自組裝的肽兩親物和用于生長因子傳遞的相關方法

專利名稱：自組裝的肽兩親物和用于生長因子傳遞的相關方法
專利說明自組裝的肽兩親物和用于生長因子傳遞的相關方法 本申請要求2003年12月5日提交的申請序列號為60/527,504的優先權權益，該申請通過參考整體并入本文。由于美國能源部對西北大學(Northwestern University)的資助(資助號DE-FG02-00ER54810)，美國政府對該發明擁有某些權利。
背景技術：
生長因子在細胞特化中發揮著重要作用，并且是在體內有希望控制干細胞分化或重新激活休眠的生物過程的因子，這兩者都可能導致無功能組織的再生。生長因子從細胞位點或損傷處快速降解并迅速擴散掉。因此，一種結構(architecture)或支架(scaffold)可用于將生長因子保留在這樣的位置，以便以可控的方式釋放到周圍的細胞。
在分子水平設計的用于組織再生的材料在高端醫學領域中正在引起人們的極大興趣。合成的聚合物和生物聚合物的支架已經被研究，所述合成聚合物包括基于L-乳酸或乙醇酸的聚合物，所述生物聚合物包括膠原、纖維蛋白或藻酸鹽。生長因子已經通過物理的方法被捕獲到水凝膠這樣的聚合物中，共價連接到或利用靜電結合到陰離子聚合物或者結構諸如肝素上。這些系統和相關系統的缺陷或者涉及對結合的生長因子的非特異性，或者涉及需要降解共價鍵以獲得期望的效果。最近，已經對天然和合成支架進行了修飾，以含有在胞外蛋白質中發現的肽，其促進以受體為基礎的與細胞的相互作用并且已經被用于促進細胞粘附或分化。
在自組裝中的進展為生物材料的分子設計提供了新的機會。兩親性分子組裝單元(building blocks)可以在含水環境中被組裝，形成具有明確限定的和多樣的化學結構的支架。在文獻中已經報道了各類基于肽的兩親物，包括兩親肽和在一端或兩端用疏水性組分(例如，烷基尾(alkyl tails))功能化的肽。兩親肽已經顯示出可以形成各種超分子結構，比如納米帶(nanotape)、帶(ribbons)、纖維和扭帶(twisted ribbon)。這些結構源于在兩親性分子之間β-片層的形成。特殊的例子是兩親肽嵌段共聚物，其形成具有強烈依賴于各個肽嵌段二級結構的特性的膠。在一端攜帶有烷基尾的肽兩親物的例子包括衍生自膠原中發現的肽模體(motif)的兩親物，其導致形成三螺旋單元，三螺旋單元形成球狀或盤樣膠束結構，這取決于尾的長度和尾的數量。另一類型具有兩個尾，每個末端一個。這類兩親物顯示出淀粉樣行為，因為一旦增加濃度，它們便從隨機的卷曲轉變為β-片類型的構象，導致形成纖維狀結構。已有反向平行排列的純肽納米結構的報道，有一個報道報道了兩個修飾的肽兩親物，其在非天然的烷基化季銨鹽的促進下以反平行排列的方式聚集。
一類肽兩親物(PAs)公開在兩個同時在審申請中的其中一個或兩個中，所述肽兩親物包括連接到肽單元(peptide block)的線性疏水尾，所述肽單元包括β-片形成片段、溶解性所需的帶電荷殘基，和生物學表位。烷基尾被連接到肽的N-端，表位片段被置于C-端。一旦應用觸發因素(trigger)，諸如pH或離子濃度變化，這些PA分子可以在含水介質中自組裝成納米纖維。烷基鏈位于纖維的核心，表位展示在周圍，用于細胞相互作用。已被摻入到PA分子中的表位模擬胞外基質蛋白，并通過細胞信號傳導促進細胞粘附或分化。也已經顯示，具有不同的表位和互補電荷的兩種不同的PA分子可以被共組裝成同樣的納米纖維。參見2003年2月18日提交的同時在審申請序列號10/368,517(國際公開號WO 03/070749)和2002年11月14日提交的申請序列號10/294,114(國際公開號WO 03/054146)，它們每一個都通過參考整體并入本文。
然而，這樣的PA化合物通常通過固相合成制備而得，肽組分由C-端至N-端產生。疏水組分與N-端的連接，提供了在所得到的膠束納米纖維組裝物(micellarnanofiber assembly)的外圍具有自由酸或酰胺基團的PA化合物，由于各種表位或肽序列常常需要自由的N-端以實現生物活性，這樣的PA化合物對于生長因子相互作用將是無效的。
發明概述
根據前面的描述，本發明的目標是提供兩親性肽化合物、其組裝的組合物和/或其用于影響各種生長因子的生物利用度的相關方法，從而克服了現有技術的各種不足和缺點，包括前面提到的那些不足和缺點。本領域技術人員理解的是，本發明的一個或多個方面可以滿足某些目標，而一個或多個其他方面可以滿足其他的目標。從全面考慮的話，不必每一個目標都等同地適用于本發明的每一個方面。因此，對于本發明的任一方面，下面的目標可以看作選擇。
本發明的一個目標是提供兩親肽化合物，該化合物包括在其N-端連接著許多表位序列中的一個或多個表位序列的肽組分，所述表位序列能夠與一種或多種生長因子發生非共價相互作用，這樣的表位可以包括噬菌體展示方法的識別產物或衍生自噬菌體展示方法的識別產物。
本發明的另一個目標是提供包括由一個或多個前述兩親肽化合物形成的組裝物(assembly)的組合物，用于呈遞連接到其上的表位結合序列，這樣的組合物可以包括缺少此類表位序列的其他兩親肽化合物。
本發明的目標也可以是提供進一步包括對應于被連接的表位序列的一個或多個生長因子的一種或多種前述組合物，此類組合物能夠進行自組裝，用于生長因子傳遞和釋放。
本發明的目標也可以是提供前述兩親肽化合物的一種或多種組合組裝物(compositional assemblies)，以及其用于影響生長因子生物利用度和/或干細胞分化的用途。
通過本概述和下面某些實施方案的描述，本發明的其他目標、特征、益處和優點將變得明顯，并且對于具有用于生長因子傳遞的肽組合物和支架或結構的知識的本領域技術人員來說將是非常明顯。從上面的描述以及隨附的實施例、數據、附圖和所有可從中獲得的合理推論——單獨考慮或者與并入本文的參考文獻一起考慮，這些目標、特征、益處和優點將變得明顯。
部分地，本發明可以涉及包括肽組分和疏水組分的兩親肽化合物，肽組分包括噬菌體展示方法中的生長因子識別產物。一種或多種此類識別產物在肽組分的N-端附近或接近N-端處直接與肽組分偶聯或鍵合，疏水組分在肽組分的C-端附近或接近C-端處直接與肽組分偶聯或鍵合。此識別產物可以選自提供與生長因子的一種或多種結合相互作用的表位序列，這樣的產物/序列和相應的生長因子包括但不限于在下面更充分描述的那些。本發明的化合物和/或其肽組分可以基本上是線性或分支的，此類分支構型和其制備如在共同在審的申請“Branched PeptideAmphiphiles，Related Epitope Compounds and Self-Assembled Structures Thereof”中公開的，其在2004年12月6日與本申請一起提交，該專利通過參考整體并入本文。
部分地，本發明也可以涉及包括許多此類兩親肽化合物的組合物，每一種化合物的肽組分在生理pH時具有凈電荷。此類組合物還可以包括許多在生理pH時具有互補的凈電荷的兩親肽化合物，此種化合物缺少生長因子識別產物，這樣，此種化合物的氨基酸序列相比包括識別產物的化合物的相應氨基酸序列，具有更短的長度或更少的數量。結果，此類化合物的膠束組裝物，在合適的介質中，提供了一種或多種識別產物的增強的提呈，所述識別產物從膠束組裝物的大概外圍延展開來。此種被增強的提呈可以用于影響和/或控制一種或多種生長因子的生物利用度。因此，本發明的各種組合物和其相關的方法可以被用于干細胞環境，以便與一種或多種生長因子非共價相互作用或結合，無論該生長因子是由干細胞產生的，還是與一種或多種前述組合物一同被傳遞到細胞環境中的。
不論任何組成用途或應用，取決于期望的柔性、電荷和/或分子間相互作用的或結合的能力，本發明的肽兩親物可以包括具有各種不同長度或序列的肽組分。此種化合物的疏水組分也可以變化(例如約C6至大于約C22的烷基或取代的烷基，飽和的或不飽和的，等等)，此組分僅僅受所得的兩親性特征和對此類化合物的組合物或組裝物的影響限制。
