豬肉質性狀基因foxo3a的克隆及其應用的制作方法

專利名稱：豬肉質性狀基因foxo3a的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及豬肉質性狀相關基因FOXO3A基因的克隆以及作為豬肉質性狀分子標記的應用。
背景技術：
過去幾十年的育種實踐中，豬的生長速度、飼料報酬和瘦肉率等都有了很大的提高。與此同時，由于肉質性狀與生長性狀或胴體性狀間常常表現為負的遺傳相關，因而在提高生長速度和瘦肉率的選擇中，常伴隨著肉質的下降，即肉質變劣、風味變差。嚴重影響了養豬生產和豬肉加工與消費，引起了消費者和豬育種學家的高度重視。為了探明肉質的遺傳規律，國內外對肉質進行了多方面的研究工作(吳金亮等.豬肉質性狀的研究進展.云南農業科技.2004年增刊，20-24)。
肉質是一個綜合性狀，它包括一系列的評價指標。在豬的育種中，度量肉質性狀的主要指標包括以下內容pH值(pH1、pH2)、系水力(失水率、滴水損失、貯存損失、熟肉率)、肌內脂肪含量、嫩度(剪切力)、大理石紋、肉色、肌纖維直徑等。肉質性狀的遺傳行為不是孤立的，肉質性狀之間往往也存在著表型和遺傳上的相關。
Lo等(Lo等，Genetic analyses of growth，real-time ultrasound，carcass，and pork quality traits in Duroc andLandrace pigs，II.Heritabilities and correlation，J Anim Sci.，1992 Aug，70(8)2387-96)對豬肉品質的研究表明背最長肌的含水量與肉的嫩度、風味、整體可接受性呈負相關，而保水性與這三個性狀呈正相關；肌肉剪切力值與所有感觀品質呈較強的負遺傳相關；肌內脂肪含量與所有感觀品質呈較強的遺傳相關，說明了肌內脂肪對感觀品質有重要的作用。Gregory等(Gregory等，Genetic and phenotypic(co)variances forgrowth and carcass traits of purebred and composite populations of beef cattle，J Anim Sci.1995 Jul，73(7)1920-6)發現肉的大理石紋評分與背最長肌脂肪含量呈高度正遺傳相關(rg＝0.98)，與嫩度呈較高的負遺傳相關(rg＝-1.00)。
近10年來，分子遺傳學和分子生物技術有了突飛猛進的發展，利用基因組掃描和候選基因策略在不同的資源家系里，已經鑒別了一些影響豬肉質性狀的主效基因及QTLs等分子遺標標記。例如1)HAL基因、豬氟烷基因，是豬第6號染色體上影響肉質的主效基因(major gene)，Webb等(webb等，Role of the halothane test in pig improvement，Pig News and Information 1981，2(1)17-23)、Nystrom等(Nystrom等，Halothane gene effects on reproduction，production and organ weights inpigs，Acta Agric，Scandinavica Section A-Animal Sci，1993，43(4)201～206)；蔣思文等(蔣思文等.氟烷敏感性與繁殖性能關系的研究，中國畜牧雜志，1995年，第33卷，第5期，20-21)均有報道，氟烷基因型NN、Nn和nn之間在肉色、pH值、保水性都存在顯著或極顯著的差異，Nn的生產性能均介于NN和nn之間。
2)RN基因影響腌制火腿產量(Rendernent Napole yield)的肉質主效基因，包括突變的顯性RN-和正常的隱性rn+兩個等位基因，其中RN-對肉質具有顯著的影響Le Roy等(Le Roy等，Evidence for a newmajor gene influencing meat quality in pigs，Genet Res，1990，Feb，55(1)33-40)，RN基因現已定位于豬的第15號染色體上。
3)CAST基因、鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)是一種特異的內源性鈣激活蛋白酶(鈣蛋白酶)抑制因子，參與肌肉生長和蛋白質更新過程，在各肉畜中顯著影響肉嫩度。Ernst等(Ernst等，Mapping ofcalpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1-q2.4，Anim Genet，1998，Jun，29(3)212-5)在豬的2號染色體上發現5個與CAST基因連鎖的微衛星標記(S0010、S0226、SW395、SW776和SW14)，進一步將其定位于2q2-q2.4。
