含有磷酸膽堿基的化合物及包含該化合物的表面改性劑的制作方法

專利名稱：含有磷酸膽堿基的化合物及包含該化合物的表面改性劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有磷酸膽堿基的新型化合物，以及包含該化合物的表面改性劑、用該表面改性劑改性了的改性粉末、利用該改性粉末作為載體的色譜用填充劑、用該表面改性劑改性了的過濾器以及玻璃實驗器具。
包含本發明化合物的表面改性劑賦予物體生物適合性、保濕性、以及多種有用的其它功能。
背景技術：
已經進行了將含有磷酸膽堿基的聚合物作為生物適合性高分子的研究，并開發了將該聚合物被覆在各種基質上的生物適合性材料。
例如，專利文獻1中，公開了將用2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿的均聚合物和共聚物被覆的粉末用作化妝品用粉末而改善了保濕性或皮膚粘附性的化妝品。
此外，專利文獻2及專利文獻3中，公開了用含有磷酸膽堿基的聚合物被覆的醫療用材料或分離劑。
上述材料主要是通過使具有羥基的丙烯類單體與2-氯-1，3，2-二氧雜正膦-2-氧化物反應，進一步通過三甲基胺形成季銨，由此合成具有磷酸膽堿結構的單體，將該單體聚合得到聚合物，將該聚合物被覆材料的表面(關于聚合物的制備方法，參照專利文獻4和5)。
專利文獻4中，制備了2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿與甲基丙烯酸酯的共聚物，專利文獻5中制備了2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿的均聚合物。
另一方面，通過尺寸排阻而將蛋白質或比蛋白質分子量小的多肽等生物樣品進行分離的GFC用填充劑有很多市售品。在該GFC用填充劑中，存在以交聯親水性高分子作為載體的填充劑和以硅膠作為載體的填充劑。
以交聯親水性高分子作為載體的填充劑能適用的流動相的pH范圍廣，通用性高。然而，以高分子作為載體的填充劑，比以硅膠作為載體的填充劑(1)由于細孔徑的控制困難，而難于得到高理論塔板數。此外，(2)在高效液相色譜法(HPLC)中使用時，由于對抗高壓條件的強度不夠，以及粒子由于流動相溶劑而溶脹，因此不能得到重現性好的色譜柱的情況也很多。
以硅膠作為載體的填充劑，存在蛋白質或多肽吸附在硅膠載體表面的問題。因此，為了抑制分析樣品中的蛋白質或多肽吸附到硅膠上，市場上銷售使用以非解離性親水基修飾了表面的硅膠的填充劑。
例如，作為硅膠類GFC用柱，昭和電工株式會社有Shodex PROTEINKW-803(產品名)市售。該硅膠類柱，在產品目錄上說明是適用于分子量數千～100萬左右的蛋白質分析的硅膠類GFC模式的柱。
此外，株式會社ワイエムシイ有YMC-Pack Diol(產品名)市售。這也是硅膠類的GFC用柱，其被說明為由于使具有二醇結構的官能團化學結合到硅膠載體上，可適用于分子量1萬～數十萬的蛋白質的分離。
非專利文獻1中，記載了通過在載體上化學接枝的磷酸膽堿基，蛋白質的吸附減少。
此外，專利文獻6及7中，公開了具有已知顯示有優良親水性的甜菜堿結構的有機硅烷類表面改性劑(硅烷偶聯劑)。專利文獻6中，認為通過使二甲基氨基烷基硅烷在有機溶劑中與1，3-丙磺酸內酯反應，可以得到具有由季銨的正電荷和磺酸的負電荷形成的磺基甜菜堿的硅烷偶聯劑。專利文獻7中，記載了具有由季銨和羧基形成的羧基甜菜堿的硅烷偶聯劑的制備方法。這些硅烷偶聯劑，可以涂布在玻璃等上，通過使其干燥來改性物質表面。然而，用這些結構的甜菜堿盡管可以賦予物質表面良好的親水性，但由于甜菜堿中的正電荷與負電荷強度存在有偏差，不能形成電中性。例如，磺基甜菜堿中，由于磺酸的強酸性而帶負電，在羧基甜菜堿中，表現出季銨所致的正電性質。這樣的甜菜堿結構中，與蛋白質之間產生過強的離子交換相互作用，導致蛋白質的不可逆性吸附。
另一方面，以生物適合性或抑制蛋白質吸附為目的而將這些硅烷偶聯劑用于色譜用填充劑或過濾器類以及實驗器具類的例子還沒有的。
專利文獻1特開平7-118123號公報專利文獻2特開2000-279512號公報專利文獻3特開2002-98676號公報專利文獻4特開平9-3132號公報專利文獻5特開平10-298240號公報專利文獻6特開平5-222064號公報專利文獻7特開昭63-295593號公報非專利文獻1Jian R.Lu等，Langmuir 2001，17，3382-3389發明內容然而，在用含有磷酸膽堿基的聚合物被覆物體表面而進行改性的方法中，難于在全部表面上進行有效地被覆。此外，由于被覆的聚合物從物體上剝離，因此有耐久性方面產生問題的情況。而且，因為物體表面被聚合物被覆，也存在偏離通過磷酸膽堿基賦予生物適合性等目標功能的目的，而使物體自身所要求的細孔等微細結構這樣的基本性質喪失的情況。
此外，在將磷酸膽堿基衍生物作為低分子導入到物體中時，在物體上先導入能與磷酸膽堿基衍生物反應的官能團，然后使磷酸膽堿基衍生物反應的方法中，由于物體表面上殘留有在物體表面上未反應的官能團，因此生物適合性也較低。
例如，在首先往物體表面上導入氨基，然后使磷酸膽堿的醛衍生物與物體表面的氨基反應的情況下，有很多未反應的氨基殘留。這些殘留的氨基盡管可以通過與其他的低分子化合物結合而在某種程度上被封鎖，但是難于維持物體表面的親水性，而且不能完全封鎖。在物體表面上殘留氨基的情況下，由于氨基具有強堿性，主要是酸性蛋白質表現出明顯很強的離子交換相互作用，其幾乎都產生吸附。在用作色譜用填充劑的情況下，成為該蛋白質的回收率降低或峰顯著拖尾的原因。而且，蛋白質的吸附導致其變性，在作為生物適合性材料使用時，成為炎癥等的原因，因而不好。
本發明發現使含有磷酸膽堿基的化合物，與具有和該化合物反應的官能團并且具有與物體表面結合的官能團的物體直接反應，簡便并且具有高通用性，可以直接賦予物體表面所期望的任意量的磷酸膽堿基。
由此發現，通過由該化合物形成的表面改性劑，可以容易地制備改性粉末、用該改性粉末作為載體的色譜用填充劑、經該表面改性劑改性的過濾器以及玻璃實驗器具，從而完成了本發明。
即，本發明提供下式(1)表示的含有磷酸膽堿基的化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。
X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素。但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個。
R是下式(2)～(4)結構中的任意一個(在下式(2)～(4)結構中，式(1)化合物以A-R-B表示)。
A-(CH2)L-B(2) 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
此外，本發明提供下式(5)或(6)表示的含有磷酸膽堿基的化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素。但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個。