本發明的一個實施方案是組合物，其包括每一個都具有結合表位(bindingepitope)的肽兩親物和沒有結合表位的填充肽兩親物的混合物。該混合物能夠形成自組裝的納米纖維或其他膠束，其由填充肽兩親物和具有結合表位的自組裝的肽兩親物組成。組合物中的肽兩親物具有烷基尾部分、β片部分和帶電荷的部分。優選地，具有結合表位的肽兩親物上的表位具有來源于噬菌體展示方法的序列，并且比填充肽兩親物長。
本發明的另一實施方案是自組裝納米纖維或其他自組裝膠束的組合物或系統，其包括具有結合表位的肽兩親物和填充肽兩親物。帶有結合表位的肽兩親物優選比填充肽兩親物長。在自組裝結構中，具有結合表位的肽兩親物優選從自組裝納米纖維或膠束的表面突出來。優選地，具有結合表位的肽兩親物能夠與生長因子或其他肽、氨基酸或核酸通過非共價鍵發生相互作用，更優選地，生長因子和表位之間的非共價鍵相互作用不會與生長因子與胞外受體的結合競爭。
自組裝的納米纖維或膠束的組合物可以構成水凝膠，其可以進一步包括非共價結合到具有結合表位的納米纖維肽兩親物上的生長因子。這樣的生長因子可以在體外加入，或可以是體內患者損傷位置的那些生長因子。與自組裝的肽兩親物相互作用的生長因子可以包括但不限于骨形態發生蛋白、轉化生長因子、血管內皮生長因子、神經營養蛋白和促有絲分裂因子如FGF-2、shh(Sonic hedgehog)蛋白和Wnt蛋白。在納米纖維水凝膠中，組合物可以包括細胞諸如但不限于干細胞。優選地，通過與胞外受體的相互作用或通過納米纖維基質的降解，與自組裝的肽兩親物發生非共價相互作用的生長因子被釋放到周圍組織或細胞。除了細胞，其他治療用化合物也可以被封裝在水凝膠中或結合到水凝膠上。在納米纖維水凝膠內，這些化合物可以包括但不限于消炎劑、化學治療劑或它們的組合。優選地，通過與胞外受體的相互作用或通過納米纖維基質的降解，與自組裝的肽兩親物非共價相互作用的生長因子被釋放到周圍組織或細胞。
本發明的另一實施方案是制備自組裝的肽兩親物納米纖維或膠束的方法，包括通過混合或合并具有結合表位的肽兩親物和填充肽兩親物進行自組裝，其中所述具有結合表位的肽兩親物長度上比所述填充肽兩親物長。通過加入多價離子，加入帶互補電荷的肽兩親物，或通過脫水，或加入酸或堿到肽兩親物中，可以形成納米纖維或膠束。在形成水凝膠的情形中，優選通過加入多價離子或在細胞介質或體液中已經存在的離子，形成膠束或納米纖維。優選地，具有結合表位的肽兩親物具有通過噬菌體展示方法獲得的序列。
本發明的另一實施方案是治療組織的方法，包括給予需要使組織再生的患者的某一位置以納米纖維或其他自組裝膠束，所述納米纖維或其他自組裝膠束包括攜帶用于非共價結合到生長因子的表位的肽兩親物。納米纖維和它們的水凝膠可以包括細胞諸如但不限于干細胞。除了細胞，其他治療化合物也可以封裝在水凝膠或結合到水凝膠。這些化合物可以包括但不限于消炎劑、化學治療劑或這些的組合。優選地，通過與胞外受體的相互作用或通過基質的降解，與自組裝結構非共價結合的生長因子被釋放到所述位置。優選地，含有生長因子和/或干細胞的自組裝膠束或納米纖維被施用到帶有損傷的患者的某一位置，諸如但不限于損傷的骨、軟骨、脊髓、腦組織、神經或這些的組合。
本發明的另一實施方案是包括烷基尾部分的肽兩親物，所述烷基尾部分連接到形成β片的肽部分的第一端，所述形成β片的肽部分也具有第二端。肽兩親物的表位肽部分被連接到形成β片的肽部分的第二端，這樣，表位可用于與其他分子或蛋白質發生非共價相互作用。優選地，表位具有獲自噬菌體展示過程的序列。肽兩親物可以選擇性地包括帶電荷的部分，其具有兩端，在形成β片的部分的第二端和表位肽部分之間形成連接。
本發明的另一實施方案包括用于將生長因子釋放到細胞的組裝物或系統，其包括由自組裝的肽兩親物制備的支架，至少一部分的肽兩親物包括用于與生長因子非共價結合的肽表位，其中生長因子結合表位從納米纖維表面伸出。表位的氨基酸序列衍生自噬菌體展示過程。此支架也可以包括干細胞，可以用于使組織生長、使組織再生、或支持在患者中的組織移植的方法中。除了細胞，其他治療用化合物也可以封裝在支架的水凝膠中或結合到支架的水凝膠。這些化合物可以包括但不限于消炎劑、化學治療劑或它們的組合。該方法包括將支架插入患者的某一位置，或體內形成支架。支架包括具有用于與生長因子非共價結合的肽表位的自組裝肽兩親物，其中所述表位從支架的納米纖維表面突出，或通過噬菌體展示方法制備，并從支架將生長因子釋放到所述支架的周圍細胞。
被描述的結合生長因子的水凝膠在再生和移植醫學領域具有若干應用。所述組合物、制備方法和使用它們的方法，可以容易地擴展到肽兩親物上的針對其他生長因子的其他表位，因此可使廣泛種類的組織再生或支持患者中移植的組織。例如，因為BMP-2和TGF-β1分別在充質干細胞的造骨細胞和軟骨形成分化中發揮重要作用，本發明的自組裝的膠束可以被用于骨和軟骨的再生。第二，BMP-2也在腦和背脊髓的形成中發揮重要的作用。因此，所述凝膠也可以與神經干細胞聯合使用，用于損傷的脊髓的再生和/或在中風的情形中用于修復損傷的腦區域。
如上討論，在某些實施方案中，本發明利用混合的纖維的延伸途徑來摻入能夠通過選擇性非共價相互作用結合生長因子的PA。這樣，生長因子的生物利用度可以通過調整結合強度和結合位點的數量來進行調節。取決于結合的局部化效果(localizing effect of binding)或者導致生長因子失活的結合效果是否更占主導優勢，生長因子的起始濃度將或者被提高或者被降低。在任一情況下，生長因子的釋放都可以被維持較長的時期。為了促進結合表位被生長因子識別，可以制備表位從纖維表面延伸出來的PA。利用噬菌體展示，可以確定結合表位的必需氨基酸序列。為了示范性闡釋的目的，選擇的生長因子包括骨形態發生蛋白-2(BMP-2)和轉化生長因子β1(TGF-β1)。BMP-2等參與骨的形成以及腦和背脊髓的發育，而TGF-β1參與軟骨形成和平滑肌細胞的分化。相應的膠將被用于控制充質干細胞的分化。已經表明充質干細胞在體外和體內分化為各種譜系(lineages)比如骨、軟骨、脂肪、肌肉細胞和心肌。下面說明了在BMP-2的影響下，分化為骨譜系。
在控制充質干細胞分化為期望的成骨細胞系時，相對于將生長因子加入到介質中，凝膠是較優的。此外，結合凝膠(binding gels)最初抑制向所有其他譜系的分化。該行為被認為由降低的生長因子生物利用度導致，或者由細胞更具漸進性暴露于結合凝膠中的這些生長因子導致。最后，也在結合凝膠中發現了一些α-平滑肌表達。這表明，延長暴露于BMP-2或缺少推動分化完成的因子可能對該群體的同質性(homogeneity)具有負面影響。最終，當存在結合序列以調節其生物利用度時，內源性產生的BMP-2水平似乎是足夠的。
生長因子結合PAs與常規的填充PAs之間成功的共組裝使得能夠產生能夠結合生長因子，將它們保持在凝膠中并調節它們的生物利用度的水凝膠。相比那些在缺少結合PA時被分化的充質干細胞，當充質干細胞在攜有結合PAs的膠中被分化時，最初獲得了更加同質的特化細胞群。取決于它的應用，其他填充PA對于改變凝膠的物理特性可能是期望的，并且其他結合序列對于優化結合強度可能是需要的。此外，本發明示范的方法允許通過簡單地將多種結合PAs與填充物混合，摻入多種信號。更可能地，需要多種生長因子以進一步優化干細胞的分化。暴露于多種生長因子的充質干細胞的分化目前正在被研究。很可能地，通過選擇對生長因子具有不同的結合常數的結合物，可以實現多生長因子系統中的暫時釋放。此外，對描述的系統進行了體內研究。最后，在此提供的方法可以容易地延伸到與細胞募集、特化或維持有關的任何生長因子或蛋白，從而使它成為再生醫學中極有前景的方法。


圖1說明了包括表位序列的代表性的PA，以及用于與其組裝的互補PA。某些實施方案的詳細描述
