小時，避免口服和靜脈給藥途徑的血藥濃度波動；本劑型臨床應用適合于全身各種癌癥的用藥，尤其是皮膚癌。
二氫青蒿素可直接購買，也可直接從植物中提取青蒿素，后還原成二氫青篙素。
與現有的二氫青蒿素相比，溴代二氫青蒿素有以下幾方面突出的優點申請人首創在在二氫青蒿素的母核上直接引進雜原子，將二氫青蒿素上的3-C位甲基溴化。
藥效更強鹵族元素的極性更強，因此比二氫青蒿素的生理活性更強；按二氫青蒿素抗癌原理，其作用方式是其特有的氧橋斷裂產生自由基，引起癌細胞膜破裂而殺死癌細胞；a-甲基的溴化有利于吸引3，12碳位上的氧橋斷裂產生自由基，可以大大增強藥效，按四川大學華西醫學院用溴代二氫青蒿素對人肝癌細胞株-Hepg2細胞毒性研究表明，溴代二氫青蒿素對體外Hepg2細胞的細胞毒IC50＜8nM。
溴化工藝簡單、并易于工業控制，有很好的專一性，使產品的合成工藝有很好的特異性，并且易于量化控制。
溴代二氫青蒿素無毒副作用。
圖1是溴代二氫青蒿素體用于體外癌細胞株癌細胞生存率示意圖(％)。
圖2是合成溴代二氫青蒿素的工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例1本實施例描述用黃花青蒿制備青蒿素、將青蒿素還原成二氫青蒿素、用二氫青蒿素導入溴源合成溴代二氫青蒿素的過程。
黃花青蒿5000Kg用8倍乙醇24h回流浸提，浸提液注入層析硅膠柱，直到流完；用石油醚洗脫，開始為黃綠液體；洗到液體基本為無色透明或用硅膠G板薄層監測有淺藍色熒光斑點時，換洗脫液為10％乙酸乙酯+90％石油醚洗脫，并收集其洗脫液，用上述薄層監測至無藍色熒光斑點；收集的洗脫液濃縮，靜置過夜，收集析出的粗結晶；用30倍的50％的乙醇液重結晶，得青蒿素針狀結晶；將青蒿素10Kg溶入300L甲醇中，攪拌下加季銨鹽EtNCl 4Kg，充分攪拌混均后加入硼氫化鉀4Kg，加磷酸二氫鈉1.65Kg，室溫下反應至白色結晶析出，質液明顯分離；將全部反應物倒入0℃的冰水中，靜置析出白色固體；收集白色固體，用蒸餾水反復洗滌3次、干燥，得二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
將反應釜用N2干燥，加入100mol二氫青蒿素和1000L氯仿，溶解；加入14KgMnO2，攪勻。并于40～60℃溫度下以大約16L/分鐘的速度導入液溴100mol，同時進行攪拌；60分鐘后，過濾反應物；向過濾物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸鈉水溶液洗滌，收集有機層；再加入5000～15000L10％的碳酸氫鈉溶液洗滌，收集有機層；有機層用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正已烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
實施例2本實施例描述用青蒿素還原成二氫青蒿素、用二氫青蒿素導入溴源合成溴代二氫青蒿素的過程。
市售青蒿素粗粉(與生藥比為1∶4)備用加5倍50％乙醇溶解，溶解液注入層析硅膠柱，直到流完；用石油醚洗脫，開始為黃綠液體；洗到液體基本為無色透明或用硅膠G板薄層監測有淺藍色熒光斑點時，換洗脫液為40％乙酸乙酯+60％石油醚洗脫，并收集其洗脫液，用上述薄層監測至無藍色熒光斑點；收集的洗脫液濃縮，干燥；用乙酸乙酯精制，得青蒿素針狀結晶。
將提純后的青蒿素10Kg溶入300L50％乙醇中，攪拌下加季銨鹽EtNCl 4Kg，充分攪拌混均后加入硼氫化鉀4Kg，加磷酸二氫鈉1.65Kg，室溫下反應至白色結晶析出，質液明顯分離；將全部反應物倒入0℃的冰水中，靜置析出白色固體；收集白色固體，用蒸餾水反復洗滌3次、干燥，得二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