4)其他基因，例如Paszek等(Paszek等，Livestock variation of linked microsatellite markers in diverseswine breeds，Anim Biotechnol，1998，9(1)55-66)初步認為15號染色體上存在肌肉嫩度的假定QTL，4號染色體上有與肉色和肉的硬度相關的基因區域(Rothschild，.Association of PIT1 polymorphisms with growth andcarcass traits in pigs，J Anim Sci，1995，May，73(5)1282-8)。
Fox基因即Forkhead，此名稱來源于果蠅的“叉頭突變”，這種突變導致腸的前后部發育缺陷。目前已發現90多個Fox基因，都具有Forkhead保守區，廣泛存在于從酵母到哺乳類的真核生物中，形成了龐大的轉錄因子家族。位于PI3K/AKT信號通路下游的一系列的Foxo轉錄因子可以調節IGF-1的作用，它們屬于forkhead轉錄因子的一部分.哺乳動物細胞含有該家族的三個成員，FOXO1(FKHR)，FOXO3A(FKHRLl)、FOXO4(AFX)(參見文獻Tran等，The many forks in FOXO’s road.Science’s STKE，10.1126/stke，2003，172.re5)。AKT通過三個保守的氨基酸殘基的磷酸化使這三個基因喪失功能，并使它們位于細胞質遠離目標基因(Brunet等，Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor，Cell 1999，96857-868)。Foxo因子的去磷酸化可以使它們進入核內，進而使細胞生長受阻，凋亡(Ramaswamy et al.A novel mechanism of gene regulation and tumor suppression by the transcriptionfactor FKHR.Cancer Cell 2002 281-91).目前，人、小鼠和大鼠FOXO3A基因的cDNA全長已被克隆和測序。人的FOXO3A基因，也就是forkhead box O3A它有兩個不同的轉錄本，它被定位于人的6q21，基因組序列全長120，943bp。小鼠FOXO3A基因定位于10號染色體，cDNA序列長2,889bp，有4個外顯子。大鼠FOXO3A基因cDNA全長為3,058bp。FOXO3A基因在人的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、子宮、胎盤、卵巢中都表達，在肌肉、卵巢、脾中表達量頗高；FOXO3A基因在小鼠的脾、胸腺中表達較高；該基因在大鼠中僅在胎盤和結腸中表達；對人、小鼠、大鼠的FOXO1、FOXO3A和FOXO4三個基因的氨基酸序列的比較分析結果表明這三個基因有很高的序列同源性，說明這三個基因是由一個祖先基因的重復(Duplication)產生的。
肉質性狀的遺傳力的估計除了受群體規模的影響外，還與群體的結構有很大關系，更重要的是肉質分析中肉質指標缺乏統一的分析標準，因此，各種肉質性狀遺傳力的估計值在國內外研究中都存在一定的差異。但從總體上看，不同肉質性狀的遺傳力差異明顯，且基本上屬于中等或偏低的遺傳特性，從遺傳上改良肉質品質是可行的。而且肉質性狀間的遺傳相關較高，在對肉質性狀進行選擇時，必須考慮它們之間的內在聯系。
由于肉質的研究需要結合屠宰后的表型數據，使得這種研究相對生長性狀和繁殖性狀顯得更為困難。但由于這種研究的結果一旦應用于實際生產將獲得巨大的經濟效益和社會效益。利用豬的生化指標和蛋白質的多態性與肉質性狀間的相關，可以尋找有用的輔助選擇遺傳標記，從而為動物的早期選擇及間接選擇提供科學的參考依據。但生化指標因受環境和個體體況等多種偶然因素影響非常大，這就使得人們轉向尋求更可靠遺傳標記。
近年來，利用DNA標記定位畜禽經濟性狀的研究已全面展開，尤其在豬的生長、胴體品質等方面的研究已取得了重大的進展，但是利用分子標記對影響肌肉品質的QTL的研究還較少。因此，構建畜禽的基因圖譜并尋找出與肉質性狀QTL相連鎖的分子遺傳標記將是今后從分子水平研究肉質遺傳行為的重要內容。綜上所述，國內外育種工作者對豬肉質的遺傳特性、遺傳規律等方面都作了較全面的研究，尤其是進入九十年代以來，由于現代生物技術的不斷發展，使得人們對重要經濟性狀的基因定位、尋找與經濟性狀相連鎖的DNA標記以及利用DNA標記輔助選擇成為可能。然而肉質的研究是一個十分復雜的問題，它受很多因素的影響，因此，我們必須深入研究豬肉肉質的遺傳機制，探明它的遺傳特性、遺傳規律，才能在生產中培育出品質優良、經濟性能良好的豬新品種或新品系。

發明內容
本發明的目的在于克隆豬肉質性狀基因FOXO3A，尋找FOXO3A基因的突變位點以及作為豬肉質性狀基因多態性的檢測方法，為標記輔助育種提供一種有用的分子標記。
本發明是這樣實現的一種豬肉質性狀基因FOXO3A，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述，該序列全長為1153bp，編碼383個氨基酸。
所獲得的FOXO3A基因cDNA序列中有1個如序列表SEQ ID NO1所述的T77-C77的堿基突變，導致AvaII-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多態性。
