專利名稱：使用腸桿菌科菌株制備l－氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及使用腸桿菌科的重組微生物菌株生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸的方法，所述菌株中命名為yaaU的可讀框(ORF)被增強，特別是過表達；本發明還涉及所述微生物。
背景技術：
L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸被應用于人體醫學和藥品工業、食品工業、特別是動物營養中。
已知可以通過發酵腸桿菌科菌株，特別是大腸桿菌(E.Coli)和粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)生產L-氨基酸。由于其極為重要，一直在持續努力對生產方法進行改進。對方法的改進可以涉及與發酵技術相關的措施，例如攪拌或供氧、或營養培養基的組成例如發酵過程中的糖濃度、或例如通過離子交換層析對產品形式的處理、或微生物本身的內在性能特性。
誘變、選擇及突變體選擇的方法被用于改良這些微生物的性能特性。這由此獲得了對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性的或對調節重要的代謝物是營養缺陷的，并產生L-氨基酸例如L-蘇氨酸的菌株。
多年以來，也已通過擴增各氨基酸生物合成基因并研究其對生產的影響，將重組DNA方法用于腸桿菌科的產L-氨基酸的菌株的改良。關于大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)的細胞生物學和分子生物學的匯編資料見于Neidhardt(ed)Escherichia coli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，2ndedition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)。
發明目的本發明的目的是提供用于提高L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸生產的新措施。
發明內容
本發明涉及腸桿菌科的重組微生物，其含有增強的或過表達的yaaU-ORF，其編碼一種被注解為推定的糖轉運蛋白的多肽；且其以一種改良的方式生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸。
在各種情形中，將非yaaU-ORF重組體微生物或不含有任何增強的yaaU-ORF的微生物用作比較的起始點。
這些重組微生物特別包括腸桿菌科的微生物，其中一種多核苷酸被增強，所述多核苷酸編碼一種多肽，該多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性為至少90％，特別地至少95％，優選至少98％，更優選99％，特別優選99.7％和甚至特別優選100％。優選與來自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
所述微生物含有一種增強的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸選自a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內對應于SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴格條件下，與序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的互補序列雜交的序列的多核苷酸序列；
d)具有含有在功能上為中性意義的突變的序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的多核苷酸，該多核苷酸編碼推定的糖轉運蛋白。
本發明還涉及使用腸桿菌科的重組微生物發酵生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸的方法，特別地，所述重組微生物已經生產L-氨基酸且其中至少編碼yaaU的可讀框(ORF)或編碼其基因產物的核苷酸序列被增強。
優選使用所描述的微生物。
當下文提及L-氨基酸或氨基酸時，是指選自如下一組的一或多種氨基酸，包括其鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸。特別優選L-蘇氨酸。
在本申請中，術語“增強”描述了微生物中由相應DNA所編碼的一或多種酶或蛋白質的胞內活性或濃度的增加，通過例如使一或多種基因或一或多種ORF的拷貝數增加至少一個(1)拷貝，采用可操縱地連接于所述基因的強啟動子或采用編碼相應的具有高活性的酶或蛋白質的基因或等位基因或ORF，且在適當的地方可以組合使用這些措施。
可讀框(ORF)是指編碼或可以編碼現有技術中未知功能的蛋白質和/或多肽或核糖核酸的核苷酸序列的片段。在確定了所述核苷酸序列片段的功能之后，這一片段通常被稱作基因。等位基因通常被理解為是給定基因的替代形式。這些形式通過核苷酸序列的不同而區分。
通常，將由核苷酸序列(即ORF、基因或等位基因)所編碼的蛋白質或核糖核酸稱作基因產物。
增強措施，尤其是過表達，通常使得相應的蛋白質的活性或濃度在野生型蛋白質的活性或濃度的基礎上，或在親代菌株或非相應酶或蛋白質重組體微生物中的蛋白質的活性或濃度的基礎上增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最高直至1000％或2000％。非重組體微生物或親代菌株是指實施了本發明的措施的微生物。
本發明涉及通過發酵腸桿菌科的重組微生物制備L-氨基酸的方法，其特征在于a)在培養基中培養所需的L-氨基酸生產微生物，在所述微生物中可讀框yaaU或編碼其基因產物的多種核苷酸序列或多種等位基因被增強尤其是過表達，所述培養在所需L-氨基酸在培養基或細胞中富集的條件下進行；和b)分離所需的L-氨基酸，任選地，發酵液組分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分離的產物中或被完全除去。
具有增強的或過表達的可讀框(ORF)yaaU的微生物，尤其是重組微生物同樣是本發明主題的一部分，可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、適當的時候從淀粉、纖維素或從甘油和乙醇產生L-氨基酸。這些微生物是腸桿菌科的代表性微生物，它們選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。優選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。在埃希氏菌屬中尤其可提及的是大腸桿菌菌種，在沙雷氏菌屬尤其可提及的是粘質沙雷氏菌菌種。
通常，采用含有所需ORF、所需基因、該ORF或基因的等位基因，或其部分，和/或增強所述ORF或基因的表達的啟動子，通過轉化、轉導或接合的方式，或這些方法的組合產生重組微生物。這一啟動子可以是通過位于所述基因或ORF上游的內源調節序列的增強突變所產生的啟動子；或與所述基因或ORF融合的有效啟動子。
埃希氏菌屬尤其大腸桿菌菌種的合適菌株，尤其是生產L-蘇氨酸的合適菌株的例子是-大腸桿菌H4581 (EP 0 301 572)-大腸桿菌KY10935(Bioscience Biotechnology andBiochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetica MG442 (US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetica M1(US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetica 472T23(US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)-大腸桿菌cat 13 (WO 98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132 (WO 00/09660)沙雷氏菌屬，特別是粘質沙雷氏菌菌種的合適的L-蘇氨酸生產菌株的例子是-粘質沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)1045-1051(1979))-粘質沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘質沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)255-265(1992)腸桿菌科的L-蘇氨酸生產菌株優選具有尤其是選自如下一組的一或多種遺傳或表型特征α-氨基β-羥戊酸抗性、硫賴氨酸(thialysine)抗性、乙硫氨酸抗性、α-甲基絲氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氨基丁酸抗性、疏螺旋體素抗性、環戊烷羧酸抗性、利福平抗性、纈氨酸類似物例如纈氨酸氧肟酸抗性、嘌呤類似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性、需要L-甲硫氨酸、可部分且可補償地需要L-異亮氨酸、需要間二氨基庚二酸、對含蘇氨酸的二肽為營養缺陷型、L-蘇氨酸抗性、蘇氨酸萃余液(raffinate)抗性、L-高絲氨酸抗性、L-賴氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-絲氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-纈氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性、缺陷型蘇氨酸脫氫酶、可利用蔗糖的能力、蘇氨酸操縱子的增強、高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的增強，優選反饋抗性形式、高絲氨酸激酶的增強、蘇氨酸合酶的增強、天冬氨酸激酶的增強，可為反饋抗性形式、天冬氨酸半醛脫氫酶的增強、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強，可為反饋抗性形式、磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強、轉氫酶的增強、RhtB基因產物因產物的增強、RhtC基因產物的增強、YfiK基因產物的增強、丙酮酸羧化酶的增強、及乙酸形成的弱化。