反應釜用N2干燥，加入100mol二氫青蒿素和1000L四氯化碳，溶解；加入14KgMnO2，攪勻。并于40℃溫度下以大約16L/分鐘的速度導入液溴，同時進行攪拌；90分鐘后，過濾反應物；過濾物用1000～2000L的水攪拌洗滌，收集有機層；有機層用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正已烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
實施例3 溴代二氫青蒿素的制備反應釜用N2干燥，加入100mol二氫青蒿素和1000L氯仿，溶解；加入14KgMnO2，攪勻。并于40～60℃溫度下以大約16L/分鐘的速度導入液溴100mol，同時進行攪拌；60分鐘后，過濾反應物；向過濾物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸鈉水溶液洗滌，收集有機層；再加入5000～15000L10％的碳酸氫鈉溶液洗滌，收集有機層；有機層用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正己烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
實施例4 溴代二氫青蒿素的制備反應釜用N2干燥，加入100mol二氫青蒿素和1000L四氯化碳，溶解；加入14KgMnO2，攪勻。并于40℃溫度下以大約16L/分鐘的速度導入液溴，同時進行攪拌；90分鐘后，過濾反應物；過濾物用1000～2000L的水攪拌洗滌，收集有機層；有機層用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正已烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
實施例5 溴代二氫青蒿素的制備反應釜用N2干燥，加入100mol二氫青蒿素和1000L乙腈，溶解；于室溫下以大約10L/分鐘的速度導入液溴，同時進行攪拌；在1000W鹵素燈光催化下，反應6小時；向反應物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸鈉水溶液洗滌，收集有機層；再加入5000～15000L10％的碳酸氫鈉溶液洗滌，收集有機層；有機層用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正已烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為類白色粉末狀結晶。
實施例6 溴代二氫青蒿素的制備1.5Kg二氫青蒿素和5L氯仿混合，溶解；加入14KgMnO2，攪勻。并于40℃溫度下以大約16L/分鐘的速度導入液溴，同時進行攪拌；90分鐘后，過濾反應物；過濾物再用氯仿精制一次；用無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮成白色結晶，晶體用正已烷洗滌，濾出結晶，干燥，得到溴代二氫青蒿素，為白色粉末狀結晶。
實施例7Br-DHA對人肝癌細胞株-Hepg2細胞毒性的研究報告(四川大學華西醫學院2004.12.22)1.材料1.1 細胞株人肝癌細胞株Hepg2購于美國ATCC，10％FBS/DMEM常規培養。
1.2 受試品Br-DHA白色粉末，平均分子量320g/mol，批號20041205。硫酸亞鐵白色粉末，批號20041205。轉鐵蛋白，Sigma公司。
2.方法2.1 細胞毒實驗方法取對數生長期的Hepg2細胞，常規方法消化，以8×103的密度接種于24孔細胞培養板。接種24h后，接表1分別加入轉鐵蛋白、硫酸亞鐵，培養8小時后，加入Br-DHA。藥物作用72小時后，常規方法細胞計數結果見圖1。
3.結果(見下表)4.小結在上述實驗條件下，發現Br-DHA對體外Hepg2細胞的細胞毒IC50＜8nM。
表1Br-DHA給藥劑量表
注硫酸亞鐵∶Br-DHA＝250ng∶1nM；每劑量樣本數N＝4實施例8Br-DHA體外抗腫瘤活性的研究(四川大學華西藥學院)。