本發明描述了基于自組裝的肽兩親物(PAs)的系統，該系統能夠通過特異性非共價相互作用來結合生長因子。生長因子在細胞信號傳導中發揮著重要作用，并因此在體內作為非常有用的因子可以用于控制干細胞分化、支持移植組織的整合，和/或特定的分子或生理過程，或重新激活休眠的生物過程，這些可以導致無功能組織的再生。在體內生長因子快速降解并從損傷位置迅速擴散掉。因此，需要這樣的一種支架，其將生長因子保留在損傷位置，以可控的方式將生長因子釋放到周圍的細胞。基于自組裝的肽兩親物的水凝膠已顯示出能夠實現胞外基質(ECM)的若干功能，即，促進細胞粘附和控制分化。本發明涉及用能夠以特異性的方式結合生長因子的肽序列修飾這些EMC替代物，所述生長因子包括但不限于骨形態發生蛋白-2(BMP-2)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、VEGF和IL-6。這些生長因子肽序列可以通過噬菌體展示技術獲得，偶聯到肽兩親物以形成結合肽兩親物(binding peptide amphiphiles)。結合肽兩親物和填充肽兩親物(filler peptideamphiphiles)可以自組裝形成水凝膠，其可以被塑造成一定的形狀，并用作組織修復的支架。可選擇地，結合肽兩親物和填充肽兩親物可以在體內或體外被引入細胞或組織樣品中，并在該樣品中自組裝成水凝膠。
如上討論，本發明的肽兩親物可以包括烷基尾、形成β-片的肽序列和生物活性肽序列。前兩個部分(blocks)形成膠束纖維，諸如但不限于納米纖維，其在合適的條件下(加入多價離子進行中和)，形成水凝膠或其它溶劑填充的濕凝膠。優選地，生物活性表位是部分帶電荷的，以獲得溶解性，但是該電荷可以隨寬范圍的序列如整聯蛋白結合序列、神經活性序列等而變化。而且，具有互補電荷的肽兩親物共同自組裝形成混合的纖維。該原理可以被用來制備由常規PAs和較長的攜帶生長因子結合表位序列的PAs組成的納米纖維，其中結合序列從纖維表面延伸出來。通過利用隨機化肽文庫的噬菌體展示——其使用組合選擇過程獲得強結合序列，獲得期望的生長因子結合序列。通過基質的降解、結合到胞外受體或它們的組合，生長因子的釋放將被誘發。
現有的技術是將生長因子捕獲在水凝膠中，將它們共價連接到聚合系鏈(polymeric tethers)內(WO 03/040336和美國專利公開號0020007217)，或通過靜電將它們連接到陰離子聚合物(WO 0/13710)或肝素(WO 00/64481)。該系留系統(tethered system)的缺點是制備復雜，并且可能發生生長因子不能接觸到胞外受體的情況。捕獲的生長因子和與陰離子聚合物復合的生長因子被相對快速地釋放，很難對持續釋放進行控制。例如，結合到陰離子聚合物的生長因子在8小時內被釋放。肝素結合系統是非特異性的(例如，有可能與血清中存在的因子發生不期望的結合)，并且局限于一部分(subset)的生長因子。有利地，本發明被設計成僅僅與期望的生長因子以一定的結合強度形成復合體，該結合強度足夠高以將生長因子保留在結合狀態，但是又足夠弱，弱到它不會競爭與胞外受體的結合。
本文描述的發明的一個方面是，它可以被用于利用噬菌體展示技術獲得結合生長因子的肽序列，以及隨后制備攜帶這些結合序列的肽兩親物。通過噬菌體技術制備的生長因子可以包括骨形態發生蛋白、轉化生長因子β1、神經營養蛋白和促有絲分裂因子FGF-2、shh(Sonic hedgehog)蛋白和Wnt-3a。這些生長因子蛋白被偶聯到更短的肽兩親物，以形成攜帶生長因子表位的較長的肽兩親物。這些攜帶生長因子表位的PAs，或結合肽兩親物，與較短的填充或互補填充PAs共組裝，產生結合表位從表面延伸出來的納米纖維，其隨后在加入多價離子或pH變化時可以形成水凝膠。然后，或者與封裝在水凝膠中的細胞諸如但不限于干細胞一起，或者單獨地，產生的水凝膠可以用作傳遞載體，用于體內組織再生。除了細胞，其他治療用化合物也可以封裝在水凝膠或鍵合到水凝膠。這些化合物包括但不限于消炎劑、化學治療劑或它們的組合。
噬菌體展示可以被用于產生針對特定目標的分子探針，并用于分析和操作蛋白-配體相互作用。噬菌體展示被用于測定將結合到目標分子諸如但不限于氨基酸、肽、生長因子、酶和各種核酸的氨基酸序列、肽或蛋白質。使用商業文庫，噬菌體展示可以在物理吸附到微量滴定孔板的目標分子如生長因子上實施。優選地，該文庫由噬菌體組成，其中，G3衣殼蛋白的N末端延伸有1至約13或更多個隨機的氨基酸，在該方式中每一種可能的氨基酸組合都存在。該文庫被暴露于目標分子諸如生長因子，然后非特異性結合的噬菌體用洗滌劑溶液洗脫。回收結合的噬菌體后，將該群體在例如大腸桿菌(E.Coli)中擴增，再重復該過程兩次，其中使用嚴緊性不斷增加的洗脫條件。結合噬菌體的最終群體得以很好的富集，可以對若干克隆的DNA測序，從而鑒定出展示在這些噬菌體上的氨基酸序列。隨后，可以進行ELISA分析，以評估分離出的克隆的相對結合強度。固態合成被用于制備肽，用于使用鑒定出的氨基酸序列制備結合肽兩親物。
在本發明的填充PAs和結合表位肽兩親物中的肽組分可以包括天然存在的氨基酸和人工的氨基酸。也考慮整合入人造氨基酸諸如β或γ氨基酸和那些含有非天然側鏈的氨基酸，和/或其他類似的單體諸如羥基酸，其效果是在這個方面中相應的組分是肽樣的，并且自組裝形成膠束諸如納米纖維。
本發明的各種肽兩親物可以用本領域技術人員熟知的制備技術合成，包括公開在前述的整入本文的出版物WO 03/054146中的那些技術，和對那些最初由Hartgerink等(參見例如J.D.Hartgerink，E.Beniash和S.I.Stupp，Science 294，1683-1688，2001)描述的方法的修改，該文獻也通過參考整體并入本文。也在本發明實踐中被考慮的是分支肽兩親物，對于它們，本發明的合成方法和表位可以被使用。分支肽兩親物可以使用前述的共同在審申請中公開的方法和組合物制備，該在審申請于2004年12月6日與本申請同時提交，其內容通過參考整體并入本文。具有結合表位的此類分支肽兩親物可以自組裝成納米纖維。分支肽兩親物將具有連接到形成β片的肽部分的第一末端的烷基尾部分，在第二末端連接到包括一個或多個肽分支的表位肽部分。該肽包括分支氨基酸和帶電荷的肽部分。分支的表位肽部分可以被連接到該肽兩親物的形成β片的肽部分的第二末端。分支肽的結合表位序列可以源自噬菌體展示過程。在這些參考文獻中闡述的合成方案可以用于本發明。肽兩親物可以是它們的充分質子化的形式、部分質子化的形式或作為酸或堿加成鹽。一般而言，此類肽兩親物可以通過標準的固相肽化學制備，如在前述的整合入本文的參考文獻中描述的或在本文中描述的。取決于期望的兩親物組成或肽序列，可以使用已知的程序和合成技術或其直截的修飾，對這些合成的方法進行修飾，如本領域技術人員知道的和意識到的。
填充肽(filler peptides)，圖1中顯示的類型的填充肽，優選在長度上比攜帶結合表位的肽兩親物短，以便由這些肽兩親物的組合自組裝的納米纖維中的生長因子結合表位從納米纖維的表面伸出。互補的填充肽兩親物具有來自氨基酸的側鏈基團，其通過酸堿或其他類型的鍵合與填充肽的那些側鏈基團發生相互作用。
來自噬菌體展示過程的肽序列可以被用作肽兩親物上的結合位置或表位，用于與肽和分子非共價結合，所述肽和分子包括但不限于生長因子、酶、核酸(RNA、DNA)和氨基酸。盡管噬菌體展示優選用于獲得表位序列，但也可以使用用于鑒定或測定結合表位的序列的其它互補方法，諸如但不限于酵母雜交系統。這些結合肽或表位可以被連接到形成β片的肽的自由端、帶電荷肽的自由端或間隔肽(spacerpeptide)的自由端。
肽兩親物設計可以包括簡單的疏水尾，其用于產生該分子的圓錐形狀的細長部分，以便該肽兩親物的自組裝。優選地，疏水尾是烷基鏈，其可以是各種尺寸的，但優選長度大于6個碳原子。烷基尾被共價結合到肽兩親物的形成β片的結構片段上。
β片肽結構片段可以被用于將所述尾基團共價偶聯到噬菌體肽；或帶電荷的肽、間隔肽和噬菌體肽；或帶電荷的肽和噬菌體肽。β片肽結構片段的一端與所述尾共價結合，它的另一端與各種肽的氨基酸序列結合。如果期望進行交聯，半胱氨酸氨基酸可以被用于任何片段中，但是優選用于結構性β片片段中。如果交聯是不期望的，其它疏水氨基酸諸如但不限于丙氨酸、絲氨酸或亮氨酸可以被用于該區域(例如SLSL或AAAA，如本文中更詳細描述的)。該無半胱氨酸的系統可能更適合于體內生物學應用，以控制納米纖維基質的降解速率。對該系統的SLSL修飾可被期望導致更緩慢的納米纖維自組裝，這可以被用來控制支架的體內組裝。不希望受到理論的限制，認為體積大的亮氨酸側鏈可能需要更多的時間來組裝成纖維。減緩的自組裝也可能在功能性的原位環境諸如手術室中具有更大的應用，在這種情況下納米纖維的延遲形成可能是有利的。形成β片結構的片段也可以包括由甘氨酸或其他氨基酸組成的柔性連接物。當該結構性片段包括疏水氨基酸時，它和烷基尾可以被看作疏水片段。當該結構性片段包括親水氨基酸時，它和親水頭基團可以被看作親水片段。
