無細胞系蛋白質合成中通過添加微粒體膜的翻譯后修飾方法

專利名稱：無細胞系蛋白質合成中通過添加微粒體膜的翻譯后修飾方法
技術領域：
本發明涉及一種無細胞系蛋白質合成方法，特別涉及一種可以進行翻譯后修飾的無細胞系蛋白質合成方法。
背景技術：
為了解析蛋白質的結構或功能，蛋白質的大量生產是不可缺少的技術。但是，使用以大腸桿菌為主的很多活細胞的表達系，事實上很難合成危及該生物的生命維持的蛋白質，只能獲得/分析有限的蛋白質。對此，無細胞系蛋白質合成是在只取出蛋白質合成中必要的裝置的人工蛋白質合成中專用的系統，所以是可以解決活細胞的表達系所存在的問題點的方法。
另外，伴隨基因組解析的進展，旨在網羅闡明生物體內存在的所有蛋白質的結構和功能的蛋白質組(プロテオ一ム)解析正在進展之中。生物體內的蛋白質在細胞質中存在的游離核糖體上開始翻譯之后，幾乎都在翻譯中或翻譯后接受蛋白酶的加工或被稱為特定氨基酸殘基的修飾的翻譯后修飾。這些翻譯后修飾在很多情況下與蛋白質的功能表達或其控制直接相關，所以這些解析在蛋白質功能的闡明中不可缺少。
作為通常的無細胞系蛋白質合成法，已知有大腸桿菌溶解液、小麥胚芽提取液、兔網織紅細胞溶解液等，但作為具有在高等動物/植物中產生的主要翻譯后修飾能力的蛋白質合成系，已知有向兔網織紅細胞溶解液中添加狗胰腺微粒體膜的系統(關于狗胰腺微粒體膜，參照Walter，P.andBlobel，G，“酶學方法(Method Enzymology)”，(美國)，1983年，第96卷，第84～93頁；Bulleid，N.J.et al.，“生物化學雜志(The Biochemicaljournal)”，(美國)，1990年，第268卷，第777～781頁；Paradis，G.etal.，“生物化學與細胞生物學(Biochemistry and cell biology)”，(加拿大)，1987年，第65卷，第921～924頁等)。但是，狗胰腺微粒體膜價格非常高，所以在很多蛋白質的網絡式合成中沒有被使用。作為解決上述問題的手段，開發出從中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)分別制備內質網組分、高爾基體組分、細胞膜組分，添加到兔網織紅細胞溶解液中的系統(例如，參照特開2002-238595號公報)。但是，翻譯后修飾裝置的制備需要很多人力。又開發出使用特殊裝置，在惰性氣體環境中加壓，制備具有翻譯后修飾活性的昆蟲來源提取液的方法(例如，參照特開2000-325076號公報)，但存在所謂mRNA的5’-UTR(非翻譯序列)與目的基因的信號序列的組合會控制修飾的有無這一不適合實際使用的問題。另外，由于裝置特殊，所以缺乏通用性。
綜上所述，需要開發出通用性高、存在于提取液中的無細胞系蛋白質合成過程中的翻譯后修飾方法。

發明內容
本發明正是為了解決上述課題而進行的發明，其目的在于，提供一種在無細胞系蛋白質合成中的新型翻譯后修飾方法以及使用該翻譯后修飾反應的新型無細胞系蛋白質合成方法。
本發明人等為了解決上述課題而進行了潛心研究，以至完成本發明。
即，本發明如下所述。
(1)本發明提供一種在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成方法，其中，包括在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
(2)根據上述(1)中記載的方法，其中，在mRNA濃度(μg/ml)與節肢動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下，進行翻譯反應。
(3)根據上述(2)中記載的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
(4)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜是從昆蟲組織提取出來的微粒體膜。
(5)根據上述(4)中記載的方法，其中，昆蟲組織是蠶組織。
(6)根據上述(5)中記載的方法，其中，蠶組織是脂肪體。
(7)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲培養細胞提取出來的微粒體膜。
(8)根據上述(7)中記載的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾(Trichoplusia ni)卵細胞來源或草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細胞來源的培養細胞。