已經發現腸桿菌科的微生物在基因或可讀框(ORF)yaaU，或其等位基因過表達后以改良的方式生產L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸。
大腸桿菌的基因或可讀框(ORF)的核苷酸序列屬于現有技術，也可以在Blattner等(Science 2771453-1462(1997))公開的大腸桿菌基因組序列獲得。已知內源酶(甲硫氨酸氨肽酶)能剪切N-末端氨基酸甲硫氨酸。
來自同樣屬于腸桿菌科的弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的yaaU-ORF的核苷酸序列也已公開。
大腸桿菌K12的yaaU ORF尤其通過如下數據描述描述可讀框功能被注解為一種推定的轉運蛋白，MFS(主要易化超家族(major facilitator superfamily))家族的膜轉運蛋白。所轉運的底物變化范圍很大；所述MFS家族包含單糖、二糖和寡糖轉運蛋白，鉀和氨基酸轉運蛋白，用于三羧酸循環的中間體的轉運蛋白，以及將抗生素泵出細胞外的轉運蛋白。
描述可讀框yaaU編碼48.7kDa的蛋白質；等電點為8.8；當在染色體上進行定位時，yaaU例如在大腸桿菌K12 MG1655中位于編碼氨甲酰磷酸合酶的長鏈的基因carB和編碼(K(+)/H(+)谷胱甘肽-調節的鉀流系統蛋白質((K(+)/H(+)glutathione-regulated potassiumefflux system protein)的基因kefC的基因間區域。
參考文獻Blattner et al.；Science 277(5331)1453-1474(1997)登錄號AE000114替代的基因名B0045核酸序列可從屬于National Library of Medicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for Biotechnology Information(NCBI)的數據庫、European Molecular Biology Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany or Cambridge，UK)的核酸序列數據庫或日本DNA數據庫(DDBJ，Mishima，Japan)獲得。
為使得更為清楚，大腸桿菌yaaU-ORF的已知序列示于SEQ IDNO3，弗氏志賀氏菌(AE015041)和鼠傷寒沙門氏菌(AE008697)的yaaU-ORF的已知序列分別示于SEQ ID NO5和SEQ ID NO7。由這些讀框編碼的蛋白質的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO4、SEQ IDNO6和SEQ ID NO8。
提及的參考文獻中所描述的可讀框根據本發明可以使用。此外，也可以使用由遺傳密碼的簡并性或者在功能上為中性意義的突變所產生的所述基因或可讀框的等位基因。優選使用內源基因或內源可讀框。
“內源基因”或“內源核苷酸序列”是指一個物種群體中存在的基因或可讀框或等位基因或核苷酸序列。
yaaU-ORF的合適的等位基因尤其包括那些在它們所編碼的蛋白質中產生了至多50個或至多40個或至多30個或至多20個，優選至多10個或至多5個，尤其優選至多3個或至多2個或至多1個保守氨基酸取代的等位基因，所述等位基因含在功能上為中性意義的突變。
在芳族氨基酸的情形中，當苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。在疏水性氨基酸的情形中，當亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。在極性氨基酸的情形中，當谷氨酰胺和天冬酰胺彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。在堿性氨基酸的情形中，當精氨酸、賴氨酸和組氨酸彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。在酸性氨基酸的情形中，當天冬氨酸和谷氨酸彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。在含羥基基團的氨基酸的情形中，當絲氨酸和蘇氨酸彼此相互取代時，所述取代被認為是保守性的。
同樣，也可以使用編碼所述蛋白質的變體的核苷酸序列，所述變體在其N或C末端額外地含有至少一個(1)氨基酸的延長或截短。這種延長或截短總計不超過50、40、30、20、10、5、3或2個氨基酸或氨基酸殘基。
合適的等位基因還包括編碼其中插入或缺失了至少一個(1)氨基酸的蛋白質的那些等位基因。這種稱為插入/缺失(indels)的改變的最大數目可涉及2、3、5、10、20但決不超過30個氨基酸。
合適的等位基因還包括使用SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7或其部分，特別是編碼區或與其互補的序列，通過雜交、特別是在嚴格條件下的雜交可獲得的那些等位基因。
本領域技術人員尤其可以在Boehringer Mannheim GmbH所提供的專業手冊“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)及Liebl et al.(Intemational Journal ofSystematic Bacteriology 41255-260(1991))中找到通過雜交的方式鑒定DNA序列的操作指南。雜交在嚴格條件下發生，也就是說只形成了其中探針和靶序列(即用探針處理的多核苷酸)具有至少80％相同性的雜交體。已知通過改變緩沖液組成、溫度和鹽濃度可以影響和/或確定雜交包括洗滌步驟的嚴格性。通常，雜交反應在與洗滌步驟相比相對較低的嚴格條件下進行(Hybaid Hybridization Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，相應于5×SSC緩沖液的緩沖液可用于在大約50℃-68℃的溫度下進行雜交反應。在這些條件下，探針也可以和與探針序列具有少于70％相同性的多核苷酸雜交。這些雜交體穩定性較低并在嚴格條件下通過洗滌而除去。這可以例如通過將鹽濃度降低至2×SSC及在適當的地方再隨后降低至0.5×SSC(The DIG System User′sGuide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，并將溫度調節至大約50℃-68℃、大約52℃-68℃、大約54℃-68℃、大約56℃-68℃、大約58℃-68℃、大約60℃-68℃、大約62℃-68℃、大約64℃-68℃、大約66℃-68℃而實現。優選大約64℃-68℃或大約66℃-68℃的溫度范圍。在適當的地方，有可能將鹽濃度降低至相應于0.2×SSC或0.1×SSC的濃度。與所用的探針序列或SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7中所示的核苷酸序列例如具有至少80％、或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的多核苷酸片段有可能通過將雜交溫度從50℃逐步(大約1-2℃)提高至68℃而分離。關于雜交的進一步的指導可以所謂試劑盒的形式商購獲得(例如DIG EasyHyb，Roche Diagnostics′GmbH，Mannheim，Germany，CatalogueNo.1603558)。由此所獲得的核苷酸序列編碼與SEQ ID NO4、SEQID NO6或SEQ ID NO8中所述氨基酸序列具有至少90％、尤其是至少95％、優選至少98％或至少99％，尤其優選99.7％的相同性的多肽。
為了實現增強，例如可以提高所述基因或可讀框或等位基因的表達，或提高所述蛋白質的催化特性。在適當的地方，可以將兩種措施組合起來。
為了實現過表達，例如可以增加相應的基因或可讀框的拷貝數，或位于結構基因上游的啟動子區域和調節區域或核糖體結合位點是突變的。摻入到所述結構基因上游的表達盒以同樣的方式發揮作用。也可以通過摻入誘導型啟動子提高發酵生產L-蘇氨酸過程中的表達；此外，使用用于基因表達的啟動子也是有利的，所述基因表達允許不同時序的基因表達。通過用于延長mRNA的生命期的措施同樣提高了表達。此外，通過阻止酶蛋白被破壞也增強了酶活性。ORF、基因或基因構建體或可以以不同的拷貝數存在于質粒中，或被整合和擴增到染色體中。或者，也可以通過改變培養基的組成和培養的實施而實現所涉及到的基因的過表達。