此外，本發明提供包含上述含有磷酸膽堿基的化合物的表面改性劑。
此外，本發明提供前述式(6)所示化合物的制備方法，其特征在于通過用高碘酸鈉和三氯化釕氧化甘油磷酸膽堿的反應合成具有磷酸膽堿基和羧基的化合物，由具有氨基的有機硅烷化合物與具有磷酸膽堿基和羧基的化合物通過縮合劑合成上述式(6)所示的化合物。
此外，本發明提供用上述表面改性劑處理過的改性粉末。
另外，本發明提供包含用上述表面改性劑處理過的改性載體的色譜用填充劑。
還有，本發明提供用上述表面改性劑處理過的過濾器。
此外，本發明提供用上述表面改性劑進行過表面處理的玻璃實驗器具。
發明效果如果使用本發明的化合物、包含該化合物的表面改性劑，通過一步極其簡便的反應，可以賦予各種物體表面所需的任意量的磷酸膽堿基。其結果，通過磷酸膽堿基可以容易地制備具有所需功能的改性粉末、用該改性粉末作為載體的色譜用填充劑、用該表面改性劑改性的過濾器以及玻璃實驗器具。
更詳細地說，根據本發明，可以將蛋白質或多肽的吸附極少的磷酸膽堿基簡便并且定量地導入而且不損傷物體表面的微細結構。此外，由于不導入磷酸膽堿基以外的未反應官能團，可以提供生物適合性極高的材料。
在適用于硅膠等色譜用載體的情況下，是極其優良的GFC用填充劑。用本發明的表面改性劑合成的色譜用填充劑的特征是利用GFC模式(GFC mode)導致的分子量差異進行分離是不言而喻的，并且由于蛋白質或多肽所具有的等電點或疏水性不同而具有優良的分離能力。
進一步地，由于離子交換性或疏水性可以根據流動相的鹽濃度或pH來調節，因此可以根據蛋白質來進行獨特的分離。而且，因為不引起蛋白質在粉末表面上不可逆地吸附，因此可以不伴隨有蛋白質的變性、失活而進行分離、分取、分析。
在將過濾器以及玻璃實驗器具用本發明的表面改性劑處理時，可以得到蛋白質吸附極少的過濾器以及玻璃實驗器具。


圖1合成例1中制備的化合物的結構式及1H-NMR圖譜。
圖2實施例2中制備的改性粉末的13C-CPMAS圖譜。
圖3實施例2中制備的改性粉末的31P-CPMAS圖譜。
圖4實施例2中制備的改性粉末的FT-IR圖譜。
圖5將實施例3中制備的液相色譜用填充劑以GFC模式使用時的校正曲線。
圖6使用實施例3中制備的液相色譜用填充劑分離人血清蛋白時的色譜圖。
圖7在流動相鹽濃度為500mM的條件下分離人血清蛋白時的色譜圖。(a)用本發明的表面改性劑合成的填充劑。(b)Shodex PROTEINKW-803。
圖8在流動相鹽濃度為150mM的條件下分離人血清蛋白時的色譜圖。(a)用本發明的表面改性劑合成的填充劑。(b)Shodex PROTEINKW-803。
圖9使用由本發明的表面改性劑合成的填充劑分離5種有機酸時的色譜圖。
圖10在本發明的表面改性劑的間隔部分插入仲胺的情況下，分離人血清蛋白時的色譜圖。
圖11實施例9中合成的改性粉末的FT-IR圖譜。
圖12使用實施例10中制備的液相色譜用填充劑的色譜圖。
圖13使用實施例3中制備的液相色譜用填充劑的色譜圖。
圖14使用以對比例2中制備的式(14)表示的化合物進行表面改性的液相色譜用填充劑的色譜圖。
圖15使用以對比例2中制備的式(15)表示的化合物進行表面改性的液相色譜用填充劑的色譜圖。
圖16實施例7中制備的化合物的1H-NMR圖譜。
圖17實施例7中制備的化合物的Mass圖譜。
圖18合成例1中制備的化合物的Mass圖譜。
具體實施例方式
此外，本發明化合物無論純化或不純化都可以進行表面改性，從而能夠得到蛋白質吸附抑制等效果。
下式(1)、或(5)或(6)表示的含有磷酸膽堿基的化合物是新型化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。
X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素。但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個。
R是下式(2)～(4)結構中的任意一種(在下式(2)～(4)結構中，式(1)化合物以A-R-B表示)。
A-(CH2)L-B(2) 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
式中，m是2～6，n是1～4。X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素。但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個。
將下式(7)表示的磷酸膽堿衍生物溶解在蒸餾水中。下式(7)的磷酸膽堿衍生物是公知化合物，可以從市售品獲得。
將式(7)化合物的水溶液在冰水浴中冷卻，添加高碘酸鈉，攪拌5小時。將反應液減壓濃縮、減壓干燥，用甲醇提取下式(8)所示的具有醛基的磷酸膽堿衍生物。結構式以及NMR圖譜如圖1所示、Mass圖譜如圖18所示。
然后，向式(8)的甲醇溶液中添加0.5當量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。將該混合物溶液在室溫攪拌規定時間后，冰冷，添加適量的氰基硼氫化鈉，恢復至室溫，攪拌16小時。在此期間也在反應容器中持續通入干燥氮氣。過濾沉淀后，得到式(5)和/或式(6)的甲醇溶液。
下面說明本發明化合物的純化方法。本發明化合物的純化方法不限于以下。
將得到的甲醇溶液減壓濃縮，并將殘渣溶于蒸餾水中。用此水溶液作為樣品。將具有疏水性相互作用和陽離子交換能力的高效液相色譜柱カプセルパツクSCX UG 80 S-5(尺寸4.6mm i.d.×250mm)(株式會社資生堂)連接在HPLC裝置中，使0.2mmol/L的磷酸緩沖液(pH3.5)以1mL/分的流速流過進行平衡后，注入10μL樣品。通過使用示差折射計作為檢測器得到色譜圖，可以分離目的化合物。
然而，包含本發明化合物的表面改性劑，可以以純化前的甲醇溶液階段的狀態直接使用。
上面的步驟，即使式(5)或(6)所示的化合物中的m、n改變，也可以同樣地進行。此處顯示的步驟是m＝3、n＝2的情況。此外，可以通過使用3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷等作為具有氨基的硅烷化合物，在硅烷部位和磷酸膽堿基之間插入仲胺，關于這點也可以用與上述相同的步驟進行。反應溶劑沒有特別限制，除了上述的甲醇外，還可以使用水或乙醇、丙醇、丁醇等醇，N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜等非質子性溶劑。但是，為了防止反應中有機硅烷化合物的聚合，優選脫水溶劑。
此外，在式(5)或(6)中的甲氧基(OCH3)為乙氧基(OC2H5)的情況下，將甲醇更換為乙醇進行反應，為Cl的情況下，更換為二甲基甲酰胺或二甲亞砜。
此外，與Si結合的甲氧基或乙氧基或Cl之中，有2個或1個被甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中任意一個所代替的情況下，也可與上述方法同樣地進行制備。