形成β片的單元優選包括那些可以相互作用以形成β片的疏水氨基酸和有助于構成基本上圓錐形狀的肽兩親物的疏水性氨基酸。對于伸出的肽兩親物，該單元中的氨基酸的數量可以被選擇，以提供比用于形成納米纖維的填充肽兩親物長的肽兩親物，以及為鍵合肽兩親物上的肽提供可及性(accessibility)。在該片段中可以有約4至約10個氨基酸，最優選約6個氨基酸。對于形成β片的片段，合適的氨基酸可以包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸和其它可以以類似的化學和結構方式用于肽兩親物中的非天然存在的氨基酸。帶電荷的片段存在于結合肽兩親物中，其賦予了該肽兩親物在含水環境中的溶解性，含水環境優選在患者的某一位點。帶電荷的肽片段可以包括提供這種溶解性和允許進行自組裝的那些氨基酸和它們的組合，并且為了改變肽兩親物的溶解性，不限于極性氨基酸諸如E或K和這些的組合。該片段中可以有約2至約7個氨基酸，優選有約3或4個氨基酸。該片段的第一端連接到結構肽，它的第二端被用于與來源于噬菌體展示方法的肽鍵合。間隔基團肽也可以被包含到肽兩親物中。該間隔可以包括氨基酸諸如但不限于S和G，該間隔可以包括1至約6個氨基酸。當在噬菌體上展示的肽具有自由的N-端時，用于肽兩親物的典型合成方案可以被修改以提供自由的N-端。這可以通過合成天冬氨酸衍生物來實現，天冬氨酸衍生物的側鏈可以用十二烷胺官能化。將該氨基酸偶聯到Wang-resin，這使得能夠通過經典的固態Fmoc-化學完成PA合成，而無需進一步將N-端官能化。自由的PA可以通過用95％TFA/2.5％水/2.5％三異丙基硅烷處理獲得。通過下述步驟可以除去殘留的TFA將PA溶解在3mM HCl，在室溫中平衡1小時，然后凍干。使用電噴霧質譜術可以確認是否成功地合成了這些分子。
利用體液中存在的離子和/或加入的離子/試劑來促進自組裝，攜帶有生長因子表位的肽兩親物可以在患者某位點處進行體內自組裝。可選擇地，攜帶生長因子結合表位的合適的肽兩親物的組合物被倒入模子(mold)中并自組裝，用來形成待被替代或再生的組織或骨的形狀的支架。模制的支架可以被插入需要修復或再生治療的患者中的某一位置處。在組織移植的情況下，攜帶生長因子結合表位的肽兩親物可以在模子中形成支持結構或基質，并在患者中用作移植的組織的支持物。肽兩親物納米纖維或其支架可以包括細胞諸如但不限于干細胞。其他治療用化合物可以封裝入水凝膠或與水凝膠鍵合。這些化合物可以包括但不限于消炎劑、化學治療劑或這些的組合。
攜帶有生長因子結合表位的肽兩親物與更短的β片結構肽-帶電荷的肽酸-作末端的填充肽兩親物的共組裝物可以被用來制備本發明的納米纖維和支架。不受限制地，攜帶有不同的生長因子結合表位的一種或多種肽兩親物可以被使用，并且多種填充肽兩親物可以被用于制備本發明的支架和納米纖維。相對于填充肽兩親物，在本發明的支架和納米纖維的制備中，攜帶有生長因子結合表位的肽兩親物的數量可以不受限制的變化。自組裝的膠束和納米纖維可以用NOE和FT-IR光譜、圓二色譜表征；納米纖維纖維網絡可以使用透射電子顯微鏡來可視化。
通過選擇表位的肽序列可以制備具有結合表位的肽兩親物，所述表位能夠通過非共價相互作用與生長因子或其他肽諸如但不限于氨基酸或核酸相互作用。生長因子或其他肽與攜帶結合表位的肽兩親物之間的非共價相互作用的程度被選擇，這樣，該表位不與胞外受體競爭生長因子或其他肽，或相比胞外受體該表位與生長因子或其他肽具有較小的結合親和力。被動釋放(passive release)實驗可以被用于表征以及隨后改變各種具有生長因子結合表位的納米纖維的親和力。該表征可以在預封閉的微量滴定板中，在含有生長因子的自組裝納米纖維凝膠上進行。這些凝膠可以通過下述步驟制備首先以合適的比例混合2％的PAs溶液，隨后用TBS以1∶1稀釋。然后可以加入生長因子，接著加入2當量的多價離子以誘發凝膠化和自組裝。可以分析上清液的生長因子含量，以評價此類凝膠的生長因子結合能力。
盡管對于組織生長和其他治療來說，結合表位對各種肽具有比附近細胞或組織的胞外受體小的親和力是優選的，但也考慮到，可能期望肽兩親物的結合表位強有力地化學結合于流體或細胞樣品中的肽、生長因子、酶或核酸或其他分子。在這種情況下，攜帶有合適的表位的結合肽兩親物可以自組裝并固定在表面上，以形成傳感器涂層或移除介質(removal media)。由這些強結合肽兩親物自組裝形成的水凝膠可以被模制，以便插入患者的某一位置處或用于過濾系統。水凝膠可以被用于除去某一位置諸如患者關節或腫瘤或患者體液中的目標肽，比如HGF或VEGF。
本發明實施例
下面的非限制性實施例和數據闡述了關于本發明的化合物、組合物和/或方法的各方面和特征，包括各種兩親肽化合物——有或無能夠與生長因子非共價相互作用的表位序列——的合成，此類化合物或組合物的自組裝，以及其影響生長因子生物利用度和干細胞分化的用途。與現有技術相比，本發明的化合物、組合物和/或方法是令人吃驚的、意想不到的和出乎意料的。盡管本發明的效用通過若干化合物/組合物和組裝物的應用來舉例說明，本領域技術人員理解的是，用其他化合物、組合物和/或組裝物也能獲得可媲美的結果，這是與本發明的范圍相稱的。
所有的樹脂和Fmoc-1-氨基酸獲自Novabiochem(San Diego，CA)。所有用于固相合成的試劑是合成級的，獲自Applied Biosystems(Foster City，CA)。所有其他試劑獲自Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI)，并且收到后便使用。用于固相肽合成的溶劑獲自Applied Biosystems，并且是肽合成級的。其他溶劑獲自FisherScientific，并且收到后便使用，除非另外指明。
使用Applied Biosystems 433A自動肽合成儀合成PA。在室溫中，在VarianInova 500 MHz分光計上獲得NMR譜。在Micromass Quattro II Triple QuadrupoleHPLC/MS/MS質譜儀上采集電噴霧質譜。在帶有Jasco PTC-348WI帕爾帖效應溫度控制器的Jasco J-715分光偏振計上記錄CD譜。FT-IR譜在BioRad FTS-40 FT-IR機器上操作，400-4000nm，分辨率為2cm-1。
圓二色譜光譜術。徑長0.1cm的石英池被用于所有實驗。記錄300至190nm的每一光譜，掃描速度100nm/min，響應時間2秒鐘，帶寬1nm，平均超過5次掃描。除非另外指明，樣品在水中被制備0.1mg/mL的濃度。
酸-堿滴定。用Fisher Accumet pH計，在pH 2-10范圍內，對PAs 1-4進行pKa滴定，濃度為3.5mg/mL，在100mM KCl中。對于酸性PAs 2和4，以1-5μL的增量，加入0.1N KOH，以低pH開始；而對于堿性PAs 1和3，以1-5μL的增量，加入0.1N HCl，以高pH開始。
NMR NOE光譜術。以5mg/mL的濃度，將PAs 1-6溶解在d6-DMSO中。在D2O中，以0.1s的混合時間和128次掃描測量NOESY光譜，每種PA的濃度為10或15mg/mL，1∶1的摩爾比。對于FT-IR研究，凍干水中重量比為2％的樣品，然后壓成KBR小球。
方案1.肽兩親物的化學結構

實施例1
