調節細胞存活、分化和/或突觸可塑性的方法

專利名稱：：調節細胞存活、分化和/或突觸可塑性的方法
技術領域：
：本發明涉及通過提供能夠調節兩個單獨的神經細胞粘著分子(NCAM)之間的相互作用的化合物，調節細胞分化和/或存活的方法。本發明還涉及篩選能夠調節兩種單獨的NCAM的Ig1、Ig2和/或Ig3組件之間的相互作用的候選化合物的方法。本發明還涉及所鑒定的候選化合物在制造藥物中的用途。
背景技術：
：神經細胞粘著分子，NCAM，通過同嗜性(homophilic)(NCAM-NCAM)結合，介導細胞-細胞粘著。NCAM在神經發育、神經元分化和突觸可塑性(包括學習和記憶鞏固)中具有關鍵作用。細胞間相互作用在種類繁多的生物學過程(包括細胞遷移、存活和分化)中扮演著至關重要的角色。這些現象依賴于由細胞-細胞粘著分子(CAM)介導的細胞表面蛋白質識別。神經細胞粘著分子NCAM最初被描述為突觸膜蛋白(Jrgensen和Bock，1974)，后來被證實介導細胞-細胞粘著，該分子是第一個被鑒定的哺乳動物細胞粘著分子。NCAM屬于免疫球蛋白(Ig)超家族。mRNA的可變剪接和翻譯后修飾導致大量NCAM同種型的產生。三種主要的NCAM同種型具有由5個Ig組件和2個纖連蛋白III型組件組成的相同細胞外部分。已知NCAM通過同嗜性(NCAM與NCAM結合)和異嗜性(NCAM與其它分子結合)相互作用，介導Ca2+非依賴性細胞-細胞和細胞-基質粘著(Berezin等，2000)。已經證實NCAM的不同組件發揮不同的功能。NCAM與各種細胞外基質成分諸如肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素蛋白聚糖和不同類型的膠原結合。肝素結合序列位于Ig2組件上。NCAM也結合神經細胞粘著分子L1。此相互作用被認為發生在NCAM的第4Ig組件與表達在L1上的低聚甘露糖苷部分之間。盡管進行了大量研究，但是NCAM同嗜性結合的精確機制仍不清楚，而且，已公開的結果在某種程度上是矛盾的。最初報道NCAM同嗜性結合依賴于兩個相對NCM分子的Ig3組件間的反平行相互作用。在表達缺失不同Ig組件的雞NCAM的小鼠L細胞上進行的細胞聚積實驗，說明涉及Ig3組件。后來，使用包被了雞NCAM的各單個重組Ig組件的微球，證明結合發生在Ig1和Ig5組件之間以及Ig2和Ig4組件之間，而包被了Ig3的微球表現出強烈的自我聚集(Ranheim等，1996)。然而，Atkins等(2001)對雞NCAMIg3組件的溶液結構研究，包括超速離心實驗，沒有支持提議的這種Ig3二聚體化。通過表面等離子體共振分析，證明了大鼠Ig1和Ig2的重組組件之間的結合(Kiselyov等，1997)。大鼠Ig1和Ig2各單個組件和雞Ig1組件的三維結構已經通過核磁共振(NMR)光譜術確定，從而導致對參與Ig1和Ig2組件間同嗜性結合的氨基酸殘基的鑒定(Thomsen等，1996；Jensen等，1999；Atkins等，1999)。大鼠NCAM的Ig1-2片段的晶體結構提供了有關十字樣Ig1-2二聚體的詳細信息，并且指出了該相互作用中的關鍵殘基，即F19和Y65(Kasper等，2000)。近來證實，F19的點突變(F19S)不影響由全長NCAM介導的細胞聚集，但是它徹底破壞原本在溶液中發生的Ig1-2-3片段的二聚體化(Atkins等，2001)。因此，這些結果對提議的NCAM同嗜性結合的Ig3-Ig3(Rao等，1992；Ranheim等，1996)和Ig1-Ig2(Kiselyov等，1997；Kasper等，2000)模型提出了質疑。因此，科學文獻中已經描述了NCAM的兩個不重疊的同嗜性結合位點Ig3-Ig3和Ig1-Ig2的結合位點。已經證明來自這兩個結合位點的序列能夠刺激神經突向外生長(outgrowth)和調節神經細胞的粘著(WO03020749，Soroka等，2002；Rao等，1992；Ranheim等，1996)。還證實，能夠與Ig3-Ig3結合位點結合的肽序列不干擾由Ig1-Ig2結合位點介導的生物學效應，反之亦然。這后一發現說明，NCAM同嗜性粘著不僅僅是兩個獨立NCAM分子通過多個同嗜性結合位點發生機械結合的機制，而是具有比此復雜得多的機制，而且在NCAM介導的過程中涉及一個或另一個同嗜性結合位點可能取決于具體的NCAM環境，諸如例如一個或另一個結合位點的配體的存在、或者一個或另一位點在結合中的可用性。本發明通過提供能夠與NCAM的Ig1、Ig2和/或Ig3組件在新的同嗜性結合位點結合的化合物，提供了調節這些過程的方法。發明概述根據本發明，通過提供針對NCAM的不同同嗜性結合位點的配體，可以精細地調節NCAM在與神經細胞可塑性有關的不同過程的分子機制中的參與情況，并由此調節這些過程。因此，本發明涉及能夠調節粘著、誘導分化、和促進再生、神經元可塑性和表達NCAM的細胞的存活的化合物，以及篩選和利用這些化合物的方法。本發明一方面涉及調節神經細胞粘著分子(NCAM)呈現細胞(NCAMpresentingcell)的細胞分化和/或存活的方法，包括a)提供候選化合物，它能夠i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，b)提供至少一個NCAM呈現分子；c)使至少一個NCAM呈現分子與所述候選化合物接觸，由此調節至少一個NCAM呈現分子的細胞分化和/或存活。另一方面，本發明涉及檢測化合物是否能夠通過由NCAM分子的Ig1、Ig2和Ig3組件組成的同嗜性結合位點，通過調節如下相互作用，調節兩個獨立的NCAM分子之間的相互作用的方法，所述相互作用是i)一個獨立NCAM分子的Ig1組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用，和/或ii)一個獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用，和/或iii)一個獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用所述方法包括a)提供化合物；b)提供至少一個獨立的NCAM分子片段或所述獨立片段的片段，其中所述片段包含一段對應于含有SEQIDNO44所示序列第1至289位殘基的NCAMIg1-2-3組件序列的連續氨基酸殘基序列，c)通過使化合物與(b)的片段接觸，檢查所述化合物是否能夠i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段；d)選擇能夠進行(c)的至少一種相互作用的化合物作為能夠調節呈現NCAM細胞的分化、粘著和/或存活的候選化合物。在另一方面，本發明提供選擇能夠通過調節如下相互作用調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的候選化合物的方法，所述相互作用是i)一個獨立NCAM分子的Ig1組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用；和/或ii)一個獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用；和/或iii)一個獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig2組件的相互作用；所述方法包括步驟a)提供包含NCAMIg1-2-3組件的可溶性或晶體多肽，b)使用計算機建模技術，產生(a)的NCAMIg1-2-3組件的結構模型；c)通過使用(c)的MCAMIg1-2-3組件的結構模型，在計算機上(insilico)評價化合物i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間相互作用的能力，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間相互作用的能力，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間相互作用的能力，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間相互作用的能力，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間相互作用的能力，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子；d)選擇能夠進行(b)的至少一種相互作用的候選化合物，和e)在體外或體內試驗中檢查(d)的候選化合物調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的能力，所述試驗包含至少一個NCAM呈現細胞，和/或f)在如下試驗中檢查(d)的候選化合物，所述試驗包括通過使化合物與至少一個獨立的NCAM分子片段接觸，評價化合物進行(b)的至少一種相互作用的能力，所述片段包含對應于含有SEQIDNO44所示序列第1至289位殘基的NCAMIg1-2-3組件序列的連續氨基酸殘基序列。因此，本發明的一個目的是提供包含NCAM的Ig1-2-3組件的晶體蛋白和制備所述晶體蛋白的方法。本發明還提供具有如下能力的化合物，所述能力為i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。本發明還涉及使用通過上述方法選擇的化合物制造藥物，以及包含它的藥物組合物。附圖簡述圖1給出晶體學數據和精化統計數據。圖2給出Ig1-2-3組件晶體的原子結構坐標。圖32.0分辨率的大鼠NCAMIg1-2-3片段的晶體結構。(A)Cα主鏈立體示意圖，其中標出了每第10個殘基。(B)帶狀圖，其中根據IgI組命名原則標出β鏈。圖4NCAM的Ig1-2-3片段的晶體結構揭示出4種主要的組件-組件相互作用和兩類Ig1-2-3排列。顯示了相互作用的Ig1-2-3順式二聚體(由Ig1-Ig2結合所介導)的空間填充模型。白色橢圓指示Ig1與Ig2(Ig1-Ig2)、Ig1與Ig3(Ig1-Ig3)、Ig2與Ig2(Ig2-Ig2)、和Ig2與Ig3(Ig2-Ig3)的相互作用位點。白色正方形指示Ig2模塊的肝素結合位點(殘基133-148)。箭頭指示Asn203(Asn203由白色三角標出)的N-連接糖基化的位置。N和C表示末端。(A，B)Ig1-2介導的Ig1-2-3片段順式二聚體通過Ig2-Ig3介導的反式相互作用形成“平”拉鏈，反映了相對細胞上的兩個NCAM分子之間的相互作用。(C，D)Ig1-2-3片段順式二聚體也通過Ig1-Ig3和Ig2-Ig2反式相互作用形成不對稱的“緊湊”拉鏈。兩個順式二聚體通過拉鏈一邊的兩個Ig1-Ig3相互作用(完整的橢圓)和拉鏈另一邊的一個Ig2-Ig2相互作用(點繪的橢圓)結合在一起。B和D的視角分別與A和C的垂直。圖5NCAMIg1-2-3片段中相互作用界面的近視圖。(A)Ig1-Ig2相互作用界面。Ig1和Ig2組件屬于兩個不同的獨立Ig1-2-3片段，這兩個Ig1-2-3片段形成一個Ig1-2-3順式二聚體。(B)Ig2-Ig3相互作用界面。(C)Ig2-Ig2相互作用界面。(D)Ig1-Ig3相互作用界面。在B-D中，帶子表示來自屬于各個不同Ig1-2-3順式二聚體的兩個相互作用Ig1-2-3片段的組件。氫鍵用虛線表示。圖6Ig3組件、P1-B、P3-DE、P3-G、P3-B肽及其衍生物對自表達NCAM的PC12-E2細胞的神經突向外生長的影響，所述細胞培養在NCAM轉染的成纖維細胞匯合單層頂上。(A-F)培養在載體轉染的(A，C，E)或NCAM-140轉染的(B，D，F)L929成纖維細胞匯合單層頂上的、表達NCAM的嗜鉻細胞瘤PC12-E2細胞的共聚焦顯微照片。相對于生長在NCAM陰性(LVN)成纖維細胞頂上的PC12-E2細胞(A)，NCAM-NCAM相互作用刺激生長在表達NCAM(LBN)的成纖維細胞頂上的PC12-E2細胞(B)中的神經突向外生長。重組Ig3組件的引入不影響生長在載體轉染的成纖維細胞上的PC12-E2細胞(C)，但是通過破壞NCAM-NCAM相互作用而清楚地抑制生長在NCAM轉染的成纖維細胞上的PC12-E2細胞(D)中的神經突向外生長。相反，Ig3mut2既不影響生長在載體轉染的成纖維細胞上的PC12-E2(E)細胞也不抑制NCAM誘導的神經突向外生長(F)。肽P1-B、P3-DE和P3-G具有與Ig3wt的作用相當的抑制作用(C，D)，而Ig3mut1、P3-B肽和對照肽的作用與Ig3mut2的作用相似(E，F)。比例尺，20μm。(G)以對照的百分數形式顯示Ig3組件、P1-B、P3-DE、P3-G、P3-B肽及其衍生物的作用，其中將生長在NCAM-140轉染的和載體轉染的成纖維細胞上的PC12-E2細胞的平均神經突長度之間的差異設定為100％。結果表示為平均值±SEM。*P＜0.05，**P＜0.01(與在生長在NCAM轉染的成纖維細胞單層頂上的PC12-E2細胞中誘導的神經突向外生長相比)。圖7圖示在NCAMIg1-2-3片段的晶體結構中觀察到的、由NCAM形成的“緊湊”、“平”和“雙重”的拉鏈粘著復合體。各單個NCAM組件顯示為圓柱體。以阿拉伯數字和羅馬數字分別對Ig和Fnlll組件編號。為了容納NCAM的所有7個細胞外組件，根據電子顯微鏡研究(Hall和Rutishauser，1987；Becker等，1989)，在Ig4后引入了一個轉角。顯示了Ig1-2-3片段的大小和兩個相對細胞膜之間的距離。(A)“緊湊”拉鏈通過源自兩個相對細胞膜的Ig1-2-3順式二聚體之間的Ig1-Ig3和Ig2-Ig2相互作用穩定。(B)“平”拉鏈通過源自兩個相對細胞膜的Ig1-2-3順式二聚體之間的Ig2-Ig3相互作用穩定。(C)正如在晶體中觀察到的兩種拉鏈可以共存，并且將導致雙拉鏈樣粘著復合體的形成。圖8說明PC2-CD肽對原代培養中以單個神經元形式生長24小時的CGN的神經突向外生長的影響，其中所述培養的培養基中存在不同濃度的該肽。神經突長度以任意單位(AU)表示。將經過處理的培養物中神經突的長度與未經處理的培養物中的神經突長度(對照)進行比較(*p＜0.05；**p＜0.02；***p＜0.001；****p＜0.0005)。P2d，NCAMIg2組件的一個肽片段(見Soroka等，2002)，用作陽性對照以指示細胞對所述處理的反應性。圖9說明P3-G肽對原代培養中以單個神經元形式生長24小時的CGN的神經突向外生長的影響，其中所述培養的培養基中存在不同濃度的該肽。神經突長度以任意單位(AU)表示。將經過處理的培養物中神經突的長度與未經處理的培養物中的神經突長度(對照)進行比較。P2d用作陽性對照。*p＜0.05；**p＜0.02；***p＜0.001；****p＜0.0005圖10說明P2-EF肽對原代培養中以單個神經元形式生長24小時的CGN的神經突向外生長的影響，其中所述培養的培養基中存在不同濃度的該肽。神經突長度以任意單位(AU)表示。將經過處理的培養物中神經突的長度與未經處理的培養物中的神經突長度(對照)進行比較。P2d用作陽性對照。*p＜0.05；**p＜0.02；***p＜0.001；****p＜0.0005圖11說明P1-CD肽對原代培養中以單個神經元形式生長24小時的CGN的神經突向外生長的影響，其中所述培養的培養基中存在不同濃度的該肽，并且CGN與表達(LBN)或不表達(LVN)NCAM的經遺傳修飾成纖維細胞共培養。可以看出，所述肽不影響兩種培養中的CGN的NCAM非依賴性神經突向外生長，但是在CGN和LBN細胞的共培養中通過干擾NCAM同嗜性粘著，抑制NCAM依賴性神經突向外生長。神經突長度以任意單位(AU)表示。將經過處理的培養物中神經突的長度與未經處理的培養物中的神經突長度(對照)進行比較。P2d用作陽性對照。***p＜0.001圖12說明P2-A’B肽對原代培養中以單個神經元形式生長24小時的CGN的神經突向外生長的影響，其中所述培養的培養基中存在不同濃度的該肽，并且CGN與表達(LBN)或不表達(LVN)NCAM的經遺傳修飾成纖維細胞共培養。從該圖可以看出，所述肽不影響兩種培養中的CGN的NCAM非依賴性神經突向外生長，但是在CGN和LBN細胞的共培養中通過干擾NCAM同嗜性粘著，抑制NCAM依賴性神經突向外生長。神經突長度以任意單位(AU)表示。將經過處理的培養物中神經突的長度與未經處理的培養物中的神經突長度(對照)進行比較。P2d用作陽性對照。***p＜0.001發明詳述具有促進神經元細胞的神經突向外生長以及刺激神經元細胞存活、再生和調節神經元細胞粘著的潛力的分子，諸如某些內源性營養因子和粘著分子，例如NCAM，是尋找有利于例如神經元再生和其它形式的神經元可塑性的化合物的主要靶標。為了評價化合物干擾細胞粘著的潛力、刺激神經元細胞的神經突向外生長、再生和存活的能力，可以調查化合物與NCAM相互作用的能力。本發明的一個目的是提供能夠與NCAM分子中的一個或多個位置結合的化合物。本申請中尤其描述NCAMIg1、Ig2和/或Ig3組件中構成NCAM同嗜性結合位點的位置。NCAM是一種多功能粘著分子。它在胚胎發育期間、在成年腦中以及在與疾病的關聯中，作為關鍵分子參與與神經可塑性有關的不同過程。NCAM與許多細胞受體和其它細胞和細胞外分子的順式和反式同嗜性相互作用及異嗜性相互作用，導致NCAM參與引起神經可塑性的不同過程。NCAM分子具有多個不重疊的和重疊的結合位點用于和這些分子發生相互作用，這些位點位于NCAM的不同細胞外組件中和NCAM的細胞內結構域中。本發明涉及調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的方法，所述方法包括提供能夠與由NCAM的Ig1、Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基組成的新NCAM同嗜性結合位點相互作用的化合物。結合位點的氨基酸殘基能夠發生如下相互作用-位于一個NCAM分子的Ig1組件中的結合位點的氨基酸殘基與位于另一相對NCAM分子的Ig3組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，但是不與位于該相對NCAM分子的Ig1或Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，-位于一個NCAM分子的Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基與位于另一相對NCAM分子的Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，但是不與位于該相對NCAM分子的Ig1或Ig3組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，-位于一個NCAM分子的Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基與位于另一相對NCAM分子的Ig3組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，但是不與位于該相對NCAM分子的Ig2或Ig1組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，-位于一個NCAM分子的Ig3組件中的結合位點的氨基酸殘基與位于另一相對NCAM分子的Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，但是不與位于該相對NCAM分子的Ig3或Ig1組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，-位于一個NCAM分子的Ig3組件中的結合位點的氨基酸殘基與位于另一相對NCAM分子的Ig1組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用，但是不與位于該相對NCAM分子的Ig3或Ig2組件中的結合位點的氨基酸殘基相互作用。根據本發明，能夠i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，的化合物是以上同嗜性結合位點的配體，能夠通過以上結合位點利用和該結合位點的相互作用來調節由NCAM同嗜性結合所協助的過程。涉及兩個或兩個以上分子/組件/片段時，術語“獨立的”用于指這兩個或兩個以上分子/組件/片段以分開的、不相連的物質形式存在。術語“相互作用”在本文中和術語“結合”同義。術語“配體”定義為和以上結合位點結合并模擬NCAM同嗜性結合的化合物。術語“模擬”理解為配體誘導/刺激或抑制由NCAM通過以上結合位點的同嗜性相互作用所介導的生物學過程的能力。配體也可以，諸如通過和NCAM中非結合位點部位的部分結合，抑制天然存在的相互作用，并且其中所述干擾僅僅是位阻影響。能夠和本發明結合位點相互作用/結合的化合物對于促進神經突向外生長是有利的。因此，本發明化合物被認為是再生神經元連接的良好促進劑，并由此是損傷后功能恢復的良好促進劑，以及在需要該作用的其它情況中神經元功能的促進劑。在本文中，“分化”涉及細胞成熟的過程，諸如例如發生在所述神經元的最后一次細胞分裂后的神經突自神經元的向外延伸。本發明化合物可能能夠阻止細胞分裂和起動神經突的成熟和/或延伸。在本發明中，當一種化合物能夠刺激神經突向外生長時，例如當相對于對照細胞而言它能夠刺激培養細胞的神經突向外生長時，諸如使神經突向外生長提高50％或更多，諸如75％，例如100％或更多，該化合物被認為是有希望的。此外，在本文中短語“刺激/促進存活”與短語“防止細胞死亡”或“神經保護”同義。通過刺激/促進存活，有可能預防疾病或在患有神經變性病的個體中阻止神經系統的進一步變性。“存活”指這樣的過程，其中細胞已經受創，并且如果不使用本發明化合物阻止所述細胞變性并由此促進或刺激所述受創細胞存活的話，在正常情況下該細胞將有很高的可能性死亡。術語“調節”是指改變，諸如刺激或抑制。本發明化合物能夠調節由NCAM同嗜性結合介導的過程。因此，本發明化合物能夠刺激或抑制神經細胞分化和/或存活。后一種過程可能涉及激活或抑制NCAM信號傳導。因此，能夠調節上述NCAM依賴性過程的化合物在本發明中被認為是能夠調節NCAM信號轉導的化合物。化合物“調節NCAM信號轉導”的能力應理解為指分子能夠調節起動第二信使分子產生和/或激活或抑制細胞內級聯反應的過程，由此導致細胞的生理反應，諸如例如應答配體與本發明同嗜性結合位點的結合出現的神經突長度增加。本發明還提供能夠“干擾細胞粘著”的化合物。這是指如下過程，在該過程中細胞彼此吸引并且本發明化合物能夠刺激或抑制所述吸引。本發明化合物也涉及防止神經元細胞死亡。周圍神經細胞具有有限程度的在各種損傷后再生和與其靶標重建功能性連接的潛力。然而，功能恢復罕有完全的，并且周圍神經細胞損傷仍是一個相當大的問題。在中樞神經系統中，再生的潛力甚至更為有限。因此，鑒定能夠在周圍和中樞神經系統中防止神經元細胞死亡的物質是有意義的并具有巨大的商業價值。本發明化合物可以是肽，諸如結合位點的肽片段/部分，或者包含結合位點的氨基酸序列的肽。在本發明再一實施方案中，化合物可以包含其它化學實體，諸如糖、膽固醇和脂肪酸。優選地，化學實體與化合物中的肽的N端或C端結合。在本發明的一個方面，化合物能夠與NCAMIg1和/或Ig2和/或Ig3組件在本發明的同嗜性結合位點結合或者在由Ig1、Ig2和Ig3組件組成的NCAM組件的任何其它位點結合，并模擬在所述同嗜性結合位點結合的效應，或者調節所述效應。