一種制備豬肉質性狀FOXO3A基因DNA序列的方法，它按照以下步驟用人FOXO3A基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性90％以上的表達序列標簽(EST)；然后拼接豬EST-重疊群；根據EST-重疊群設計2對引物，其中1對引物用于3’RACE擴增；另外1對引物用于PCR擴增，對獲得的PCR產物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申請人應用上述PCR-RFLP方法對豬FOXO3A基因第77位的堿基突變進行了檢測。
以下對本發明作進一步的描述1、FOXO3A基因的3’非翻譯區的克隆(1)引物設計用人FOXO3A基因cDNA(GenBank收錄號NM_001455)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數據庫中做同源序列篩選，獲得一系列相似性為90％以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構建豬EST-重疊群。根據EST拼接序列設計3’RACE引物，序列如下
外側引物3’-RACE-F15’GACTTGGACCTGGACATGTTCAACGAG 3’巢式引物3’-RACE-F25’TCCATTATCCGTAGCGAACTCA 3’(2)RACE反應1)cDNA第一鏈的合成在0.5ml管中加入3′RACE cDNA第一鏈的合成的試劑，具體如下3′RACE3μl(1μg)總RNA，1μl 3′-CDS引物和1μl去離子水將上述試劑混勻后稍加離心，于70℃溫育2min使總RNA二級結構消除，迅速置于冰上冷卻2min，稍加離心將試劑集中到管底；往上述管中分別加入2μl 5×第一鏈緩沖液、1μl 20mmol/L DTT、1μl 10mmol/LdNTP和1μl PowerScript反轉錄酶，混勻并離心，于42℃溫育1.5hr進行第一鏈的合成。反應結束后，加入100μl Tricine-EDTA緩沖液，在72℃加熱7min，然后置于-20℃保存。
2)RACE-PCR方法建立在干凈的0.5ml管中按表1所示的體系加入PCR主要試劑、引物及PCR模板DNA，總體積50μl。將所有成分混勻即可進行RACE-PCR。PCR擴增采用降落PCR程序，如下5個循環(94℃ 5s，72℃ 3min)，5個循環(94℃ 5s，70℃ 10s，72℃ 3min)，25個循環(94℃ 5s，68℃ 10s，72℃ 3min)。產物通過1.2％瓊脂糖電泳檢測。
表1PCR反應體系

(3)3’RACE產物的純化、克隆和測序RACE產物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300μl融化的凝膠中加入1ml Resin(樹脂)，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使漿液通過Minicolumn(裝有樹脂的小過濾柱)擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
連接反應將純化PCR產物與pGEM-T載體(購自Promega公司)連接，連接反應總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T載體，0.5μl的純化PCR產物，0.5μl的T4連接酶，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態細胞的制備從37℃培養了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養3h，轉接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37℃振蕩培養約4h，待OD600達到0.3-0.4時，將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉入離心管中于4℃ 4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30 min，重復4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存備用。
轉化無菌狀態下取100-120μl感受態細胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養。
(4)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數據庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
2.物理定位(1)用于物理定位的引物序列是FOXO3A-PPL 5′-TGTTCATCCTCCTTCCCGTTGC-3′PR 5′-CACAGGCGTGAACGCTTGAGA-3′該引物擴增片段長度為95bp。