制備了四種PAs(方案1)，兩種具有三聯絲氨酸序列(1，3)，兩種具有三聯谷氨酸序列(2，4)。通過標準的Fmoc固相肽技術制備PAs 1和2，該制備使用預載的Wang樹脂，然后用棕櫚酸進行烷基化，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(tetramethyluronium hexafiuorophosphate)(HBTU)作為偶聯劑。使用95％三氟乙酸(TFA)、2.5％水和2.5％三異丙基硅烷(TIS)的混合物，將兩親物從樹脂上切割下來。對于肽兩親物3和4的合成，根據方案2合成氨基酸7。將N-芐氧羰基-L-天冬氨酸酐與十二烷基胺反應，產生脂肪酸氨基酸5。然后通過催化氫化除去CBz基團，產生6，接著對胺進行Fmoc-保護。該合成很容易地在5克水平進行。然后使用HBTU作為偶聯劑，將產物7偶聯到rink樹脂。隨后，使用標準Fmoc固相技術，將剩余的氨基酸加入到8。標準切割條件產生具有如前面描述的反向結構的PAs。1H NMR和電噴霧離子化質譜結果與期望的結構一致。
方案2.脂肪酸氨基酸的合成
實施例1a
N-十二烷基-2-芐氧羰基氨基-琥珀酰胺酸(5)。
將N-芐氧羰基-L-天冬氨酸酐(1mmol)溶解在50mL二氯甲烷中，再加入1.05eq的十二烷胺和1.1eq的三乙胺。反應蓋上蓋，以防止蒸發，攪拌12小時。當用薄層層析(TLC)(CH2Cl2，5％MeOH)不能檢測到微量的起始物質時，反應用20mL 1N鹽酸淬滅，再用氯仿(5×)萃取。用硫酸鎂干燥有機層，獲得白色固體7(產量97％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.8(t，J＝8.5Hz，3H，尾CH3)，1.18(s，18H C9H18尾)，1.48(br-s，2H，CONHCH2)，2.68(s，2H，CONHCH2CH2)，3.15(br-s，2H，Asp Hβ)，4.49(m，1H，Asp Hα)，5.12(s，2H，PhCH2O)，7.28(s，5H，Ph)。13C(DMSO-D6)δ14.6，22.8，29.4，29.6，29.7，32.0，52.2，56.7，66.1，128.4，129.0，137.7，156.5，171.1，172.5。ESI MSm/z435.4(MH+)。
實施例1b
2-氨基-N-十二烷基-琥珀酰胺酸(6)。在100mL乙醇中，溶解100mmol的7，并轉移到含有Pd和C(10％，重量比)的反應容器中。然后將容器置于氫下(35Torr)3小時。用C礦(celite)過濾反應混合物，在減壓下蒸發至干燥之后，獲得白色固體產物。產量95％。
1H NMR(CD3CN)δ1.15(m，23H，脂族尾)，1.3(m，2H，CONH2CH2CH2)，2.37(br-s，2H，CONH2CH2)，3.55(m，3H，Asp Hβ)，4.6(m，1H，Asp Hα)。ESI MSm/z301.2(MH+)。
實施例1c
N-十二烷基-2-Fmoc-氨基-琥珀酰胺酸(7)。將6.6mmol的6與1.3mL(1.5eq.)的三乙胺溶解到200mL的水/二噁烷(1∶1 v∶v)混合物中，再加入1eq.的Fmoc-O琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)。反應用TLC(CH2Cl2，10％MeOH)監控，2-3小時后，所有的Fmoc-OSu被消耗掉。用酸淬滅反應，產生白色沉淀，通過過濾收集該白色沉淀。產量85％。
1H NMR(d6-DMSO)δ0.84(t，J＝8Hz，3H，末端脂族CH3)，1.19(s，18H，脂族CH2)，1.34(s，2H，NH2CH2CH2)，2.61(br-s，2H，CONHCH2)，3.08(s，2H，Asp Hβ)，4.24(m，3H，Asp Hα+FmocCH2CONH+FmocCH)，7.3(t，J＝9Hz，1H，FmocH)，7.39(t，J＝9Hz，1H，FmocH)，7.68(d，J＝8.5Hz，1H，FmocH)，7.85(d，J＝9Hz，1H，FmocH)。13C(DMSO-D6)δ14.6，22.8，29.4，29.5，29.7，32.0，46.1，47.3，52.2，6.7，120.8，126.0，127.7，128.3，141.5，144.5，156.5，171.1，172.5。ESI MSm/z524(MH+)。
實施例1d
PA合成和純化。如在ref.3中描述的，制備PAs 1-2。對于PA′s 3-6，將標準rink樹脂置于反應容器中，用NMP中的30％哌啶去保護三次，然后偶聯到2eq.的7，過夜。重復偶聯作用，直到ninhyndrin測試顯示陰性結果。然后將該修飾的樹脂8裝載到自動合成儀上，進行肽合成，如同PAs 1-2那樣。當自動合成完成后，將PA從樹脂切割下來，如在ref.3中描述的。
實施例1e
C15H31CONHVal-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-Lys-COOH(1)1H NMR(d6DMSO)δ0.80-0.84(m，21H，Valγ，+尾CH3)，1.22(br-s，28H，C14脂族尾)，1.36(m，6H，Ala Hβ)，1.51(m，11H，Lys Hγ+尾CH2CH2CONH)，1.62(m，6H，LysHβ)，1.91(m，9H，Val Hβ+LysHδ)，2.16(m，2H，尾CH2CONH)，2.73(s，6H，Lys Hε)，4.10-4.23(m，9H，Hα)，7.6-8.1(酰胺NH)。ESI MS(MeOH∶H2O 1∶1 v∶v)∶m/z＝1151(MH+)。
實施例1f
C15H31CONHVal-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-COOH(2)1H NMR(d6DMSO)δ0.81(br-s，21H，Valγ，+尾CH3)，1.21(br-s，31H，C14脂族尾)，1.45(s，2H，Ala Hβ)，1.75(m，6H Glu Hβ)，1.94(m，9H，Valβ+Glu Hβ)，2.24(s，6H，GluHγ)，4.2(s，9H，Hα)，7.6-8.1(酰胺NH)。ESI MS(MeOH∶H2O 1∶1 v∶v)m/z＝1177(MNa+)。
實施例1g
Asp(CONHC12)-Val-Val-Val-Val-Val-Val-Lys-Lys-Lys-NH2(3)1H NMR(d6DMSO)δ0.82(br-s，39H，ValHγ+尾CH3)，1.22(br-s，20H，C10脂族尾)，1.34-1.53(m，6H，Lys Hγ)，1.69(m，6H，Lys Hβ)，1.93(m，12H，Lys Hδ+Val Hβ)，2.74(m，2H，尾CH2NH)，2.98(br-s，6H，Lys Hε)，4.09-4.44(m，9H，Hα)，7.02-8.25(酰胺NH)。ESI MS(MeOH∶H2O 1∶1 v∶v)m/z＝1279(MH+)。
實施例1h
Asp(CONHC12)-Val-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-NH2(4)1H NMR(d6DMSO)δ0.82(br-s，21H，Val Hγ+脂族尾CH3)，1.22(s，20H，尾C10)，1.32(m，9H，Ala Hβ)，1.74(m，3H，Glu Hβ)，1.94(m，6H，Glu Hβ+Val Hβ)，2.25(m，6H，Glu Hγ)，2.97(d，J＝6Hz，2H，尾CH2CH2CONH)，4.10-4.44(m，9H，Hα)，7.23-8.2(酰胺NH)。ESI MS(MeOH∶H2O 1∶1 v∶v)m/z＝1197(MH+)。
實施例2
當被分散在存在有合適的激勵的含水介質中時，PAs通常自組裝成高長徑比的柱狀納米纖維。基于先前的工作，由一種PA分子或兩種PA分子的混合物組成的纖維將有望顯示出具有β-片-樣氫鍵的二級結構。可預料到，將帶負電荷的2或4分別與帶相反電荷的1或3混合，將產生平行β-片樣氫鍵排列，而將1或2分別與以胺為末端的帶相反電荷的4或3混合，能產生反平行的排列。
實施例3