不受理論的束縛，本發明人認為NCAMIg1和/或Ig2和/或Ig3組件的活性配體是與NCAMIg1和/或Ig2和/或Ig3組件結合由此觸發組件構象改變從而導致啟動信號轉導級聯反應的配體，其中所述信號轉導引起細胞生理變化，諸如影響細胞的存活、細胞粘著和/或神經突向外生長。因此，本發明化合物可以是上述能夠觸發NCAMIg1和/或Ig2和/或Ig3組件的構象變化從而導致下游信號轉導級聯反應發生改變的任何化合物。調節方法因此，本發明的一個目的是通過如下方式提供調節NCAM呈現細胞的粘著、分化和/或存活的方法，所述方式是a)提供能夠通過如下手段與由NCAMIg1、Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基組成的NCAM同嗜性結合位點相互作用的化合物，所述手段是i)與NCAMIg1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAMIg3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAMIg2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAMIg3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAMIg2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，b)提供至少一個NCAM呈現細胞；c)通過使至少一個NCAM呈現細胞與所述化合物接觸，由此調節至少一個NCAM呈現細胞的細胞分化和/或存活。本發明涉及NCAM呈現細胞是i)天然在細胞表面表達NCAM分子的細胞，諸如例如神經細胞、肌細胞或任何其它組織的細胞；ii)在細胞表面表達NCAM分子的癌細胞；iii)經遺傳修飾在細胞表面表達NCAM分子的重組細胞。以上NCAM呈現細胞可以是體內細胞，諸如動物身體中的細胞，或者可以是體外培養的細胞。因此，以上方法可以用于體內和體外調節NCAM呈現細胞的分化、存活和/或粘著。在一些實施方案中，所述方法用于體外應用，在其它實施方案中，所述方法用于體內應用。以上方法包括提供能夠與由NCAMIg1、Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基組成的NCAM同嗜性結合位點相互作用的化合物。在一個實施方案中，所述化合物可以是能夠與NCAM的Ig1組件殘基相互作用并由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件之間的相互作用的化合物，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。另一實施方案中，這可以是能夠與NCAM的Ig3組件殘基相互作用并由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件之間的相互作用的化合物，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。另一實施方案中，該化合物可以是能夠與Ig2組件殘基相互作用并由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件之間的相互作用的化合物，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。再一實施方案中，該化合物可以是能夠與Ig3組件殘基相互作用并由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件之間的相互作用的化合物，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。再一實施方案中，該化合物可以是能夠與Ig2組件殘基相互作用并由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件之間的相互作用的化合物，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。以上化合物可以表現為a)能夠進行以上(i)至(v)的所有相互作用，或以上相互作用中的一些相互作用，諸如例如(i)和(ii)、或(i)和(iii)的相互作用或(i)至(v)的相互作用的任何其它組合的分子，或者b)能夠進行選自(i)至(v)相互作用之任一的僅一種相互作用的分子。在一個實施方案種，可以通過使用本申請中描述的選擇候選化合物的方法，提供能夠具有以上一種或多種相互作用的化合物。另一實施方案中，可以通過本申請以下描述的檢查化合物的方法，提供能夠進行以上一種或多種相互作用的化合物。如果NCAM分子執行所述功能時涉及以上(i)至(v)中的一種或多種相互作用，則(a)和(b)的所有化合物被認為能夠調節所述NCAM功能。化合物能夠“模擬”相互作用是指該化合物可以作為能夠與Ig1、Ig2或Ig3組件結合的以上同嗜性結合位點的配體起作用，由此替代另一相對的NCAM分子的Ig3、Ig2或Ig1組件與這些組件的結合(見上述)。所述模擬根據本發明將導致對與后面的結合相關的生物學過程的刺激或抑制。本發明人在此提出了NCAM同嗜性結合模型，其中Ig1和Ig2組件介導位于相同細胞表面的獨立NCAM分子的二聚體化(順式相互作用)，而其中Ig3組件通過同時結合Ig1和Ig2組件，介導在相對細胞表面表達的獨立NCAM分子間的相互作用(反式相互作用)。這種排列導致雙拉鏈樣NCAM粘著復合體的形成。來自NCAM的序列本發明化合物可以是來源于NCAM序列的肽片段，或者所述肽片段的變體。該肽片段可以是標識為SwissProt登錄號NP_113709(SEQIDNO44)或SwissProt登錄號P13591(SEQIDNO45)的NCAM序列的片段。優選的肽片段可以選自下示氨基酸序列WFSPNGEKLSPNQ(SEQIDNO1)YKCVVTAEDGTQSE(SEQIDNO2)TLVADADGFPEP(SEQIDNO3)QIRGIKKTD(SEQIDNO4)DVR(SEQIDNO5)RGIKKTD(SEOIDNO6)DVRRGIKKTD(SEQIDNO7KEGED(SEQIDNO8)IRGIKKTD(SEQlDNO9)KEGEDGIRGIKKTD(SEQIDNO10)DKNDE(SEQIDNO11)TVQARNSIVNAT(SEQIDNO12)SIHLKVFAK(SEQIDNO13)LSNNYLQIR(SEOIDNO14)RFIVLSNNYLQI(SEQIDNO15)KKDVRFIVLSNNYLQI(SEQIDNO16)QEFKEGEDAVIV(SEQIDNO17)KEGEDAVIVCD(SEQIDNO18)GEISVGESKFFL(SEQIDNO19)KHIFSDDSSELTIRNVDKNDE(SEQIDNO20)AFSPNGEKLSPNQ(SEQIDNO40)AKSVVTAEDGTQSE(SEQIDNO41)DVRRGIKKTD(SEQIDNO42)QIRGIKKTD(SEQIDNO43)以上氨基酸序列來源于具有SwissProt登錄號NP_113709的大鼠NCAM序列(SEQIDNO40)。另一優選的肽片段可以選自上示序列的片段或變體。“變體”應理解為指能夠與NCAM的Ig1、Ig2和/或Ig3組件相互作用、并通過所述相互作用誘導細胞分化、調節細胞粘著、刺激細胞再生、神經元可塑性和存活的任何肽序列。因此，片段或變體是生物學活性化合物，并可以定義成如下化合物，該化合物i)包含能夠被抗體識別的氨基酸序列，其中所述抗體也能夠識別預定的NCAM氨基酸序列，和/或ii)包含能夠與受體部分結合的氨基酸序列，其中所述受體部分也能夠結合預定的NCAM氨基酸序列，和/或iii)與Ig1、Ig2或Ig3組件中的至少一個的結合親合力和所述預定NCAM氨基酸序列實質上相似。因此，根據本發明，以上定義的變體是以上優選肽片段的功能等價物。全長NCAM蛋白質，諸如SEQIDNO44或45的NCAM，的變體可以是蛋白質的天然同種型，諸如天然的可溶性NCAM分子、由于可變剪接導致的較短或較長的NCAM多肽，或者該變體可以是含有包含全長蛋白質30-100％殘基的NCAM片段的重組蛋白，或者可以是與NCAM同源的天然蛋白質。兩個氨基酸序列間的同源性可以使用已知算法，諸如BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85或BLOSUM90計算。當同系物(homologue)與SEQIDNO44或45的NCAM具有至少大約40％同源性、諸如至少大約50％同源性、例如至少大約60％同源性、諸如至少大約70％同源性、例如至少大約75％同源性、諸如至少大約80％同源性、例如至少大約85％同源性、諸如至少大約90％同源性、例如至少92％同源性、諸如至少94％同源性、例如至少95％同源性、諸如至少96％同源性、例如至少97％同源性、諸如至少98％同源性、例如至少99％同源性時，認為這些同系物落入本發明的范圍中。根據本發明的一個實施方案，同源性百分數指同一性百分數。NCAM變體根據本發明是功能變體，諸如變體保留全長蛋白質通過本發明結合位點進行同嗜性結合并執行由所述結合所支持的功能的能力。本發明化合物的結合親合力優選為對NCAM組件具有10-3至10-10M，諸如優選10-4至10-8M的結合親合性(Kd值)。根據本發明，結合親合力通過表面等離子體共振分析或核磁共振光譜法這些試驗之一進行測定。在一個實施方案中，可以理解隨著插入、缺失和替代(包括保守替代)的數目和范圍的增加，變體將顯示出逐漸與優選的預定序列不同的氨基酸序列。這種差異可以以預定序列與變體間同源性的降低來測量。“肽序列的變體”是指可以通過例如替代一個或多個氨基酸殘基來修飾肽。L-氨基酸和D-氨基酸均可以使用。其它修飾可以包含衍生物，諸如酯、糖等。實例是甲基和乙酰基酯。聚合諸如重復序列或附著于各種載體上是本領域熟知的，例如賴氨酸骨架，諸如帶有4個肽、8個肽、16個肽或32個肽的賴氨酸樹狀聚合物(dendrimer)。其它載體可以是蛋白質部分，諸如牛血清清蛋白(BSA)、或親脂性樹狀聚合物、或由親脂性衍生物形成的微團樣載體、或星爆形(starbust，星形)碳鏈聚合物綴合體、或基于二乙基氨基甲烷衍生物的配體呈遞裝配物(Ligandpresentingassembly，LPA)。根據本發明的肽片段變體可以在同一變體或其片段中或在不同變體或其片段中包含至少一個替代，諸如彼此獨立地引入的多個替代。因此，復合體變體或其片段可以包含彼此獨立的保守替代，其中所述變體或其片段的至少一個甘氨酸(Gly)用選自Ala、Val、Leu和Ile的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個丙氨酸(Ala)用選自Gly、Val、Leu和Ile的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個纈氨酸(Val)用選自Gly、Ala、Leu和Ile的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個亮氨酸(Leu)用選自Gly、Ala、Val和Ile的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個異亮氨酸(Ile)用選自Gly、Ala、Val和Leu的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個天冬氨酸(Asp)用選自Glu、Asn和Gln的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個天冬酰胺(Asn)用選自Asp、Glu和Gln的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個谷氨酰胺(Gln)用選自Asp、Glu和Asn的氨基酸替代，并且其中所述變體或其片段的至少一個苯丙氨酸(Phe)用選自Tyr、Trp、His、Pro且優選地選自Tyr和Trp的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個酪氨酸(Tyr)用選自Phe、Trp、His和Pro且優選地選自Phe和Trp的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個精氨酸(Arg)用選自Lys和His的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個賴氨酸(Lys)用選自Arg和His的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個脯氨酸(Pro)用選自Phe、Tyr、Trp和His的氨基酸替代，并且獨立于此、變體或其片段，其中所述變體或其片段的至少一個半胱氨酸(Cys)用選自Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr的氨基酸替代。因此，從上可以得出，肽片段的相同功能等價物、或所述功能等價物的片段可以包含一個以上的保守氨基酸替代，所述替代來自一個以上的上文定義的保守氨基酸組。術語“保守氨基酸替代”在本文中與術語“同源性氨基酸替代”同義。保守氨基酸組如下P，A，G，S，T(中性、弱疏水性)Q，N，E，D，B，Z(親水性，酸性胺)H，K，R(親水性，堿性)F，Y，W(疏水性，芳香族的)L，I，V，M(疏水性)C(交聯形成)可以將保守替代引入本發明的優選預定肽或其片段的任何位置。然而，也可能期望引入非保守替代，尤其是，但不限于，在任何一個或多個位置引入非保守替代。導致形成本發明肽的功能等價片段的非保守替代將例如在極性上具有實質性的不同，例如用具有非極性側鏈的殘基(Ala，Leu，Pro，Trp，Val，Ile，Leu，Phe或Met)替代具有極性側鏈的殘基諸如Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn或Gln或者帶電荷的氨基酸諸如Asp，Glu，Arg或Lys，或者用帶電荷的或極性的殘基替代非極性殘基；和/或ii)在其對肽骨架取向的影響方面具有實質性的不同，諸如將Pro或Gly用另一殘基替代或反之；和/或iii)在電荷方面具有實質性的不同，例如用帶負電荷的殘基諸如Glu或Asp替代帶正電荷的殘基諸如Lys，His或Arg(反之亦然)；和/或iv)在空間體積上具有實質性的不同，例如用大體積殘基諸如His，Trp，Phe或Tyr替代具有小側鏈的殘基，例如Ala，Gly或Ser(反之亦然)。在一個實施方案中可以基于氨基酸的疏水性和親水性值以及氨基酸側鏈取代基的相對相似性(包括電荷、大小等)，實施氨基酸替代。考慮到前述各種特征的示例性氨基酸替代是本領域技術人員熟知的，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。氨基酸的添加或刪除可以是2至優選地10個氨基酸，諸如2至8個氨基酸，例如2至6個氨基酸，諸如2至4個氨基酸的添加或缺失。然而，10個以上的氨基酸添加，例如2至10個氨基酸的添加，也包括在本發明內。在多聚體形式中，添加/刪除可以在多聚體的各單體中獨立地進行。本發明也涉及本文公開的化合物的非肽變體。具體地，該變體應理解為指與NCAM的Ig1、Ig2或Ig3組件結合或以其它方式相互作用并由此刺激Ig1、Ig2或Ig3信號轉導和/或調節呈現NCAM受體的細胞的增殖和/或誘導分化和/或刺激再生、神經元可塑性和/或存活的化合物。功能等價物可以通過在具有本發明功能活性的序列中進行氨基酸替代，獲得功能等價物。在本上下文中功能相似指側鏈的主要特征，諸如疏水性、堿性、中性或酸性，或者存在或不存在空間位阻。因此，在本發明一個實施方案中，i)一個能夠實行的給定功能等價物與ii)一個優選預定片段之間的同一性程度不是將該片段評判為本發明的優選預定肽片段的變體或功能等價物的首要尺度。與至少3個氨基酸，更優選地至少5個氨基酸的優選預定片段享有至少某些同源性的片段，當其與該優選預定NCAM肽或其片段具有至少大約25％同源性，諸如至少大約30％同源性，例如至少大約40％同源性，諸如至少大約50％同源性，例如至少大約55％同源性，諸如至少大約60％同源性，例如至少大約65％同源性，諸如至少大約70％同源性，諸如至少大約75％同源性，例如至少大約80％同源性，諸如至少大約85％同源性時，認為落入本發明范圍內。可以使用序列分析軟件(例如Wisconsin大學生物技術中心遺傳學計算機組的序列分析軟件包，1710UniversityAvenue，Madison，WI53705)，利用其中規定的默認參數，計算序列同一性。在沒有規定時，本發明多肽的C端氨基酸理解為以游離羧酸形式存在，這也可以描述為“-OH”。然而，本發明化合物的C端氨基酸可以是酰胺化的衍生物，表示為“-NH2”。在無其它陳述時，多肽的N端氨基酸包含游離氨基，這也可以描述為“H-”。當無特別規定時，氨基酸可以選自任何氨基酸，無論其是天然的還是非天然的，諸如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。因此，該組包括但不限于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，His，Aib，Nal，Sar，Orn，賴氨酸類似物DAP和DAPA，4Hyp。檢查方法根據本發明，可以通過檢查化合物的如下能力，鑒定能夠通過由NCAM分子的Ig1、Ig2和Ig3組件組成的同嗜性結合位點調節兩個獨立NCAM分子間的相互作用的化合物，所述能力是i)與NCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段。本發明方法包括步驟a)提供化合物；b)提供至少一個獨立的NCAM分子片段，其中所述片段包含對應于包含SEQIDNO40所示序列的第1至289位殘基的NCAMIg1-2-3組件序列的連續氨基酸殘基序列或所述序列的片段；c)使(a)的化合物與(b)的獨立NCAM片段接觸，和d)檢查該化合物是否能夠-與NCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或-與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或-與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或-與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，和/或-與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩個獨立(b)片段，d)提供能夠進行以上任何相互作用的候選化合物。在本發明的一個優選實施方案中，獨立的NCAM片段是包含來自NCAM序列的至少289個氨基酸的連續序列的NCAMIg1-2-3組件。在更優選的實施方案中，該序列包含NCAM的aa1至289，其中NCAM是具有NCBI登錄號NP_113709、在本申請中標識為SEQIDNO40的大鼠NCAM。在本上下文中“NCAM的Ig1-2-3組件”是指由Ig1、Ig2和Ig3的序列以及按如下順序連接所述組件的接頭序列組成的上述連續氨基酸序列N端<Ig1-接頭-Ig2-接頭-Ig3>C端。Ig1-2-3組件可以是由Ig1、Ig2和Ig3組件組成的重組分子，或者可以是含有Ig1、Ig2和Ig3組件以及融合配偶體的重組融合蛋白，或者可以是通過任何已知的本領域方法獲得的全長NCAM分子的片段。根據以上發明，以上方法的Ig1-2-3組件在溶液中。在一個實施方案中，所述溶液是水性溶液。在一個優選實施方案中，溶液是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液或TRIS-HCl緩沖液(pH7.4)。步驟(c)中化合物與獨立NCAM片段的接觸優選發生在Ig1-2-3組件的溶液中。檢測化合物是否能夠進行以上相互作用可以通過當前用于檢測蛋白質相互作用的任何本領域現有方法進行。例如，可以選擇NMR光譜法作為適宜方法，或者可以通過使用等離子體共振分析實施所述檢查。根據本發明，優選NMR評價。通過上述方法鑒定為能夠進行以上相互作用的化合物在本發明中命名為候選化合物。可以進一步檢查候選化合物調節至少兩個獨立的NCAM組件間的相互作用的能力，所述NCAM組件是諸如i)Ig1組件和Ig3組件，和/或ii)Ig2組件和Ig3組件，和/或iii)Ig2組件和Ig2組件。后一種檢查可以通過例如在所選候選化合物存在下凝膠過濾溶液中的Ig1-2-3組件來實施。或者，可以通過凝膠過濾獨立的Ig1和Ig3組件的混合物、或獨立的Ig2和Ig3組件的混合物、或兩個獨立的各由Ig1和Ig3組件的連續序列組成的NCAM片段或由Ig2和Ig3組件組成的片段的混合物來實施。凝膠過濾層析是最常用的實驗室技術之一，并且本領域技術人員可以容易地實施此檢查。根據本發明，候選化合物可以是能夠調節以上Ig1、Ig2和Ig3NCAM組件的相互作用的任何分子。該化合物可以例如從肽、脂質、糖或其它有機分子或氨基酸和其它有機化合物的共聚物的組合文庫中選擇。在優選實施方案中，本發明候選化合物是肽。以上檢查方法的目的是鑒定和選擇能夠與NCAM的Ig1-2-3組件在本發明結合位點相互作用并由此調節NCAM依賴性細胞分化、粘著和/或存活的目的化合物(候選化合物)。晶體根據本發明，鑒定候選化合物可以包括使用包含獨立的Ig1、Ig2和Ig3組件或者所述組件的組合的晶體蛋白質。本發明作者制備由對應于大鼠NCAM(SwissProt登錄號NP_113709)(SEQIDNO40)氨基酸殘基1-289的氨基酸序列組成的NCAMIg1-2-3組件的晶體蛋白，以確定NCAM同嗜性結合位點的結構，并在本文中提出了用計算機產生的該組件的3D結構用于在計算機上篩選能夠與鑒定的同嗜性結合位點結合的化合物。在優選實施方案中，本發明的晶體蛋白是包含含有NCAM同嗜性結合位點的NCAMIg1-2-3組件的多肽的晶體。晶體可以包含一個以上的多肽，例如兩個多肽。在優選實施方案中，晶體包含通過氨基酸序列的相互連接共連接在一個片段中的NCAMIg1、Ig2和Ig3組件，所述一個片段在本文中稱作“Ig1-2-3片段”。因此，優選地是晶體衍射X射線，以確定達到至少4、優選至少3、更優選至少2.8、甚至更優選至少2.5、最優選至少2.0分辨率的原子坐標。在本發明的一個非常優選的實施方案中，晶體包含按照以如下坐標代表的空間關系排列的原子，所述坐標為圖2上所示表2的結構坐標、或者具有距此不超過2.5、優選不超過2.25、更優選不超過2.0、甚至更優選不超過1.75、再更優選不超過1.5、例如不超過1.25、諸如不超過1.0的均方根偏差的坐標。優選地是，所述坐標具有距此不超過2.5、優選不超過2.25、更優選不超過2.0、甚至更優選不超過1.75、再更優選不超過1.5、例如不超過1.25、諸如不超過1.0的均方根偏差。優選地是，晶體包含以id1QZ1收藏于PDB的結構，或更優選地是晶體由以id1QZ1收藏于PDB的結構組成。晶體可以在每個不對稱單位中包含一個以上的Ig1-2-3片段NCAM多肽，在本發明的一個優選實施方案中，晶體的每個不對稱單位包含一個NCAMIg1-2-3組件的多肽。優選地是，晶體具有如下晶胞尺寸a＝50至52，優選50.5至51.0，更優選大約51.5b＝107.5至109.5，優選108至109，更優選大約108.5c＝146至151，優選148至150，更優選大約149.0α＝85.5至95.5，優選88至92，更優選大約90β＝85.5至95.5，優選88至92，更優選大約90γ＝85.5至95.5，優選88至92，更優選大約90。