(2)用于物理定位的實驗材料用豬×嚙齒類體細胞雜種板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)進行染色體區域定位，用美國Minnesota大學共同構建的豬輻射雜種板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)進行染色體精確定位，兩套體細胞雜種板均由法國Martin Yerle博士(Laboratoire de GénétiqueCellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠贈。
其中SCHP包括27個體細胞雜種細胞系，1-19號是豬×倉鼠體細胞雜種細胞系，20-27號是豬×小鼠體細胞雜種細胞系，并以倉鼠、小鼠和豬基因組DNA作為陽性對照。經細胞遺傳學鑒定該雜種板保留了豬的除Y染色體外的全部18條常染色體以及X染色體，其中含有127個非重疊的染色體區域，各細胞系中所包含的豬染色體及染色體片段信息可從WWW(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/per/pcr.htm)獲得。
IMpRH使用的輻射劑量是7,000-rad。IMpRH包括118個豬×倉鼠輻射雜種細胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標記的鑒定結果表明IMpRH中的平均標記存留率為29.3％，包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用于估計標記間距離的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理論分辨率是145kb。
(3)PCR分型條件進行擴增的PCR反應總體積為15μl，其中模板DNA為20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 3min，循環35次94℃ 30s，60℃ 30s，然后72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反應產物用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列FOXO3APL1 5′-GGAGGTGATGTTGGAGTTGG-3′PR2 5′-CTGATATGATGAGCCGAAGG-3′該引物擴增片段長度423 bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應總體積20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 4min，循環34次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。
(3)RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR產物3-5μl，限制性內切酶AvaII為0.5μl(5U)，用H2O補足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
4.標記性狀關聯分析在利用我室組建的通城豬群做性狀關聯分析，219個DNA樣品用于基因型檢測。所分析的性狀有部分生產性能，部分肉質性狀。運用SAS Vergion8.1軟件中GLM程序按以下模型進行基因型和性狀間的關聯分析，分析有兩個步驟，先建立如下模型剔除所有系統效應Yijkl＝μ+Bi+Sj+Ck+εijkl其中，Yijkl是性狀觀察值，μ為總體均數，Bi為批次效應，Sj為性別效應，Ck為組合效應，εijkl為隨機誤差，假定服從N(0，σ2)分布。用最小二乘分析獲得每一個體的殘差，以殘差做為新的性狀值進一步進行基因型的單因素方差分析及多重比較檢驗。
Yij＝μ+GENOTYPEi+eij其中，Yij是性狀觀察值，μ為總體均數，GENOTYPEi為基因型效應，eij為隨機誤差本發明的效果是1、豬FOXO3A基因的3′RACE克隆結果以cDNA第一鏈為模板，用3′RACE外側引物進行PCR擴增，再用第一輪的擴增產物做模板，用3′RACE巢式引物進行擴增，產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯述為特異的PCR產物(如圖4所述)。將3′RACE產物回收純化后克隆測序，測序結果顯示該片段長度為1042bp。
2、豬FOXO3A基因的定位結果用FOXO3A-P引物在SCHP中分型結果表明，19個豬×中國倉鼠體細胞雜種細胞系(1-19號)中，2、4、7-9、16、18、19號出現與豬基因組DNA陽性對照擴增一致的95bp的目的片段，而在8個豬×小鼠體細胞雜種細胞系(20-27號)中，22、24、25號雜種細胞系均擴增得到95bp的目的片段。將上述實際觀測的PCR分型數據提交給HybWeb(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/pcr/pcr.htm)進行統計分析以獲得區域定位信息，數據分析結果是FOXO3A基因定位于豬1號染色體上(P＝1.000)，進一步的區域定位結果為SSC 1p13(P＝0.8901，與該區域標記間的相關系數為0.8528，P＜0.1％)。