1.材料1.1 細胞株人肝癌細胞株Hepg2購于美國ATCC，人肺癌細胞株A549，購于中國科學院上海細胞所。
1.2 培養基Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)GIBCOBRL，Cat.No12100-038，RPMI1640GIBCOBRL，Cat.No430-1800EB，Fetal Bovine SerumCat.NoCH30160.03
胰酶GIBCOBRL，Cat.No27250-018。
1.3 受試品Br-DHA白色粉末，平均分子量320，大陸蓉東藥業，批號20041205，硫酸亞鐵白色粉末，大陸蓉東藥業，批號20041205，轉鐵蛋白白色晶狀粉末，平均分子量79000，Sigma。
2.方法2.1 細胞培養Hepg2與A549細胞分別常規培養于10％FBS/DMEM與10％FBS/RPMI1640中，2-3天換液。
2.2 藥物配制用十萬分之一電子天平精密稱取轉鐵蛋白、硫酸亞鐵、BrDHA，其中轉鐵蛋白、硫酸亞鐵直接溶于細胞培養基后過濾除菌，轉鐵蛋白Co＝17.6nM，硫酸亞鐵Co＝5mg/L；而BrDHA先溶于DMSO后，再用細胞培養基稀釋到所需濃度，過濾除菌Co＝6.4mg/L。受試品的不同濃度由低比稀釋配制。
轉鐵蛋白、硫酸亞鐵、BrDHA的溶液均于臨用前新鮮配制，每孔加50uL。
2.3 細胞毒試驗方法取對數生長期的Hepg2、A549細胞，常規方法消化，以8×103的密度接種于24孔細胞培養板。接種24h后，接表1、2分別加入轉鐵蛋白、相應劑量的硫酸亞鐵。孵育8h后，加入各劑量的Br-DHA。藥物作用72小時后，常規方法細胞計數結果見表2、3。
3.結果見表2、表3。
4.結論本實驗表明Br-DHA對人肝癌細胞株Hepg2細胞和人肺癌細胞株A549細胞均有非常明顯的體外抗腫瘤作用，對Hepg2和A549細胞的IC50分別＜8nM和31.6nM。(表見下頁)表2、Br-DHA對人肝癌細胞株--Hepg2體外抗腫瘤活性
注.硫酸亞鐵∶BrDHA＝250ng∶1nM表3、Br-DHA對人肺癌細胞株-A549體外抗腫瘤活性
注.硫酸亞鐵∶BrDHA＝250ng∶1nM。
實施例9中國科學院成都分院分析測試中心分析、測試結果報告單溴化率的計算1、二氫青蒿素(DHA)分子量為284.34，溴原子(Br)分子量為79.90，氫原子(H)分子量為1；2、二氫青蒿素的一個氫原子被溴原子取代后，溴代二氫青蒿素的分子量為(284.34-1)+79.90＝363.243、溴化率的計算79.90÷363.24＝21.996％≈22.0％。
檢驗報告上22.90％屬正常值。
表4
權利要求
1.一種溴代二氫青蒿素，化學名稱為(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氫-3-溴代亞甲基-6，9二甲基-3，12-橋氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10(3H)醇，其結構式如下式
全文摘要
本發明公開了一種溴代二氫青蒿素，其特別適用于治療各種癌癥；申請人首創將二氫青蒿素上的3－C位甲基溴化，在二氫青蒿素的母核上直接引進雜原子；主要是以二氫青蒿素為母核，制成溴代二氫青蒿素；利用鹵族元素有更強的極性，使二氫青蒿素的氧橋更容易斷裂成自由基；大大增強藥效，本發明溴化工藝簡單，易于工業化生產，溴化有很好的專一性，使產品的合成工藝有很好的特異性，易于量化控制，對正常細胞無毒副作用，用溴代二氫青蒿素對人肝癌細胞株－Hepg2細胞毒性研究表明，溴代二氫青蒿素對體外Hepg2細胞的細胞毒IC50＜8nM。
文檔編號C07D321/00GK1680389SQ200510020150
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月12日 優先權日2005年1月12日
發明者石雁羽, 楊大陸, 鐃水元 申請人:四川大陸蓉東制藥有限公司