更優選地是，晶體具有如下特征空間群I212121，每個不對稱單位一個分子，晶胞尺寸a＝51.5，b＝108.5，c＝149.0，α＝90°，β＝90°，γ＝90°。制備晶體在幾次不成功的嘗試后，鑒定了適用于制備對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽的晶體的適宜條件。因此，本發明的一個方面是使用晶體制備方法，提供包含如下多肽的晶體，所述多肽含有對應于大鼠NCAM(NCBI登錄號NP_113709)(SEQIDNO40)氨基酸殘基1-289的至少289個連續氨基酸殘基，所述連續氨基酸對應于大鼠NCAM的Ig1-2-3片段，其中所述方法包括步驟i)提供所述多肽；ii)在將所述多肽孵育在包含14％至17％聚乙二醇4000(PEG4k)、0.150M至0.5M硫酸鋰鹽的緩沖液中的條件下生長晶體，其中所述緩沖液具有4.8至5.8的pH；iii)由此制備所述晶體。在本發明的一個實施方案中，制備所述多肽和能夠與所述多肽相互作用的化合物的共晶。所述化合物可以是已經通過本文以下所述任何方法鑒定的化合物。因此，在本發明的一個方面，該化合物可以是調節劑，諸如由NCAMIg1-2-3組件介導的NCAM同嗜性相互作用的調節劑。可以使用共晶設計具有增強的結合性質的優化化合物。尤其是，可以使用共晶設計由NCAMIg1-2-3組件介導的同嗜性相互作用的更佳抑制劑，或者所述相互作用的穩定劑。緩沖液優選包含5％-25％聚乙二醇，更優選10％-20％，甚至更優選12％-18％，再更優選14％-16％、最優選大約15％聚乙二醇。聚乙二醇(PEG)可以是任何適宜的PEG，例如從PEG4000、PEG6000和PEG8000中選擇的PEG，優選地是聚乙二醇是PEG4000。緩沖液優選包含0.15M至0.5M鹽，更優選0.2至0.5M、甚至更優選0.3至0.5M、再更優選0.4至0.5M、最優選大約0.45M鹽。鹽可以是任何有用的鹽，優選的鹽是硫酸鋰(Li2SO4)。緩沖液優選具有4.0至8.5，更優選4.5至7.5，甚至更優選5.0至6.5，再更優選5.0至5.2的pH。緩沖液可以是任何有用的緩沖液，優選乙酸鈉緩沖液。孵育應在適宜溫度，優選在5至25℃、更優選10至25℃、甚至更優選15至25℃，甚至更優選17至21℃、再更優選大約18℃實施。晶體可以通過任何適宜方法，例如通過懸滴法生長。結構確定可以利用本領域技術人員已知的任何方法，例如使用X射線衍射，確定晶體結構。一旦鑒定了結構，可以使用適宜軟件對所述結構進行精化(refine)。在本發明的一個實施方案中，可以使用分子置換技術。所述技術涉及通過獲得希望確定其三維結構的多肽或復合體之晶體的X射線衍射數據，確定結構。然后，使用分子置換技術，參考結構類似蛋白質的已知結構坐標，分析X射線衍射數據，從而確定該多肽或復合體的三維結構。對于含有NCAMIg1-2組件的多肽，可以使用所述組件的結構坐標。如例如美國專利號5,353,236中所述的，分子置換使用具有已知結構的分子作為起點，為未知晶體樣品的結構建模。該技術基于如下原理兩個在晶胞中具有相似結構、取向和位置的分子將以相似的方式衍射。分子置換涉及按照和未知結構相同的位置和取向將已知結構放置在晶胞中。放置后，使用該晶胞中已知結構的原子計算將由假設的衍射實驗產生的結構因素。這涉及對已知結構進行6維(3個角度和3個空間維度)旋轉，直到已知結構和實驗室數據對上。可以使用各種精化技術，微調此近似結構以產生更準確且常常具有更高分辨率的結構。例如，由實驗室數據定義的結構得到的模型可以進行剛體精化，其中模型進行6維的有限額外旋轉，產生大約5％以下的位置遷移。然后，可以使用其它已知的精化方法，對精化后的模型作進一步精化。確定對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽或者所述多肽與相互作用化合物的復合體的三維結構的另一方法是同源建模技術。同源建模涉及使用一個或多個與未知結構相關的蛋白質、蛋白質結構域和/或子結構域的結構坐標，構建該未知結構的模型。可以通過將三維結構待解析的蛋白質或肽的共同或同源部分與同源結構元件的三維結構進行擬合(fit)，進行同源建模。同源建模可以包括隨著用待解析相關結構的氨基酸(或其它成分)進行氨基酸(或其它成分)的置換，重建部分或整個三維結構。結構測定的一個實例見實施例2。本發明晶體多肽的結構坐標可以以機器可讀形式儲存在機器可讀存儲介質，例如計算機硬驅動機、磁盤、DAT帶、CO-ROM等上，用于以三維形狀展示或者用于涉及結構坐標、或其定義的三維結構的計算機輔助操作或基于此的計算的其它用途。例如，定義對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽的三維結構的數據可以存儲在機器可讀存儲介質中，并且可以以該蛋白質結構的三維圖形形式展示，通常使用能夠從所述存儲介質讀取數據并執行從這些數據創建該三維圖形的程序指令的計算機來完成。因此，本發明包括具有存儲器的機器，例如計算機，所述存儲器中包含代表本發明晶體組合物的結構坐標(例如表2中所示坐標，見圖2)的數據以及其它任選數據和操作這些數據的指令。這些數據可以用于多種目的，諸如用于闡明其它相關結構和藥物開發。可以通過執行程序指令的機器將第一組這樣的機器可讀數據與第二組機器可讀數據組合起來，所述指令使用第一組數據和第二組數據確定對應于該第二組機器可讀數據的至少一部分坐標。例如，第一組數據可以包含表2(圖2)所示復合體的至少一部分坐標的傅里葉變換，而第二組數據可以包含分子或分子復合體的X射線衍射數據。更特別地，本發明的一個目的是提供包含NCAMIg1-2-3組件的同嗜性結合位點的共復合體的三維結構信息。為此，我們提出，可以應用本發明晶體組合物的結構坐標或其部分，通過例如分子置換或通過同源建模技術，解析另一相似細胞粘著分子(CAM)(例如包含能夠進行同嗜性相互作用的Ig組件的另一CAM)或多肽相互作用化合物復合體的晶體三維結構。例如，可以使用分子置換來開發一組坐標，諸如表2(圖2)中所示坐標，以確定對應于包含同嗜性結合位點的NCAMIg1-2-3組件的多肽和相互作用化合物的晶體共復合體的結構。結構的應用本發明中對多肽的3D描述可以用于幾個目的，例如用于確定相似蛋白質或多肽的結構(也參見上文)或用于設計能夠和所述多肽相互作用的化合物。例如，可以通過計算方式評價機器可讀數據定義的NCAMIg1-2-3組件多肽的三維結構，以評價該多肽與各種化學實體或被測化合物締合的能力。術語“化學實體”在本文中用于指化學化合物、至少兩個化學化合物的復合體、和該化合物或復合體的片段。例如，可以使用執行程序指令的機器，將定義對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽或其復合體的3D結構的第一組機器可讀數據，與定義目的化學實體或被測化合物的結構的第二組機器可讀數據組合在一起，用于評價化學實體或化合物與NCAMIg1-2-3組件或其復合體締合的能力和/或該締合的位置和/或取向。這些方法可以導致對蛋白質表面與這些化學實體發生締合的位置、取向和能量的了解。由數據定義的三維結構可以以圖形形式展示，從而允許目視觀察該結構、以及目視觀察多肽成分與相互作用化合物的締合。或者，可以使用涉及更多量化或計算的方法。例如，本發明中用于評價化學實體與本文所述任何分子或分子復合體締合的能力的一種方法，包括步驟(a)使用計算方式在化學實體和所述分子或分子復合體的結合位點或其它表面特征之間進法擬合操作；和(b)分析所述擬合操作的結果從而量化化學實體和結合位點之間的締合。本發明還涉及應用本發明晶體組合物或其部分的結構坐標鑒定在三維結構中，優選在結合位點中或在結合位點附近的反應性氨基酸，諸如半胱氨酸殘基；產生和呈現分子表面，諸如水可接近的表面或包括所有原子的空間填充的范德瓦爾斯表面在內的表面；計算和呈現蛋白質或復合體的表面特征，例如底物結合位點的大小和形狀；在三維結構中，優選在配體結合位點中或在配體結合位點附近定位潛在H鍵供體和受體；計算三維結構中，優選配體結合位點中或配體結合位點附近的疏水性和親水性區域；以及計算和呈現蛋白質表面上就所選的目的官能團(例如，氨基、羥基、羧基、亞甲基、烷基、烯基、芳族碳、芳族環、芳族雜環等)而言具有有利的相互作用能量的區域或其附近區域。可以使用前述方法表征對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽以及它和潛在相互作用化合物的部分的相互作用，從而設計或選擇能夠特異地共價結合反應性氨基酸(例如半胱氨酸)的化合物，和設計或選擇與蛋白質表面特征(可以預先選擇一組表面特征)具有互補特征(例如，大小、形狀、電荷、疏水性/親水性、參與氫鍵鍵合的能力等)的化合物。使用結構坐標，還可以預測或計算復合狀況中給定配體相對于蛋白質的取向、結合常數或相對親合力，并使用該信息設計或選擇具有改良的親合力的化合物。在這些情況中，將NCAMIg1-2-3組件多肽或其部分或復合體的結構坐標以機器可讀形式輸入執行如下程序指令的機器中，所述指令用于實施期望操作和包含任何需要的額外數據，例如定義潛在相互作用的化合物或其部分的結構和/或功能特征的數據、定義各種氨基酸的分子特征的數據等等。本發明的一種方法涉及從化學結構數據庫中選擇能夠與NCAMIg1-2-3組件結合的化合物。該方法以本發明晶體組合物的結構坐標(例如，定義NCAMIg1-2-3組件或其部分或其復合體的三維結構的坐標)為起點。基于有利地與一個或多個官能團相互作用的能力，表征與該三維結構相關的點。然后基于前述表征從化學結構數據庫中搜索含有傾向于有利地與該蛋白質相互作用的一個或多個官能團的候選化合物。由此鑒定具有如下結構的化合物，所述結構最佳地匹配與該三維結構發生有利相互作用的點。常常優選地，但不是必需的，該搜索借助計算機進行。在此情況中，使用執行程序指令的計算機，將定義對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽或其部分或多肽/相互作用化合物復合體的3D結構的第一組機器可讀數據，與定義一個或多個目的部分或官能團的第二組機器可讀數據組合，以鑒定官能團和多肽原子之間發生有利相互作用的優選位置。由此產生第三組數據，即，定義多肽和官能團間發生有利相互作用的位置的數據。然后，使用執行程序指令的機器將第三組數據與定義一個或多個化學實體的3D結構的第四組數據組合起來，以鑒定含有如下官能團的化學實體，其中所述官能團傾向于最佳地匹配其各自和該多肽發生有利相互作用的位置。可以檢查具有通過前述任何方法選擇或設計的結構的化合物與NCAMIg1-2-3組件結合的能力。在本發明的一個優選實施方案中，化合物優選是由Ig1-2-3片段介導的NCAM同嗜性相互作用的調節劑。例如，能夠與Ig1-2-3同嗜性結合位點相互作用的化合物可能是NCAM同嗜性結合和需要該結合的NCAM功能的良好抑制劑。因此，可以對具有通過前述任何方法選擇或設計的結構的化合物檢查調節NCAM活性(諸如介導NCAM呈現細胞的細胞分化和/或存活)的能力。正如本領域技術人員將明了的，可以使用各種計算分析來確定給定多肽(或其部分或復合體)與對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽或其復合體(諸如本文所述)在三維結構方面的相似程度。此類分析可以利用商業上可獲得的應用軟件，諸如QUANTA的分子相似性應用軟件(MolecularSimulationsInc.，Waltham，Mass.)3.3版，按照所附用戶指南第3卷第134-135頁中所述進行。分子相似性應用軟件允許比較不同結構、同一結構的不同構象和同一結構的不同部分。分子相似性軟件中用于比較結構的程序分為四步(1)加載待比較的結構；(2)定義這些結構中的原子等價性(atomequivalency)；(3)實施擬合操作；和(4)分析結果。每個結構標以一個名稱。將一個結構標識為靶(即固定結構)；所有剩余結構為工作結構(即活動的結構)。由于QUANTA中的原子等價性由用戶輸入來定義，因此為了本發明目的，對于進行比較的兩個結構間的所有保守殘基，我們將等價原子定義為蛋白質骨架原子(N，Cα，C和O)，并僅考慮剛性擬合操作。當使用剛性擬合方法時，平移和旋轉工作結構以獲得對靶結構的最佳匹配。匹配操作使用最小二乘方擬合算法，計算待應用于工作結構的最佳平移和旋轉，使得對于規定的等價原子對，該擬合的均方根差異值是絕對最小值。QUANTA以埃為單位報告該數字。為了本發明的目的，對應于NCAMIg1-2-3組件的多肽或其分子復合體的任何一組結構坐標，當重疊——使用骨架原子——在本發明相關蛋白質或復合體的結構坐標(例如表2中列出的坐標(圖2))上時，如果保守殘基骨架原子(N，Cα，C，O)均方根偏差(rootmeansquaredeviation)小于1.5，則認為是相同的。更優選地是，所述均方根偏差小于1.0。最優選地是，所述均方根偏差小于0.5。術語“均方根偏差”指相對于平均值的偏差的平方的算術平均值的平方根。它是對相對于趨勢或對象發生偏離或變化的一種表示方式。為了本發明的目的，“均方根偏差”用于定義一個蛋白質骨架相對于本發明蛋白質骨架(諸如本文中所述的由表2(圖2)結構坐標定義的NCAMIg1-2-3組件的同嗜性結合位點)發生的偏離。術語“最小二乘方”指基于如下原則的方法，所述原則為最佳估計值是當觀測值的偏差的平方和為最小時的值。為了使用為本發明晶體物質產生的結構坐標，例如表2(圖2)所示結構坐標，常常必需或期望將其展示或轉化成三維形狀，或者對其進行其它方式的操作。這通常通過使用能夠由一組結構坐標產生分子或其部分的三維圖形的商業軟件諸如程序來完成。例如，一系列非限制性的用于呈現或以其它方式操作蛋白質結構的計算機程序包括Midas(Univ.ofCalifornia，SanFrancisco)MidasPlus(Univ.ofCal.，SanFrancisco)MOIL(UniveristyofIllinois)Yummie(YaleUniversity)Sybyl(Tripos，Inc.)Insight/Discover(BiosymTechnologles)MacroModel(ColumbiaUniversity)Quanta(MolecularSimulations，Inc.)Cerius(MolecularSimulations，Inc.)Alchemy(Tripos，Inc.)LabVision(Tripos，Inc.)Rasmol(GlaxoResearchandDevelopment)Ribbon(UniversityofAlabama)NAOMI(OxfordUniversity)ExplorerEyechem(SiliconGraphics，Inc.)Univision(CrayResearch)Molscript(UppsalaUniversity)Chem-3D(CambridgeScientific)Chain(BaylorCollegeofMedicine)O(UppsalaUniversity)GRASP(ColumbiaUniversity)X-Plor(MolecularSimulations，Inc.；YaleUniv.)Spartan(Wavefunction，Inc.)Catalyst(MolecularSimulations，Inc.)Molcadd(Tripos，Inc.)VMD(Univ.ofIllinois/BeckmanInstitute)Sculpt(InteractiveSimulations，Inc.)Procheck(BrookhavenNat′lLaboratory)DGEOM(QCPE)RE_VIEW(BrunelUniversity)Modeller(BirbeckCol.，Univ.ofLondon)Xmol(MinnesotaSupercomputingCenter)ProteinExpert(CambridgeScientific)HyperChem(Hypercube)MDDisplay(UniversityofWashington)PKB(Nat′lCenterforBiotech，Info.，NIH)ChemX(ChemicalDesign，Ltd.)Cameleon(OxfordMolecular，Inc.)Iditis(OxfordMolecular，Inc.)為了使用這些程序存儲、轉移和使用本發明晶體物質的結構坐標，提供包含數據存儲材料的機器可讀存儲介質，該數據存儲材料用機器可讀數據編碼，當利用以使用所述數據的指令編程的機器(例如加載了一個或多個諸如以上所定義種類的程序的計算機)時，該機器可讀存儲介質能夠展示本文所述任何分子或分子復合體的三維圖形。包含數據存儲材料的機器可讀存儲介質包括常規計算機硬盤驅動器、軟盤、DAT帶、CD-ROM和其它磁的、磁光的、光的、可光讀的介質及其它可以適用于計算機使用的介質。甚至更優選能夠展示由NCAMIg1-2-3組件結構坐標定義的分子或分子復合體的三維圖形的機器可讀存儲介質，其中所述結構坐標諸如是表2(圖2)所示坐標+/-不超過1.5的偏離其氨基酸的保守骨架原子的均方根偏差。本發明此方面的一個示例性實施方案是由包含表2(圖2)坐標的一組數據編碼的常規3.5寸磁盤、DAT帶或硬盤驅動器，所述數據優選為PDB格式。圖3舉例說明此類多肽的一個三維圖形打印輸出結果。在另一個實施方案中，機器可讀數據存儲介質包含編碼第一組機器可讀數據的數據存儲材料，所述第一組機器可讀數據包含圖2所示(圖2)結構坐標(或再有，其衍生物)的傅立葉變換，并且當應用以使用所述數據的指令編程的機器時，該組數據可以和包含分子或分子復合體的X射線衍射模式的第二組機器可讀數據組合，以確定至少一部分對應于該第二組機器可讀數據的結構坐標。該系統可以包括例如含有中央處理器(“CPU”)、工作存儲器(可以是例如RAM(隨機存取存儲器)或磁心存儲器、大容量存儲器(諸如一個或多個磁盤驅動器或CD-ROM驅動器))、一個或多個陰極射線管(“CRT”)顯示終端、一個或多個鍵盤、一個或多個輸入線路(IP)、以及一個或多個輸出線路(OP)——所有這些通過常規雙向系統總線相互連接——的計算機。可以以多種方式執行通過輸入線與計算機連接的輸入硬件。本發明的機器可讀數據可以使用通過電話線或專用數據線連接的調制解調器來輸入。備選地或額外地，輸入硬件可以包含CD-ROM驅動器或磁盤驅動器。與CRT顯示終端結合，鍵盤也可以用作輸入裝置。通過輸出線與計算機連接的輸出硬件可以類似地利用常規裝置執行。例如，輸出硬件可以包括使用諸如本文所述QUANTA等程序來展示本發明蛋白質(或其部分)的圖形的CRT顯示終端。輸出硬件還可以包括打印機(這樣可以產生硬拷貝輸出)、或磁盤驅動器(存儲系統輸出以備用)。在運行中，CPU協調各種輸入和輸出裝置的使用、協調由大容量存儲器存取數據和向工作存儲器及由工作存儲器存取數據，并決定數據處理步驟的順序。可以使用許多程序處理本發明的機器可讀數據。這些程序的例子在上文中已經討論過。也可以在如下程序中執行適于此目的的算法，所述程序諸如Cast-3D(ChemicalAbstractsService)、3DBUnity(Tripos，Inc.)、Quest-3D(CambridgeCrystallographicdataCenter)和MACCS/ISIS-3D(MolecularDesignLimited)。這些幾何搜索可以通過空間搜索得到提升，在空間搜索中使用結合位點的大小和形狀的必備條件剔除具有禁用外形尺寸的命中結果。可以在應用于FRAP的FRB的搜索中使幾何和空間必備條件同步的程序，包括CAVEAT(P.Bartlett，UniversityofCalifornia，Berkeley)、HOOK(MSI)、ALADDIN(DaylightSoftware)和DOCK(http://www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz-/kuntz.html及其引用的參考文獻)。所有這些搜索工具均可與現有的團體數據庫、Cambridge結構數據庫或可從化學藥品供應商處獲得的化學數據庫聯用。在本發明的一個實施方案中，該方法包括鑒定潛在地能夠與NCAMIg1-2-3組件或其片段相互作用的多個化合物，例如，該方法可以包括鑒定由潛在地能夠與NCAMIg1-2-3組件或其片段相互作用的化合物組成的一個子文庫。這可以使用任何常規方法實現。例如，可以首先根據可獲得的試劑和已經建立的合成化學，枚舉組合文庫中的所有可能成員。然后使各成員單獨地與MASP-2多肽的結合位點對接(dock)。最后，可以基于其對接分數和/或多樣性測度(diversitymeasure)的等級，選擇最佳的子文庫進行合成。已經開發了用于進行快速文庫枚舉的軟件，包括例如Sybyl中的CombiLibMaker、Cerius2中的AnalogBuilder、可在MOE中獲得的QuaSAR-CombiGen模塊(MOE軟件，ChemicalComputingGroup，1010SherbrookeStreetW.，Suite910，Montreal，CanadaH3A2R7)。使用基于片段或基于反應的方案，這些程序中的大多數可以為含有幾百萬個化合物的組合文庫容易地產生所有2D或3D結構。還可以使用這些軟件包中的其它工具在對接前減少虛擬文庫的大小。例如，通過CombiLibMaker枚舉的文庫可以隨后利用DiverseSolutions(可在Sybyl中獲得)進行分析，以提供對化學空間充分采樣的子文庫。QuaSAR-CombiDesign是另一個可在MOE中獲得的組合文庫設計工具，它提供了用于產生組合文庫的一種非枚舉方法，并且可以例如使用統計學采樣技術在文庫創建期間針對Five-Filter規則進行檢查，從而創建具有用戶定義的性質范圍的更小子文庫。原則上，文庫創建后的對接步驟可以使用任何可獲得的對接程序如DOCK或FlexX進行，而多樣性選擇可以使用例如可從Daylight、Tripos(diversesolutions)或BCI獲得的軟件，或者通過高通量對接(見例如Diller和Merz所述)進行。在另一個實例中，可以使用“分而治之”(divide-and-conquer)的方法。使用該策略，組合文庫中所有的產物結構可以視為在共同模板上通過一個或多個位點附著可變取代基。首先將模板對接在結合位點中，并僅保存最高得分的姿態作進一步考慮。然后將各取代基獨立地附著在模板的每一個姿態上，以評價哪些取代基可以良好地與該結合位點匹配。僅得分最高的取代基的組合才進一步加以考慮和評分，以確定可以真正良好地對接在該結合位點中的完整產物結構。這可以借助適宜軟件，例如PROSELECT，CombiBULID，CombiDOCK，DREAM++和FlexX來進行。在一個實施方案中，本發明的方法包括應用通過活性位點作圖得到的藥效團。在此，術語“活性位點”旨在描述負責與化合物相互作用的位點而不是催化活性位點。該方法可以是例如計算方法，包括產生多個、有希望的、結構多樣的被測化合物。可以使用任何適宜方法將蛋白質結構信息與組合文庫設計結合在一起，以搜索多結構系列。例如，可以使用“在受體中設計”的方法(Murrary等，1999)或以下列出的方法。也可以使用例如Masion等2000描述的用于說明多個蛋白質構象的方法，包括由分子動力學模擬出發創建動態藥效團模型(例如見Carlson等2000的描述)。也可以使用實驗和計算探針篩選方法，利用分子片段對活性位點進行作圖，例如參見Boehm等2000中的描述。用于位點作圖的任何適宜軟件工具(例如GRID和SITEPOINT)均可以用于本發明。