在0.1mM濃度，2-4的CD譜顯示出主要為無規則卷曲特征的肽片段。這最有可能是由高載電荷分子之間的靜電排斥引起。一旦pH發生變化以中和電荷，或者一旦加入鈣離子，所有PA顯示出β-片信號特征。相反，1在任何pH都顯示出β-片信號特征。1可能攜帶比其他少的電荷，因為酸末端可以中和其中一個賴氨酸殘基的電荷，使得該分子具有+2的形式凈電荷。該較低的總電荷可以減少排斥，并允許在纖維內形成β-片氫鍵。反過來，4將具有-2的形式凈電荷，因為胺末端可以中和其中一個谷氨酸殘基的電荷，從而使得β-片相互作用能夠發生。然而，4仍然顯示出紊亂的CD信號特征。為了弄清該表面上的矛盾，測定在pH 7時聚集體的實際電荷狀態和表觀pKa，以更好地理解這些各種各樣的系統自組裝的驅動力。
實施例4
在3mM濃度，進行分子1-4的聚集體的pKa滴定。所有滴定在分子已經處于聚集狀態的pH時開始，以避免由于自組裝產生的動力學影響。只有3的pKa滴定顯示出急劇的轉變，這與兩個表觀pKa相對應，一個是由于更具溶劑可及性的胺末端的去質子化作用所致，另一個由一個或多個賴氨酸ε胺引起。PAs 1、2和4的聚集體顯示出在寬的范圍內發生轉變的復雜曲線，這意味著這些超分子對象的質子化/去質子化緩慢進行，具有由納米纖維內的局部微環境導致的酸變化。從這些結果可以明顯看出，聚集作用改變了酸和胺基團的表觀pKa，這與最近的文獻報道相符。
實施例5
帶互補電荷的PA分子的共組裝將產生具有β-片氫鍵排列的、含有這兩種組分的混合物的纖維。當2與三聯賴氨酸兩親物3或1混合時(縮寫為2/3或2/1)，獲得的CD譜對應于純的β-片。觀察到的β-片信號并不是簡單為兩組分各自的CD譜的疊加這樣的事實，明顯地表明混合的納米纖維的形成，其中兩種分子形成單一的聚集體結構。與三聯谷氨酸PAs 4或2混合的PA 1(1/4或1/2)顯示出類似的行為。當混合兩種具有類似電荷的PA時，1/3賴氨酸混合物顯示出β-片，而2/4谷氨酸混合物顯示出紊亂的構象，這可能是谷氨酸殘基之間較大的電荷排斥的緣故。
實施例6
為了進一步證明纖維內的分子共組裝，對由電荷互補PA構成的重量百分比為1.5％的膠進行核歐沃豪斯效應(NOE)光譜術。2和3(2/3)代表性NOESY顯示觀察到2的Glu-Hβ質子分別與3的Lys-Hε和Val-Hδ質子之間的緊密的接觸(＜3)。若干其他可能的分子間接觸被檢測到，但是它們不能明確地歸于2/3接觸。這些結果提供了額外的證據，證明兩PA分子在同一納米纖維內發生共組裝。
實施例7
一旦成功地建立了兩親物的共組裝，研究了由單和多PA形成的系統的膠凝化行為。1-4的重量百分比為1％的溶液是微微不透明的，并且能夠通過分別加入酸(1，3)或堿(2，4)形成凝膠。透射電子顯微鏡顯示了平均直徑為6.5nm，平均長度為幾百納米的納米纖維的形成，這類似于先前在其他PA中觀察到的。
實施例8
噬菌體展示通常被用于發現受體阻斷肽(receptor-blocking peptides)，即具有高結合常數的序列。為了將生長因子從PA結合位置轉移到細胞受體，極高的結合常數是不需要的，并且甚至可能是不利的。因此，選擇7-mer商業噬菌體文庫，而不是13-mer文庫，以獲得中度的結合強度。將生長因子物理吸附到96孔板上，隨后暴露于噬菌體文庫。在室溫中溫育60分鐘后，通過用洗滌劑溶液漂洗除去未結合的噬菌體。然后通過用生長因子溶液溫育60分鐘，洗脫結合的噬菌體。將回收的噬菌體在37℃用大腸桿菌擴增4小時，隨后再重復該淘選程序(panning)兩次。在隨后幾輪的淘選中，通過提高洗滌劑濃度和減少暴露于文庫的時間，增加嚴緊性。將最終的噬菌體群鋪板，對僅含有一種噬菌體類型的集落中的10個克隆的DNA進行測序。接下來，ELISA篩選被用于測試假陽性并測定選擇的克隆的相對結合強度。利用該方案，發現rh-BMP-2的最佳結合表位是YPVHPST；rh-TGF-β1的最佳結合表位是LPLGNSH(參見下面表1)。
實施例8a
用Ph.D.7試劑盒(New England Biosystems)實施噬菌體展示。將50微升稀釋的M13噬菌體文庫(含有2×109個噬菌體，和所有可能的7-mer序列)加入到96孔微量滴定板，該微量滴定板已經在0℃暴露于50μl 10μg/ml生長因子(peprotech)溶液18小時。將板封閉1小時，然后在室溫溫育60分鐘，同時溫和搖動。通過用TBS/Tween-20(0.1％v/v Tween-20)漂洗，除去未結合的噬菌體。然后通過用50μl的生長因子溶液溫育60分鐘，洗脫結合的噬菌體。通過連續稀釋噬菌體，并隨后和大腸桿菌在瓊脂平板上鋪板，確定結合噬菌體的存在。形成的噬菌斑的數目可以關聯到在原混合物中的噬菌體的數目。噬菌體然后在37℃，在大腸桿菌中擴增4小時。在隨后幾輪的淘選中，將Tween-20的濃度提高到0.5％，分別減少和增加結合時間和洗脫時間，以增加選擇過程的嚴緊性。三輪淘選之后，稀釋回收的噬菌體混合物，并和細菌在瓊脂上鋪板。隨后分離含有單一DNA序列的噬菌斑。純化之后，對10個克隆測序。接下來，ELISA篩選被用于除去假陽性和測定選擇的克隆的相對結合強度。將每個克隆在包被有生長因子的微量滴定板上溫育1小時，將板用TBS/Tween-20漂洗，然后用HRP連接的抗-M13抗體(Amersham Biosciences)溫育1小時。加入ABTS之后，在30分鐘后測量在450nm的吸光度，以測定分離的克隆的相對結合強度。隨后選擇最強的結合物(binder)。
表1使用噬菌體展示獲得的BMP-2和TGF-β1的結合序列(binding sequences)

數字代碼說明的是選擇的克隆的相對結合強度，結合強度從最高(1)減小至最低(4)。所有序列都明顯地發生結合。
實施例9
因為在噬菌體上展示的肽序列具有游離的N-末端，不可能使用典型的PA合成途徑。因此，將側鏈用十二烷胺修飾的天冬氨酸用Rink酰胺樹脂處理(參見上面的方案2)。隨后，剩余的肽可以用常規的Fmoc-肽合成技術合成，產生具有反向極性的PA。分別地，選擇的肽序列對于BMP-2是V6K3SG3YPVHPST(9)，對于TGF-β1是V3A3K3SG3LPLGNSH(10)(方案3)。K3片段被選擇以與填充物2的帶電荷的E3頭部基團共組裝。SG3序列是間隔單元，并且是與噬菌體上存在的相同間隔單元。BMP-2分別與YPVHPST和KQALTOT的結合常數是Ka＝1.9±0.9 106M-1和2.1±0.85 105M-1，這是通過熒光去極化作用測定的，這說明了結合強度的可調節性(tunability)。
實施例9a
Asp(CONHC12)-Val-Val-Val-Val-Val-Val-Lys-Lys-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Pro-Val-His-Pro-Ser-Thr(9)
1H NMR(d6DMSO)δ0.82(br-s，39H，Val Hγ+尾CH3)，1.22(br-s，20H，C10脂族尾)，1.53(m，6H，Lys Hγ)，1.69(m，6H，Lys Hβ)，1.93(m，16H，Lys Hδ+Val Hβ+ProHγ)，2.37(m，4H，Pro Hβ)，2.74(br-s，6H，Lys Hε)，2.98(m，2H，尾CH2NH)，3.45(m，8H，Pro Hδ+His Hβ+Tyr Hβ)，3.72(m，3H，Thr Hα+Thr Hβ)，4.1-4.6(m，13H，Hα+SerHβ)，6.81(m，5H，Tyr芳族Hs+His H)，7.02-8.25(酰胺NH+His H)。ESI MS(H2O)773.9(M+3H)+3。
實施例9b
Asp(CONHC12)-Val-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Pro-Leu-Gly-Gln-Ser-His-NH2(10)