用于過表達的方法在現有技術中已有充分描述，例如Makrideset al.(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))。使用載體增加至少1個(1)拷貝的拷貝數。所使用的載體可以是質粒，如在US5,538,873中所述的質粒。所使用的載體也可以是噬菌體，例如在EP 0332448中所述的噬菌體Mu，或噬菌體λ。也可以通過在染色體中的另一位點摻入額外的拷貝而增加拷貝數，例如摻入噬菌體λ的att位點(Yu and Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307報道了可以通過例如在染色體蘇氨酸操縱子的上游摻入表達盒或啟動子(例如tac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子、或噬菌體λ的PL啟動子或PR啟動子)來提高表達。同樣地，可以使用噬菌體T7啟動子、gearbox啟動子或nar啟動子。也可以使用如EP 0 593 792中所描述的這種表達盒或啟動子以過表達質粒結合基因(plasmid-boundgenes)。使用lacIQ等位基因反過來使得有可能調節質粒結合基因的表達(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。此外，還可以通過一個或多個核苷酸的取代、插入/和或缺失對啟動子序列進行修飾而提高所述啟動子的活性。如Walker et al.(Journal ofBacteriology 1811269-80(1999))所述，通過使用生長期依賴型fis啟動子可以實現不同時序的基因表達。
本領域技術人員尤其可以在Chang和Cohen(Journal ofBacteriology 1341141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene 13347-353(1981))、Amann and Brosius(Gene 40183-190(1985))、de Broer et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 8021-25(1983))，LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY11187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosaet al.(Plasmid 26222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))，Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))和已知的遺傳學和分子生物學的教科書中找到關于此的一般操作指南。
可以使用能在腸桿菌中進行復制的質粒載體，例如pACYC184-衍生的克隆載體(Bartoloméet al.；Gene 10275-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene 69301-315(1988))或pSC101衍生物(Vocke andBastia；Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在根據本發明的方法中，可以使用由質粒載體所轉化的菌株，所述載體攜帶有至少1種編碼yaaU ORF或其基因產物的核苷酸序列或等位基因。
術語“轉化”是指宿主(微生物)對分離的核酸的攝入。
也可以利用序列交換(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、接合或轉導將影響給定基因或可讀框的表達的突變轉移到不同菌株中。
有關遺傳學和分子生物學概念的更詳細的解釋見于已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Birge(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5th ed.，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)所著教科書或Sambrook et al.(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(3-Volume Set)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)所著手冊。
此外，當使用腸桿菌科的菌株生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸時，除增強可讀框yaaU之外，增強已知的蘇氨酸生物合成途徑的一或多種酶或添補代謝的酶或用于生產還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或糖酵解的酶或PTS酶或硫代謝的酶是有利的。通常優選使用內源基因。
因此，可以例如同時增強尤其是過表達選自如下一組的一或多個基因·至少一種編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的基因(US-A-4,278,765)，·編碼丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因(WO 99/18228)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)，
·編碼嘧啶轉氫酶亞基的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，·編碼介導高絲氨酸抗性的蛋白質的rhtB基因(EP-A-0 994190)，·編碼介導蘇氨酸抗性的蛋白質的rhtC基因(EP-A-1 013765)，·編碼蘇氨酸輸出載體蛋白的谷氨酸棒桿菌的thrE基因(WO01/92545)，·編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，·編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(WO 03/004598)，·編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(WO 03/004664)，·編碼PTS磷酸轉移酶系統的磷酸-組氨酸蛋白質己糖磷酸轉移酶的ptsHIcrr操縱子的ptsH基因(WO 03/004674)，·編碼PTS磷酸轉移酶系統的酶I的ptsHIcrr操縱子的ptsI基因(WO 03/004674)，·編碼PTS磷酸轉移酶系統的葡萄糖特異性IIA成分的ptsHIcrr操縱子的crr基因(WO 03/004674)，·編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，·編碼亮氨酸調節子的調節物的1rp基因(WO 03/004665)，·編碼fad調節子的調節物的fadR基因(WO 03/038106)，·編碼中心中間代謝(central intermediate metabolism)的調節物的iclR基因(WO 03/038106)，·編碼烷基過氧化氫還原酶的小亞基的ahpCF操縱子的ahpC基因(WO 03/004663)，
·編碼烷基過氧化氫還原酶的大亞基的ahpCF操縱子的ahpF基因(WO 03/004663)，·編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，·編碼cys調節子的調節物的cysB基因(WO 03/006666)，·編碼NADPH亞硫酸還原酶黃素蛋白的cysJIH操縱子的cysJ基因(WO 03/006666)，·編碼NADPH亞硫酸還原酶血紅素蛋白的cysJIH操縱子的cysI基因(WO 03/006666)，·編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysJIH操縱子的cysH基因(WO03/006666)，·編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操縱子的rseA基因(WO 03/008612)，·編碼sigmaE因子的全局調節物的rseABC操縱子的rseC基因(WO 03/008612)，·編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucABCD操縱子的sucA基因(WO 03/008614)，·編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶E2亞基的sucABCD操縱子的sucB基因(WO 03/008614)，·編碼琥珀酰-CoA合成酶的β亞基的sucABCD操縱子的sucC基因(WO 03/008615)，·編碼琥珀酰-CoA合成酶的α亞基的sucABCD操縱子的sucD基因(WO 03/008615)，·編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E1成分的aceE基因(WO03/076635)，·編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E2成分的aceF基因(WO03/076635)，
·編碼sigmaE因子活性的調節物的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))，和·大腸桿菌yodA可讀框(ORF)的基因產物(Accession NumberAE000288，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA，DE10361192.4)。