此外還可以使用用于產生位點圖譜的MCSS技術。適宜的方法可以包括例如由蛋白質結構產生活性位點圖譜。然后，可以從該位點圖譜枚舉出所有可能的2-，3-和4-點藥效團，并以位串(Signature)形式編碼，這些藥效團定義一個將由化合物探測的空間，而所述化合物是使用信息文庫設計工具選擇的。用于評價該方法的成功性的量度是在文庫設計中選擇的活性支架的數量，活性化合物的數量是第二量度。可以使用用于產生位點圖譜的任何適宜算法，例如，針對每個活性位點產生10至80個特征位置的算法。該方法的一個實例見例如Eksterowicz等JMolGraphModel.2002年6月；20(6)469-77。Ig1-2-3組件的各種結合位點的信息連同本發明晶體結構的信息，為檢查所觀察的Ig1-Ig2、Ig1-Ig3和Ig2-Ig2接觸的生物學意義，以及為篩選能夠模擬NCAM的Ig1-Ig2、Ig1-Ig3、Ig3-Ig1、Ig2-Ig3和Ig2-Ig2組件結合的化合物，提供了工具。Ig1-2-3組件在溶液中的結構或者，可以確定可溶性Ig1-2-3組件的3D結構，并將其用于在計算機上篩選化合物，以評價化合物與該組件所包含的結合位點相互作用的潛力。NMR光譜學可以最終用于解析這些蛋白質在溶液中的結構。篩選化合物一方面，可以通過篩選計算機模型模板，諸如例如晶體或可溶性蛋白質形式的NCAMIg1-2-3組件的三維結構，鑒定能夠調節NCAM呈現細胞的粘著、分化和/或存活的新化合物。因此，本發明也涉及提供用于篩選能夠調節NCAM呈現細胞的細胞分化和/或存活的化合物的篩選方法，所述方法包括步驟i)提供包含NCAMIg1-2-3組件的多肽；ii)制備包含(i)的多肽的晶體蛋白；iii)產生(ii)的晶體蛋白形式的NCAMIg1-2-3組件的結構模型；iv)將化合物設計進所述步驟i)產生的模型的結構中；v)選擇根據(iii)的結構模型能夠與同嗜性結合位點相互作用的化合物；vi)在體外或體內試驗中，檢查步驟vi)的化合物是否能夠調節神經細胞分化、粘著和/或存活。在一些實施方案中，上述篩選方法可以包括使用計算機生成的NCAMIg1-2-3組件或所述組件的片段(例如，Ig1、Ig2、Ig3或Ig1-2、或Ig2-3組件)在溶液中的模型。此模型可以基于從例如上述組件的樣品的核磁共振光譜獲得的數據產生。然而，優選地是，計算機生成的模型是上述組件的晶體結構模型。本發明提供計算機生成的Ig1-2-3組件的結構模型，用于篩選能夠調節依賴于NCAM同嗜性結合的細胞粘著、存活和分化的化合物。設計相互作用化合物設計相互作用化合物產生位點圖譜使用內部開發的軟件工具計算與活性位點互補的特征點。例如，在蛋白質活性位點中于氫鍵受體附近繪制氫鍵供體特征圖。3D坐標和標記(受體、供體、負電荷、正電荷、疏水物和芳香族)的集合稱作位點圖譜。技術上，位點圖是三個分開的計算圖譜的聯合，其中所述的三個計算圖譜是含有靜電特征點(P，N和H)的ESMap、具有氫鍵鍵合特征點(D和A)的HBMap、和含有芳香族特征點(Ar)的AroMap。靜電特征圖，ESMap，首先使用PASS程序中所用的球體放置算法(sphereplacementalgorithm)(Brady等，2000)計算。它沿著蛋白質表面在具有隱蔽體積的區域中產生均勻分布的一組點(ProbeMap)。根據蛋白質的局部靜電特征，ProbeMap的點子集包含P、N和H特征點。使用CVFF分子力學力場計算ProbeMap每個i點的靜電勢i，以及對ProbeMap中所有點求平均得到的平均電勢和平均量級||。根據以下定義，由i值確定是否將i點包括為P、N或H特征點i＞+1.5*σ()，i＝N特征點i＞-1.5*σ()，i＝P特征點||-1.0*σ(||)＜|i|＜(||)+1.0*σ(||)，i＝H特征點。在此，σ(X)指數量X的平均值的標準偏差。這相對于活性位點的整體靜電環境，對點的賦值進行標化。這在避免不合理地歪曲特征點賦值的情況下給出不帶電荷的中性蛋白質結構(該結構可以由在晶體結構中未解析的或不存在的抗衡離子獲得)。氫鍵鍵合特征圖，HBMap，通過從蛋白質的已知氫鍵鍵合原子向外投射互補點來確定。所獲的點超集基于相似特征點的空間沖突、不充分的埋藏和最小接近度進行過濾。基于PDB中觀察到的平均角度和距離(見例如圖1所示表2)，放置理想的氫鍵鍵合點。除去與蛋白質沖突的點。然而，為了穩健，應用小的位置擾動(positionalperturbation)，以保留潛在的重要氫鍵鍵合位置。以拭探法，通過研究在兩個認為是中等或強氫鍵參與者的蛋白質原子間平均分叉的點的所有環，計算分叉氫鍵的接合處。這些環上的點，如果不違反空間沖突、埋藏和相互接近條件，即保留為分叉HB點。為了建立最終的HBMap，將存留下來的該組理想的和分叉的HB點組合在一起，并基于相互接近度進行過濾。AroMap的芳香族特征點集通過重復地將苯環對接入蛋白質活性位點并保留具有最高得分的構型的形心(centroid)來計算。使用極性氫CVFF力場給出蛋白質。對接使用內部代碼以局部優化模式進行。使用不同的起始位置進行100個單獨的局部對接試驗。任何對接構象如果其得分落入最低能量構型的5kcal/mol能量窗內，則被包括在AroMap中。再次，基于埋藏和相互接近度對點進行過濾。將藥效團轉化成位串(signature)基于活性位點中的特征點，通過徹底枚舉這些特征點的所有2-，3-和4-點子集，產生藥效團。針對所有的特征點對，預先計算其在3D空間中的距離。為了離散地表示藥效團，應用用戶定義的二進制化(binning)方案，將這些距離二進制化。通過編碼4-點藥效團的手型性，表示手性。將每個藥效團繪制在獨特地址上，由此表示多至4種特征和距離的任何可能組合。將地址用于這些藥效團的二進制表示，稱作位串。位串的長度是用于編碼一個4點藥效團的最大可能性地址。位串中的所有位最初均設為0。為了表示藥效團，開啟位串中位于相應地址的位(設為1)。為了表示活性位點，徹底地枚舉所有藥效團并開啟相應的位。多個結構的位串的聯合可以聯合多個位串。多個位串的二進制聯合可以產生用于表示在任何結構中存在的所有藥效團的單個位串。對于多個活性位點的共有表示，可以使用任何共有閾值c來進行定義。即，藥效團存在于至少c個活性位點構象中。注意，處理多個活性位點瞬象的這種方式是十分方便的。分子位串被測化合物按如下編碼。首先，針對每一個化合物，使用可以產生該分子的一個相當完整的構象模型的內部工具，產生構象異構體。使用基于亞結構的一組規則分派特征。從這些三維特征位置出發，遵循與用于活性位點相同的方案，枚舉藥效團，由此確保二進制編碼的相容性。然而，在此需要同時表示多個構象異構體。這通過在化合物的所有構象異構體上覆蓋針對單一一個構象異構體進行的藥效團徹底枚舉而形成額外一圈來實現。即，通過開啟位串中相應的位，表示處于化合物的任何構象體上的任何藥效團。分子位串掩蓋在類似地對活性位點的二進制表示和分子的二進制表示進行定義的情況下，位于一個確定地址的位的意義是相同的(相同的藥效團，在該距離二進制化的耐受范圍內)。因此，描述設計空間等于通過活性位點位串掩蓋所有分子位串。掩蓋位串意味著采取該位點位串和分子位串的位的邏輯″與″。對于給定分子，關閉代表活性位點中不存在的藥效團的位，而活性位點中的藥效團的位可以開啟或關上，這取決于它們是否存在于分子中。這樣，僅考慮由活性位點定義的藥效團空間。信息文庫設計(informativelibrarydesign)信息文庫設計是針對給定虛擬文庫優化信息反饋的一種分子選擇策略。目的是檢測可以用于確定針對具體被測化合物的活性的一組特征(藥效團)。信息設計旨在選擇一組化合物，使得所得的該子集可以以不同但重疊的方式問詢該被測化合物。為合成和篩選而選擇分子，使得該設計空間中的每一個藥效團都在該組分子中具有獨特的存在模式。此獨特“代碼”使得可以在分析該組化合物時鑒定和保持住重要的藥效團，而不論實際的實驗結果如何。這與試圖在每個分子中產生一個獨特的藥效團存在模式的多樣性方法是不同的。給定一個設計空間，該算法旨在優化盡可能多的解碼藥效團，在所有的藥效團類型之間最平滑地分布。藥效團的類型是指藥效團子集，該子集中的所有藥效團具有相同的代碼或模式。注意，最佳解決方案是能夠解碼每一個獨立藥效團的一組化合物。然而，由于源庫、位相關性或有限的選擇數量，這可能是不可能的。就分子選擇而言進行無約束優化的代價函數是類型分布的熵。該熵以如下公式給出H--Σi=1c|Ci|fln|Ci|f]]>其中H是特征類型的熵，C是不同類型的數量，f是在該設計空間中特征的數量，|c|是i類型的大小。在優化過程中，選擇分子以便使H最大化。檢查進一步檢查通過上述計算機篩選選出的化合物，以檢查它是否能夠調節呈現NCAM的細胞的細胞粘著、分化和/或存活。用于檢查化合物調節NCAM呈現細胞的粘著、分化和/或存活的能力的生物學試驗是本領域已知的。尤其是，可以使用本申請中以及WO03020749、WO0247719、WO03016351中所述的試驗。在一些實施方案中，可以使用上文描述的檢查方法，額外地或備選地用于實施(vi)中對所鑒定化合物的檢查。化合物本發明的化合物優選通過上述任何篩選方法選擇。根據本發明，所選擇的化合物是候選化合物。術語“候選化合物”是指該化合物能夠i)與NCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子。能夠進行至少一種上述相互作用的候選化合物，根據本發明，也能夠調節通過本文所述的同嗜性結合位點由NCAM的同嗜性結合所介導的細胞分化、粘著和存活。在一個優選的實施方案中，候選化合物能夠與NCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用(其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子)，并由此調節通過本發明同嗜性結合位點由NCAM同嗜性結合介導的細胞分化、粘著和存活。在另一個優選的實施方案中，候選化合物能夠與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用(其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子)，并由此調節通過本發明同嗜性結合位點由NCAM同嗜性結合介導的細胞分化、粘著和存活。本發明的另一個優選實施方案是，能夠與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用(其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子)，并由此調節通過本發明同嗜性結合位點由NCAM同嗜性結合介導的細胞分化、粘著和存活的候選化合物。在再一個優選的實施方案中，候選化合物能夠與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用(其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子)，并由此調節通過本發明同嗜性結合位點由NCAM同嗜性結合介導的細胞分化、粘著和存活。在再一個優選的實施方案中，候選化合物能夠與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用(其中所述組件來自兩個獨立的NCAM分子)，并由此調節通過本發明同嗜性結合位點由NCAM同嗜性結合介導的細胞分化、粘著和存活。本發明的其它優選實施方案涉及i)能夠同時與同一NCAM分子的Ig1和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig1-Ig3和Ig3-Ig1組件間的相互作用的候選化合物；ii)能夠同時與同一NCAM分子的Ig1和Ig2組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig1-Ig3和Ig2-Ig3組件間的相互作用的候選化合物；iii)能夠同時與同一NCAM分子的Ig1和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig1-Ig3和Ig3-Ig2組件間的相互作用的候選化合物；iv)能夠同時與同一NCAM分子的Ig1和Ig2組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig1-Ig3和Ig2-Ig2組件間的相互作用的候選化合物；v)能夠同時與同一NCAM分子的Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig2-Ig3和Ig3-Ig1組件間的相互作用的候選化合物；vi)能夠同時與同一NCAM分子的Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig2-Ig2和Ig3-Ig1組件間的相互作用的候選化合物；vii)能夠同時與同一NCAM分子的Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig2-Ig3和Ig3-Ig1組件間的相互作用的候選化合物；viii)能夠同時與同一NCAM分子的Ig2和Ig3組件的氨基酸殘基相互作用，并由此模擬和/或調節兩個通過所述組件相互作用的獨立NCAM分子的Ig2-Ig3和Ig3-Ig2組件間的相互作用的候選化合物。候選化合物可以是能夠進行上述相互作用的任何化合物。該化合物可以例如選自肽、脂質、糖或其它有機分子或氨基酸和其它有機化合物的共聚物的組合文庫。在一個優選的實施方案中，本發明的候選化合物是肽。或者，該化合物可以是能夠選擇性地結合位于結合位點中或緊靠結合位點的表位的抗體分子。緊靠在此定義為指，表位的氨基酸殘基與結合位點的氨基酸殘基之間的距離為大約50至500。與遠側表位(與結合位點的氨基酸殘基的距離超過500)結合、并且該結合導致Ig1-2-3組件發生構象變化由此影響通過結合位點的同嗜性結合的抗體分子，也是本發明所涉及的。一個優選的候選化合物是包含衍生自本文所述結合位點的氨基酸序列的化合物。“衍生”是指氨基酸序列包含NCAMIg1-2-3組件的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含結合位點或結合位點的一部分；或者所述氨基酸序列包含如下氨基酸殘基的序列，其中所述氨基酸殘基與參與兩個獨立NCAM分子間通過結合位點相互作用的殘基同源。氨基酸殘基的同源性可以是大約60％，更優選大約70％、甚至更優選大約80％、諸如例如90％、最優選大約100％。關于一個氨基酸殘基與另一氨基酸殘基的同源性，見上文中的定義。因此，一個優選的候選化合物可以包含衍生自NCAM的Ig1組件和/或Ig2組件和/或Ig3組件的序列。該化合物的非限制性實例可以是本申請中標識為SEQIDNO1-20，40-43的化合物。因此，本發明在一個實施方案中提供具有SEQIDNO1所示氨基酸序列WFSPNGEKLSPNQ的化合物。在另一個實施方案中本發明的化合物具有SEQIDNO2所示氨基酸序列YKCVVTAEDGTQSE。在再一實施方案中，本發明提供具有SEQIDNO3所示氨基酸序列TLVADADGFPEG的化合物。在再一實施方案中，本發明提供具有SEQIDNO4所示氨基酸序列QIRGIKKTD的化合物。在再一實施方案中，本發明提供具有SEQIDNO5所示氨基酸序列DVR的化合物。在又一實施方案中，本發明化合物具有SEQIDNO6所示氨基酸序列RGIKKTD。在再一實施方案中，本發明提供了具有SEQIDNO7所示氨基酸序列DVRRGIKKTD的化合物。在另一方面，本發明涉及化合物具有SEQIDNO8氨基酸序列KEGED。在再一方面，化合物具有SEQIDNO9所示氨基酸序列IRGIKKTD。本發明還提供具有SEQIDNO10所示氨基酸序列KEGEDGIRGIKKTD的化合物。此外，在另一實施方案中，本發明提供具有SEQIDNO11所示氨基酸序列DKNDE的化合物。在再一實施方案中，本發明涉及具有SEQIDNO12所示氨基酸序列TVQARNSIVNAT的化合物。在本發明又一實施方案中，化合物具有SEQIDNO13所示氨基酸序列SIHLKVFAK。在又一實施方案中，化合物具有SEQIDNO14所示氨基酸序列LSNNYLQIR。在再一實施方案中，本發明提供具有SEQIDNO15所示氨基酸序列RFIVLSNNYLQI的化合物。在再一實施方案中，本發明還提供具有SEQIDNO16所示氨基酸序列KKDVRFIVLSNNYLQI的化合物。在再一實施方案中，本發明還提供具有SEQIDNO17所示氨基酸序列QEFKEGEDAVIV的化合物。本發明還提供具有SEQIDNO18所示氨基酸序列KEGEDAVIVCD的化合物。在其它實施方案中，本發明涉及具有如下氨基酸序列的化合物GEISVGESKFFL(SEQIDNO19)KHIFSDDSSELTIRNVDKNDE(SEQIDNO20)AFSPNGEKLSPNQ(SEQIDNO40)AKSVVTAEDGTQSE(SEQIDNO41)DVRRGIKKTD(SEQIDNO42)或QIRGIKKTD(SEQIDNO43)。以上序列也被視為本發明的優選候選化合物。這些序列的片段或變體也包括在本發明范圍內作為能夠像原始序列(即它們所衍生自的序列或與它們同源的序列)一樣相互作用和/或發揮作用，的候選化合物。根據本發明，以上鑒定的序列是Ig1-2-3組件中NCAM同嗜性結合位點的不同片段，能夠調節NCAM呈現細胞的分化和/或存活。根據本發明，以上鑒定的序列可以用于制造治療疾病或病癥的藥物，其中在所述疾病或病癥中調節NCAM同嗜性相互作用將導致對疾病或病癥的改善或救助。另外，上述序列可用于生成能夠識別并特異結合本發明結合位點的抗體。依照本發明的這種抗體具有上文所述化合物的至少一種生物學活性，且在有些實施方案中可以像本發明的化合物那樣有利的用于醫學應用。生成肽序列本發明的肽化合物可以通過任何常規合成方法、重組DNA技術、酶促切割可以衍生出該肽序列的全長蛋白質(諸如例如不同物種來源的NCAM分子)、或者所述方法的組合來制備。重組制備重組制備是用于產生長鏈多肽序列，諸如例如Ig1-2-3組件、或NCAM的單個獨立組件如Ig1、Ig2或Ig3、或者其組合如Ig1-2、Ig1-3或Ig2-3的優選方法。然而，包含衍生自結合位點的序列、長15-50個氨基酸的較短肽片段，也可以利用任何下述技術重組制備。編碼肽或肽所來源的相應全長蛋白質或其片段的DNA序列可以通過已經建立的標準方法，以合成方式制備，其中所述標準方法為例如Beaucage和Caruthers，1981，TetrahedronLett.221859-1869描述的磷脒(phosphoamidine)法、或者Matthes等，1984，EMBOJ3801-805所述的方法。根據磷脒法，在例如自動DNA合成儀中合成寡核苷酸、并將其純化、退火、連接并克隆至適宜載體中。編碼肽的DNA序列也可以通過使用DNA酶I根據標準方案(Sambrook等，MolecularcloningALaboratorymanual，2rded.，CSHLPress，ColdSprinHarbor，NY，1989)，對編碼相應全長蛋白質(例如NCAM蛋白質)的DNA序列進行片段化來制備。或者，編碼全長蛋白質的DNA可以通過使用特異的限制性內切酶來片段化。使用Sambrook等，MolecularcloningALaboratorymanual，2rded，CSHLPress，ColdSpringHarbor，NY，1989所述的標準方案，進一步純化DNA片段。編碼全長蛋白質的DNA序列也可以是基因組或cDNA來源的，例如通過制備基因組或cDNA文庫并通過使用合成寡核苷酸探針依據標準技術(參見，Sambrook等，MolecularcloningALaboratorymanual，2rded，CSHLPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)進行雜交以篩選編碼全長蛋白質的全部或一部分的DNA序列而獲得。也可以使用特異引物，例如US4,683,202或Saiki等1988，Science239487-491中所述的，通過聚合酶鏈式反應制備DNA序列。然后將DNA序列插入重組表達載體，該載體可以是可以方便地進行重組DNA程序操作的任何載體。載體的選擇常常取決于其待要引入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復制載體，即，以染色體外實體形式存在且其復制獨立于染色體的復制的載體，例如質粒。或者，載體可以是引入宿主細胞后整合入宿主細胞基因組中并與其所整入的染色體一起復制的載體。在載體中，編碼肽或全長蛋白質的DNA序列應可操作地與適宜的啟動子序列連接。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何DNA序列，其可以來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用于指導編碼DNA序列在哺乳動物細胞中轉錄的適宜啟動子的實例是SV40啟動子(Subramani等，1981，Mol.CellBiol.1854-864)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter等，1983，Science222809-814)或者2型腺病毒主要晚期啟動子。適宜在昆蟲細胞中使用的啟動子是多角體蛋白啟動子(Vasuvedan等，1992，FEBSLett.3117-11)。適宜在酵母宿主細胞中使用的啟動子包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，1980，JBiol.Chem.25512073-12080；Alber和Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1419-434)或醇脫氫酶基因(Young等，1982，《GeneticEngineeringofMicroorganismforChemicals》，Hollaender等編，PlenumPress，紐約)的啟動子，或者TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，1983，Nature304652-654)啟動子。適宜在絲狀真菌宿主細胞中使用的啟動子是例如ADH3啟動子(McKnight等，1985，EMBOJ42093-2099)或者tpiA啟動子。編碼DNA序列也可以可操作地與適宜的終止子連接，所述終止子諸如是人生長激素終止子(Palmiter等，前面引用的文獻)或者(對于真菌宿主)TPI1(Alber和Kawasaki，前面引用的文獻)或ADH3(McKnight等，前面引用的文獻)終止子。載體還可以包含諸如多聚腺苷酸化信號(例如來自SV40或5型腺病毒Elb區)、轉錄增強子序列(例如SV40增強子)和翻譯增強子序列(例如編碼腺病毒VARNA的翻譯增強子序列)的元件。重組表達載體還可以包含使載體能夠在所考慮的宿主細胞中復制的DNA序列。此序列的例子(當宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40的復制起點。載體還可以包含選擇標記，例如其產物彌補了宿主細胞缺陷的基因，諸如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因，或者賦予抗藥物(例如新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)抗性的基因。