表面改性劑上述式(5)和(6)的化合物可以作為物質的表面改性劑。即，容易在物質表面導入所需量的磷酸膽堿基而進行改性。具體地，在表面具有羥基的物質的情況下，通過該物質表面的羥基與式(5)和(6)化合物的Si-OCH3進行脫水反應形成化學鍵。該化學反應在幾乎所有的有機溶劑中在10℃～250℃的溫度范圍內極容易地定量進行。通過該脫水反應，可以進行化學、物理上極穩定的通過磷酸膽堿基的表面改性。
此外，在物質表面上不存在羥基的情況下，以下方法是有效的將式(5)和(6)的化合物溶解在揮發性溶劑中，將該溶液涂布到物質表面上，并使溶劑干燥。作為具體的實例，將式(5)和(6)化合物溶解在甲醇中，并將其涂布到物質表面上。然后在10℃～250℃的溫度范圍內使甲醇氣化，進一步根據需要進行加熱處理。此時，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之間發生脫水反應，生成Si-O-Si鍵，從而可以被覆物質表面。Si-OCH3之間發生脫水反應生成Si-O-Si鍵的反應是公知的。在甲醇揮發時這樣形成的膜，由于與幾乎所有物質表面上微量存在的羥基在各處產生結合，因此成為穩定性良好的表面改性法。本法不僅對沒有羥基的物質，對有羥基的物質也是極為效的表面改性法。
用本發明的表面改性劑改性了的物質(或者是材料)，成為生物適合性及親水性優良的材料及成形品。作為在材料表面上直接具有有生物適合性的磷酸膽堿基的材料，可以在化妝品、醫用材料(人工臟器、手術用具等)、色譜用填充劑、涂料等廣泛的用途中應用。
此外，本發明的表面改性劑，作為分離或分析裝置用的配管、配管連接部件、取樣的針、取樣瓶、檢測池等與試驗液相接觸的部件的改性方法是有用的，尤其優選用于HPLC、MS、NMR的連接配管或電泳裝置的毛細配管等材料的改性。特氟隆(注冊商標)管、テフゼル管、ピ一ク樹脂管、熔融石英管等材料。
磷酸膽堿衍生物親水性極高，在有機溶劑中的溶解度極低。磷酸膽堿衍生物的合成大致分為用二氧雜正膦類作為起始物質的全合成法和用通過包含在大豆等中的磷脂——磷脂酰膽堿水解而得到的甘油磷酸膽堿作為起始物質的合成法。由于溶解磷酸膽堿衍生物的有機溶劑有限，造成合成路線復雜，制備成本高而阻礙實際應用。該合成的復雜性和成本問題在全合成法中表現突出。但是根據本發明的制備方法，可以在磷酸膽堿衍生物的良溶劑中極簡單且高收率地制備具有羧基的磷酸膽堿衍生物，而且可以從由可廉價大量獲得的磷脂酰膽堿衍生的甘油磷酸膽堿進行制備，在成本方面也很有利。最終，式(6)所示的化合物也可以簡便并且高收率地得到。
將甘油磷酸膽堿、高碘酸鈉、三氯化釕(水合物)加入到乙腈水溶液中。在室溫攪拌后，過濾，從濾液中除去溶劑。從得到的固體物中用甲醇提取目的物，然后通過蒸餾除去甲醇，得到下式(9)所示的具有羧基的磷酸膽堿衍生物。結構式及NMR圖譜如圖16所示、Mass圖譜如圖17所示。
此外，反應溶劑也可以是水，并且還可以使用高碘酸以外的其他高碘酸鹽或高碘酸等，也可以使用三氯化釕以外的其他二價和/或三價釕化合物或這些物質的水合物等。
然后，向式(9)所示的化合物的甲醇溶液中，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷0.5當量、以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-乙基-N’-3-二氨基丙基碳化二亞胺(EDC)各1當量。通過將該混合溶液在室溫攪拌3小時，得到式(6)所示化合物。
此外，反應溶劑也可以是甲醇以外的N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、氯仿等，此外還可以使用NHS、EDC以外的二環碳化二亞胺(DCC)、羧基二咪唑(CDI)等。
上面的步驟，即使式(6)所示的化合物中的m、n改變，也可以完全同樣地進行。此處顯示的步驟是m＝3、n＝2的情況。但是，為了防止反應中有機硅烷化合物的聚合，優選脫水溶劑。
此外，在式(6)中的甲氧基(OCH3)變成乙氧基(OC2H5)的情況下，將甲醇更換為乙醇進行反應，變成Cl的情況下，更換為二甲基甲酰胺或二甲亞砜。
此外，與Si結合的甲氧基或乙氧基或Cl中，有2個或1個被甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個所代替的情況下，也可與上述方法完全同樣地進行制備。
本發明的表面改性劑可以優選用于將具有羥基的粉末進行改性。
本發明的改性粉末用以下方法制備。通過該方法，可以容易地制備在粉末表面直接具有磷酸膽堿基的改性粉末，即，在粉末表面通過化學結合導入磷酸膽堿基的改性粉末。
該改性粉末，與通過用具有磷酸膽堿基的聚合物被覆而導入磷酸膽堿基的粉末相比較，具有不會因聚合物的剝落而失去磷酸膽堿基的優點。此外，由于沒有被聚合物被覆，因而具有不損害粉末自身微細結構的優點。具體地，通過使用本發明的表面改性劑，可以不埋沒粉末表面所具有的立體上數nm級別的微細結構(微細孔等)而用磷酸膽堿基被覆表面。
此外，在將磷酸膽堿基衍生物作為低分子導入物體的情況下，首先該物體上導入能與磷酸膽堿基衍生物反應的官能團然后使磷酸膽堿基衍生物反應的方法中，由于物體表面上未反應的官能團殘留在物體表面上，因此生物適合性低。例如，在首先在物體表面上導入氨基，然后使磷酸膽堿的醛衍生物與物體表面的氨基反應的情況下，很多未反應的氨基殘留。這些殘留氨基盡管可以通過與其它低分子化合物結合而一定程度地封鎖，但是難于維持物體表面的親水性，而且不能完全封鎖。在物體表面上殘留很多氨基的情況下，由于氨基具有強堿性，主要是酸性蛋白質表現出明顯很強的電相互作用，其幾乎所有產生吸附。在用作色譜用填充劑的情況下，成為該蛋白質的回收率降低或峰顯著拖尾的原因。而且，蛋白質的吸附導致其變性，在用作生物適合性材料的情況下，成為炎癥等的原因，因而不好。
在合成本發明的表面改性劑時，相對于具有氨基的有機硅烷化合物，添加過量的磷酸膽堿的醛衍生物，使二者在液相中反應。已知氨基與醛基的反應性非常高，在添加過量醛的情況下幾乎100％的氨基與醛反應。因此，本發明的表面改性劑中沒有檢出未反應的氨基。因此，采用本發明的表面改性，可以在物體表面只導入磷酸膽堿基而不混有未反應的氨基。據此，與在固相上進行2步反應的方法相比，可以得到生物適合性極高，蛋白質吸附少的粉末。
向式(5)或(6)化合物的0.3mmol/mL濃度的甲醇溶液20mL中加入蒸餾水20mL，添加進行表面改性的粉末。粉末的質量必須根據其比表面積進行調整。例如當為100m2/g的粉末時，其添加量為10g左右是適當的。將該粉末分散液在油浴中80℃回流，5小時后將粉末過濾，用甲醇洗凈，在80℃減壓干燥3小時，由此得到改性粉末。