1H NMR(d6DMSO)δ0.82(br-s，21H，Val Hγ+脂族尾CH3)，1.22(br-s，20H，尾C10)，1.32(m，9H，Ala Hβ)，1.53(m，6H，Lys Hγ)，1.64(m，6H，Lys Hβ)，1.84(m，4H，Leu Hβ)，1.93(m，16H，Lys Hδ+Val Hβ+Pro Hγ)，2.37(m，2H，Pro Hβ)，2.74(br-s，6H，Lys Hε)，2.97(m，2H，尾CH2CH2CONH)，3.45(m，4H，Pro Hδ+His Hβ)，3.72(m，3H，His Hα+Ser Hβ)，4.10-4.61(m，9H，Hα)，6.81(m，2H，His H)，7.02-8.25(酰胺NH+HisH)。ESI MS(MeOH∶H2O 1∶1 v∶v)m/z＝1086.7(M+H)+2。
方案3
實施例10
利用圓二色譜(CD)光譜術，可以證明PA 9與填充物PA 2的共組裝。在0.13mM濃度，在該濃度的單獨PA納米纖維的CD譜主要具有無規則卷曲特征。然而當混合一起時，CD譜反映的是純的β-片，這說明了PA在同一纖維內發生共組裝，而不是形成僅由一種PA分子組成的單獨的同質纖維。共組裝在能量上是有利的，因為當KKK和EEE部分形成復合體時，靜電排斥被減少。通過對1.5wt％溶液使用核歐沃豪斯效應光譜術，獲得共組裝的額外證據。在Eβ和Kε質子之間和Eβ和Vδ質子之間觀察到緊密的接觸(＜3)，這一距離在同質纖維之間則要大得多。其他可能的分子間接觸的屬性不能被明確地確定。最后，對凍干的樣品和1wt％溶液進行的傅立葉轉換紅外光譜術顯示，存在β-片典型的1630cm-1峰。對于10/2混合物獲得了類似的結果。在37℃將樣品退火24小時，導致CD效應的強度明顯增加。該增加歸因于完全偶聯的生色團的區域(domain)的尺寸增加。據推測，最初的混合導致非完全混合的系統的動力學俘獲，退火使得兩親物隨后可以重新組織成熱力學上最穩定的狀態。即使在80℃——遠高于氫鍵網絡和脂族尾的預期熔化溫度——進行延長時間的加熱也不會導致任何明顯的超分子手性喪失，這表明了納米纖維的高度穩定性。
實施例11
為了測試這種方法的生理學意義，充質干細胞被培養在含有不同水平的生長因子的膠中。對于這些細胞實驗，結合表位被稀釋成50∶1(填充物結合物)的比率，以確保被蛋白質識別。通過將50μl含有期望數量的生長因子的預混合的PA(2％，重量百分比)與50μl充質干細胞懸浮液(100,000個細胞)在蓋玻片上混合，再加入10μl 30mg/ml CaCl2溶液制備膠。允許膠固化1.5小時，之后加入1ml的充質干細胞培養基。以這樣的方式，制備由9/2或單獨的2組成的、含有0、1或50ng/ml的BMP-2的凝膠。作為進一步的對照，將10,000個干細胞鋪在蓋玻片上，以相同的濃度將BMP-2加入到培養基中。每4天更換一次培養基，在培養7和21天后分離出三等份的樣品。隨后，通過蛋白印跡，評測譜系特異性標記骨鈣蛋白(造骨細胞)、脂聯蛋白(脂肪細胞)、膠原II和軟骨蛋白聚糖(軟骨細胞)和α-平滑肌肌動蛋白和結蛋白(平滑肌細胞)的蛋白表達。
實施例11a
細胞實驗的實驗方案將人充質干細胞(Cambrex technologies)以5,000個細胞/cm2的密度植入四個T75培養瓶中，其中含有15ml的充質干細胞培養基(Cambrex Technologies)，在37℃，5％CO2，90％濕度溫育。在90％匯合時，用2.5ml0.25％胰蛋白酶/EDTA對細胞進行胰蛋白酶處理5分鐘。隨后，加入8ml的培養基以淬滅蛋白酶活性。將細胞懸浮液合并在一起，在850rpm離心8分鐘。將細胞沉淀重新懸浮于1ml的培養基中，取10μl用于細胞計數。用培養基將細胞懸浮液稀釋到2,000,000個細胞/ml的濃度。
以2wt％的濃度溶解PAs 1和3。隨后，將50μl的1與1250μl的3混合。將混合物分為410μl的3份，此外制備3份410μl的3(2wt％)。然后將20μl的2μg/ml BMP-2(Peprotech)加入到一份的1/3和1中，使濃度達到100ng/ml BMP-2。類似地，加入41μl 20ng/ml BMP-2，使最終濃度為2ng/ml BMP-2。
通過在顯微鏡蓋玻片上將50μl PA溶液與50μl細胞懸浮液混合制備三份膠。然后，加入10μl 30mg/ml CaCl2，使凝膠在37℃，5％CO2，90％濕度下固化90分鐘。所得到的濃度是1wt％PA和0、1或50ng/ml BMP-2。接下來，加入1ml培養基。通過將5μl的細胞懸浮液放置在蓋玻片上，然后加入1ml的培養基，制備含有生長因子的對照溶液。然后，加入25μl 2μg/ml BMP-2和0.5μl 2μlg/ml BMP-2，分別獲得濃度為50ng/ml和1ng/ml的BMP-2溶液。每四天更新一次半量的培養基。
實施例12
細胞成活分析顯示，3周的培養之后，在所有的凝膠中細胞的成活率＞95％。在任一時刻，通過蛋白印跡都不能檢測到內皮糖蛋白(endoglin)的表達，這表明所有細胞已經開始分化。在任一時刻也不能檢測到脂聯蛋白和軟骨蛋白聚糖的表達。骨鈣蛋白的表達在凝膠和對照之間顯示出顯著差異。盡管在對照中不能檢測到骨鈣蛋白，但所有凝膠在第7天——而不是通常2-3周——已經表達明顯水平的骨鈣蛋白(圖3a)，但是在第3周時并沒有顯著增加(圖3b)。于是，在1和3周時可比較的表達水平表明，骨鈣蛋白的表達水平在培養期間是恒定的。令人驚奇的是，該表達似乎獨立于BMP-2的濃度，含有結合PA和不含有結合PA的凝膠之間的比率是1∶2。而且，未加入BMP-2的凝膠顯示出類似的水平。顯然，由細胞本身產生的內源性BMP-2水平足以刺激造骨細胞的分化，但是結合凝膠的結合一些BMP-2的能力稍微減低了表達的骨鈣蛋白的數量。骨鈣蛋白的表達也可以用免疫細胞化學方法來觀察。
相反，α-平滑肌肌動蛋白在含有9的凝膠中未檢測到，但是它在無結合物的凝膠中被表達。然而，在3周之后，它在任一情況中都被表達(圖3b)，但是在9/2凝膠中的表達依然稍微低于在2凝膠中的表達，并明顯低于在對照中的表達。此外，不能檢測到結蛋白的表達，結蛋白是終末分化的平滑肌細胞的標記。
實施例12a
蛋白印跡實驗方案除去培養基之后，用1ml的磷酸緩沖鹽水漂洗凝膠，并隨后在200μl 2％十二烷基硫酸鈉、0.08M Tris、10％甘油中裂解細胞。將三份裂解物合并，通過將10μl裂解物和200μl BCA蛋白分析試劑(Pierce)混合，并在37℃溫育30分鐘后參照BSA標準系列讀取562nm處的吸光度，來測量蛋白質的濃度。然后，混合10μg蛋白質、3μl β-巰基乙醇，3μl溴酚藍，加入水使總體積達到36μl。將混合物煮沸5分鐘，上樣到或者4％(內皮糖蛋白、軟骨蛋白聚糖)或者10-20％(骨鈣蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、脂聯蛋白、結蛋白)Novex tris(glycine)凝膠(Invitrogen)。將凝膠置于tris(glycine)分離緩沖液(Invitrogen)中，130V恒定電壓，工作90分鐘。然后，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)，恒定電流190mA，90-120分鐘。
將膜在5％脫脂奶(Bio-Rad)中封閉1小時，針對各個標記物的探測在1％牛奶中以1∶500的稀釋度進行2小時，其中使用單克隆抗體探測骨鈣蛋白(克隆190125，R&D systems)、內皮糖蛋白(克隆166709，R&D systems)、脂聯蛋白(克隆166126，R&D systems)、α-平滑肌肌動蛋白(克隆1A4，R&D systems)，以及多克隆軟骨蛋白聚糖(AF1220，R&D systems)。用tris緩沖鹽水/0.1％tween-20(TTBS)，漂洗膜3次，每次15分鐘。然后，以1∶3000的稀釋度，在1％牛奶中，用二抗平衡1小時，然后用TTBS漂洗3次。通過用ECL蛋白印跡分析溶液(Amersham Biosciences)平衡1分鐘并暴露于ECL hyperfilm(Amersham Biosciences)，對膜進行顯影。
實施例12b