用FOXO3A-P引物在IMpRH分型結果是0000000011 0100000110 0010101001 0000000001 00000010000100000111 0100000010 1010000000 0000101011 0001000011 0010100010 11011111(其中0和1分別表述擴增結果為陰性和陽性)。統計分析結果，FOXO3A基因與豬1號染色體上的SW301緊密連鎖，LOD值為14.72，RH圖距是0.26Ray，其次與SW781緊密連鎖，LOD值為10.08，RH圖距是0.42Ray，進一步證實該基因位于豬1號染色體上。
3、PCR-RFLP診斷方法建立用FOXO3A-PL1和FOXO3A-PR1擴增豬基因組DNA得到1153bp特異擴增片段，包括部分外顯子2序列(詳見圖3)。測序的結果發現在該1153bp片段中存在AvaII酶切位點(G*G(A/T)CC)，其中第77bp處為多態性切點，位于外顯子2中，其編碼氨基酸為蘇氨酸，用FOXO3A-PL1和FOXO3A-PR2擴增豬的FOXO3A基因獲得長度為423bp的PCR產物，酶切產生三種基因型，基因型BB型有347bp和76bp兩條帶，AA型只有423bp的一條帶，雜合子AB型有423bp，347bp和76bp三條帶。(其中76bp的條帶在圖中看不到)4、標記性狀關聯分析對豬FOXO3A基因第2外顯子AvaII-RFLP多態性位點與部分胴體、肉質性狀進行關聯分析，基因型檢測結果表明在219個個體中AA基因型有93個，AB基因型有108個，BB基因型有17個(由于個別測定性狀的數據缺失，因此得到的實際值如表2所示)，所得到相關的性狀是胴體斜長、6-7膘厚、滴水損失。
由表2可知，A等位基因是胴體斜長和6-7膘厚性狀的有利標記(胴體長、背膘薄)，M基因型標記可用于同時提高體長和降低背膘厚的選擇標記。
表2FOXO3A基因多態性對胴體斜長、6-7膘厚、滴水損失的影響

注小寫字母表不5％水平差異顯著，大寫字母表不1％水平差異極顯著


序列表SEQ ID NO1是本發明與豬肉質性狀相關的FOXO3A基因cDNA序列。
圖1是本發明關于FOXO3A基因制備的流程圖。
圖2是本發明中豬FOXO3A基因3’非翻譯區序列。圖中定位引物FOXO3A-PPL，PR的序列用邊框顯示。
圖3是本發明中豬FOXO3A基因DNA序列，擴增引物序列FOXO3APL1，PR1，PR2用下劃線標注。
圖4是本發明中豬FOXO3A基因3’RACE的擴增結果的電泳圖譜(瓊脂糖膠濃度為1.5％)。圖中M泳道DNA分子量標記(2000bp ladder)圖5是本發明中豬FOXO3A基因第二外顯子的擴增序列的電泳圖譜，片段大小為1153bp。圖中M泳道DNA分子量標記(100bp ladder)圖6是本發明中豬FOXO3A基因第二外顯子的AvaII-RFLP的三種基因型(AA AB BB)電泳圖譜。圖中M泳道DNA分子量標準(100bp ladder)具體實施方式
實施例1PCR-RFLP-AvaII多態性在各豬品種中的分布情況利用PCR-AvaII-RFLP檢測了六個豬種其中屬于中國地方血緣的豬種分別是小梅山，通城豬，大花自豬，江西玉山豬，屬于外來的例如歐美血緣的豬種分別是杜洛克豬和大白豬，這些豬種基本涵蓋各豬種的基因型。試驗使用的豬種的基因頻率如表3所示，發現玉山豬中等位基因A和等位基因B的頻率接近，其余幾個豬種均等位基因A占優勢。
表3FOXO3A基因PCR產物基因型頻率及基因頻率

幾個品種間基因型頻率的卡方檢驗結果如表4。x2檢驗六個豬種間基因型頻率差異性發現，通城豬和玉山豬存在顯著差異與大花白存在極顯著差異，大白和小梅山存在顯著差異與杜洛克存在極顯著差異！表4FOXO3A基因的PCR-AvaII-RFLP基因型分布x2檢驗結果

注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01Note*indicates P＜0.05；**indicates P＜0.01實施例2豬標記性狀關聯分析對豬FOXO3A基因第2外顯子AvaII-RFLP多態性位點與部分胴體、肉質性狀進行關聯分析，基因型檢測結果表明在219個個體中AA基因型有93個，AB基因型有108個個體，BB基因型有17個(由于個別測定性狀的數據缺失，因此得到的實際值如表5所示)，在與部分生產性狀進行關聯分析中，所分析的性狀有部分生產性狀和肉質性狀，所相關的性狀是胴體斜長、6-7膘厚、滴水損失。
由表5可知，A等位基因是胴體斜長和6-7膘厚性狀的有利標記(胴體長、背膘薄)，AA基因型標記可用于同時提高體長和降低背膘厚的選擇標記。
表5FOXO3A基因多態性對胴體斜長、6-7膘厚、滴水損失的影響