所用的粉末沒有特別的限制，是指根據用途一般平均粒徑為0.01～10μm或者0.01～1000μm左右的任意物體。作為具體的粉末，可以列舉例如無機粉末(例如滑石粉、高嶺土、云母、絹云母、白云母、金云母、合成云母、紅云母、黑云母、蛭石、碳酸鎂、碳酸鈣、硅酸鋁、硅酸鋇、硅酸鈣、硅酸鎂、硅酸鍶、鎢酸金屬鹽、鎂、硅、沸石、硫酸鋇、煅燒硫酸鈣(熟石膏)、磷酸鈣、氟磷灰石、羥基磷灰石、陶瓷粉、金屬皂(例如肉豆蔻酸鋅、棕櫚酸鈣、硬脂酸鋁)、氮化硼、氧化鈰等)；有機粉末(例如聚酰胺樹脂粉末(尼龍粉末)、聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、苯并鳥糞胺樹脂粉末、聚四氟乙烯粉末、聚甲基硅倍半氧烷粉末、硅酮彈性體粉末、纖維素粉末等)；無機白色顏料(例如二氧化鈦、氧化鋅等)；無機紅色系顏料(例如氧化鐵(氧化鐵紅)、鈦酸鐵等)；無機褐色系顏料(例如γ-氧化鐵等)；無機黃色系顏料(例如黃色氧化鐵、黃土等)；無機黑色系顏料(例如黑色氧化鐵、低次氧化鈦(低次酸化チタン)等)；無機紫色系顏料(例如錳紫、鈷紫等)；無機綠色系顏料(例如氧化鉻、氫氧化鉻、鈦酸鈷等)；無機藍色系顏料(例如群青、普魯士青等)；珍珠顏料(例如氧化鈦包衣的云母、氧化鈦包衣的氯氧化鉍、氧化鈦包衣的滑石粉、著色氧化鈦包衣的云母、氯氧化鉍、魚鱗箔等)；金屬粉末顏料(例如鋁粉、銅粉等)；鋯、鋇或鋁色淀等有機顏料(例如紅色201號、紅色202號、紅色204號、紅色205號、紅色220號、紅色226號、紅色228號、紅色405號、橙色203號、橙色204號、黃色205號、黃色401號以及藍色404號等有機顏料，紅色3號、紅色104號、紅色106號、紅色227號、紅色230號、紅色401號、紅色505號、橙色205號、黃色4號、黃色5號、黃色202號、黃色203號、綠色3號以及藍色1號等)；天然色素(例如葉綠素、β-胡蘿卜素等)等。
通過上述的制備方法，可以簡便地得到含有任意量的親水性磷酸膽堿基的粉末。此外，在粉末是合成聚合物的情況下，作為其親水部分，也可以含有羧酸基、羥基、伯～叔氨基、磺酸基、磷酸基、聚氧乙烯基、銨基、酰氨基、羧基甜菜堿、糖類等，可以通過這些物質的種類以及含量來設計粉末的功能。此外，作為其疏水部分，也可以含有碳原子數2～22的直鏈或支鏈烷基、膽固醇等環狀烷基、含有油烯基等不飽和鍵的烴基、以苯環、萘環、芘為首的烴類芳香族、吡啶環、咪唑、噻唑、吲哚等雜環類芳香族、全氟烷基、聚烷基硅氧烷等疏水基，可以根據粉末的用途進行選擇、設計。合成聚合物粉末的疏水基的結合形態，可以通過酯、醚、酰胺、尿烷、尿素鍵等，直接結合到聚合物主鏈上，也可以通過間隔物與主鏈結合。作為間隔物的種類，可以列舉親水性的聚氧化乙烯、疏水性的聚氧化丙烯、直鏈烷基(碳原子數2～22)等。
本發明的改性粉末是親水性和保濕性優良的粉末。作為具有生物適合性的粉末，可以應用到化妝品、醫用材料、色譜用填充劑、涂料等廣泛的用途中。
通過本發明的表面改性劑，可以將載體表面改性從而容易地制備具有所需量的磷酸膽堿基的色譜用填充劑。
具體地，通過載體表面上存在的羥基與式(5)以及(6)化合物中的Si-OCH3的脫水反應，將磷酸膽堿基導入到載體表面。
向式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)20mL中，加入蒸餾水20mL，添加平均粒徑5μm、平均細孔徑300埃、比表面積100m2/g的球狀高純度硅膠4g。將該粉末分散液在油浴中于80℃回流，5小時后將粉末過濾，以甲醇洗凈，在80℃減壓干燥3小時，由此可以容易地得到表面上直接具有磷酸膽堿基的粉末。
反應溶劑除了水-甲醇混合溶劑以外，還可以使用水、乙醇、2-丙醇等質子性溶劑，或二甲亞砜、二甲基甲酰胺、甲苯、乙醚等非質子性溶劑，這些可以單獨或組合使用。
此外，在載體表面上不存在羥基的情況下，以下方法是有效的將式(5)和(6)的化合物溶解在揮發性溶劑中，將該溶液涂布在物質表面上，然后干燥溶劑。作為具體的實例，將式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)，根據物質的比表面積將其適量直接涂布在物質上。然后在10℃～250℃的溫度范圍內使甲醇氣化。此時，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之間發生脫水反應，生成Si-O-Si鍵，從而可以被覆物質表面。該脫水反應是公知的。在甲醇揮發時這樣形成的膜，由于與幾乎所有物質表面上微量存在的羥基在各處產生結合，因此可以進行穩定性良好的表面改性。本法不僅對沒有羥基的物質，對有羥基的物質也是極為效的表面改性法。
與首先向載體表面導入氨基、然后將含有通過甘油磷酸膽堿的氧化分解反應而得到的醛體的化合物導入的方法相比，使用本發明表面改性劑的方法的最大不同點是在物體表面上有無未反應的氨基。
即，在使用本發明的表面改性劑的情況下，可以在物質表面上只導入磷酸膽堿基而不混有未反應的氨基。在首先將氨基導入到粉末表面的情況下，第二步導入磷酸膽堿基的反應由于液相中的甘油磷酸膽堿的醛化物必須與固相表面的氨基反應，因而由于擴散速率或固相表面的立體結構導致的立體障礙、磷酸膽堿基自身的立體性等而使反應率低。在只有大約30％的氨基上可以導入磷酸膽堿基。盡管殘留的氨基可以通過與其它低分子化合物結合而一程度地封鎖，但是維持物體表面的親水性很困難，而且不能完全封鎖。
此外，在物體表面上殘留很多氨基的情況下，由于氨基具有強堿性，主要是酸性蛋白質表現出明顯很強的電相互作用，其幾乎都產生吸附。用作色譜用填充劑時，成為該蛋白質的回收率降低或峰顯著拖尾的原因。而且，蛋白質的吸附導致其變性，在用作生物適合性材料時，成為炎癥等的原因，因而不好。
相反，本發明的表面改性劑在合成時相對于具有氨基的有機硅烷化合物添加過量的磷酸膽堿的醛衍生物，使二者在液相中反應。已知氨基與醛基的反應性非常高，一般在添加過量醛的情況下幾乎100％的氨基與醛反應。
因此，在本發明的表面改性劑中沒有檢出未反應的氨基。因此，使用本發明的表面改性，可以在物體表面只導入磷酸膽堿基而不混有未反應的氨基。據此，與在固相上進行2步反應的方法相比，可以得到生物適合性極好、蛋白質吸附少的粉末。
此外，已知在通過將球狀粉末分散于液相中而進行表面改性時，強度弱的粉末存在攪拌中粉末崩解的現象。在本法中，由于可以一步并且短時間地直接將磷酸膽堿基導入到粉末上，因此與在固相上進行2步反應的方法相比，粉末的攪拌時間節省了1/4或以下，可以適用于更廣泛的結構、材料的粉末。具體地，就連對細孔徑超過1000埃的這樣的機械強度弱的粉末，也可以不損害粉末形狀而進行表面改性。
本發明中使用的載體包括二氧化硅、硅膠、活性炭、沸石、氧化鋁、粘土礦物等無機多孔體、多孔有機高分子樹脂。載體優選粉末。優選球型或破碎型多孔硅膠。球狀多孔硅膠的平均粒徑是1～200μm，優選1～10μm，球狀多孔硅膠的細孔平均徑是10～2000埃，優選80～1000埃，比表面積是0.01～800m2/g，優選80～600m2/g。
本發明的色譜用填充劑用于GFC用柱時，蛋白質或多肽的吸附極少，發揮高分離能力。
即，是在蛋白質及多肽的吸附抑制方面優良的柱填充劑。因此，可以適用于利用分子量的差異分離蛋白質和多肽的模式(GFC模式)。
而且，本發明的色譜用填充劑由于磷酸膽堿基帶有雙電荷，因此是不僅基于樣品分子量的不同，而且基于樣品所帶有的微弱的電荷差異而具有更高分離能力的柱填充劑。像這樣為了抑制蛋白質的吸附而導入具有雙電荷的官能團的例子還沒有，用本發明的表面處理劑制備的色譜用填充劑是迄今沒有的新的GFC用柱填充劑。利用具有該電荷的這一特征，不僅能夠根據分子量的不同和其所帶的電荷來分離蛋白質或多肽，而且表明，通過改變流動相的pH或鹽濃度，也可以控制填充劑表面與蛋白質或多肽的相互作用強度。因此，通過使流動相的pH或鹽濃度最優化，可以自如地保留目的蛋白質或多肽。