用于將編碼肽或全長蛋白質的DNA序列與啟動子和終止子分別連接起來的方法、以及用于將它們插入含有復制所需信息的適宜載體中的方法是本領域技術人員所熟知的(參見例如，Sambrook等，前述引文)。為了獲得本發明的重組肽，有用的是，可以將編碼DNA序列與編碼第二種肽的序列和編碼蛋白酶切割位點的序列融合，產生編碼融合蛋白的DNA構建體，其中編碼蛋白酶切割位點的序列位于HBP片段和編碼第二種肽的DNA之間，并插入重組表達載體中，在重組宿主細胞中表達。在一個實施方案中，所述第二種肽選自，但不限于，谷胱苷肽-S-還原酶、牛胸腺素、細菌硫氧還蛋白或人泛素的天然或合成變體、或者其肽。在另一實施方案中，包含蛋白酶切割位點的肽序列可以是具有氨基酸序列IEGR的因子Xa的切割位點、具有氨基酸序列DDDDK的腸激酶的切割位點、具有氨基酸序列LVPR/GS的凝血酶的切割位點、或者具有氨基酸序列XKX的水解無色桿菌(Achromobacterlyticus)的切割位點。表達載體所引入的宿主細胞可以是能夠表達肽或全長蛋白質的任何細胞，并且優選真核細胞，諸如無脊椎動物(昆蟲)細胞或脊椎動物細胞，例如光滑爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細胞或哺乳動物細胞，尤其是昆蟲和哺乳動物細胞。適宜的哺乳動物細胞系的例子是HEK293(ATCCCRL-1573)、COS(ATCCCRL-1650)、BHK(ATCCCRL-1632，ATCCCCL-10)或CHO(ATCCCCL-61)細胞系。轉染哺乳動物細胞和表達引入這些細胞中的DNA序列的方法描述在例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1327-341；Loyter等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79422-426；Wigler等，1978，Cell14725；Corsaro和Pearson，1981，《SomaticCellGenetics》7，p.603；Graham和vanderEb，1973，Virol.52456；和Neumann等，1982，EMBOJ.1841-845。或者，可以使用真菌細胞(包括酵母細胞)作為宿主細胞。適宜的酵母細胞的例子包括酵母屬(Saccharomycesspp.)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomycesspp.)物種的細胞，尤其是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株的細胞。其它真菌細胞的例子是絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillusspp.)或脈孢霉(Neurosporaspp.)物種，尤其是米曲霉(Aspergillusoryzae)或黑曲霉(Aspergillusniger)菌株的細胞。曲霉屬物種在蛋白質表達中的應用參見例如EP238023中所述。用于培養細胞的培養基可以是適宜哺乳動物細胞生長的任何常規培養基，諸如包含適當的補充物的、含有血清的或無血清的培養基，或者適宜昆蟲、酵母或真菌細胞生長的培養基。適宜的培養基可以從商業途徑獲得，或者可以根據已經公布的配方(例如，美國典型培養物保藏中心的目錄)制備。通過細胞重組產生的肽或全長蛋白質然后可以從培養基中利用常規方法回收，其中所述常規方法包括從培養中通過離心或過濾的方式分離出宿主細胞、利用鹽(例如硫酸銨)沉淀上清液或濾出液中的蛋白質性成分、通過各種層析方法(例如HPLC、離子交換層析、親和層析等)純化。合成制備當考慮3至50個氨基酸的短序列時，優選合成制備。肽的合成制備方法是本領域熟知的。關于制備合成肽的詳細描述和實踐意見可以見SyntheticPeptidesAUser’sGuide(AdvancesinMolecularBiology)，GrantG.A.編，OxfordUniversityPress，2002，或者《PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins》，Frokjaer和Hovgaard編，Taylor和Francis，1999。肽可以例如通過使用Fmoc化學以及Acm-保護的半胱氨酸來合成。通過反相HPLC純化后，可以進一步加工肽以獲得例如環狀或C或N端修飾的異構體。用于環化和末端修飾的方法是本領域熟知的，詳細描述在上文引用的手冊中。在一個優選的實施方案中，本發明的肽序列通過合成方式，尤其是通過序列輔助的肽合成(SAPS)方法制備。可以成批地在配備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯管中，或者以聚酰胺固相方法(Dryland，A和Sheppard，R.C.，(1986)J.Chem.Soc.PerkinTrans.I，125-137)的連續作業方式，在一個完全自動化的肽合成儀(CameronET等，(1987)，J.Chem.Soc.Chem.Commun，270-272)上，使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁基氧基羰基(Boc)作為N-a-氨基的保護基、并使用適用于側鏈官能團的常用保護基，合成肽。藥物組合物在鑒定了本發明的候選化合物后，本發明的范圍進一步擴充至提供包含一種或多種化合物的藥物組合物。在本文上下文中，術語藥物組合物與術語藥物同義。本發明還涉及能夠如本文所述在體內或在體外在幾種組織和器官中防止NCAM呈現細胞死亡、促進神經細胞的細胞分化和神經元可塑性、及刺激NCAM呈現細胞和/或NCAM配體呈現細胞的存活和再生的藥物組合物，所述組合物包含有效量的一種或多種上述化合物。本發明的藥物可以包含有效量的一種或多種上述化合物以及可藥用添加劑。可以適宜地配制該藥物以用于口服、經皮、肌內、靜脈內、顱內、鞘內、腦室內、鼻內或肺施用。本發明還涉及用于治療中樞和周圍神經系統、肌肉或各種器官的疾病和病癥的藥物，其中所述藥物包含有效量的一種或多種上述化合物或者上述組合物以及可藥用添加劑或載體。可以適宜地配制該藥物以用于口服、經皮、肌內、靜脈內、顱內、鞘內、腦室內、鼻內或肺施用。制劑基于本發明化合物的藥物和組合物的制劑開發策略一般符合用于任何其它基于蛋白質的藥物產物的配制策略。潛在的問題和克服這些問題所需要的指導在幾本教科書中有詳細闡述，所述教科書例如“TherapeuticPeptidesandProteinsFormulation.ProcessingandDeliverySystems”，編者A.K.Banga，TechnomicPublishingAG，Basel，1995。注射劑通常制備成液體溶液或懸浮液、適宜在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。該制劑也可以乳化。活性成分常常與可藥用的且和活性成分相容的賦形劑混和。適宜的賦形劑是例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等、以及它們的組合。此外，如果期望，制劑可以含有少量的輔助物質，諸如潤濕或乳化劑、pH緩沖劑，以增強制劑的效力或運輸。本發明化合物的制劑可以通過本領域技術人員已知的技術配制。制劑可以包含可藥用載體和賦形劑，包括微球體、脂質體、微囊、納米顆粒等。施用對于大多數適應癥，優選局部的或實質上局部的施用。化合物尤其可以和假器官裝置，例如神經導引假器官(prostheticnerveguide)聯合使用。因此，在再一方面，本發明涉及神經導引假器官，其特征在于包含一種或多種上述化合物或組合物。神經導引是本領域熟知的。制劑可以適宜地通過注射、任選在活性成分發揮作用的位點注射來實施。適宜其它施用模式的其它制劑包括栓劑、鼻、肺，及一些情況下，口服制劑。對于栓劑，傳統粘合劑和載體包括聚烷撐二醇或甘油三酯。這些栓劑可以從含有0.5％至10％，優選1-2％活性成分的混和物形成。口服制劑包括經常使用的賦形劑，例如制藥級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、囊劑、緩釋制劑或粉劑的形式，并一般含有10-95％活性成分，優選25-70％。其它制劑是適于鼻和肺施用的制劑，例如吸入劑和氣霧劑。活性成分可以配成中性或鹽形式。可藥用鹽包括與無機酸，諸如例如鹽酸或磷酸、或者與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽(與肽化合物的游離氨基形成的)。由游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿，諸如例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，以及有機堿諸如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。制劑以和劑型相容的方法、以治療有效的量施用。待施用的量取決于所治療的對象，包括，例如對象的體重和年齡、所治療的疾病和疾病階段。適宜的劑量范圍是每次施用大約幾百μg活性成分，優選范圍是大約0.1μg至100mg，諸如大約1μg至100mg，尤其是大約10μg至50mg。可以一次性給藥，或者可以尾隨多次給藥。劑量也取決于給藥途徑，并且隨著所治療的對象的年齡和體重變化。優選劑量在每70kg體重0.5mg至50mg的范圍內。本發明一些候選化合物具有充分的活性，但對于另一些，如果制劑還包含可藥用添加劑和/或載體時則可以增強效果。這些添加劑和載體是本領域已知的。在一些情況下，有利的是將促進活性物質向其靶標遞送的化合物包括在內。在另一個實施方案中，可能有利的是，施用本發明的候選化合物和其它物質以獲得協同效果。這些其它物質的例子可以是能夠誘導分化的生長因子、或激素、或細胞移植物，包括干細胞移植物、或基因治療、或免疫治療。在許多情況下，多次施用制劑是必需的。施用可以是連續輸注，諸如心室內輸注，或者是多次給藥，例如一天多次、一天一次、一周多次或一周一次的施用。優選地，藥物施用在個體接受可以導致細胞死亡的因子之前或之后不久開始。優選地，距該因子開始發作的8小時內，諸如距該因子開始發作的5小時內，施用藥物。許多化合物顯示出長期效果，由此可以以長時間間隔，諸如1周或2周來施用這些化合物。在本發明一個實施方案中，本發明化合物可以在急性損傷，諸如急性中風后立即施用，或者在所述中風后最多8小時時施用，以便本發明化合物對細胞存活產生刺激效應。而且，在涉及增殖和/或分化的情況中，本發明的施用是不依賴時間的，即可以在任何時間施用。生產藥物在另一方面，本發明涉及生產藥物組合物的方法，包括將有效量的一種或多種本發明化合物、或根據本發明的藥物組合物與一種或多種可藥用添加劑或載體一起混和，并將有效量的至少一種所述化合物或所述藥物組合物施用給對象。在再一方面，本發明涉及通過向患有一種或多種上述疾病的個體施用本文描述的化合物或包含所述化合物的藥物組合物，治療所述個體的方法。藥物本發明的候選化合物可以有利地用于處理呈現NCAM分子的細胞。NCAM在生物體的多種細胞中表達，取決于細胞類型和/或細胞環境，NCAM在細胞中可以充當粘著分子、受體和/或配體。本發明的作者發現，與本文所述結合位點的不同部分結合的候選化合物對細胞粘著、分化和/或存活可具有不同的效果，因此，在此提出將所述化合物用作細胞分化和存活(諸如神經細胞分化和存活)的直接刺激劑，以及NCAM在神經可塑性(諸如例如突觸可塑性)中的功能的調節劑。因此，本發明的候選化合物可以用于制造藥物以用于治療周圍和/或中樞神經系統和/或肌肉和其它表達NCAM的組織的各種病理狀況，例如創傷和/或疾病，以及可能得益于NCAM功能的精細調節的狀況，諸如記憶和學習刺激。因此，本發明的候選化合物可以用于制造藥物，以處理正常的、變性的、或損傷的NCAM和/或NCAM配體呈現細胞。尤其是，本發明的化合物和/或藥物組合物可以用于治療臨床病癥，諸如瘤，例如惡性瘤、良性瘤、原位癌和具有不定行為表現的瘤，內分泌腺疾病，諸如糖尿病，精神病，諸如老年性和早老性器質性精神病狀況、酒精中毒性精神病、藥物性精神病、暫時性器質性精神病狀況、阿爾茨海默氏病、腦脂沉積癥、癲癇、全身麻痹性癡呆[梅毒]、肝豆狀核變性、亨廷頓舞蹈病、雅-克二氏病、多發性硬化、Pick氏腦病、梅毒、精神分裂癥、情感性精神病、神經性障礙(neuroticdisorder)、人格障礙，包括性格神經癥、與器質性腦綜合癥有關的非精神病性人格障礙、偏執性人格障礙、狂信型人格(fanaticpersonality)、偏執性人格(障礙)、偏執特質、性偏離和性功能障礙、智力遲鈍、神經系統和感覺器官的疾病、認知異常、中樞神經系統的炎癥，諸如腦膜炎、腦炎、大腦變性，諸如阿爾茨海默氏病、Pick氏病、腦的老年性變性、交通性腦積水、梗阻性腦積水、帕金森病包括其它椎體外系疾病和異常運動障礙、脊髓-小腦疾病、小腦共濟失調、Marie氏、Sanger-Brown、肌陣攣性小腦協同失調、原發性小腦變性、諸如脊髓性肌萎縮癥、家族性、青少年性、成年性脊髓性肌萎縮癥、運動神經元疾病、肌萎縮性側索硬化、運動神經元疾病、進行性延髓麻痹、假延髓麻痹、原發性側索硬化、其它前角細胞疾病、前角細胞疾病、未分類的其它脊髓疾病、脊髓空洞癥和延髓空洞癥、血管性脊髓病、脊髓的急性梗死(栓塞性的)(非栓塞性的)、脊髓的動脈血栓癥、脊髓的水腫、亞急性壞死性脊髓病、脊髓的亞急性聯合變性(在其它地方分類的疾病中)、脊髓病、藥物誘導的、輻射誘導的脊髓炎、自主神經系統紊亂、周圍自主、交感、副交感或植物系統紊亂、家族性自主神經異常[里-戴二氏綜合癥]、特發性周圍自主神經病、頸動脈竇暈厥或頸動脈竇綜合癥、頸交感神經營養不良或麻痹、周圍自主神經病(在別處分類的病癥中)、淀粉樣變性、周圍神經系統的疾病、臂神經叢損傷、頸肋綜合癥、肋鎖綜合癥、前斜角肌綜合癥(scalenusanteriorsyndrome)、胸腔出口綜合癥、臂叢神經炎或脊神經根炎，包括新生兒中的；炎性和毒性神經病，包括急性傳染性多神經炎、Guillain-Barre綜合癥、感染后多神經炎、膠原血管病中的多神經病、影響眼睛的多個結構的疾病、化膿性眼內炎、耳和乳突的疾病、慢性風濕性心臟病、缺血性心臟病、心律失常、肺系統的疾病、新生兒的器官和軟組織異常，包括神經系統中的，陣痛和分娩中麻醉劑或其它鎮靜劑施用的并發癥、皮膚疾病，包括感染、不充分的血液循環問題、損傷，包括手術后的、壓傷、燒傷；神經和脊髓的損傷，包括神經切斷、連貫性的損害(有或無開放傷口)、創傷性神經瘤(有或無開放傷口)、創傷性暫時性麻痹(有或無開放傷口)、在醫學操作中的意外刺傷或撕裂、視神經和視路的損傷、視神經損傷、第二顱神經、視交叉損傷、視路損傷、視皮層損傷、未分類的失明、其它顱神經損傷、其它和未分類的神經損傷；藥物、醫學和生物學物質中毒、遺傳性的或創傷性的萎縮性肌障礙；或用于治療各種器官的疾病或病癥，諸如生殖腺、胰腺(諸如I和II型糖尿病)、腎(諸如腎變病)的變性病。CNS/PNS的病癥在本發明另一方面，化合物用于治療中樞和周圍神經系統的疾病或病癥，諸如手術后神經損傷、創傷性神經損傷、神經纖維的受損的髓鞘形成、缺血后損傷、例如由中風所致的、帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病、癡呆諸如多發梗塞性癡呆(Multiinfarctdementia)、硬化、與糖尿病有關的神經變性、影響晝夜節律鐘或神經-肌肉傳遞的病癥、和精神分裂癥、情感障礙(mooddisorders)諸如躁郁癥(manicdepression)；用于治療肌肉的疾病和病癥，包括神經-肌肉連接功能受損的病癥，諸如器官移植后的，或者諸如遺傳性的或創傷性的萎縮性肌障礙；或者用于治療各種器官的疾病或病癥，例如生殖腺、胰腺(諸如I和II型糖尿病)、腎(諸如腎變病)、以及心臟和腸的變性病；用于治療手術后神經損傷、創傷性神經損傷、神經纖維的受損的髓鞘形成、缺血后的，例如中風所致的、帕金森病、阿爾茨海默氏病、癡呆諸如多發梗塞性癡呆(Multiinfarctdementia)、硬化、與糖尿病有關的神經變性、影響晝夜節律鐘或神經-肌肉傳遞的病癥、和精神分裂癥、情感障礙，諸如躁郁癥。防止細胞死亡此外，本發明的候選化合物可用于防止植入的或移植的細胞發生細胞死亡。這在使用具有長期效果的化合物時是尤其有用的。在本發明的另一個方面，可以自植入的或注射的經基因操作的細胞合成并分泌候選化合物。心肌此外，候選化合物和/或藥物組合物可以用于防止心肌細胞的細胞死亡，諸如在急性心肌梗死后，或在血管發生后。再者，在一個實施方案中，化合物和/或藥物組合物用于刺激心肌細胞的存活，諸如在急性心肌梗死后的存活。在另一方面，化合物和/或藥物組合物用于重新脈管化，諸如在損傷后。記憶另一方面，候選化合物和/或藥物組合物用于刺激學習能力和/或短期和/或長期記憶。再生在本發明的一個方面，應用本發明的候選化合物進行治療，對于刺激由于各種原因(諸如創傷和損傷、急性疾病、慢性疾病和/或病癥，尤其是正常導致細胞死亡的變性病、其它外部因素諸如藥物和/或手術處理和/或可能導致游離自由基形成或者具有其它細胞毒效應的診斷方法，諸如X射線和化療)而正在變性的或者有死亡危險的細胞再生是有用的。朊病毒疾病候選化合物或包含它的藥物組合物也可以用于治療朊病毒疾病。已經證明NCAM是細胞朊病毒蛋白的一個分子相互作用配偶體。用于傷口愈合本發明的范圍也包括使用候選化合物和/或藥物組合物促進傷口愈合。本發明化合物能夠干擾細胞粘著并由此促進傷口愈合過程。癌癥本發明還公開了候選化合物和/或藥物組合物在癌癥治療中的用途。NCAM調節癌細胞的運動性并抑制癌癥細胞擴散。參考文獻Atkins，A.R.，Osborne，M.J.，Lashuel，H.A.，Edelman，G.M.，Wright，P.E.，Cunningham，B.A.，andDyson，H.J.(1999).Associationbetweenthefirsttwoimmunoglobulin-likedomainsoftheneuralcelladhesionmoleculeN-CAM.FEBSLett.451，162-168.Atkins，A.R，Chung，J.，Deechongkit，S.，Little，E.B.，Edelman，G.M.，Wright，P.E.，Cunningham，B.A.，andDyson，H.J.(2001).SolutionstructureofthethirdimmunoglobulindomainoftheneuralcelladhesionmoleculeN-CAMcansolutionstudiesdefinethemechanismofhomophilicbinding？J.Mol.Biol.311，161-172.Becker，J.W.，Erickson，H.P.，Hoffman，S.，Cunningham，B.A.，andEdelman，G.M.(1989).Topologyofcelladhesionmolecules.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，1088-1092.Berezin，V.，Bock，E.，andPoulsen，F.M.(2000).Theneuralcelladhesionmolecule.Curr.Opin.DrugDiscoveryDev.3，605-609.Bork，P.，Downing，A.K.，Kieffer，B.，andCampbell，I.D.(1996).Structureanddistributionofmodulesinextracellularproteins.Q.Rev.Biophys.29，119-167.Brieher，W.M.，Yap，A.S.，andGumbiner，B.M.(1996).LateraldimerizationisrequiredforthehomophilicbindingactivityofC-cadherin.JCellBiol.135，487-496.Brünger，A.T.，Adams，P.A.，Clore，G.M.，DeLano，W.L.，Gros，P.，Grosse-Kunstleve，R.W.，Jiang，J-S.，Kuszewskl，J.，Nilges，M.，Pannu，N.S.，Read，R.J.，Rice，L.M.，Simonson，T.，andWarren，G.L.(1998).Crystallography&NMRsystemAnewsoftwaresuiteformacromolecularstructuredeterminaticn.ActaCryst.D54，905-921.Casasnovas，J.M.，Stehle，T.，Liu，J.H.，Wang，J.H.，andSpringer，T.A.(1998).AdimericcrystalstructurefortheN-terminaltwodomainsofintercellularadhesionmolecule-1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95，4134-4139.Chothia，C.，andJones，E.Y.(1997).Themolecularstructureofcelladhesionmolecules.Annu.Rev.Biochem.66，823-862.Cole，G.J.，andAkeson，R.(1989).IdentificationofaheparinbindingdomainoftheneuralcelladhesionmoleculeN-CAMusingsyntheticpeptides.Neuron2，1157-1165.CollaborativeComputationalProject，number4.(1994).TheCCP4SujteProgramsforProteinCrystallography.ActaCryst.D50，760-763.Covault，J.，andSanes，J.R.(1985).Neuralcelladhesionmolecule(NCAM)accumulatesindenervatedandparalyzedskeletalmuscles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，4544-4548.Conte，L.L.，Chothia，C.，andJanin，J.(1999).Theatomicstructureofprotein-proteinrecognitionsites.J.Mol.Biol.285，2177-98.Cremer，H.，Lange，R.，Christoph，A.，Plomann，M.，Vopper，G.，Roes，J.，Brown，R.，Baldwin，S.，Kraemer，P.，Scheff，S.，Barthels，D.，Rajewsky，K.，andWille，W.(1994).InactivationoftheN-CAMgeneinmiceresultsinsizereductionoftheolfactorybulbanddeficitsinspatialIearning.Nature367，455-459.Cunningham，B.A.，Hemperly，J.J.，Murray，B.A.，Prediger，E.A.，Brackenbury，R.，andEdelman，G.M.