在4℃，用2％低聚甲醛/0.2％戊二醛/0.2M卡可酸鈉(sodium calcodylate)固定細胞20分鐘。用PBS漂洗(2×)之后，樣品用含有0.1％Triton-X的PBS溫育5分鐘。然后，樣品用PBS漂洗(2×)。接下來，加入在1％BSA/PBS中的人骨鈣蛋白單克隆抗體(R&D systems，1∶200)，并將樣品在4℃溫育過夜。在用PBS漂洗三次之后，加入在1％BSA/PBS中的FITC連接的二抗，并溫育2小時。三次PBS漂洗之后，將樣品在Nikon Eclipse TE 2000顯微鏡上，以10×放大倍數進行觀察。
實施例13
針對結合TGF-β1的PA10進行一系列的實驗，如同BMP-2實驗那樣，除了最高的TGF-β1濃度是20ng/ml，而不是50ng/ml。樣品在10天之后分離。在TGF-β1存在下的培養，導致分化成平滑肌和軟骨譜系。對于結合凝膠，膠原II表達是更高的，并且似乎隨著TGF-β1的增加而增加。令人驚奇地，骨鈣蛋白和膠原X被表達，這表明發生了成熟至肥大軟骨細胞階段的現象，這在早期的時間點是未預料到的。類似地，α-平滑肌肌動蛋白表達隨TGF-1濃度而增加，但在結合凝膠中比在非結合凝膠中高。在對照中它則更高，但是結蛋白的表達水平表明這些大多是未成熟的肌細胞。
實施例14
測定了血管內皮生長因子(VEGF)——使用了7-mer和12-mer噬菌體展示試劑盒、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、神經營養蛋白-3(NT-3)和層粘連蛋白-5的大量結合序列；*表示最強的結合物

FGF-2PMHHHKHAQVRSGDKHPPTNWAMLSHLSDFIQPYQVYWSRIEAMPQRPLHSRHFHHRMTQVPLLSTPPLRNT-3HTTEILHPSNYQTSSYFPSSAEARQSYSDEPQKAHTLGLGLHYMRRSLSVVLYLPL層粘連蛋白-5SKLNTKSPTYHHRHLRHKSLH
RYHPHLH*GRYHHYLH
如前面的實施例所示，本發明提供了攜帶自由N末端的肽兩親分子的合成策略，該合成策略與標準的固相方法是兼容的。當與自由C末端PA混合時，這些分子自組裝成含有高度熱穩定的β片結構的納米纖維，其似乎比具有相同極性的PA的共組裝物更穩定。創造出在其表面上具有自由N末端的組裝物的新機會，使得能夠設計出生物活性納米纖維，這是以前的暴露肽序列C末端的納米結構不能實現的。
盡管本發明已經參考其某些優選實施方案進行了相當詳細的描述，但是其他的形式是可能的。例如源自噬菌體展示方法的肽或蛋白序列可以被用于形成結合肽兩親物，其可結合和保留不同于生長因子的蛋白質。酶可以被偶聯以形成結合肽兩親物，其可以自組裝并固定在納米纖維水凝膠的表面上。此水凝膠可以被用作傳感器應用的涂層。可選擇地，連接到肽兩親物上的噬菌體展示來源的肽的結合相互作用可以被選擇，以強烈地結合肽諸如HGF(肝細胞生長因子)或VEGF，以及通過除去它們來治療各種疾病和狀況。由這些結合肽兩親物自組裝形成的水凝膠可以被模制，以便插入患者的某一位置或用于濾過系統中。水凝膠可被用于除去某一位置諸如患者關節或腫瘤或患者體液中的目標肽比如HGF或VEGF。
權利要求
1.兩親性肽化合物，其包括肽組分和疏水組分，所述肽組分包括噬菌體展示過程的生長因子識別產物，所述識別產物連接到所述肽組分的N末端附近，所述疏水組分連接到所述肽組分的C末端附近。
2.權利要求1的化合物，其中所述識別產物選自表位序列，所述表位序列提供了與生長因子BMP-2、TGF-β1、VEGF、FGF-2、NT-3和層粘連蛋白-5的結合相互作用。
3.權利要求2的化合物，其中所述結合表位序列包括YPVHPST。
4.權利要求3的化合物，其中所述序列與生長因子BMP-2產生非共價結合相互作用。
5.權利要求2的化合物，其中所述結合表位序列包括LPLGNSH。
6.權利要求5的化合物，其中所述序列與生長因子TGF-β1產生非共價結合相互作用。
7.權利要求1的化合物，其中所述肽組分在生理pH時具有凈電荷。
8.權利要求7的化合物，其含有選自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、纈氨酸和絲氨酸的殘基。
9.權利要求2的化合物，其中所述疏水組分包括從約C6至約C22的烷基部分。
10.權利要求1的化合物，其中所述肽組分是基本上線性的。
11.肽組合物，其包括多個第一種兩親性肽化合物，每一個所述化合物包括噬菌體展示過程的生長因子識別產物，該識別產物連接到所述化合物的肽組分，所述肽組分在生理pH時具有凈電荷，并且在其C末端附近偶聯到疏水組分。
12.權利要求11的組合物，還包括多個第二種兩親性肽化合物，每一個所述化合物缺少生長因子識別產物，并且在生理pH時具有凈電荷，該凈電荷與所述第一種化合物的所述凈電荷互補。
13.權利要求12的組合物，其中所述第二種化合物的肽組分的氨基酸序列的長度比所述第一種化合物的肽氨基酸序列的長度短。
14.權利要求13的組合物，包括在含水介質中的膠束組裝物。
15.權利要求14的組合物，包括與之發生非共價相互作用的至少一種生長因子。
16.權利要求15的組合物，其中所述生長因子選自BMP-2、TGF-β1、VEGF、FGF-2、NT-3、層粘連蛋白-5和其組合。
17.權利要求16的組合物，其接觸干細胞。
18.權利要求11的組合物，還包括多個第二種兩親性肽化合物，所述化合物包括長度比所述第一種化合物的肽氨基酸序列的長度短的肽氨基酸序列，所述第二種化合物缺少生長因子識別產物，并且在生理pH時具有凈電荷，該凈電荷與所述第一種化合物的所述凈電荷互補。
19.權利要求18的組合物，包括在含水介質中的膠束組裝物。
20.權利要求19的組合物，其接觸干細胞，并且包括與所述組合物非共價相互作用的生長因子。
21.使用兩親性肽化合物來影響生長因子的生物利用度的方法，所述方法包括提供膠束組裝物，所述膠束組裝物包括多個第一種兩親性肽化合物，每一個所述化合物包括噬菌體展示過程的生長因子識別產物，該識別產物連接到所述第一種化合物的肽組分，所述肽組分在生理pH時具有凈電荷，并且在其C末端附近連接到疏水組分；以及多個第二種兩親性肽化合物，所述第二種兩親性肽化合物包括長度比所述第一種化合物的肽序列的長度短的肽氨基酸序列，所述第二種化合物缺少生長因子識別產物，并且在生理pH時具有凈電荷，該凈電荷與所述第一種化合物的所述凈電荷互補；和將干細胞與所述組裝物接觸。
22.權利要求21的方法，其中所述生長因子由所述干細胞產生。
23.權利要求21的方法，其中所述生長因子選自BMP-2、TGF-β1、VEGF、FGF-2、NT-3、層粘連蛋白-5和其組合。
24.權利要求23的方法，其中所述識別產物選自表位序列，所述表位序列提供與生長因子BMP-2和TGF-β1其中之一的非共價相互作用。
25.權利要求24的方法，其中所述表位序列包括YPVHPST，其與生長因子BMP-2產生非共價相互作用。
26.權利要求24的方法，其中所述表位序列包括LPLGNSH，其與生長因子TGF-β1產生非共價相互作用。
27.權利要求21的方法，其中所述接觸對于干細胞分化是足夠的。
28.權利要求27的方法，其中所述組裝物包括生長因子BMP-2，所述識別產物包括與所述生長因子非共價相互作用的表位序列。
29.權利要求28的方法，其中所述干細胞是充質干細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述干細胞分化成骨細胞。
全文摘要
本發明提供了兩親肽化合物、此類化合物的膠束組裝物和相關的應用方法，所述兩親肽化合物包括一個或多個用于與一種或多種相應的生長因子發生結合相互作用的表位序列。
文檔編號C07K14/475GK1905892SQ200480040497
公開日2007年1月31日 申請日期2004年12月6日 優先權日2003年12月5日
發明者S·I·斯圖普, J·J·J·M·唐納斯, G·A·席爾瓦, H·A·貝安娜, S·G·安東尼 申請人:西北大學