此外，為了生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸，除增強可讀框yaaU之外，弱化特別是消除或降低選自如下一組的一或多個基因的表達對生產L-氨基酸特別是蘇氨酸是有利的·編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，·編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives inMicrobiology 14936-42(1987))，·大腸桿菌yjfA可讀框(ORF)的基因產物(Accession NumberAAC77180，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·大腸桿菌ytfP可讀框(ORF)的基因產物(Accession NumberAAC77179，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，·編碼磷酸轉移酶系統的DgsA調節物的dgsA基因(WO02/081721)，其也已知稱作mlc基因，·編碼果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，其也已知稱作cra基因，·編碼sigma38因子的rpoS基因(WO 01/05939)，其也已知稱作katF基因，和
·編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因(WO 03/008603)。
在本申請中，術語“弱化”描述的是在微生物中由相應的DNA所編碼的一或多種酶或蛋白質的胞內活性或濃度的降低或消除，例如通過使用較親代菌株或非相應酶或蛋白質重組體微生物中的啟動子更弱的啟動子、或編碼具有較低活性的相應酶或蛋白質的基因或等位基因、或滅活相應酶或蛋白質或所述可讀框或基因，及在適當的地方組合使用這些措施。
通常，弱化措施使得相應蛋白質的活性或濃度降低至野生型蛋白質的活性或濃度，或親代菌株或非相應酶或蛋白質重組體微生物的蛋白質的活性或濃度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。親代菌株或非重組體微生物是指實施了本發明的措施的微生物。
為了實現弱化，例如可以降低或消除所述基因或可讀框的表達或所述酶蛋白的催化特性。在適當的地方，可組合使用這兩種措施。
可以通過遺傳修飾(突變)用于基因表達的信號結構，或通過反義RNA技術，以適當的方式進行培養而降低基因表達。用于基因表達的信號結構例如是阻遏基因、激活基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結合位點、起始密碼子和終止子。本領域技術人員尤其可在如下文獻中發現此方面的信息，例如Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))、Carrier和Keasling(Biotechnology Progress 1558-64(1999))、Franch和Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3159-164(2000))，以及遺傳學和分子生物學的已知教科書例如由Knippers所提供的教科書(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”，6th edition，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，1995)或Winnacker所提供的教科書(“Gene und Klone[Genes and Clones]”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)。
導致酶蛋白催化特性的改變或降低的突變是現有技術中所已知的。可提及的例子如Qiu和Goodman (Journal of BiologicalChemistry 2728611-8617(1997))、Yano et al.(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 955511-5515(1998))以及Wente和Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 26620833-20839(1991))等文章。綜述可參見遺傳學和分子生物學的已知教科書，如由Hagemann所提供的教科書(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可考慮的突變有至少一個(1)堿基對或核苷酸的轉換、顛換、插入和缺失。根據突變引發的氨基酸取代對酶活性的影響，參見錯義突變或無義突變。錯義突變使得蛋白質中的給定氨基酸被不同的氨基酸所置換，所述氨基酸置換尤其是非保守性的。這因此削弱了所述蛋白質的功能性或活性，并將其降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％的量。無義突變在基因的編碼區產生了一個終止密碼子，并因此提前終止翻譯。基因中至少一個堿基對的插入或缺失導致了移碼突變，這反過來導致摻入不正確的氨基酸或導致翻譯提前終止。如果所述突變的結果是在編碼區形成一個終止密碼子，這隨后也會導致翻譯提前終止。典型地，至少一個(1)或多個密碼子的缺失也將導致酶活性的完全喪失。
產生這些突變的指示屬于現有技術，且可以從遺傳學和分子生物學的已知教科書獲得例如由Knippers所著教科書(“MolekulareGenetik[Molecular Genetics]”，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker所著教科書“Gene und Klone，[Genes and Clones]”，VHC Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann所著教科書(“Allgemeine Genetik [GeneralGenetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可以將基因中的適當突變通過基因或等位基因交換摻入適當的菌株中。一種常用的方法是Hamilton et al.(Journal of Bacteriologv1714617-4622(1989))所描述的利用條件復制型pSC101衍生物pMAK705的基因交換方法。也可以使用現有技術中所描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1817143-7148(1999))或Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182842-847(2000))所描述的方法。
同樣可以將相關基因中的突變或影響相關基因或可讀框的表達的突變以連合或轉導的方式轉移至不同的菌株中。
此外，為了生產L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸，除增強可讀框yaaU之外，消除不需要的副反應是有利的(Nakayama“Breeding ofAmino Acid Producing Microorganisms”，inOverproduction ofMicrobial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據本發明所制備的微生物可以在分批工藝、補料分批工藝、重復補料分批工藝或連續發酵工藝(DE102004028859.3或US5,763,230)中進行培養。已知的培養方法概述于Chmiel所著教科書(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocess technology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas所著教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralinstallations](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中。
待使用的培養基必須以適當方式滿足特定菌株的需求。美國細菌學會(The American Society for Bacteriology)手冊“Manual ofMethods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)包含用于培養多種微生物的培養基的描述。
可以將糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉以及適當的地方纖維素、油和脂肪(如豆油、葵花油、花生油和椰子油)、脂肪酸(如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)、醇如甘油和乙醇、及有機酸如乙酸用作碳源。這些物質可單獨或混合使用。
可以將含氮的有機化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素)或無機化合物(如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)用作氮源。氮源可單獨或混合使用。