(1987).NeuralcelladhesionrnoleculeStructure，immunoglobulin-likedomains，cellsurfacemodulation，andalternativeRNAsplicing.Science236，799-806.DrejerJ.andSchousboeA.(1989)Selectionofapurecerebellargranulecellculturebykainatetreatment.NeurochemRes.14751-4Edelman，G.M.，andCrossin，K.L.(1991).Celladheslonm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igakuRU300旋轉陽極上，于120K，收集低分辨率數據，至3.5。將這兩組數據合并，并用DENZO/SCALEPACK(Otwinowski和Minor，1997)和CCP4程序組(CollaborativeComputationalProjectNo.4，1994)處理。結構測定和修正使用程序AmoRe(Navaza和Saludjan，1997)和CNS版本1.0(Brünger等，1988)，利用NCAMIg2和Ig1組件的X射線結構(Kasper等，2000)作為搜索模型，通過分子置換測定結構。最初，使用AmoRe定位Ig2組件的位置。之后使用CNS定位Ig1組件。基于來自Ig1和Ig2的相信息，計算電子密度圖。將Ig3的殘基逐漸地嵌入該圖中。使用程序O(Jones等，1991)，進行圖的解釋和模型建立。經過幾個建立和精化循環后，使用ARP/wARP版本5.1(Perrakis等，1999)，重建NCAMIg1-2-3的291個殘基中的233個。使用CNS實施最后的精化循環。最終的模型含有氨基酸(-1)-238和241-289，及266個水分子。根據NCAM的成熟序列對氨基酸進行編號。來源于克隆位點的殘基Arg和Val分別被賦予負整數-2和-1。使用50-2.0分辨率范圍內的所有反射，Rcryst是21.8％，Rfee是23.8％(3％測試集，對應于828個反射)。表1(圖1)中給出數據收集和精化統計。根據Bork等(1996)確定結構域間幾何形狀，并使用蛋白質-蛋白質相互作用服務器(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server)(Jones和Thornton，1996)計算隱蔽的可接近表面區域。用程序MOLSCRIPT、RASTER3D(Kraulis，1991；Merritt和Bacon，1997)和InsightII(Accelrys)，準備圖像。表2(圖2)中顯示了結構的原子坐標。蛋白質數據庫ID代碼已經將結構坐標收錄入蛋白質數據庫，ID代碼1QZ1。細胞培養和免疫染色表達NCAM的嗜鉻細胞瘤PC12-E2細胞系(Wu和Bradshaw，1995)由Dr.KlausSeedorf(HagedornResearchInstitute，Denmark)惠贈。細胞在補加了5％v/v胎牛血清(FCS)和10％v/v馬血清(HS)、100Uml-1青霉素、100μgml-1鏈霉素(均來自GibcoBRL)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM)中，于37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中培養。用含有編碼人140kDaNCAM-B的全長cDNA的真核表達載體pHβ-Apr-1-neo(Gunning等，1987)，或者用空載體，穩定轉染成纖維樣小鼠細胞系L929(EuropeanCellCultureCollection)。NCAMcDNA不含外顯子VASE，a，b，c，或AAG。細胞在37℃、5％CO2和補加了10％v/vFCS、100Uml-1青霉素和100μgml-1鏈霉素的DMEM中常規地培養。為了分析神經突向外生長，將PC12-E2細胞(每孔8,000個細胞)接種在4孔LabTek組織培養室載片(NUNC)中的經轉染成纖維樣L929細胞匯合單層頂上。細胞在補加了1％v/vHS的DMEM中培養24小時，然后進行分析。從出生后3天的Wistar大鼠幼崽，制備小腦顆粒神經元(CGN)。在保持于冰上的改良Krebs-Ringer溶液中解剖小腦組織，如以上用于海馬神經元的方式處理。所有的細胞培養物均培養在37℃，含有5％CO2的潮濕空氣中。所有動物依據國家的動物福利準則進行操作。CGN的原代培養物以100,000個細胞/cm2的密度接種在多聚L-賴氨酸包被的8孔permanox載片上于補加了2％(v/v)B27、0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和KCl(使培養基中KCl的終濃度為40mM)的Neurobasal-A培養基(Gibco，BRL)中。接種后24小時，加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C；Sigma-Aldrich)至10μM終濃度，以避免神經膠質細胞增殖，之后允許神經元在37℃再分化6天。在接種細胞后立即加入糖基化的重組大鼠NCAMIg3組件(野生型和突變形式)或選擇的肽，以評價它們對粘著的抑制作用，反映為通過對NCAM介導的神經突向外生長的干擾。檢查濃度500μgml-1的Ig3wt、Ig3mut1和Ig3mut2。包括適當對照，實施實驗的人員不知道這些突變體或肽的身份。為了評價PC12-E2細胞的向外生長長度，在4％w/v多聚甲醛中固定共培養物25分鐘。PBS中洗滌后，用10％v/v山羊血清(DAKO)封閉細胞30分鐘，隨后室溫與小鼠單克隆抗Thy-1抗體(CaltagLaboratories)(含有10％v/v山羊血清的PBS中1∶100)孵育1小時。洗滌后，室溫下細胞與Alexa-Fluor568TM山羊抗小鼠IgG(MolecularProbes)(含有10％山羊血清的PBS中1∶1000)孵育1小時。所有洗滌均在PBS中進行10分鐘，并且重復3次。為了評價CGN神經突的長度，在培養24小時后用4％(v/v)多聚甲醛固定神經元20分鐘，之后使用一抗抗GAP-43兔抗體和二抗AlexaFluor山羊抗兔抗體免疫染色。使用計算機輔助的熒光顯微鏡，系統地獲取圖像，每個獨立實驗中每組獲取至少200個神經元的圖像。使用軟件ProcessLength(Rnn等，2000)，分析每個細胞的總神經突長度。用Ig3組件、其突變體和各肽進行5個獨立實驗。每一個實驗中，分析200-300個細胞的神經突。為了比較各個獨立實驗的結果，而且因為細胞實驗固有的高度變化性，標化數據，設定生長在經NCAM-140轉染的和經載體轉染的成纖維細胞上的PC12-E2細胞之間的平均神經突長度差異為100％。使用雙側Studentt檢驗，進行統計學評價。動態光散射(DLS)測量使用DynaPro-MS/X儀(ProteinSolution)在18℃進行測量。使用PBSpH7.4中Ig1-2-3(4mgml-1)、Ig1-2-3mut(4mgml-1)、Ig3(10mgml-1)的脫糖基化制品，確定溶液中重組蛋白的分子量。結果和討論NCAMIg1-2-3組件的X射線結構確定了NCAMIg1-2-3的x射線結構，至2.0分辨率(見圖1的表1)。Ig1-2-3結構中，Ig1和Ig2組件呈現延伸的構象，Ig3的取向與Ig1-Ig2軸成大約45°角(圖3)。Ig1-Ig2之間和Ig2-Ig3之間的接頭區域短，并分別僅包含兩個(Lys98-Leu99)和一個(Asn190)殘基。Ig1和Ig2組件的整體結構與以前確定的Ig1-2結構(Kasper等，2000)十分相似，均方根偏差(r.m.s.d.)分別為0.7(96個Cα原子)和0.8(93個Cα原子)。在Ig1-2-3結構中，Ig1和Ig2間的傾角為11°，因此與Ig1-2結構相差13°。大鼠NCAM的98個殘基的Ig3組件采取中間型1(I1)集Ig組件(Casasnovas等，1998)的拓撲布局。在Ig3組件中，經典β-夾層由具有總共9個β鏈的兩個β折疊組成(圖3B)。A、B、D和Eβ鏈構成一個折疊，A’、C、C’、F和Gβ鏈構成第二個折疊。由半胱氨酸橋Cys216-Cys269連接這兩個β折疊。所有的鏈除了A’鏈外均是反平行的，A’鏈走向與G鏈的C末端部分平行。Ig3在位于A’鏈中的Asn203處含有一個用于N連接的糖基化的位點。E-F環(殘基Lys261-Asp263)形成310α螺旋轉角。大鼠Ig3的總體結構與雞Ig3的結構(Atkins等，2001)相似，r.m.s.d.為1.65(95個Cα原子)。Ig組件間的平行相互作用在NCAMIg1-2-3片段的結構中觀察到幾個特征性相互作用，這些相互作用可以分成兩組兩個相互作用的Ig1-2-3分子的長軸(N端至C端)走向平行的相互作用，和兩個長軸的走向反平行的相互作用。在晶體中觀察到一個平行相互作用和3個主要的反平行相互作用。NCAMIg1-2-3的平行的、交叉樣二聚體相互作用涉及Ig1和Ig2組件(圖5)。此接觸面的總隱蔽表面面積為15942(每個二聚體)，這類似于先前在Ig1-2交叉樣二聚體中觀察到的結果(Kasper等，2000)。此Ig1-Ig2相互作用的最顯著特征是Ig1的兩個芳香族殘基Phe19和Tyr65嵌入Ig2殘基形成的疏水口袋中(圖5A)，這在Ig1-2結構中也已經觀察到。然而，在Ig1-2-3結構中觀察到更緊密的Ig1和Ig2結合界面，其中Tyr65的羥基與Glu171形成直接的氫鍵(H鍵)，而不是在Ig1-2中觀察到的水介導的H鍵。Tyr65還與Lys133、Glu171和Arg173的側鏈形成3個H鍵。Arg173形成Ig2疏水口袋的一部分，并與Thr63形成兩個H鍵。Arg173和Phe19側鏈的平行走向以及Arg173胍基的N1原子和Phe19苯環的Cξ原子之間的距離(3.4)提示這兩個殘基之間的陽離子-π相互作用(Flocco和Mowbray，1994)。動態光散射(DLS)測量結果顯示，脫糖基化的Ig1-2-3在溶液中形成單一分子種類，具有大約78kDa的分子量，對應于二聚體。為了闡明Ig1-2-3二聚體化由觀察到的Ig1和Ig2結合所介導，制備了含有3個Ala替代的Ig1-2-3突變體(Ig1-2-3mut)E11A、E16A和K18A。這些突變體以前已經被證明可以完全破壞Ig1-2NCAM片段在溶液中的二聚體化(Jensen等，1999)。在本發明結構中，Glu11和Glu16分別與來自Ig1和Ig2的接頭區域的Arg177及Lys98形成分子內鹽橋(未顯示)。這些鹽橋可能有助于Ig1相對于Ig2的正確取向，因此對于Ig1-Ig2相互作用是重要的。Lys18與來自Ig2組件的Arg177的羧基形成H鍵，從而穩定Ig1-Ig2相互作用(圖5A)。Lys18位于Phe19附近，正如以前已經清楚闡明的(Atkins等，2001)，Phe19是Ig1-Ig2相互作用的關鍵殘基。因此，對Lys18-Arg177H-鍵的破壞可能影響Phe19的取向，從而導致Ig1-Ig2相互作用的消除。通過DLS測定的Ig1-2-3mut片段的分子量為大約34kDa，說明是單體。這證實Ig1-2-3二聚體化由Ig1-Ig2結合介導。平行(順式)相互作用在細胞粘著分子中并非罕見。因此，已經闡明了屬于Ig超家族的細胞粘著分子C-CAM1、C-CAM2、ICAM-1、nectin-2α和JAM(Hunter等，1996；Casasnovas等，1998；Miyahara等，2000；Kostrewa等，2001)以及N-、E-和C-鈣粘著蛋白(Shapiro等，1995；Takeda等，1999；Breher等，1996)的順式二聚體化。已經證明，C-鈣粘著蛋白的二聚體形式具有粘著能力，而單體形式則不能(Brieher等，1996)。Ig組件間的反平行相互作用反平行相互作用發生在兩個Ig1-2-3分子的Ig2和Ig3組件之間，由此形成Ig1-2-3二聚體的排列(圖4A，B)。一個分子的Ig2與第二分子的Ig3結合，反之亦然(圖3B)。所涉及的殘基是來自Ig2的B鏈、CD環/D鏈和E鏈的殘基112-115、143-146和158-161，以及來自Ig3的A’鏈、EF環和G鏈的殘基200-205、261和278-289。此相互作用的中心元素是來自Ig3的Phe287的側鏈嵌入由Ig2組件的Val145、Arg146和Arg158的側鏈以及Ig3的Lys285的側鏈形成的疏水口袋中。Arg158也參與水介導的和殘基Lys261和Ala288的氫鍵鍵合，Gly159與Asn203形成直接的H鍵。晶體填積在Asn203留下糖基化的空間。為了在該位點容納N連接的糖基化，Asn203的側鏈必須采取另一旋轉異構體構象。由此，該糖的指向將離開結合位點而朝向晶體中的溶劑通道，結果是Asn203不干擾Ig2-Ig3相互作用。當Gln196與Gln278形成水介導的H鍵時，在該界面上觀察到兩個Ig3組件的相互作用。Ig2-Ig3界面的總隱蔽表面是每個二聚體14072。根據Janin(1997)，發現此大小的Ig2-Ig3接觸的非特異性接觸面的可能性僅為1.9％。兩個Ig1-2-3分子間的另一反平行相互作用在兩個Ig2組件之間形成(圖4C，D)。此相互作用涉及AA’環/A’鏈/A’B環及DE環/E鏈的殘基103-121和150-158，并且每個二聚體的總隱蔽表面為9582。在此，中心殘基似乎是Glu114，它與Ser151(側鏈和骨架)形成兩個H鍵。除了廣泛的氫鍵鍵合網絡(尤其是通過水分子)外，兩個Ig2組件的Val117，Val119，Leu150和Tyr154在Ig2-Ig2界面上還彼此形成許多疏水性接觸(未顯示)。稍為較小的反平行相互作用(每個二聚體8582的總隱蔽表面)在Ig1和Ig3組件間形成(圖4C，D)，涉及來自Ig1的C鏈/CC’環/C’鏈/C’D環和F鏈/FG環/G鏈的殘基32-47和76-88、以及來自Ig3的A鏈、B鏈/BC環和D鏈/DE環的殘基198、213-223和248-253(圖5D)。Arg198和Asp249分別與Ala81和Glu82的骨架氧原子形成直接的H鍵以及與Lys76形成兩個鹽橋。此外，在Lys42和Asp250之間形成一個水介導的H鍵，在Ser44和Gly220之間形成一個水介導的H鍵，在Ser44和Glu223之間形成兩個水介導的H鍵。保守的Phe36和Phe221分別向Asp249和Gln47填積。兩個Ig1-Ig3相互作用位點加上一個Ig2-Ig2位點在晶體中于Ig1-2-3二聚體之間構成主要的接觸(26542)，形成Ig1-2-3二聚體的第二種排列(圖4C，D)，此排列與Ig2-Ig3介導的排列垂直(圖2A，B)。在其它CAM中已經發現了相似大小的接觸面積。人ICAM-1和小鼠JAM的順式二聚體分別具有11002和12002的總隱蔽表面面積(每個二聚體)(Casasnovas等，1998；Kostrewa等，2001)，而大鼠CD2和雞axonin-1/TAG-1的反式二聚體具有甚至更大的接觸面積，13002和20002(Jones等，1992；Freigang等，2000)。Ig3抑制NCAM依賴性的神經突向外生長已知NCAM-NCAM相互作用誘導神經突自表達NCAM的PC12-E2細胞向外向外生長，其中所述PC12-E2細胞生長在表達NCAM的成纖維細胞匯合單層上(Kolkova等，2000)。因此，抑制NCAM-NCAM相互作用將抑制PC12-E2細胞中的神經突向外生長。為了檢查在NCAMIg1-2-3結構中觀察到的Ig1-Ig3和Ig2-Ig3接觸的生物學意義，測試了重組Ig3組件對NCAM-NCAM粘著的抑制作用。此外，還制備了含有Ig1-Ig3接觸位點殘基突變R198A、D249G、E253A(Ig3mut1)(圖5D)和含有Ig2-Ig3接觸位點殘基突變K285A、F287A(Ig3mut2)(圖5B)的兩個Ig3突變體。在圖4中，可以看出，野生型Ig3組件(Ig3wt)確實具有抑制作用，而兩個突變體均無活性，由此有力地支持Ig1-Ig3和Ig2-Ig3接觸位點均參與同嗜性相互作用。已經成功地使用培養在轉染了NCAM140的小鼠L細胞頂上的、表達NCAM的雞視網膜神經節細胞的類似共培養測試系統，證實Ig3組件同嗜性結合位點(本工作中的Ig1-Ig3結合位點)中的突變的破壞性效果，以及顯示了代表此同嗜性結合位點的合成肽對神經突向外生長的抑制作用(Sandig等，1994)。相互作用界面肽抑制神經突向外生長先前已經證明，代表來自NCAMIg3和Ig2組件的同嗜性結合序列的肽抑制NCAM介導的細胞聚集(Rao等，1992；Sandig等，1994；Rao等，1994；Soroka等，2002)。因此，為了進一步檢查在NCAMIg1-2-3結構中觀察到的Ig1-Ig2、Ig1-Ig3和Ig2-Ig3接觸的生物學意義，我們測試了代表來自所觀察到的接觸區域的氨基酸序列的一系列肽的抑制作用(圖6，8-12)。P1-B肽(10-GEISVGESKFFL-21)(SEQIDNO19)代表Ig1-Ig2接觸，覆蓋Ig1的Bβ鏈并含有Ig1-Ig2結合的關鍵殘基Phe19(Kasper等，2000；Atkins等，2001)。作為陰性對照，使用分別含有對F19的單個Ala替代和對F19和F20的雙重Ala替代的兩個肽GEISVGESKAFL(P1-B-F19A)(SEQIDNO21)和GEISVGESKAAL(P1-B-F19A-F20A)(SEQIDNO22)。Ig1-Ig3接觸由如下三個肽代表AFSPNGEKLSPNQ(P1-CD)(SEQIDNO40)、AKSVVTAEDGTQSE(P1-FG)(SEQIDNO41)和KHIFSDDSSELTIRNVDKNDE(P3-DE)(SEQIDNO20)。覆蓋Ig3組件的D和Eβ鏈和EF環的序列的P3-DE肽，與以前提出的雞NCAMIg3組件中的同嗜性結合位點的序列(243-KYSFNYDGSELIIKKVDKSDE-263)(SEQIDNO23)(Rao等，1992)同源。作為陰性對照，使用P3-DE肽的截短形式244-KHIFSDDSSE-253(P3-DE-trunc)(SEQIDNO24)。P3-DE-trunc肽與243-KYSFNYDGSE-252(SEQIDNO25)雞序列同源，該雞序列比較長序列具有較低的效力(Rao等，1992)。Ig2-Ig2接觸由肽p2-A’B(QEFKEGEDAVIV)(SEQIDNO；17)代表。Ig2-Ig3接觸由對應地覆蓋Ig2組件的CD和EFβ鏈的序列的肽P2-CD(DVRRGIKKTD)(SEQIDNO42)和P2-EF(QIRGIKKTD)(SEQIDNO43)以及來自Ig3組件的P3-G(SIHLKVFAK)(SEQIDNO13)代表。序列SIHLKVFAK(SEQIDNO13)覆蓋Gβ鏈的C末端部分，包括暴露于溶劑的Phe287。作為陰性對照，使用替代了K285和F287的兩個肽SIHLAVAAK(P3-G-K285A-F287S)(SEQIDNO26)和SIHLAVGAK(P3-G-K285A-F287G)(SEQIDNO27)。P1-B和P3-G肽含有兩個疏水性殘基(Ile和Val/Leu)緊靠其N末端以及至少一個Phe殘基緊靠其C末端。作為具有相似疏水性質的對照肽，選擇了覆蓋Ig3組件的Bβ鏈和B-C環并包括參與Ig1-Ig3結合的Gly220、Phe221和Glu223的肽213-TLVADADGFPEP-224(P3-B)(SEQIDNO3)。盡管與P1-B和P3-G肽的序列相似，但P3-B無活性(圖6G)。這可能是由于Ig3中的Phe221部分地暴露于溶劑而Gly220和Glu223形成水介導的氫鍵(圖5D)這一事實所致。相反地，肽P1-B、P3-DE和P3-G含有隱蔽于疏水口袋中的Phe或者形成直接H鍵的殘基(圖5)。圖4、6-10顯示生物學檢查肽獲得的結果。在PC12-E2或CGN細胞與表達NCAM的成纖維細胞共培養時，P1-B、P1-CD、P2-A’B、P3-DE和P3-G肽均抑制NCAM刺激的神經突向外生長，說明這兩層細胞間的NCAM-NCAM結合受到削弱。相應的對照肽幾乎沒有或完全沒有抑制作用(圖6G)。相反地，肽P2-EF、P2-CD和P3-G不影響共培養時NCAM刺激的神經突向外生長，并且是原代CGN單細胞培養物神經突向外生長的極為有力的刺激劑(圖8-10)。肽P2-A’B和肽P1-CD(圖8-12)能夠調節NCAM同嗜性粘著所介導的神經突向外生長，但不刺激原代CGN單細胞培養物的分化。P1-B肽干擾Ig1-Ig2相互作用，由此抑制Ig1-Ig2介導的NCAM順式二聚體化。在Ig1-2-3組件的晶體中，觀察到拉鏈樣排列的NCAM順式二聚體，反映了NCAM的反式相互作用。因此，反式相互作用似乎要求NCAM分子順式二聚體化(圖4)。P3-DE和P3-G肽不影響順式相互作用，但是干擾反式相互作用。由于NCAM依賴性神經突向外生長依賴于兩層細胞之間的NCAM-NCAM相互作用，故抑制此相互作用將直接地影響NCAM介導的神經突向外生長。在我們的研究中，我們證明來源于Ig3組件的肽的突變與Ig3組件中的相似突變產生相同的效果。這說明，在本實驗設置中，所用的肽模擬了Ig3組件，因此可以作為一個簡單方便的工具用于進一步的分析。而且，代表雞NCAMIg3組件同嗜性結合位點(在本發明中Ig1-Ig3結合位點)的序列的肽先前已經用于鑒定和表征Ig3組件同嗜性結合位點(Rao等，1992；Sanding等，1994；Rao等，1994)。這些結果，結合Ig3突變研究，為所觀察到的Ig1-Ig2、Ig1-Ig3和Ig2-Ig3接觸的生物學作用提供了有力的證據。NCAM同嗜性粘著的新拉鏈機制Ig1-2-3片段的晶體結構揭示出NCAMIg1和Ig3以及Ig2和Ig3組件間的新相互作用，并證實了先前觀察到的Ig1-Ig2和Ig2和Ig2相互作用(Kasper等，2000)。總之，這些接觸介導了兩個垂直的拉鏈樣Ig1-2-3二聚體陣列的形成(圖4)。晶體中由Ig1-Ig2接觸介導的NCAMIg1-2-3組件的平行相互作用可能反映了相同細胞表面上存在的NCAM分子間的相互作用——順式相互作用。由Ig1-Ig3、Ig2-Ig2和Ig2-Ig3接觸介導的反平行相互作用可能反映了相對細胞上存在的NCAM分子的相互作用——反式相互作用。基于呈現出的所有觀察結果，我們提出由兩個拉鏈樣NCAM分子陣列構成的NCAM同嗜性粘著模型(圖7)。在“緊湊”拉鏈(圖7A)中，起源于相對細胞膜的NCAM順式二聚體通過Ig1-3和Ig2-2相互作用排列成陣列。我們推測，“緊湊”拉鏈可能首先形成，因為它們比垂直的“平”拉鏈允許更大的相對細胞膜間距離。在“平”拉鏈(圖7B)中，Ig2-Ig3相互作用提示了NCAM“緊湊”拉鏈之間的側面聯系，由此形成雙拉鏈粘著復合體(圖7C)。Ig3的Asn203上的糖基化(圖2)不大可能干擾形成拉鏈的能力，這得到如下事實的支持糖化的Ig3組件抑制NCAM介導的神經突向外生長，但在Ig2-Ig3結合位點含有突變的糖基化Ig3mut2無活性(圖6F、G)。在“緊湊”拉鏈中，Ig1-2-3分子的肝素結合位點(133-KHKGRDVILKKDVRFI-148)(SEQIDNO39)(Cole和Akeson，1989)暴露于溶劑(圖2C、D)，并因此可用于和肝素和硫酸乙酰肝素分子結合，提示NCAM可以同時參與同嗜性和異嗜性相互作用。為了在大約30nm的典型質膜間距離(Hall和Rutishauser，1987)中容納NCAM的所有7個胞外組件，在我們的模型中必須向NCAM分子中引入一個轉角(圖7)。NCAM的電子顯微鏡分析已經揭示出此轉角棒狀結構(Hall和Rutishauser，1987；Becker等，1989)。