(9)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有節肢動物來源的提取物的提取液。
(10)根據上述(9)中記載的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
(11)根據上述(10)中記載的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
(12)根據上述(11)中記載的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
(13)根據上述(9)中記載的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲培養細胞提取的提取物。
(14)根據上述(13)中記載的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
(15)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有小麥胚芽來源的提取物的提取液。
(16)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有哺乳動物培養細胞來源的提取物的提取液。
(17)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有兔網織紅細胞來源的提取物的提取液。
(18)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有大腸桿菌來源的提取物的提取液。
(19)根據上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有酵母來源的提取物的提取液。
(20)本發明提供一種翻譯后的蛋白質的修飾方法，其中，在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成中，包括在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
(21)根據上述(20)中記載的方法，其中，在mRNA濃度(μg/ml)與節肢動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下進行翻譯反應。
(22)根據上述(21)中記載的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
(23)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲組織提取的微粒體膜。
(24)根據上述(23)中記載的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
(25)根據上述(24)中記載的方法，其中，蠶組織為脂肪體。
(26)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲培養細胞提取出來的微粒體膜。
(27)根據上述(26)中記載的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
(28)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有節肢動物來源的提取物的提取液。
(29)根據上述(28)中記載的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
(30)根據上述(29)中記載的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
(31)根據上述(30)中記載的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
(32)根據上述(28)中記載的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲培養細胞提取的提取物。
(33)根據上述(32)中記載的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
(34)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有小麥胚芽來源的提取物的提取液。
(35)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有哺乳動物培養細胞來源的提取物的提取液。