可以將磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽用作磷源。此外，培養基還必須含有生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用基本生長促進劑如氨基酸和維生素。還可將適當的前體添加到所述培養基中。上述成分可以單批混合物的形式或在培養過程中適當地添加到培養物中。
通常在pH 5.5-9.0，尤其是pH 6.0-8.0的范圍內進行發酵。可以適當的方式使用堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水、或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調節培養物的pH值。消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產生。可以將適當的選擇性作用物質例如抗生素添加到培養基中以維持質粒的穩定性。氧或含氧氣體混合，例如空氣，可通入培養物中以維持需氧條件。培養溫度通常在25℃～45℃，優選30℃～40℃。持續培養直至L-氨基酸或L-蘇氨酸形成最大量。這一目的通常在10～160小時的范圍內達到。
可以通過如Spackman et al.(Analytical Chemistry 301190-1206(1958))中所述的陰離子交換層析繼以茚三酮衍生化作用的方式，或通過如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))中所述的反相HPLC對L-氨基酸進行分析。
根據本發明的方法可用于發酵生產L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸，尤其是L-蘇氨酸。
根據布達佩斯條約將以下微生物保藏在德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ，不倫瑞克，德國)大腸桿菌菌株E.coli MG442，保藏號DSM 16574。
本發明借助于以下實施例得以更詳述的闡述。
用于大腸桿菌的基本培養基(M9)和完全培養基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)所描述。將質粒DNA從大腸桿菌中分離及所用用于限制、連接、以及用Klenow磷酸酶和堿性磷酸酶處理的技術均如Sambrook et al.(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述技術進行。除非特別說明，大腸桿菌的轉化按照Chung et al.(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 862172-2175(1989))所述方法進行。
制備菌株和轉化體的溫育溫度為37℃。
實施例實施例1構建表達質粒pTrc99AyaaU使用聚合酶鏈反應(PCR)及合成寡核苷酸擴增大腸桿菌K12yaaU ORF。基于大腸桿菌K12 MG1655中的yaaU ORF的核苷酸序列(登錄號AE000114)合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)，Blattner et al.(Science 2771453-1474(1997))。對引物序列進行修飾以形成識別位點用于限制性酶消化。選擇EcoRI識別序列為yaaU-exl引物，選擇BamHI識別序列為yaaU-ex2引物，這些序列在以下所示的核苷酸序列中帶有下劃線yaaU-ex15′-GATCTGAATTCTAAGGAATAACCATGCAACCGTC-3′(SEQ ID No.1)yaaU-ex25′-GATCTAGGATCCCAATTTACCCCATTCTCTGC-3′(SEQ ID No.2)使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)根據廠商的說明分離用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA。在標準PCR條件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，Academic Press)，使用Vent DNA聚合酶(New England Biolaps GmbH，Frankfurt，Germany)和所述特異性引物可擴增到大小為約1371bp的DNA片段。
將擴增的yaaU片段根據廠商說明與載體pCR-Blunt II-TOPO(Zero TOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Netherlands)連接并轉化入大腸桿菌菌株TOP10中。在含50μg/ml卡拉霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。在分離質粒DNA后，將載體用酶EcoRV和EcoRI切割，并在0.8％瓊脂糖凝膠上檢查該切割后，將該載體命名為pCRBluntyaaU。
然后用酶EcoRI和BamHI切割載體pCRBluntyaaU，并在0.8％瓊脂糖凝膠上分離yaaU片段；然后將其從凝膠上分離(QIAquick GelExtraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)并與載體pTrc99A相連接(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，該載體已用酶BamHI和EcoRI消化。將大腸桿菌菌株XL1Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，USA)用連接混合物轉化，并在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。
分離質粒DNA后，通過用酶EcoRI/BamHI和EcoRV進行對照切割可以證明克隆成功的事實。
該質粒被命名為pTrc99AyaaU(圖1)。
實施例2使用菌株MG442/pTrc99AyaaU制備L-蘇氨酸生產L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442記載于專利說明書US-A-4,278,765中，該菌株被保藏于俄羅斯國家工業微生物保藏中心(VKPM，莫斯科，俄羅斯)，保藏號CMIM B-1628；并根據布達佩斯條約保藏于德國微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)，保藏號DSM 16574。
用實施例1中所描述的表達質粒pTrc99AyaaU和載體pTrc99A轉化菌株MG442，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。這生成了菌株MG442/pTrc99AyaaU和MG442/pTrc99A。然后將所選擇的各個克隆在具有如下成分的基本培養基上進一步增殖3.5g/L Na2HPO4*2H2O、1.5g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl，0.1g/L MgSO4*7H2O、2g/L葡萄糖、20g/L瓊脂和50mg/l氨芐青霉素。
在100ml錐形瓶中的10ml分批培養物中檢測L-蘇氨酸的形成。為此，接種具有如下成分的10ml預培養基2g/L酵母提取物、10g/L(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、0.5g/L MgSO4*7H2O、15g/LCaCO3、20g/L葡萄糖和50mg/l氨芐青霉素；并將混合物在來自Kühner AG ESR培養箱(Birsfelden，Switzerland)上，于37℃和180rpm溫育16小時。將250μl這種預培養物接種到10ml生產培養基中(25g/l(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4*7H2O、0.03g/LFeSO4*7H2O、0.018g/L MnSO4*1H2O、30g/L CaCO3、20g/L葡萄糖和50mg/l氨芐青霉素)，并于37℃溫育48小時。以相同的方式，但不添加氨芐青霉素到所述培養基中，檢測起始菌株MG442所形成的L-蘇氨酸。溫育后，培養物上清液的光密度(OD)用Dr.Lange LP2W光度計(Düsseldorf，Germany)在660nm測定波長測定。
然后使用Eppendorf-BioTronik氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)，通過離子交換層析和包括茚三酮檢測的柱后反應，測定已過濾滅菌的培養物上清中所生成的L-蘇氨酸的濃度。
實驗結果示于表1中。
表1
圖1含有yaaU基因的質粒pTrc99AyaaU的圖譜。
長度為近似值。所用縮寫和名稱具有如下含義·bla編碼氨芐青霉素抗性的基因·lac Iq編碼trc啟動子抑制物蛋白的基因·trctrc啟動子區域，IPTG-誘導型·yaaUyaaU基因的編碼區·5S5S rRNA區域·rrnBTrRNA終止區用于限制性酶的縮寫具有如下含義·BamHI來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens H)的限制性核酸內切酶·EcoRI來自大腸桿菌RY13的限制性核酸內切酶·EcoRV來自大腸桿菌B946的限制性核酸內切酶序列表<110>德古薩股份公司<120>使用腸桿菌科菌株制備L-氨基酸的方法<130>030321 BT<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>34<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<221>Primer<222>(1)..(32)<223>yaaU-ex2<400>2gatctaggat cccaatttac cccattctct gc32<210>3<211>1372<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