GFC模式由于可以不使蛋白質或酶失活而將其分離、純化，因此在未知生物樣品的分離或醫療用途方面，也期待本發明的柱填充劑的高分離能力發揮作用。
本發明的色譜用填充劑，具體地，作為蛋白質及多肽的吸附極少的高分離能力柱填充劑，在例如人血清中的蛋白質的分離，或者在胰蛋白酶消化蛋白質所得的樣品中含有的多肽的分離，或者以生物中含有的未知蛋白質的活性評價為基礎的分離、分取方面是優良的。
當對生物樣品中含有的蛋白質等進行分析時，必須進行除去來自生物的雜質的預處理。具體地，在測定血液中蛋白質的濃度時，為了得到溶解有蛋白質的血清，必須預先采用過濾、或者離心分離等除去血細胞或血小板等。在血液等的過濾過程中，存在由于所用的過濾器吸附蛋白質而導致蛋白質的定量性降低的問題。此外，用離心力使其通過有細孔的膜的雙層結構的容器，在蛋白質樣品的濃縮或脫鹽、溶劑置換等目的中已經被廣泛應用。例如可以列舉Ultrafree-MC離心式フイルタ一ユニツト(產品名)(日本ミリポア株式會社)。該フイルタ一ユニツト是在上部裝入濃縮前的樣品，下部設置為朝向離心分離器的外側，通過施加5000G左右的離心力完成過濾。就連這樣的器具的過濾膜，也存在蛋白質的回收率下降到接近50％的情況，存在不良好的課題。
通過用式(5)和(6)的化合物對過濾器進行表面改性，可以得到蛋白質吸附極少的過濾器。由于式(5)和(6)中的Si-OCH3與過濾器表面的羥基發生脫水反應而結合，可以簡便地導入蛋白質吸附抑制能力優良的磷酸膽堿基。由于所用的金屬、玻璃、玻璃纖維等材質的過濾器的幾乎所有表面上都具有來自氧化物的羥基，因此對廣泛的材料都有效。
此外，在沒有羥基的材料的情況下，以下方法是有效的將式(5)和(6)的化合物溶解在揮發性溶劑中，將過濾器或其他材料浸漬在該溶液中，然后干燥溶劑，洗凈。具體地，將式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)根據物質的比表面積適量地直接浸漬物質，然后在10℃～250℃的溫度范圍內使甲醇氣化。此時，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之間發生脫水反應，生成Si-O-Si鍵，從而可以被覆物質表面。該脫水反應是公知的。在甲醇揮發時這樣形成的膜，由于與在幾乎所有物質表面上微量存在的羥基在各處形成結合，因此可以進行比較強韌的表面改性。本法不僅對沒有羥基的物質，對有羥基的物質也是極為效的表面改性法。
在通過磷酸膽堿基對如過濾器一樣具有微細孔的物體進行表面改性時，用已經公知的具有磷酸膽堿基的聚合物進行被覆是困難的。主要原因是聚合物堵塞微細孔，降低作為過濾器的能力。通過使用式(5)和(6)這樣的低分子，可以使載體表面改性而不損害載體的微細孔結構特性。而且，由于與載體表面不是物理吸附而可以形成化學鍵，在耐久性方面非常優良。
玻璃實驗器具是指保存容器、計量用器具、比色杯(cell)、分餾管(fractionation tip)、樣品分級(sample fractionation)用注射器等實驗器具。在用本發明的表面改性劑進行處理的情況下，可以得到蛋白質吸附極少的實驗器具。
實施例以下以實施例為基礎進一步詳細說明本發明。本發明不受這些實施例的限制。
合成例1含有磷酸膽堿基的醛化合物將L-α-甘油磷酸膽堿(450mg)溶解在蒸餾水15mL中，在冰水浴中冷卻。添加高碘酸鈉(750mg)(和光純藥工業株式會社)，攪拌5小時。將反應液減壓濃縮，減壓干燥，用甲醇提取目的物。結構如下述化合物(8)所示。式(8)化合物的1H NMR圖譜如圖1所示、Mass圖譜如圖18所示。
實施例1 式(5)和(6)化合物的制備將合成例1的化合物7.5g溶解在脫水甲醇30mL中，將容器內用干燥氮氣置換。然后在化合物1的甲醇溶液中添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷(信越化學工業株式會社)3.6g。將該混合物溶液在室溫攪拌5小時后，冰冷，添加氰基硼氫化鈉(和光純藥工業株式會社)2.5g，恢復至室溫，并攪拌16小時。在此期間在反應容器中持續通入干燥氮氣。過濾沉淀后，得到目的物質，即下式(10)和式(11)化合物的甲醇溶液。

實施例2 改性粉末的制備向含有實施例1中制備的式(10)和(11)化合物的甲醇溶液中加入蒸餾水35mL，進一步添加平均粒徑5μm、平均細孔徑30nm、比表面積140m2/g的硅膠14g。將該粉末分散溶液在80℃回流5小時。回流后用甲醇100mL過濾洗凈，得到目的物質。
按照以上的步驟，用實施例1的表面改性劑處理過的改性粉末的元素分析值如表1所示。表中的C％或N％表示粉末中所含的碳元素或氮元素的質量％。從該值可知，用實施例1的表面改性劑處理后的粉末的碳和氮原子數之比(C/N)是5.08。由于式(10)和(11)的表面改性劑的甲氧基位置部位結合后的C/N是5，所以表明表面改性劑被導入到了粉末中而未被破壞。
表1

此外，該硅膠的13C-CPMAS圖譜以及13C-PSTMAS圖譜如圖2所示。所謂PSTMAS圖譜，是選擇性得到自由運動的分子鏈的圖譜的方法，是在粉末表面的修飾鏈的解析中廣泛應用的方法。圖2中在54.2ppm處觀測到由膽堿基的碳產生的圖譜。
另一方面，在圖3所示的相同硅膠的31P-CPMAS圖譜中，由于在與作為對象測定的NaH2PO4幾乎相同的化學位移值上檢測出峰，因此可以確認磷酸基的存在。由于根據圖2確認了膽堿基的存在，又根據圖3確認了磷酸基的存在，因此認為可以將磷酸膽堿基導入到載體硅膠表面。
此外，圖2在9ppm、23ppm附近觀測到由在硅原子和磷酸膽堿基之間存在的丙基的碳產生的圖譜，在60ppm、69ppm附近觀測到由磷酸膽堿內的乙基產生的圖譜。由以上可知，式(5)和(6)的結構可以不被破壞而導入到硅膠中。此外，磷酸膽堿基與丙基三甲氧基硅烷的結合部分，與式(5)中所示的仲胺的結合部分、式(6)中所示的酰胺鍵的結合部分混在一起。
圖4中顯示了在本實施例中合成的改性粉末的FT-IR圖譜。可以在1650cm-1附近觀測到酰胺鍵所特有的吸收。
實施例3色譜用填充劑將在實施例2中制備的改性粉末作為載體，通過常規淤漿法填充在內徑4.6mm、長250mm的空柱中。獲得色譜圖的條件如下流動相50mmol/L磷酸緩沖液+500mmol/L NaCl pH6.8流速100μL/min溫度25℃檢測UV 280nm在本條件下使用實施例3的柱時的校正曲線如圖5中所示。圖5所示的校正曲線在測定范圍內線性極好。由于蛋白質的吸附少，因此填充劑表面與蛋白質的相互作用極小，作為其結果，可知進行分子量大的分子較早洗脫的GFC模式分離。其次，在上述條件下分離人血清蛋白質的結果如圖6所示。
作為樣品使用的是用蒸餾水稀釋2倍的コンセ一ラN(產品名)，注入2μL。可知人血清這樣的實驗樣品也是以分子量順序的GFC模式進行分離，實用性非常高。
對比例1