(36)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有兔網織紅細胞來源的提取物的提取液。
(37)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有大腸桿菌來源的提取物的提取液。
(38)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有酵母來源的提取物的提取液。
(39)根據上述(20)～(22)中任意一項記載的方法，其中，翻譯后的蛋白質的修飾為N-糖基化和/或信號序列的切除。
(40)本發明提供一種N-糖基化的蛋白質，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一項所述的蛋白質合成方法得到的。
(41)本發明提供一種切除了信號序列的蛋白質，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一項所述的蛋白質合成方法得到的。
通過本發明，能夠提供一種可以進行信號肽切割或N-糖基化等蛋白質的翻譯后修飾的無細胞系蛋白質合成方法。


圖1是表示構建的表達質粒[體外pro-TNF-GLC基因轉錄用質粒-I(I)和體外pro-TNF-GLC基因轉錄用質粒-II(II)]的模式圖。
圖2是表示使用含有節肢動物來源的提取物(蠶來源(BML)、HighFive來源(HFL)、Sf21(Sf21L)來源)的無細胞系蛋白質合成用提取液，在微粒體膜(狗胰腺來源(CMM)、High Five來源(HFMM)、Sf21來源(Sf21MM))存在下或不存在下進行蛋白質合成，檢查是否進行了N-糖基化的結果的圖。
圖3是表示使用含有兔網織紅細胞溶解液的無細胞系蛋白質合成用提取液，在微粒體膜(High Five來源(HFMM)、Sf21來源(Sf21MM))存在下或不存在下進行蛋白質合成，檢查是否進行了糖基化的結果的圖。
具體實施例方式
以下，對本發明進行詳細說明。
本發明是一種在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成方法，其特征在于，在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
無細胞系蛋白質合成方法通常是在含有生物體來源提取物的無細胞系蛋白質合成用反應液中，添加轉錄模板或翻譯模板來進行的，其中所述的生物體來源提取物含有作為翻譯裝置的核糖體等。作為翻譯模板，也可以是從模板DNA轉錄而得到的mRNA。
在本發明中使用的無細胞系蛋白質合成用反應液中含有的提取物，只要是可以翻譯翻譯模板而產生該模板編碼的蛋白質，則任何提取物均可，可以沒有特別限制地使用從以往公知的大腸桿菌、小麥、大麥、稻子、玉米等稻科植物以及菠菜等植物種子的胚芽、兔網織紅細胞等提取的提取物、提取液。這些也可以使用市售的產品，也可以使用其本身已知的方法，具體地說，在是大腸桿菌、小麥胚芽或兔網織紅細胞來源的提取液的情況下，按照“生物化學實驗法43、基因表達研究法”(學會出版中心)中記載的方法等進行制備。作為市售的蛋白質合成用細胞提取液，為大腸桿菌來源時可以舉出RTS100 E.coli HYKit(Roche Diagnostics公司制)等，為兔網織紅細胞來源時，可以舉出兔網織紅細胞裂解物系統(RabbitReticulocyte Lysate System，Nuclease Treated)(Promega公司制)等，為小麥胚芽來源時可以舉出PROTEIOS套(set)(東洋紡織公司制)等。進而，酵母來源的提取液可以按照Gasior等的方法(Gasior，E等、生物化學雜質(J.Biol.Chem.)、254、3965-3969、1979)或者Hussain等的方法(Hussain、I.等、基因(Gene)、46、13-23、1986)進行制備。另外，也可以按照本發明人等提出的方法進行制備(特愿2003-001317)。
這樣，在本發明的無細胞系蛋白質合成用反應液中，也可以含有如上所述的公知的提取物、提取液，但也可以含有本發明人等提出的節肢動物來源的提取物。
在這里，“節肢動物”是后生動物的一個門，是指左右對稱、具有裂體腔的原口動物，可以屬于螯角亞門、有鄂亞門的任意一種，例如，包括屬于昆蟲綱、蜘蛛綱等的動物。其中，優選屬于昆蟲綱或蜘蛛綱(特別是蜘蛛亞綱)的節肢動物，特別優選屬于昆蟲綱的節肢動物。作為屬于昆蟲綱的節肢動物，例如可以舉出屬于鱗翅目(蝶目)、直翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、甲蟲目、脈翅目、半翅目等的動物，沒有特別限制，其中，優選使用蠶蛾科、夜蛾科等屬于鱗翅目的動物。