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Leu Gly Ala Gly Thr Leu Ala Gly Leu Phe Val Gly Thr Ser Leu Phe60 65 70ggt tat att tcc gat aaa gtc gga cgg cgc aaa atg ttc ctc att gat291Gly Tyr Ile Ser Asp Lys Val Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Ile Asp75 80 85atc atc gcc atc ggc gtg ata tcg gtg gcg acg atg ttt gtt tca tcc339Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Ser90 95 100 105ccc gtc gaa ctg ttg gtg atg cgg gta ctt atc ggc att gtc atc ggt387Pro Val Glu Leu Leu Val Met Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly110 115 120gca gat tat ccc atc gcc acc tca atg atc acc gag ttc tcc agt acc435Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Ser Thr125 130 135cgt cag cgg gcg ttt tcc atc agc ttt att gcc gcg atg tgg tat gtc483Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val140 145 150ggc gcg acc tgt gcc gat ctg gtc ggc tac tgg ctt tat gat gtg gaa
531Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu155 160 165ggc ggc tgg cgc tgg atg ctg ggt agc gcg gcg atc ccc tgt ttg ttg579Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu170 175 180 185att ttg att ggt cga ttc gaa ctg cct gaa tct ccc cgc tgg tta tta627Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu190 195 200cgc aaa ggg cga gta aaa gag tgc gaa gag atg atg atc aaa ctg ttt675Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe205 210 215ggc gaa ccg gtg gct ttc gat gaa gag cag ccg cag caa acc cgt ttt723Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp Glu Glu Gln Pro Gln Gln Thr Arg Phe220 225 230cgc gat ctg ttt aat cgc cgc cat ttt cct ttt gtt ctg ttt gtt gcc771Arg Asp Leu Phe Asn Arg Arg His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala235 240 245
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430 435 440atg ggg taa attgggatcc tagatc1372Met Gly<210>4<211>443<212>PRT<213>Escherichia coli<400>4Met Gln Pro Ser Arg Asn Phe Asp Asp Leu Lys Phe Ser Ser Ile His1 5 10 15Arg Arg Ile Leu Leu Trp Gly Ser Gly Gly Pro Phe Leu Asp Gly Tyr20 25 30Val Leu Val Met Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu35 40 45Lys Leu Asp Ala Asp Trp Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Thr Leu Ala50 55 60Gly Leu Phe Val Gly Thr Ser Leu Phe Gly Tyr Ile Ser Asp Lys Val65 70 75 80Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Ile Asp Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile85 90 95Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Ser Pro Val Glu Leu Leu Val Met100 105 110Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr115 120 125Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Ser Thr Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile130 135 140
Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu145 150 155 160Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu180 185 190Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp210 215 220Glu Glu Gln Pro Gln Gln Thr Arg Phe Arg Asp Leu Phe Asn Arg Arg225 230 235 240His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala Ala Ile Trp Thr Cys Gln Val245 250 255Ile Pro Met Phe Ala Ile Tyr Thr Phe Gly Pro Gln Ile Val Gly Leu260 265 270Leu Gly Leu Gly Val Gly Lys Asn Ala Ala Leu Gly Asn Val Val Ile275 280 285Ser Leu Phe Phe Met Leu Gly Cys Ile Pro Pro Met Leu Trp Leu Asn290 295 300Thr Ala Gly Arg Arg Pro Leu Leu Ile Gly Ser Phe Ala Met Met Thr305 310 315 320Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Ile Pro Asp Met Gly Ile Trp Leu325 330 335Val Val Met Ala Phe Ala Val Tyr Ala Phe Phe Ser Gly Gly Pro Gly340 345 350Asn Leu Gln Trp Leu Tyr Pro Asn Glu Leu Phe Pro Thr Asp Ile Arg355 360 365Ala Ser Ala Val Gly Val Ile Met Ser Leu Ser Arg Ile Gly Thr Ile
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<221>CDS<222>(1)..(1395)<223>yaaU coding region<400>5atg caa ccg tcc aga aac ttt gac gat ctc aaa ttc tcc tct att cac48Met Gln Pro Ser Arg Asn Phe Asp Asp Leu Lys Phe Ser Ser Ile His1 5 10 15cgc cgc att ttg ctg tgg gga agc ggt ggt ccg ttt ctg gat ggt tat96Arg Arg Ile Leu Leu Trp Gly Ser Gly Gly Pro Phe Leu Asp Gly Tyr20 25 30gta ctg gta atg att ggc gtg gcg ctg gag caa ctg act ccg gcg ctg144Val Leu Val Met Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu35 40 45