接下來，將市售的色譜用柱(Shodex PROTEIN KW803，昭和電工株式會社制)以市售狀態直接使用，嘗試分離人血清樣品(將コンセ一ラN(產品名)用蒸餾水稀釋2倍)中的蛋白質。對比例中列舉的該柱與實施例3中所述的柱有相同的內徑和長度。
該填充劑被說明成是使親水性基團化學結合到多孔性硅膠的表面上的尺寸排阻模式用的填充劑。平均細孔徑是300埃，平均粒徑5μm，適合與實施例1中所述的填充劑比較。被說明成適合于分子量1萬～數十萬的蛋白質的分離。
Shodex PROTEIN KW803由于使用非解離性親水性基團，與用本發明的表面改性劑制備的填充劑不同，沒有帶電荷的官能團。因此，認為幾乎沒有與蛋白質的離子相互作用。
與實施例3同樣，使用向50mmol/L磷酸緩沖液(由Na2HPO4及KH2PO4配制)中加入500mmol/L氯化鈉的流動相，在流速100μL/min，柱溫25℃的條件下，嘗試分離人血清樣品(將純コンセ一ラN(產品名)用純水稀釋2倍)中的蛋白質。檢測在UV 280nm處進行。結果如圖7(b)所示。
此外，為了比較，在圖7(a)中顯示用實施例3中得到的本發明的表面改性劑制備的填充劑在相同條件下用相同樣品獲得的色譜圖。
此外，在圖(8)(a)中顯示用本發明的表面改性劑制備的填充劑以鹽濃度150mM使用時的色譜圖；圖8(b)中顯示Shodex PROTEIN KW803以鹽濃度150mM使用時的色譜圖。圖8中除了鹽濃度外其他條件與圖7相同。
在使用了用本發明的表面改性劑制備的填充劑的色譜圖中(圖7(a))，人血清中除了是主要蛋白質的γ-球蛋白和白蛋白以外，轉鐵蛋白的峰被確認為肩峰狀是很大的特征。峰的歸屬使用分離的各種蛋白質的市售品進行。
相反，在使用現有的GFC用填充劑的情況下(圖7(b))，白蛋白和轉鐵蛋白完全沒有被分離。這由與分離的市售品的各種蛋白質的洗脫時間相同而確認。
白蛋白和轉鐵蛋白的分子量分別是大約69,000和75,000，非常相似。用現有的GFC用柱不能分離象白蛋白和轉鐵蛋白這樣分子量相近的樣品。可知使用本發明的表面改性劑配制的填充劑，不僅蛋白質的吸附極少，而且由于磷酸膽堿基帶有雙電荷而與蛋白質具有微弱的離子相互作用，即使是分子量相近的蛋白質也可以基于等電點和疏水性的不同而分離。
即，本發明的色譜用填充劑，在GFC模式中，不僅可以利用分子量的不同，而且可以根據蛋白質所具有的等電點和疏水性的不同來分離樣品。
用本發明的表面改性劑制備的填充劑具有微弱的離子交換相互作用，這可以通過減小流動相的鹽濃度來確認。
流動相的鹽濃度是500mM的圖7(a)中，即使使用以本發明的表面改性劑制備的填充劑，轉鐵蛋白也只是作為白蛋白峰的肩峰而確認的程度，流動相的鹽濃度減小到150mM的圖8(a)中，轉鐵蛋白與白蛋白的峰達到基線分離。
此外，在圖8(a)中可以確認大量蛋白質產生的峰。一般地，已知在填充劑表面和流動相內的物質之間發生作用的離子交換相互作用是隨著流動相鹽濃度的減小而變強。這是指通過減小流動相鹽濃度，受離子交換相互作用的物質就會被更強地保留。用本發明的表面改性劑制備的填充劑，通過減小流動相的鹽濃度，形成尤其是對白蛋白的強保留，達到與轉鐵蛋白的完全分離。
由像圖7、圖8這樣中性pH下在低鹽濃度下保留帶負電的白蛋白，推測用本發明的表面改性劑制備的填充劑具有陰離子交換模式。
因此，隨后用乳酸、醋酸、琥珀酸、丙二酸、枸櫞酸5種有機酸，評價了用本發明的表面改性劑制備的填充劑所具有的陰離子交換能力。評價條件如下。結果如圖9所示。
柱4.6×150mm流動相50mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)流速1000mL/min檢測UV 210nm由圖9可知，用本發明的表面改性劑制備的填充劑可以根據羧酸的數量分離各種有機酸。
具體地，對由5種有機酸產生的各個峰進行歸屬時，2種具有1個羧酸的有機酸最早被洗脫分離，然后是2種具有2個羧酸的有機酸被洗脫分離，最后是具有三個羧酸的枸櫞酸被洗脫分離。由于確認了隨著羧酸數量的增加保留變大的趨勢，就明確了該填充劑具有陰離子交換能力。因此可以說，用本發明的表面改性劑處理過的粉末作為陰離子交換用填充劑也是非常有效的。以上所示的離子交換性，適合用于進行沒有使蛋白質吸附、變性程度的強度，回收率良好的獨特分離。
另一方面，作為一般GFC用柱的Shodex PROTEIN KW803，如圖8(b)中所示，在150mM的鹽濃度時也不能分離轉鐵蛋白和白蛋白。
用本發明的表面改性劑制備的填充劑，是因具有抑制蛋白質吸附的優良功能而致的GFC模式(尺寸排阻模式)而且也存在離子交換模式的極獨特的填充劑。由于蛋白質的吸附極少，因此可以在不使蛋白質變性而保持其酶活性狀態的條件下分離、純化蛋白質。而且，由于不僅有GFC模式還混有離子交換模式，因此是可以根據流動相的鹽濃度或pH來控制分離的劃時代的填充劑。
實施例4色譜用填充劑(用在硅原子和磷酸膽堿基之間具有2個氮原子、式(1)中R是式(4)p＝1所表示的化合物進行表面改性)將合成例1的化合物7.5g溶解在脫水甲醇30mL中，將容器內用干燥氮氣置換。然后在化合物1的甲醇溶液中添加3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷(信越化學工業株式會社)3.6g。
將該混合溶液在室溫攪拌5小時后，冰冷，添加氰基硼氫化鈉2.5g，恢復至室溫，攪拌16小時。在此期間在反應容器中持續通入干燥氮氣。
過濾沉淀后，得到作為目的物質的下式(12)、(13)化合物的甲醇溶液。

向含有式(12)及(13)化合物的甲醇溶液中加入蒸餾水35mL，進一步添加平均粒徑5μm、平均細孔徑30nm、比表面積140m2/g的硅膠14g。將該粉末分散溶液在80℃回流5小時。回流后以甲醇100mL過濾洗凈，得到目的物質。
在圖10(b)中顯示將導入了式(12)和(13)的硅膠按常規淤漿法進行填充，注入人血清樣品(將コンセ一ラN(產品名)用蒸餾水稀釋2倍)時的色譜圖。
圖10(a)是使用實施例3中制備的粉末時的色譜圖。
實施例3與本實施例的不同是，表面改性劑的間隔物部分的仲胺數量不同。此外，在圖10(a)和(b)中使用的硅膠是同一物質。
在硅原子與磷酸膽堿基之間的仲胺比圖10(a)多1個的圖10(b)中，可知轉鐵蛋白與白蛋白的分離進一步改善。這被認為是由于在硅原子與磷酸膽堿基之間插入了仲胺，由此增大了修飾基團的堿性，作為酸性蛋白質的白蛋白被更強地保留。
像這樣，本發明的表面改性劑，因磷酸膽堿基產生蛋白質吸附抑制效果，而且可以通過改變硅原子與磷酸膽堿基之間間隔物的性質，賦予所謂離子交換性、疏水性、親水性、氫結合性的相互作用。
實施例5硼硅酸玻璃纖維過濾材料<結合有磷酸膽堿基的硼硅酸玻璃纖維過濾材料的制備>
在100mL三角瓶中加入蒸餾水20g、含有實施例1中制備的式(10)和(11)化合物(大約0.4mmol)的甲醇溶液1.0mL，振蕩混合。在其中添加8張ワツトマンジヤパン株式會社制的硼硅酸玻璃纖維過濾片(玻璃纖維濾紙グレ一ドGF/F，直徑25mmΦ，每1片大約0.70g)后，于100℃加熱煮沸回流5小時。冷卻到室溫后，將過濾器濾過，洗凈，在80℃減壓干燥3小時，得到在表面上直接具有磷酸膽堿基的硼硅酸玻璃纖維過濾片。
<過濾材料對蛋白質吸附的抑制效果的測定>