N端(大約18nm)和C端(大約10nm)部分之間鉸鏈區的轉角角度有相當大的變化(50-140°)，平均值98°(Becker等，1989)，并且推測它為NCAM提供了充分的內部柔性以適應細胞-細胞間距離。基于這些研究以及Ig組件的大約4.3nm平均長度(本工作)和FnIII組件的大約3.5nm平均長度(Leahy等，1996)，鉸鏈區最有可能位于Ig4后面。不同脊椎動物物種的NCAM序列的多序列比對揭示了位于連接Ig4和Ig5組件的PKLQGP序列中的保守Pro，Lys和Gly殘基。由于Pro和Gly典型地與多肽轉角有關，因此該序列可能在Ig4和Ig5組件間引入轉角。在晶體中觀察到的雙拉鏈(圖7C)以不同高度呈現Ig組件1至3，暗示在這些拉鏈共存時NCAM分子彎曲成不同角度。這與電子顯微鏡數據相符(Hall和Rutishauser，1987；Becker等，1989)。盡管Ig1-Ig2組件間的順式相互作用不介導細胞-細胞相互作用本身，但是它們可能有助于反式相互作用的穩定性。此論點得到使用對應于Ig1中與Ig2結合的位點的P1-B肽進行的細胞共培養實驗的支持(圖6)。此外，最近證實了代表Ig2組件中與Ig1組件結合的位點(Soroka等，2002)的肽172-GRILARGEINFK-182(P2肽)(SEQIDNO28)，對細胞聚集的抑制作用。因此，我們提出順式二聚體的形成可能是建立反式相互作用的先決條件。就我們所知，僅三個含有Ig組件的粘著分子的X射線結構已經得以確定，包含3個或更多個Ig組件(axonin-1/TAGl(Freigang等，2000)、hemolin(Su等，1998)和CD4(Wu等，1997)。在接頭粘著分子(junctionaladhesionmolecule，JAM)的晶體結構中觀察到相似的拉鏈樣排列的反式相互作用的順式同二聚體(Kostrewa等，2001)。同嗜性相互作用的拉鏈樣機制也被提示用于axonin-1/TAG-1(Freigang等，2000)，而由相對膜交替提供的分子形成線性拉鏈樣陣列。然而，NCAM形成的雙拉鏈與先前描述的這些拉鏈是根本不同的。總之，我們在此給出了基于拉鏈形成的NCAM同嗜性結合新模型。該模型與證實Ig1、Ig2和Ig3組件均參與NCAM同嗜性結合的多項研究(Rao等，1992；Sandig等，1994；Kiselyov等，1997；Jensen等，1999；Kasper等，2000；Atkins等，2001)相符，并調和了大量的矛盾生物學數據。Ig1-2-3片段的晶體結構揭示出Ig1和Ig3之間以及Ig2和Ig3之間這兩個迄今未知的相互作用的細節。有趣的是，NCAM的Ig1和Ig2組件同時介導順式和反式相互作用，而Ig3僅參與反式相互作用。綜上，我們的研究提示，正是頭三個Ig組件的連接力量賦予了NCAM-介導的粘著以強度。序列表<110>恩卡姆醫藥公司(ENKAMPharmaceuticalsA/S)<120>調節細胞存活、分化和/或突觸可塑性的方法<130>P810PC00<160>45<170>PatentInversion3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg1片段氨基酸殘基35-47<400>1TrpPheSerProAsnGlyGluLysLeuSerProAsnGln1510<210>2<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg1片段氨基酸殘基75-88<400>2TyrLysCysValValThrAlaGluAspGlyThrGlnSerGlu1510<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基213-224<400>3ThrLeuValAlaAspAlaAspGlyPheProGluPro1510<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基156-164<400>4GlnIleArgGlyIleLysLysThrAsp15<210>5<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基144-146<400>5AspValArg1<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基158-164<400>6ArgGlyIleLysLysThrAsp15<210>7<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基144-146和158-164<400>7AspValArgArgGlyIleLysLysThrAsp1510<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基111-115<400>8LysGluGlyGluAsp15<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基157-164<400>9IleArgGlyIleLysLysThrAsp15<210>10<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基111-115和157-164<400>10LysGluGlyGluAspGlyIleArgGlyIleLysLysThrAsp1510<210>11<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基260-264<400>11AspLysAsnAspGlu15<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基194-205<400>12ThrValGlnAlaArgAsnSerIleValAsnAlaThr1510<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基281-289<400>13SerIleHisLeuLysValPheAlaLys15<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基150-158<400>14LeuSerAshAsnTyrLeuGlnIleArg15<210>15<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基146-157<400>15ArgPheIleValLeuSerAsnAsnTyrLeuGlnIle1510<210>16<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基142-157<400>16LysLysAspValArgPheIleValLeuSerAsnAsnTyrLeuGlnIle151015<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基108-119<400>17GlnGluPheLysGluGlyGluAspAlaValIleVal1510<210>18<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基111-121<400>18LysGluGlyGluAspAlaValIleValCysAsp1510<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg1片段氨基酸殘基10-21<400>19GlyGluIleSerValGlyGluSerLysPhePheLeu1510<210>20<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基243-263<400>20LysHisIlePheSerAspAspSerSerGluLeuThrIleArgAsnVal151015AspLysAsnAspGlu20<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg1片段氨基酸殘基10-21，含有突變F19A<400>21GlyGluIleSerValGlyGluSerLysAlaPheLeu1510<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCANIg1片段氨基酸殘基10-21，含有突變F19A和F20A<400>22GlyGluIleSerValGlyGluSerLysAlaAlaLeu1510<210>23<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>雞NCAMIg3片段氨基酸殘基243-263<400>23LysTyrSerPheAsnTyrAspGlySerGluLeuIleIleLysLysVal151015AspLysSerAspGlu20<210>24<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基244-253<400>24LysHisIlePheSerAspAspSerSerGlu1510<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>雞NCAMIg3片段氨基酸殘基243-252<400>25LysTyrSerPheAsnTyrAspGlySerGlu1510<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基281-289，含有突變K285A和F287S<400>26SerIleHisLeuAlaValAlaAlaLys15<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg3片段氨基酸殘基281-289，含有突變K285A和F287G<400>27SerIleHisLeuAlaValGlyAlaLys15<210>28<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基172-182<400>28GlyArgIleLeuAlaArgGlyGluIleAsnPheLys1510<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游PCR引物<400>29tctctcgagaactgcaggtagatattgtt29<210>30<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游PCR引物<400>30aaacccgggttactttgcaaagacctt27<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游PCR引物<400>31gaatacgtaactgtccaggccagac25<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游PCR引物<400>32aaacctaggttactttgcaaagacctt27<210>33<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游PCR引物<400>33ctgcaggtagatattgttcccagccaaggagccatcagcgttggagcctccgccttcttc60ctgtgtcaagtggca75<210>34<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游PCR引物<400>34ggcgacagttcggcgttaaccatcaggaatgtggac36<210>35<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游PCR引物<400>35ggttaacgccgaactgtcgccactgaagatgtgcttctc39<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游PCR引物<400>36aaacttaggttactttgctgcgactgcgaggtggatggaggcatc45<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>37tctctcgagttctgcaggtagatattgtt29<210>38<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>38aaatacgtaactgtccaggccgcccagagcatcgtg36<210>39<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠NCAMIg2片段氨基酸殘基133-148<400>39LysGisLysGlyArgAspValIleLeuLysLysAspValArgPheIle151015<210>40<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>NCAMIg1片段CD鏈<400>40AlaPheSerProAsnGlyGluLysLeuSerProAsnGln1510<210>41<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>NCAMIg1片段FG鏈<400>41AlaLysSerValValThrAlaGluAspGlyThrGlnSerGlu1510<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>NCAMIg2片段CD鏈<400>42AspValArgArgGlyIleLysLysThrAsp1510<210>43<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>NCAMIg2片段EF鏈<400>43GlnIleArgGlyIleLysLysThrAsp15<210>44<211>858<212>PRT<213>褐家鼠(Rattusnorvegicus)<400>44MetLeuArgThrLysAspLeuIleTrpThrLeuPhePheLeuGlyThr151015AlaValSerLeuGlnValAspIleValProSerGlnGlyGluIleSer202530ValGlyGluSerLysPhePheLeuCysGlnValAlaGlyAspAlaLys354045AspLysAspIleSerTrpPheSerProAsnGlyGluLysLeuSerPro505560AsnGlnGlnArgIleSerValValTrpAsnAspAspAspSerSerThr65707580LeuThrIleTyrAsnAlaAsnIleAspAspAlaGlyIleTyrLysCys859095ValValThrAlaGluAspGlyThrGlnSerGluAlaThrValAsnVal100105110LysIlePheGlnLysLeuMetPheLysAsnAlaProThrProGlnGlu115120125PheLysGluGlyGluAspAlaValIleValCysAspValValSerSer130135140LeuProProThrIleIleTrpLysHisLysGlyArgAspValIleLeu145150155160LysLysAspValArgPheIleValLeuSerAsnAsnTyrLeuGlnIle165170175ArgGlyIleLysLysThrAspGluGlyThrTyrArgCysGluGlyArg180185190IleLeuAlaArgGlyGluIleAsnPheLysAspIleGlnValIleVal195200205AsnValProProThrValGlnAlaArgGlnSerIleValAsnAlaThr210215220AlaAsnLeuGlyGlnSerValThrLeuValCysAspAlaAspGlyPhe225230235240ProGluProThrMetSerTrpThrLysAspGlyGluProIleGluAsn245250255GluGluGluAspAspGluLysHisIlePheSerAspAspSerSerGlu260265270LeuThrIleArgAsnValAspLysAsnAspGluAlaGluTyrValCys275280285IleAlaGluAsnLysAlaGlyGluGlnAspAlaSerIleHisLeuLys290295300ValPheAlaLysProLysIleThrTyrValGluAsnGlnThrAlaMet305310315320GluLeuGluGluGlnValThrLeuThrCysGluAlaSerGlyAspPro325330335IleProSerIleThrTrpArgThrSerThrArgAsnIleSerSerGlu340345350GluLysAlaSerTrpThrArgProGluLysGlnGluThrLeuAspGly355360365HisMetValValArgSerHisAlaArgValSerSerLeuThrLeuLys370375380SerIleGlnTyrThrAspAlaGlyGluTyrIleCysThrAlaSerAsn385390395400ThrIleGlyGlnAspSerGlnSerMetTyrLeuGluValGlnTyrAla405410415ProLysLeuGlnGlyProValAlaValTyrThrTrpGluGlyAsnGln420425430ValAsnIleThrCysGluValPheAlaTyrProSerAlaThrIleSer435440445TrpPheArgAspGlyGlnLeuLeuProSerSerAsnTyrSerAsnIle450455460LysIleTyrAsnThrProSerAlaSerTyrLeuGluValThrProAsp465470475480SerGluAsnAspPheGlyAsnTyrAsnCysThrAlaValAsnArgIle485490495GlyGlnGluSerLeuGluPheIleLeuValGlnAlaAspThrProSer500505510SerProSerIleAspArgValGluProTyrSerSerThrAlaGlnVal515520525GlnPheAspGluProGluAlaThrGlyGlyValProIleLeuLysTyr530535540LysAlaGluTrpLysSerLeuGlyGluGluAlaTrpHisSerLysTrp545550555560TyrAspAlaLysGluAlaAsnMetGluGlyIleValThrIleMetGly565570575LeuLysProGluThrArgTyrAlaValArgLeuAlaAlaLeuAsnGly580585590LysGlyLeuGlyGluIleSerAlaAlaThrGluPheLysThrGlnPro595600605ValArgGluProSerAlaProLysLeuGluGlyGlnMetGlyGluAsp610615620GlyAsnSerIleLysValAsnLeuIleLysGlnAspAspGlyGlySer625630635640ProIleArgHisTyrLeuValLysTyrArgAlaLeuAlaSerGluTrp645650655LysProGluIleArgLeuProSerGlySerAspHisValMetLeuLys660665670SerLeuAspTrpAsnAlaGluTyrGluValTyrValValAlaGluAsn675680685GlnGlnGlyLysSerLysAlaAlaHisPheValPheArgThrSerAla690695700GlnProThrAlaIleProAlaAsnGlySerProThrAlaGlyLeuSer705710715720ThrGlyAlaIleValGlyIleLeuIleValIlePheValLeuLeuLeu725730735ValValMetAspIleThrCysTyrPheLeuAsnLysCysGlyLeuLeu740745750MetCysIleAlaValAsnLeuCysGlyLysAlaGlyProGlyAlaLys755760765GlyLysAspMetGluGluGlyLysAlaAlaPheSerLysAspGluSer770775780LysGluProIleValGluValArgThrGluGluGluArgThrProAsn785790795800HisAspGlyGlyLysHisThrGluProAsnGluThrThrProLeuThr805810815GluProGluLysGlyProValGluThrLysSerGluProGlnGluSer820825830GluAlaLysProAlaProThrGluValLysThrValProAsnGluAla835840845ThrGlnThrLysGluAsnGluSerLysAla850855<210>45<211>848<212>PRT<213>人類(homosapiens)<400>45MetLeuGlnThrLysAspLeuIleTrpThrLeuPhePheLeuGlyThr151015AlaValSerLeuGlnValAspIleValProSerGlnGlyGluIleSer202530ValGlyGluSerLysPhePheLeuCysGlnValAlaGlyAspAlaLys354045AspLysAspIleSerTrpPheSerProAsnGlyGluLysLeuThrPro505560AsnGlnGlnArgIleSerValValTrpAsnAspAspSerSerSerThr65707580LeuThrIleTyrAsnAlaAsnIleAspAspAlaGlyIleTyrLysCys859095ValValThrGlyGluAspGlySerGluSerGluAlaThrValAsnVal100105110LysIlePheGlnLysLeuMetPheLysAsnAlaProThrProGlnGlu115120125PheArgGluGlyGluAspAlaValIleValCysAspValValSerSer130135140LeuProProThrIleIleTrpLysHisLysGlyArgAspValIleLeu145150155160LysLysAspValArgPheIleValLeuSerAsnAsnTyrLeuGlnIle165170175ArgGlyIleLysLysThrAspGluGlyThrTyrArgCysGluGlyArg180185190IleLeuAlaArgGlyGluIleAsnPheLysAspIleGlnValIleVal195200205AsnValProProThrIleGlnAlaArgGlnAsnIleValAsnAlaThr210215220AlaAsnLeuGlyGlnSerValThrLeuValCysAspAlaGluGlyPhe225230235240ProGluProThrMetSerTrpThrLysAspGlyGluGlnIleGluGln245250255GluGluAspAspGluLysTyrIlePheSerAspAspSerSerGlnLeu260265270ThrIleLysLysValAspLysAsnAspGluAlaGluTyrIleCysIle275280285AlaGluAsnLysAlaGlyGluGlnAspAlaThrIleHisLeuLysVal290295300PheAlaLysProLysIleThrTyrValGluAsnGlnThrAlaMetGlu305310315320LeuGluGluGlnValThrLeuThrCysGluAlaSerGlyAspProIle325330335ProSerIleThrTrpArgThrSerThrArgAsnIleSerSerGluGlu340345350LysThrLeuAspGlyHisMetValValArgSerHisAlaArgValSer355360365SerLeuThrLeuLysSerIleGlnTyrThrAspAlaGlyGluTyrIle370375380CysThrAlaSerAsnThrIleGlyGlnAspSerGlnSerMetTyrLeu385390395400GluValGlnTyrAlaProLysLeuGlnGlyProValAlaValTyrThr405410415TrpGluGlyAsnGlnValAsnIleThrCysGluValPheAlaTyrPro420425430SerAlaThrIleSerTrpPheArgAspGlyGlnLeuLeuProSerSer435440445AsnTyrSerAsnIleLysIleTyrAsnThrProSerAlaSerTyrLeu450455460GluValThrProAspSerGluAsnAspPheGlyAsnTyrAsnCysThr465470475480AlaValAsnArgIleGlyGlnGluSerLeuGluPheIleLeuValGln485490495AlaAspThrProSerSerProSerIleAspGlnValGluProTyrSer500505510SerThrAlaGlnValGlnPheAspGluProGluAlaThrGlyGlyVal515520525ProIleLeuLysTyrLysAlaGluTrpArgAlaValGlyGluGluVal530535540TrpHisSerLysTrpTyrAspAlaLysGluAlaSerMetGluGlyIle545550555560ValThrIleValGlyLeuLysProGluThrThrTyrAlaValArgLeu565570575AlaAlaLeuAsnGlyLysGlyLeuGlyGluIleSerAlaAlaSerGlu580585590PheLysThrGlnProValGlnGlyGluProSerAlaProLysLeuGlu595600605GlyGlnMetGlyGluAspGlyAsnSerIleLysValAsnLeuIleLys610615620GlnAspAspGlyGlySerProIleArgHisTyrLeuValArgTyrArg625630635640AlaLeuSerSerGluTrpLysProGlulleArgLeuProSerGlySer645650655AspHisValMetLeuLysSerLeuAspTrpAsnAlaGluTyrGluVal660665670TyrValValAlaGluAsnGlnGlnGlyLysSerLysAlaAlaHisPhe675680685ValPheArgThrSerAlaGlnProThrAlaIleProAlaAsnGlySer690695700ProThrSerGlyLeuSerThrGlyAlaIleValGlyIleLeuIleVal705710715720IlePheValLeuLeuLeuValValValAspIleThrCysTyrPheLeu725730735AsnLysCysGlyLeuPheMetCysIleAlaValAsnLeuCysGlyLys740745750AlaGlyProGlyAlaLysGlyLysAspMetGluGluGlyLysAlaAla755760765PheSerLysAspGluSerLysGluProIleValGluValArgThrGlu770775780GluGluArgThrProAsnHisAspGlyGlyLysHisThrGluProAsn785790795800GluThrThrProLeuThrGluProGluLysGlyProValGluAlaLys805810815ProGluCysGlnGluThrGluThrLysProAlaProAlaGluValLys820825830ThrValProAsnAspAlaThrGlnThrLysGluAsnGluSerLysAla83584084權利要求1.調節神經細胞粘著分子(NCAM)呈現細胞的粘著、分化和/或存活的方法，所述方法包括a)提供能夠通過如下手段與由NCAMIg1、Ig2和Ig3組件組成的NCAM同嗜性結合位點相互作用的化合物，所述手段是i)與NCAMIg1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAMIg3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAMIg2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAMIg3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAMIg2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，b)提供NCAM呈現細胞；c)通過使(b)的NCAM呈現細胞與(a)的化合物接觸來調節至少一種NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活。2.權利要求1的方法，其中分化、粘著和存活是由NCAM介導的。3.權利要求1-2的方法，其中NCAM是哺乳動物NCAM或其變體或片段。4.權利要求3的方法，其中NCAM具有標識為SwissProt登錄號P13591(SEQIDNO44)的序列或其變體或片段。5.權利要求1的方法，其中化合物是由肽、糖、脂質、和氨基酸與其它有機分子的共聚物中選擇的。6.權利要求5的方法，其中肽是衍生自標識為SwissProt登錄號NP_113709(SEQIDNO44)或SwissProt登錄號P13591(SEQIDNO45)的NCAM序列的片段或所述肽片段的變體。7.檢測化合物是否能夠通過由NCAM分子的Ig1、Ig2和Ig3組件組成的同嗜性結合位點，通過調節如下相互作用，調節兩種獨立的NCAM分子之間的相互作用的方法，所述相互作用是i)一種獨立NCAM分子的Ig1組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用，和/或ii)一種獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig3組件的相互作用，和/或iii)一種獨立NCAM分子的Ig2組件與另一獨立NCAM分子的Ig2組件的相互作用所述方法包括a)提供化合物；b)提供至少一種獨立的NCAM分子片段或所述獨立片段的片段，其中所述片段包含對應于含有SEQIDNO44所示序列第1至289位殘基的NCAMIg1-2-3組件序列的連續氨基酸殘基序列，c)通過使化合物與(b)的片段接觸，檢查化合物是否能夠i)與MCAM的Ig1組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩種獨立(b)片段，和/或ii)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩種獨立(b)片段，和/或iii)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬NCAM的Ig2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩種獨立(b)片段，和/或iv)與NCAM的Ig3組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩種獨立(b)片段，和/或v)與NCAM的Ig2組件相互作用，由此模擬和/或調節NCAM的Ig2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自彼此相互作用的兩種獨立(b)片段；d)選擇能夠實施(c)的至少一種相互作用的化合物作為能夠調節呈現NCAM細胞的分化、粘著和/或存活的候選化合物。8.權利要求7的方法，其中候選化合物是由肽、糖、脂質、和氨基酸與其它有機分子的共聚物中選擇的。9.權利要求8的方法，其中肽是衍生自具有SwissProt登錄號NP_113709(SEQIDNO44)的NCAM序列或具有SwissProt登錄號P13591(SEQIDNO45)的NCAM序列的肽片段或所述肽片段的片段或變體。10.權利要求7的方法，其中獨立的NCAM片段或其片段是可溶性蛋白質。11.包含NCAMIg1-2-3組件的多肽的晶體，其中所述多肽包含SwissProt登錄號NP_113709(SEQIDNO44)的大鼠NCAM序列的至少289種連續氨基酸殘基。12.權利要求11的晶體，其中多肽包含SEQIDNO44的氨基酸殘基1至289。13.權利要求11的晶體，其中多肽由SEQIDNO44的氨基酸殘基1至289和1-4種氨基酸殘基的額外氨基酸序列組成。14.權利要求11的晶體，其中所述晶體使X射線衍射以確定達到至少4分辨率的原子坐標。15.權利要求11的晶體，其中晶體有效地使X射線衍射以確定達到至多5.0分辨率的原子坐標。16.權利要求14或15的晶體，其中晶體有效地使X射線衍射以確定達到1.5分辨率的原子坐標。17.權利要求11的晶體，其中所述晶體包含按表2(圖2)結構坐標或者按具有偏離此不超過2.5的均方根偏差的坐標表示的空間關系排列的原子。18.權利要求11的晶體，其中所述晶體具有晶胞尺寸a＝51.5，b＝108.5，c＝149.0，α＝90°，β＝90°，γ＝90°。19.制備權利要求11-18定義的晶體的方法，所述方法包括步驟i)提供所述多肽；ii)任選提供能夠與所述多肽相互作用的化合物；iii)在將所述多肽和任選的所述化合物孵育在包含5％至25％聚乙二醇、0.01M至0.5M鹽、1％-10％選自甘油和2-甲基-2，4-戊二醇的醇的緩沖液中的條件下生長晶體，其中所述緩沖液具有6至9的pH；iv)由此制備所述晶體。20.選擇能夠通過調節i)一種獨立的NCAM分子的Ig1組件和另一獨立NCAM分子的Ig3組件，和/或ii)一種獨立的NCAM分子的Ig2組件和另一獨立NCAM分子的Ig3組件，和/或iii)一種獨立的NCAM分子的Ig2組件和另一獨立NCAM分子的Ig2組件的相互作用來調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的候選化合物的方法，所述方法包括步驟a)提供包含NCAMIg1-2-3組件的可溶性或晶體多肽；b)使用計算機建模技術，產生(a)的NCAMIg1-2-3組件的結構模型；c)通過使用(b)的NCAMIg1-2-3組件的結構模型，在計算機上評價化合物i)與NCAMIg1組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg1和Ig3組件間的相互作用的能力，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAMIg3組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg3和Ig1組件間的相互作用的能力，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAMIg2組件相互作用，并由此模擬NCAMIg2和Ig3組件間的相互作用的能力，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAMIg3組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg3和Ig2組件間的相互作用的能力，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAMIg2組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg2和Ig2組件間的相互作用的能力，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子；d)選擇能夠進行(c)的至少一種相互作用的候選化合物；和e)在體外或體內試驗中檢查(d)的候選化合物調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的能力，所述試驗包含至少一種NCAM呈現細胞，和/或f)在如下試驗中檢查(d)的候選化合物，其中所述試驗包括通過使化合物與NCAM分子的至少一種獨立片段接觸，評價化合物進行至少一種(b)相互作用的能力，所述片段包含對應于含有SEQIDNO44所示序列殘基1至289的NCAMIg1-2-3組件序列的連續氨基酸殘基序列。21.權利要求20的篩選方法，其中用計算機生成的模型是權利要求13-20任一項的晶體蛋白的結構模型。22.權利要求20的篩選方法，其中用計算機生成的模型是Ig1-2-3組件在溶液中的結構模型。23.能夠通過如下相互作用與由NCAMIg1、Ig2和Ig3組件組成的NCAM同嗜性結合位點結合的化合物i)與NCAMIg1組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg1和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或ii)與NCAMIg3組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg3和Ig1組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iii)與NCAMIg2組件相互作用，并由此模擬NCAMIg2和Ig3組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或iv)與NCAMIg3組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg3和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子，和/或v)與NCAMIg2組件相互作用，并由此模擬和/或調節NCAMIg2和Ig2組件間的相互作用，其中所述組件來自兩種獨立的NCAM分子。24.權利要求23的化合物，其中化合物選自插序列25.權利要求23或24的化合物，其中化合物是通過權利要求7或權利要求20的方法選擇的候選化合物。26.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO1所示氨基酸序列WFSPNGEKLSPNQ或其片段或變體。27.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO2所示氨基酸序列YKCVVTAEDGTQSE或其片段或變體。28.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO3所示氨基酸序列TLVADADGFPEP或其片段或變體。29.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO4所示氨基酸序列QIRGIKKTD或其片段或變體。30.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO5所示氨基酸序列DVR或其片段或變體。31.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO6所示氨基酸序列RGIKKTD或其片段或變體。32.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO7所示氨基酸序列DVRRGIKKTD或其片段或變體。33.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO8所示氨基酸序列KEGED或其片段或變體。34.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO9所示氨基酸序列IRGIKKTD或其片段或變體。35.權利要求25的化合物，所述化合物具有SEQIDNO10所示氨基酸序列KEGEDGIRGIKKTD或其片段或變體。36.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列DKNDE(SEQIDNO11)或其片段或變體。37.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列TVQARNSIVNAT(SEQIDNO12)或其片段或變體。38.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列SIHLKVFAK(SEQIDNO13)或其片段或變體。39.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列LSNNYLQIR(SEQIDNO14)或其片段或變體。40.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列RFIVLSNNYLQI(SEQIDNO15)或其片段或變體。41.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列KKDVRFIVLSNNYLQI(SEQIDNO16)或其片段或變體。42.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列QEFKEGEDAVIV(SEQIDNO17)或其片段或變體。43.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列KEGEDAVIVCD(SEQIDNO18)或其片段或變體。權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列GEISVGESKFFL(SEQIDNO19)或其片段或變體。44.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列KHIFSDDSSELTIRNVDKNDE(SEQIDNO20)或其片段或變體。45.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列AFSPNGEKLSPNQ(SEQIDNO40)或其片段或變體。46.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列AKSVVTAEDGTQSE(SEQIDNO41)或其片段或變體。47.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列DVRRGIKKTD(SEQIDNO42)或其片段或變體。48.權利要求25的化合物，所述化合物具有氨基酸序列QIRGIKKTD(SEQIDNO43)或其片段或變體。49.可以通過權利要求7或20的方法獲得的化合物用于調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的用途。50.一種或多種權利要求23-48之任一項定義的化合物用于制造藥物的用途。51.權利要求50的用途，其中所述藥物用于治療正常的、變性的或損傷的NCAM呈現細胞。52.權利要求50的用途，其中所述藥物用于包括刺激NCAM呈現細胞的分化和/或存活的治療。53.權利要求50的用途，其中所述藥物用于治療中樞和周圍神經系統或者肌肉或各種器官的疾病和病癥。54.權利要求50的用途，其中所述藥物用于治療中樞和周圍神經系統的疾病或病癥，諸如術后神經損傷、創傷性神經損傷、受損的神經纖維髓鞘形成、缺血后損傷，例如由中風導致的缺血后損傷、帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病、癡呆，諸如多發梗塞性癡呆、硬化、與糖尿病相關的神經變性、影響晝夜節律鐘或神經-肌肉傳遞的病癥、和精神分裂癥、情感障礙，諸如躁郁癥；用于治療肌肉的疾病和病癥，包括神經-肌肉連接功能受損的病癥，諸如器官移植后的，或者諸如遺傳的或創傷性的萎縮性肌功能障礙；或者用于治療各種器官的疾病或病癥，諸如生殖腺的變性病，胰腺的變性病，諸如I和II型糖尿病，腎的變性病，諸如腎變病，以及心臟、肝和腸的變性病。55.權利要求50的用途，其中所述藥物用于治療術后神經損傷、創傷性神經損傷、受損的神經纖維髓鞘形成、缺血后損傷，例如由中風導致的缺血后損傷、帕金森病、阿爾茨海默氏病、癡呆，諸如多發梗塞性癡呆、硬化、與糖尿病相關的神經變性、影響晝夜節律鐘或神經-肌肉傳遞的病癥、和精神分裂癥、情感障礙，諸如躁郁癥。56.權利要求50的用途，其中所述藥物用于促進傷口愈合。57.權利要求50的用途，其中所述藥物用于治療癌癥。58.權利要求50的用途，其中所述藥物用于預防心肌細胞的細胞死亡，諸如在急性心肌梗死之后、或者在血管發生之后。59.權利要求50的用途，其中所述藥物用于促進重新血管化。60.權利要求50的用途，其中所述藥物用于刺激學習和/或短期和/或長期記憶的能力。61.NCAMIg1-2-3組件的晶體的用途，用于在計算機上篩選能夠調節依賴于NCAM同嗜性粘著的神經可塑性、細胞分化和/或存活的候選化合物。62.包含一種或多種權利要求23-48之任一項定義的化合物的藥物組合物。全文摘要本發明涉及通過提供能夠調節神經細胞粘著分子(NCAM)的Ig1、Ig2和/或Ig3組件之間的相互作用的化合物，調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活的方法。本發明通過使用本申請中所描述的篩選和測試方法，提供能夠調節NCAM的Ig1、Ig2和/或Ig3組件之間的相互作用的候選化合物。本發明還涉及包含能夠調節NCAM的Ig1、Ig2和/或Ig3組件之間的相互作用的化合物的藥物組合物和該藥物組合物和化合物在調節NCAM呈現細胞的分化、粘著和/或存活中的用途。文檔編號C07K14/00GK1886422SQ200480035496公開日2006年12月27日申請日期2004年9月29日優先權日2003年9月30日發明者伊麗莎白·博克,弗拉迪米爾·貝雷津,弗拉迪斯拉夫·索羅卡申請人:恩卡姆醫藥公司