在本發明的無細胞系蛋白質合成用反應液中含有的上述節肢動物來源的提取物，可以是從節肢動物的生長階段的任意階段的任何組織提取出來的提取物，另外，也可以是從節肢動物的任意組織來源的培養細胞提取的提取物。其中，特別優選從蠶組織或昆蟲培養細胞提取的提取物。
“蠶”與屬于蠶蛾科的鱗翅目昆蟲(蠶蛾昆蟲)為相同的意思，是在其一生中經歷“卵(胚)”(從剛剛產卵之后到即將孵化之前為止的期間)、“幼蟲”(從剛剛孵化之后開始到繭形成即將結束之前(分為1齡期～5齡期))、“蛹”(從繭形成即將結束之前到即將羽化之前為止的期間)以及“成蟲(蛾)”(從剛剛羽化之后到死亡為止的期間)的各狀態的動物，還包括其一生中所經歷的任意形態。蠶在從卵孵化后的幼蟲狀態下，吃桑葉發育的時期(齡instar)和不吃桑葉而準備蛻皮的時期(眠)交替重復。蠶的幼蟲在孵化后到第一次蛻皮稱為1齡期，從第一次蛻皮到第二次蛻皮稱為2齡期，通常蛻皮4次，在5齡期成熟(該成熟狀態的蠶幼蟲也稱為“熟蠶”)。蠶的幼蟲成為熟蠶時，身體變透明，吐絲，形成繭，蛹化。在蛹之后，羽化成為成蟲。
在無細胞系蛋白質合成用反應液含有蠶組織來源的提取物時，作為組織，可以為蠶一生中的任何狀態(卵、幼蟲(1齡期～5齡期)、蛹、成蟲)的任意組織。另外，蠶組織不限于單一狀態下的單一組織(例如只有5齡期的蠶幼蟲中的后部絲腺)，也可以是單一狀態下的多種組織(例如5齡期的蠶幼蟲中的后部絲腺和脂肪體)，也可以是多種狀態下的單一組織(例如3齡期、4齡期、5齡期的各蠶幼蟲中的后部絲腺)。當然也可以是多種狀態下的多種組織。其中，蠶組織不需要是整個蠶組織(例如整個后部絲腺)。
在這里，蠶組織的“絲腺”是指在蠶幼蟲的兩個體側，從位于頭部的下唇頂端的吐出口到盲管連接的一對管狀外分泌腺，大致可分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺。后部絲腺分泌成為絲的中心部的蠶絲蛋白。另外，中部絲腺分泌絲膠蛋白。蠶絲蛋白被蓄積在中部絲腺中，同時絲膠蛋白覆蓋其外周，成為凝膠狀絹物質。該絹物質通過前部絲腺從吐出口被排出，固化成絲。
另外，蠶組織的“脂肪體”是指在蠶幼蟲中，分布在體內所有位置，白色柔軟的扁平帶狀、繩狀或者葉狀的組織。脂肪體類似于人的肝臟，起到營養、儲藏能源的作用，所以在細胞內含有脂肪球、蛋白質、糖原以及其它與新陳代謝有關的各種物質。
另外，“胚”是指蠶的卵的狀態的組織。
另外，在含有蠶組織來源的提取物時，優選為從蠶幼蟲的絲腺、脂肪體和蠶的胚中選擇的至少一種組織來源的提取物。當從蠶幼蟲的絲腺(特別是后部絲腺)進行制備時，存在可以在短時間內合成大量的蛋白質的特別出色的優點。另外，當從蠶幼蟲的脂肪體制備提取液時，因為脂肪體是柔軟的組織，所以優點是可以在短時間內完成磨碎的操作，可以更容易地制備提取液。進而，當從蠶的胚進行制備時，胚是一個個體，所以優點是與其它組織不同，不需要摘取操作，可以更容易地制備提取液。
將蠶作為提取對象時，蠶只要是1齡期～5齡期的幼蟲即可，優選5齡期的幼蟲。這是因為，蠶幼蟲隨著繭的形成期的臨近而組織變成熟，特別是在5齡期的蠶幼蟲中，其組織在1齡期～5齡期中是最成熟的，所以為了得到等量的提取物而需要的數目可以少。其中，如果含有來自5齡期的蠶幼蟲的絲腺或脂肪體(優選5齡期的蠶幼蟲的后部絲腺，更優選5齡期的3天～7天的蠶幼蟲的后部絲腺)的提取物，與其它齡期的組織相比，可以得到能夠在短時間內合成大量蛋白質的無細胞系蛋白質合成用反應液，所以特別優選。
另外，如上所述，在無細胞系蛋白質合成用反應液中含有的節肢動物來源的提取物，也可以是從來源于以往公知的節肢動物的培養細胞中得到的提取物。作為這種培養細胞，已經建立了很多培養細胞株，另外，與很多哺乳動物系的培養細胞不同，不需要在二氧化碳環境下進行培養，即使在無血清培養基中也可以培養，所以優選使用鱗翅目、半翅目等昆蟲來源的培養細胞(昆蟲培養細胞)。昆蟲培養細胞還可以是任何組織來源的細胞，例如可以沒有特別限制地使用血細胞、生殖腺來源細胞、脂肪體來源細胞、胚來源細胞、孵化幼蟲來源細胞等，其中，優選使用蛋白質生產能力高的生殖腺來源的昆蟲培養細胞。特別是可以例示在細胞系中蛋白質合成能力高且在無血清培養基中也可以培養的粉絲夜蛾(Trichoplusia ni)的卵細胞來源的細胞High Five(Invitrogen公司制)或草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細胞來源的細胞Sf21(Invitrogen公司制)作為優選的昆蟲培養細胞。