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130 135 140agc ttt att gcc gcg atg tgg tat gtc ggc gcg acc tgc gcc gat ctg480Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu145 150 155 160gtc ggc tac tgg ctt tat gat gtg gaa ggt ggt tgg cgc tgg atg ctg528Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175ggt agc gcg gcg atc cct tgt ttg ttg att ttg att ggt cga ttc gaa576Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu180 185 190ctg cca gaa tct ccc cgc tgg tta tta cgc aaa ggg cga gta aaa gag624Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205tgc gaa gag atg atg ata aaa ctg ttt ggc gaa ccg gtg gct ttc gat672Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp210 215 220gaa gag cag ccg cag caa acc cgt ttt cgc gat ctg ttt aat cgc cge720
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1008Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Ile Pro Asp Met Gly Ile Trp Leu325 330 335gta gtg atg gcc ttt gcg gtg tat gcc ttt ttc tct ggc ggg ccg ggt1056Val Val Met Ala Phe Ala Val Tyr Ala Phe Phe Ser Gly Gly Pro Gly340 345 350aat ttg cag tgg ctc tat cct aat gaa ctc ttc ccg acg gat atc cgc1104Asn Leu Gln Trp Leu Tyr Pro Asn Glu Leu Phe Pro Thr Asp Ile Arg355 360 365gcc tct gcc gtg ggc gtg att atg tcc tta agt cgt att ggc acc att1152Ala Ser Ala Val Gly Val Ile Met Ser Leu Ser Arg Ile Gly Thr Ile370 375 380gtt tcg acc tgg gca ctg ccg ata ttt atc aat aat tac ggt atc agt1200Val Ser Thr Trp Ala Leu Pro Ile Phe Ile Asn Asn Tyr Gly Ile Ser385 390 395 400aac acg atg cta atg ggg gcg ggt atc tcg ctg ttt ggc ttg ttg att1248Asn Thr Met Leu Met Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Gly Leu Leu Ile405 410 415
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336Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Thr Pro Leu Glu Leu Leu Val Met100 105 110cgc gtt tta att ggc att gtt atc ggc gcg gat tac cct atc gct act384Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr115 120 125tcc atg att acg gag ttt tcc aac acc cgc cag cgc gcg ttc tcc atc432Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Asn Thr Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile130 135 140ggt ttt atc gcc gcg atg tgg tac gtc ggc gcg acc tgc gcc aac ctg480Gly Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asn Leu145 150 155 160gtg ggc tac tgg ctg tat gac atg gaa ggc ggc tgg cgt tgg atg ctt528Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Met Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175ggc agc gcc ttt atc ccg tgc tta atc att ttg att ggc cgc ttt gac576Gly Ser Ala Phe Ile Pro Cys Leu Ile Ile Leu Ile Gly Arg Phe Asp180 185 190
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20 25 30Val Leu Val Ile Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Leu Leu35 40 45His Leu Asp Ala Glu Trp Ile Gly Ala Leu Gly Ala Ala Thr Leu Ala50 55 60Gly Leu Phe Ile Gly Thr Ser Leu Phe Gly Tyr Ile Cys Asp Lys Val65 70 75 80Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Leu Asp Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile85 90 95Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Thr Pro Leu Glu Leu Leu Val Met100 105 110Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr115 120 125Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Asn Thr Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile130 135 140Gly Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asn Leu145 150 155 160Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Met Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175Gly Ser Ala Phe Ile Pro Cys Leu Ile Ile Leu Ile Gly Arg Phe Asp180 185 190Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205Cys Glu Gln Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Cys Phe Asp210 215 220Asp Glu Leu Pro Gln Glu Thr Arg Phe Leu Gln Leu Phe Asn Arg Arg225 230 235 240His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala Ala Ile Trp Thr Cys Gln Val245 250 255
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1.含有增強的或過表達的yaaU ORF的腸桿菌科的重組微生物，其編碼一種為推定的糖轉運蛋白的多肽，且其以一種改良的方式生產L-氨基酸。
2.權利要求1所述的微生物，其中一種多核苷酸被增強，所述多核苷酸編碼一種多肽，該多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性為至少90％。