將牛血清白蛋白(BSA)10mg溶于100mL磷酸緩沖液中(將タカラバイオ社制的PBS片1片溶解在蒸餾水中，使總量為100mL。pH7.4～7.5)作為BSA溶液。分別取配制的BSA溶液2.0g到3支聚丙烯制的30mL取樣管中，其中1支取樣管中浸漬實施例6中制備的硼硅酸玻璃纖維過濾片，另1支取樣管中浸漬未處理過的硼硅酸玻璃纖維過濾片。將其在室溫(25℃)放置24小時，通過Lowry法分別對3支取樣管中的BSA溶液進行發色、吸光光度分析，由此定量分析每1個過濾片的BSA吸附量。
可知本發明的硼硅酸玻璃纖維過濾片與未處理品相比較，BSA吸附量降低。
表2

由上述結果可知，本發明可以提供蛋白質或多肽的吸附極少的過濾材料。
本發明的過濾材料在抗體、酶等的分離、濃縮或血液透析、血液過濾等血液凈化、分析等廣泛的生物物質的過濾中有用。
實施例6玻璃瓶<結合有磷酸膽堿基的玻璃瓶的制作>
在100mL三角瓶中加入蒸餾水20g、含有實施例1中制備的式(10)和(11)化合物(大約0.4mmol)的甲醇溶液1.0mL，振蕩混合。在其中添加10個日本ウオ一タ一ズ株式會社制的玻璃瓶(12×32mm螺旋式玻璃瓶)后，在100℃加熱煮沸回流5小時。冷卻到室溫后，用甲醇洗凈所述瓶，在80℃減壓干燥3小時，得到在表面上直接具有磷酸膽堿基的玻璃瓶。
像這樣，通過本發明的表面改性劑，可以得到蛋白質吸附極少的玻璃實驗器具。已知用不能抑制蛋白質吸附的普通管瓶時，實驗操作中蛋白質的樣品濃度隨著時間而減少。具體地，已知當從保存容器向高效液相色譜中注入樣品時，存在盡管每次注入相同量的體積，但峰面積隨時間減少的現象。本實施例中制造的玻璃瓶，由于在蛋白質吸附抑制方面優良，因此可以避免這樣的現象。
此外，已知在使容器內壁吸附高分子從而抑制蛋白質的吸附的情況下，樣品中含有有機溶劑時，會發生高分子的脫吸附，從而存在耐久性的問題。用高分子進行的表面被覆，是通過高分子與聚丙烯容器這樣的基材之間的疏水性相互作用導致的吸附而實現的。樣品溶劑中含有有機溶劑時，高分子與基材之間的疏水性相互作用減弱，高分子剝離。另一方面，本發明的表面改性劑(硅烷偶聯劑)，由于通過化學結合進行表面修飾，因此不會實質性地受到樣品中溶劑的影響，可以保持效果。
實施例7具有羧基的磷酸膽堿衍生物的制備向200mL燒瓶中加入甘油磷酸膽堿5g(19.4mmol)、高碘酸鈉17g(79.7mmol，4.1當量)(和光純藥工業株式會社)、三氯化釕(水合物)81mg(0.39mmol，0.02mol當量)(和光純藥工業株式會社)以及離子交換水70g、乙腈30g。在室溫攪拌2小時后，過濾，從濾液中除去溶劑。從得到的固體物中用甲醇提取目的物，然后通過除去甲醇得到下式(9)所示的具有羧基的磷酸膽堿衍生物。式(9)化合物的1H NMR圖譜如圖16所示、Mass譜如圖17所示。
實施例8在硅原子和磷酸膽堿基之間具有酰胺鍵、式(1)中R是式(3)L＝2所表示的有機硅烷化合物(硅烷偶聯劑)
將上式(9)化合物3g(12.4mmol)溶解在脫水甲醇100mL中，將容器內用干燥氮氣置換。然后添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷1.1g(6.2mmol)、N-羥基琥珀酰亞胺1.4g(12.4mmol)以及N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基碳化二亞胺2.4g(12.4mmol)，在-10℃反應16小時，得到含有下式(11)所示的間隔物中具有酰胺鍵、在末端具有磷酸膽堿基的有機硅烷化合物的溶液。
此外，代替上式(9)所示的化合物，通過使用在磷酸膽堿基和羧基之間具有碳原子數為5的飽和烷基鏈的O-磷酸膽堿羥基己酸，以同樣的步驟可以得到式(1)中R是式(3)L＝6所示的化合物。
本發明的表面改性劑，不用純化也可以將磷酸膽堿基固定在基材上。然而，也可以用例如下述的方法進行純化。
純化方法將得到的溶液減壓濃縮，將其溶于蒸餾水中。以此水溶液作為樣品。將具有疏水性相互作用和陽離子交換能力的高效液相色譜用柱-カプセルパツクSCX UG80 S-5(尺寸4.6mm i.d.×250mm)(株式會社資生堂)連接在HPLC裝置中，使其用0.2mmol/L的磷酸緩沖液(pH3.5)以1mL/分的流速流過進行平衡后，注入10μL樣品。使用示差折射計作為檢測器得到色譜圖，由此可以分離目的化合物。
實施例9用間隔物中具有酰胺鍵、在末端具有磷酸膽堿基的有機硅烷化合物處理的改性粉末向含有實施例8中制備的式(11)化合物的溶液30mL(0.25mmol/mL)中，加入蒸餾水35mL，進一步添加平均粒徑5μm、平均細孔徑30nm、比表面積140m2/g的硅膠14g。將該粉末分散液在80℃回流5小時。回流后用甲醇100mL過濾洗凈，得到目的物質。通過上述步驟得到的用實施例8的表面改性劑處理過的改性粉末(處理前的碳含量是0.15％)的碳含量是2.49％。
對實施例9中制備的在表面上具有磷酸膽堿基的粉末中的磷元素進行了含量測定。在本發明的制備方法中，磷元素是磷酸膽堿基固有的元素，可以通過測定粉末表面上存在的磷元素量，確認實際上導入的磷酸膽堿基。
磷元素的含量測定通過鉬酸發色法進行。以下說明含量測定方法。
(1)將所測定的粉末計量到充分洗凈的試管中。
(2)向1的粉末中添加60％高氯酸水溶液(和光純藥工業株式會社)3mL。
(3)為了避免液體的氣化擴散，在2的試管上部安裝冷凝管，于120℃加熱1小時，然后于180℃加熱2小時。在本操作中，使粉末表面的修飾鏈全部被氧化，特別地，使磷元素以磷酸形式游離。
(4)將3的溶液放入離心分離機中(3000r pm，5分鐘)，將上清液轉移至1mL的取樣管中。
(5)向4的溶液中添加蒸餾水1mL，和0.5M的鉬酸鈉(和光純藥工業株式會社)500μL以及0.5M的抗壞血酸500μL。
(6)將5的溶液在95℃的熱水浴中加熱5分鐘，然后用冷水冷卻。
(7)將6中發色完畢的溶液200μL滴加到96孔板中，在讀板器中測定710nm處的發色強度。
(8)以由預先已知濃度的磷酸溶液的發色強度得到的校正曲線為基礎，對樣品中所含的磷元素的量進行定量。磷酸的標準溶液可以從和光純藥工業株式會社得到。
其結果是，實施例9中制備的在表面上具有磷酸膽堿基的改性粉末的磷元素是0.13mmol/ggel。即，可知可將0.13mmol/ggel的磷酸膽堿基固定在粉末表面上。
圖11中顯示本實施例中合成的改性粉末的FT-IR譜。
在1650cm-1附近可以觀測到酰胺鍵所特有的吸收。
實施例10用間隔物中具有酰胺鍵、在末端具有磷酸膽堿基的表面改性劑(硅烷偶聯劑)處理過的液相色譜用填充劑用在實施例9中合成的改性粉末作為載體，通過常規淤漿法填充在內徑4.6mm、長250mm的空柱中。獲得色譜圖的條件如下流動相50mmol/L磷酸緩沖液+500mmol/L NaCl pH6.9流速200μL/min溫度25℃檢測UV 280nm首先，在圖12中顯示注入2μL混合有α2巨球蛋白0.67mg/mL(分子量約800,000，縮寫α2M)、γ-球蛋白1.3mg/mL(分子量約160,000，縮寫γG)、人血清白蛋白1.7mg/mL(分子量約70,000，縮寫HSA)、溶菌酶0.3mg/mL(分子量約14,000，縮寫LYZ)、尿嘧啶0.017mg/mL(分子量112，縮寫U)的水溶液樣品時的色譜圖。α2M、γ-G、HSA、LYZ從シグマアルドリツチジヤパン株式會社得到、尿嘧啶從ナカライテスク株式會社得到。5個峰被明確地確認，以市售的單個樣品的洗脫時間對其進行鑒定，結果按照洗脫早晚的順序依次是α2M、γG、HSA、LYZ、U。5個峰之外觀測到的小峰是市售標準樣品中含有的雜質。可知通過酰胺鍵將磷酸膽堿基固定在硅膠上使蛋白質的吸附少，填充劑表面與蛋白質的相互作用極小，結果以分子量大的分子早洗脫的GFC模式進行分離。