注小寫字母表示5％水平差異顯著，大寫字母表示1％水平差異極顯著序列表<110>華中農業大學<120>豬肉質性狀FOXO3A基因的克隆及其應用<130>
<141>2005-11-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1153<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>CDS<222>(3)..(1151)<223>
<220>
<221>mutation<222>(77)..(77)<223>
<400>1ca gac gac agt ccc tcc cag ctc tcc aag tgg ccc ggc agc ccc acg47Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr1 5 10 15tcc cgc agc agc gat gag ctg gac gcc tgg aca gac ttc cgc tcg cgc 95Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg20 25 30acc aat tcc aac gcc agc acg gtc agc ggc cgc ctg tcc ccc arc ctg 143Thr Asn Ser Asn Ala Ser Thr Val Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Leu35 40 45gcc agc aca gag ttg gat gac gtc cag gat gac gac gcg ccg crc tcc 191Ala Ser Thr Glu Leu Asp Asp Val Gin Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser50 55 60ccc atg ctc tac agc agc tcg gcc agc ctg tcc ccc tcg gtc agt aag 239Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys65 70 75ccc tgc acc gtg gag ctg ccc cgg ctg acc gac atg gcc gga acc atg 287Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met80 85 90 95
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權利要求
1.一種豬肉質性狀基因FOXO3A，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根據權利要求1所述的基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
3.根據權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所獲得的FOXO3A基因序列長度為1153bp，編碼383個氨基酸。
4.根據權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所獲得的FOXO3A基因cDNA序列中有1個如序列表SEQ ID NO1所述的T77-C77的堿基突變，導致AvaII-RFLP多態性。
5.制備如權利要求1或2所述的DNA序列的方法，按照以下步驟用人FOXOSA基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性90％以上的表達序列標簽(EST)，然后拼接豬EST-重疊群，根據EST-重疊群設計2對引物，其中1對引物用于3’RACE擴增；另外1對引物用于PCR擴增，對獲得的PCR產物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
6.應用PCR-RFLP方法檢測豬FOXO3A基因第77位的堿基突變。
全文摘要
本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及豬FOXO3A基因的克隆以及作為分子標記的應用。本發明克隆的豬肉質性狀基因FOXO3A序列如SEQ ID NO1所示，序列長度為1153bp，編碼383個氨基酸。在SEQ ID NO1序列中有1個如序列表所示的T77－C77的堿基突變，從而導致AvaII－RFLP多態性，可以應用于豬肉質性狀的關聯分析。本發明克隆的基因為豬的標記輔助育種提供了新的分子標記。
文檔編號C07K14/47GK1978641SQ20051001991
公開日2007年6月13日 申請日期2005年11月29日 優先權日2005年11月29日
發明者趙書紅, 于晶, 朱猛進, 李奎, 劉榜, 樊斌, 余梅, 李長春 申請人:華中農業大學