3.權利要求2所述的微生物，特征在于其含有一種過表達的或增強的多核苷酸，所述多核苷酸對應于yaaU ORF并選自a)具有來自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內對應于SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴格條件下，與序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的互補序列雜交的序列的多核苷酸序列；和d)具有含有在功能上為中性意義的突變的序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的多核苷酸。
4.權利要求2所述的微生物，其特征在于所述多肽具有與選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的一種序列的相同性為至少95％的氨基酸序列。
5.權利要求2所述的微生物，其特征在于所述多肽具有與來自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性為100％的氨基酸序列。
6.權利要求1-5中任一項所述的微生物，其特征在于所述微生物是用含有所述yaaU ORF、該ORF的等位基因、或其部分、和/或啟動子的載體，通過轉化、轉導或接合、或這些方法的組合而產生的。
7.權利要求1或6所述的微生物，其中所述yaaU ORF或所述等位基因的拷貝數增加至少一個拷貝。
8.權利要求7所述的微生物，其特征在于通過將所述ORF或所述等位基因摻入所述微生物的染色體而實現增加至少一個拷貝的yaaU ORF。
9.權利要求7所述的微生物，其特征在于通過在染色體外進行復制的載體實現增加至少一個拷貝的yaaU ORF。
10.權利要求1或2所述的微生物，其特征在于為了實現增強，a)位于所述yaaU ORF的上游的啟動子和調節區域或核糖體結合位點是突變的；或b)表達盒或啟動子被摻入所述yaaU ORF的上游。
11.權利要求1或2所述的微生物，其特征在于所述yaaU ORF位于增強所述基因表達的啟動子的控制下。
12.權利要求1-11中任一項所述的微生物，其特征在于增強yaaU ORF使yaaU基因產物(蛋白質)的濃度或活性在親代菌株或非yaaU ORF重組體微生物中的基因產物的活性或濃度的基礎上增加至少10％。
13.權利要求1-12中任一項所述的微生物，其特征在于所需的L-氨基酸的生物合成代謝途徑中的其它基因也以增強的尤其是過表達的形式存在。
14.權利要求13所述的微生物，其特征在于所述微生物選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。
15.權利要求1-14中任一項所述的微生物，其特征在于該微生物產生L-蘇氨酸。
16.一種通過發酵腸桿菌科的重組微生物而生產L-氨基酸的方法，其特征在于a)在培養基中培養所需的L-氨基酸生產微生物，所述微生物中的yaaU ORF或編碼其基因產物的核苷酸序列或等位基因被增強尤其是過表達，所述培養在所需L-氨基酸在培養基或細胞中富集的條件下進行；和b)分離所需的L-氨基酸，其中發酵液組分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分離的產物中或被完全除去。
17.權利要求16所述的方法，其特征在于使用權利要求1-15中任一項所述的微生物。
18.權利要求16或17所述的方法，其特征在于為了生產L-蘇氨酸，發酵腸桿菌科的微生物，其中選自以下一組的一或多個基因被同時額外增強，尤其是過表達18.1至少一種編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的基因；18.2編碼丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因；18.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因；18.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；18.5編碼嘧啶轉氫酶亞基的pntA和pntB基因；18.6編碼介導高絲氨酸抗性的蛋白質的rhtB基因；18.7編碼介導蘇氨酸抗性的蛋白質的rhtC基因；18.8編碼蘇氨酸輸出載體蛋白的谷氨酸棒桿菌的thrE基因；18.9編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因；18.10編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因；18.11編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因；18.12編碼磷酸-組氨酸蛋白質己糖磷酸轉移酶的ptsH基因；18.13編碼磷酸轉移酶系統的酶I的ptsI基因；18.14編碼葡萄糖特異性IIA成分的crr基因；18.15編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因；18.16編碼亮氨酸調節子的調節物的lrp基因；18.17編碼fad調節子的調節物的fadR基因；18.18編碼中心中間代謝的調節物的iclR基因；18.19編碼烷基過氧化氫還原酶的小亞基的ahpC基因；18.20編碼烷基過氧化氫還原酶的大亞基的ahpF基因；18.21編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因；18.22編碼cys調節子的調節物的cysB基因；18.23編碼NADPH亞硫酸還原酶黃素蛋白的cysJ基因；18.24編碼NADPH亞硫酸還原酶血紅素蛋白的cysI基因；18.25編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因；18.26編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseA基因；18.27編碼sigmaE因子的全局調節物的rseC基因；18.28編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因；18.29編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶E2亞基的sucB基因；18.30編碼琥珀酰-CoA合成酶的β亞基的sucC基因；18.31編碼琥珀酰-CoA合成酶的α亞基的sucD基因；18.32編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E1成分的aceE基因；18.33編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E2成分的aceF基因；18.34編碼sigmaE因子活性的調節物的rseB基因；和18.35大腸桿菌yodA可讀框(ORF)的基因產物。
19.權利要求16-18中任一項所述的方法，其特征在于使用其中降低所需L-氨基酸的形成的代謝途徑被至少部分弱化的微生物。
20.權利要求19所述的方法，其特征在于為了生產L-蘇氨酸，發酵腸桿菌科的微生物，所述微生物中一或多個選自以下一組的基因被同時額外地弱化尤其是消除，或它們的表達被降低20.1編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因；20.2編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因；20.3大腸桿菌yjfA可讀框(ORF)的基因產物；20.4大腸桿菌ytfP可讀框(ORF)的基因產物；20.5編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因；20.6編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因；20.7編碼磷酸轉移酶系統的DgsA調節物的dgsA基因；20.8編碼果糖阻抑物的fruR基因；20.9編碼sigma38因子的rpoS基因；和20.10編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因。
21.權利要求16-20中任一項所述的方法，其特征在于制備選自L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸的L-氨基酸。
22.權利要求21述的方法，其特征在于制備選自L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸的L-氨基酸。
全文摘要
本發明涉及通過發酵腸桿菌科的重組微生物而生產L－氨基酸的方法，其特征在于a)在培養基中培養所需的L－氨基酸生產微生物，在所述微生物中可讀框yaaU或編碼其基因產物的核苷酸序列或等位基因被增強尤其是過表達，所述培養在所需L－氨基酸在培養基或細胞中富集的條件下進行；和b)分離所需的L－氨基酸，任選地，發酵液組分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分離的產物中或被完全除去。
文檔編號C07K14/245GK1898392SQ200480038807
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月10日 優先權日2003年12月24日
發明者妮科爾·杜施 申請人:德古薩股份公司