酰胺鍵親水性良好。從抑制蛋白質吸附的觀點考慮，優選物質表面被覆親水性并且非離子性的官能團。磷酸膽堿基有兩性離子固有的極優良的親水性、由于兩性離子的電荷平衡的均衡，實質上離子性非常微弱，可以說是抑制蛋白質吸附方面優良的官能團。然而，將磷酸膽堿基固定到物質表面所用的間隔物的疏水性很高時，會誘發蛋白質的非特異性不可逆吸附。因此，在間隔物上存在酰胺鍵是極重要的，它實現更親水的表面改性。連該間隔物所含的親水性在蛋白質的吸附抑制中也極有效果。
<與甜菜堿結構的表面改性劑相比的對比例(與現有技術的比較)>
對比例2關于具有與磷酸膽堿基不同的甜菜堿結構的有機硅烷類表面改性劑，日本特開平5-222064號公報中公開了式(14)所示的具有磺基甜菜堿的硅烷化合物。此外，在日本特開昭63-295593號公報中公開了式(15)所示的具有羧基甜菜堿的硅烷化合物。
將式(14)及(15)的硅烷化合物與實施例1的式(10)及(11)化合物進行比較。
式(14)及(15)化合物的制備方法按照公知的文獻進行。
向式(14)化合物2.0g中加入甲醇20mL和蒸餾水20mL，進一步添加平均粒徑5μm、平均細孔徑30nm、比表面積140m2/g的硅膠5.0g。將該粉末分散溶液在80℃回流5小時，使式(14)所示的化合物固定到硅膠上。回流后用甲醇50mL過濾洗凈，得到被式(14)所示化合物表面改性的硅膠。
關于式(15)所示化合物，也進行同樣的操作，得到被式(15)所示化合物表面改性的硅膠。
然后，將得到的表面改性硅膠分別通過常規淤漿法填充在內徑4.6mm、長250mm的空柱中。獲得色譜圖的條件如下流動相50mmol/L磷酸緩沖液+500mmol/L NaClpH6.9流速200μL/min溫度25℃檢測UV 280nm首先，在圖13中顯示往填充了實施例3的在表面具有磷酸膽堿基的填充劑的柱中注入2μL混合有α2巨球蛋白0.67mg/mL(分子量約800,000，縮寫α2M)、γ-球蛋白1.3mg/mL(分子量約160,000，縮寫γG)、人血清白蛋白1.7mg/mL(分子量約70,000，縮寫HSA)、溶菌酶0.3mg/mL(分子量約14,000，縮寫LYZ)、尿嘧啶0.017mg/mL(分子量112，縮寫U)的水溶液樣品時的色譜圖。α2M、γ-G、HSA、LYZ從シグマアルドリツチジヤパン株式會社得到、尿嘧啶從ナカライテスク株式會社得到。
5個峰被明確地確認，由市售的單個樣品的洗脫時間對其進行鑒定，結果按照洗脫早晚的順序依次是α2M、γG、HSA、LYZ、U。是此前所述的從分子量大的物質開始洗脫的GFC模式。5個峰之外觀測到的小峰是市售標準樣品中含有的雜質。
另一方面，向用固定有式(14)所示的磺基甜菜堿的填充劑填充的柱中注入相同樣品時的色譜圖如圖14所示。5種物質中，只觀測到人血清白蛋白和尿素的峰，尤其是溶菌酶，在該樣品濃度下不能確認洗脫。在構成磺基甜菜堿的季銨和磺酸之間沒有達到電中性，發現在端部存在作為強酸的磺酸引起的陽離子交換能力，結果是由于與中性且帶正電的溶菌酶之間產生極強的離子交換相互作用。
向用固定有式(15)所示的羧基甜菜堿的填充劑填充的柱中注入相同樣品時的色譜圖如圖15所示。5種物質的峰與固定有磺基甜菜堿的柱的情況相比，洗脫良好。按照α2M、γ-球蛋白、溶菌酶、尿素、人血清白蛋白的順序洗脫。應當注意的是，中性流動相下，帶負電的人血清白蛋白被特征性地保留，洗脫比低分子的尿素還在后。這是因為在構成羧基甜菜堿的季銨與羧基之間沒有達到電中性，由于發現了離子性相對強的季銨的強陰離子交換性，因此與中性且具有負電荷的人血清白蛋白之間產生極強的離子交換相互作用。
像這樣，一般已知的甜菜堿并不完全是離子中性的。列舉的磺基甜菜堿或羧基甜菜堿這樣的甜菜堿結構具有優良的親水性，但由于過強的離子交換性會誘發蛋白質的吸附。其中，已知磷酸膽堿基中磷酸與季銨的電荷平衡適當，在甜菜堿結構固有的極優良的親水性和非離子性的抑制蛋白質吸附功能方面是優良的。
由以上可以說，迄今沒有報告例的具有磷酸膽堿基的有機硅烷類表面改性劑(硅烷偶聯劑)，在以不吸附蛋白質為目的的物質表面改性方面極為有效。通過使用本發明的表面改性劑，可以實施蛋白質的吸附少、生物適合性優良的表面改性。
產業實用性本發明含有磷酸膽堿基的新型化合物，可以作為表面改性劑。本發明的表面改性劑賦予物體生物適合性、保濕性、以及其它多種有用的功能。通過本發明的表面改性劑可以容易地制造用磷酸膽堿基改性的改性粉末、用該改性粉末作為載體的色譜用填充劑、用該表面改性劑改性的過濾器、用該表面改性劑改性的玻璃器具。
權利要求
1.下式(1)表示的含有磷酸膽堿基的化合物， 式中，m是2～6，n是1～4，X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素，但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個，R是下式(2)～(4)所示結構中的任意一個(在下式(2)～(4)結構中，式(1)化合物以A-R-B表示)， 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
2.下式(5)或(6)表示的含有磷酸膽堿基的化合物， 式中，m是2～6，n是1～4，X1、X2、X3各自獨立地為甲氧基、乙氧基或鹵素，但是，X1、X2、X3中至多2個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基中的任意一個。
3.一種表面改性劑，其包含權利要求1或2所述的含有磷酸膽堿基的化合物。
4.上述式(6)所示化合物的制備方法，其特征在于通過用高碘酸鈉和三氯化釕氧化甘油磷酸膽堿的反應合成具有羧基的磷酸膽堿衍生物，由具有氨基的有機硅烷化合物與具有羧基的磷酸膽堿衍生物通過縮合劑合成上述式(6)所示的化合物。
5.用權利要求3所述的表面改性劑處理過的改性粉末。
6.色譜用填充劑，其包含用權利要求3所述的表面改性劑處理過的改性載體。
7.用權利要求3所述的表面改性劑處理過的過濾器。
8.用權利要求3所述的表面改性劑進行過表面處理的玻璃實驗器具。
全文摘要
右式(1)表示的含有磷酸膽堿基的化合物。式(1)中，m是2～6，n是1～4。X
文檔編號C07F9/00GK1886413SQ20048003511
公開日2006年12月27日 申請日期2004年12月1日 優先權日2003年12月2日
發明者東條洋介, 宮澤和之, 神田武利, 沓名裕, 佐久間健, 和田正良, 隅田如光 申請人:株式會社資生堂