含有上述節肢動物來源的提取物的無細胞系蛋白質合成用反應液，可以通過如下所述的過程來制備使用以往公知的適當組成的提取用液，制備從節肢動物的組織或培養細胞進行提取操作而得到的提取液(無細胞系蛋白質合成用提取液；提取液＝提取用液+提取物)，適當添加如后所述的翻譯反應所需要的成分，根據不同情況而適當添加翻譯反應和轉錄反應所需要的成分。
作為用于從節肢動物進行提取操作的提取用液，沒有特別限制，但優選至少含有蛋白酶抑制劑。如果使用含有蛋白酶抑制劑的提取用液，節肢動物來源的提取物中含有的蛋白酶的活性被抑制，可以防止由該蛋白酶導致的提取物中的活性蛋白出現不希望的分解，這樣可以有效地引導出節肢動物來源的提取物具有的蛋白質合成能力。作為上述蛋白酶抑制劑，只要是可以抑制蛋白酶的活性的物質，就沒有特別限制，例如可以使用甲苯磺酰氟(phenylmethane sulphonyl fluorid，下面有時稱為“PMSF”)、抑肽酶(aprotinin)、貝他定(bestatin)、亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)A、E-64(L-轉環氧琥珀酰亮氨酰酰胺-4-胍基丁烷L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane)、乙二胺四乙酸、磷酸阿米酮等，節肢動物來源的提取物中大多含有絲氨酸蛋白酶，所以上述中優選使用作為對絲氨酸蛋白酶的特異性高的抑制劑而發揮作用的PMSF。另外，不僅可以使用一種蛋白酶抑制劑，也可以使用多種的混合物(蛋白酶抑制劑混合物)。
對該提取用液中的蛋白酶抑制劑的含量沒有特別限制，但從能夠很好地發揮在無細胞系蛋白質合成中所必須的酶類的分解抑制能力的觀點出發，優選含有1μM～50mM，更優選含有0.01mM～5mM。這是因為，當蛋白酶抑制劑不到1μM時，有不能充分抑制蛋白酶的分解活性的趨勢，另外，當蛋白酶抑制劑超過50mM時，則有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
另外，用于本發明中的提取用液除了上述蛋白酶抑制劑以外，優選至少含有鉀鹽、鎂鹽、DTT和緩沖劑。
作為上述鉀鹽，例如可以以醋酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二鉀、硫酸鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀、苯二甲酸鉀等通常的形態使用，其中，優選使用醋酸鉀。鉀鹽起到蛋白質合成反應中的輔助因子的作用。
對該提取用液中的鉀鹽的含量沒有特別限制，但從保存穩定性的觀點出發，例如在為醋酸鉀等1價鉀鹽的情況下，優選含有10mM～500mM，更優選為含有50mM～300mM。這是因為，鉀鹽如果不到10mM或超過500mM，則蛋白質合成所必需的成分有變得不穩定的趨勢。
作為上述鎂鹽，例如可以以醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂、檸檬酸鎂、磷酸氫鎂、碘化鎂、乳酸鎂、硝酸鎂、草酸鎂等通常的形態使用，其中，優選使用醋酸鎂。鎂鹽也作為蛋白質合成反應中的輔助因子發揮作用。
對該提取用液中的鎂鹽的含量沒有特別限制，從保存穩定性的觀點出發，例如在為醋酸鎂等2價鹽的情況下，優選含有0.1mM～10mM，更優選含有0.5mM～5mM。這是因為，如果鎂鹽不到0.1mM或超過10mM，蛋白質合成所必需的成分有變得不穩定的趨勢。
上述DTT是為了抗氧化而配合的，在該提取用液中優選含有0.1mM～10mM，更優選含有0.5mM～5mM。這是因為，如果DTT不到0.1mM或超過10mM，蛋白質合成所必需的成分有變得不穩定的趨勢。
上述緩沖劑是為了向提取用液賦予緩沖能力而防止如酸性或堿性物質的添加等引起提取液pH急劇變化導致的提取物的變性而配合的。作為這樣的緩沖劑，沒有特別限制，例如可以使用HEPES-KOH、Tris-HCl、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
緩沖劑優選使用將得到的提取液的pH保持在4～10的緩沖劑，更優選使用將pH保持在6.5～8.5的緩沖劑。這是因為，如果提取液的pH不到4或pH超過10，則本發明的反應中必須的成分可能發生變性。從這樣的觀點出發，在上述中特別優選使用HEPES-KOH(pH6.5～8.5)對該提取用液中的緩沖劑的含量沒有特別限制，但從保持適當的緩沖能力的觀點出發，優選含有5mM～200mM，更優選含有10mM～100mM。這是因為，如果緩沖劑不到5mM，酸性或堿性物質的添加會引起pH的急劇變動，有提取物發生變性的趨勢，另外，如果緩沖劑超過200mM，則鹽濃度變得過高，蛋白質合成所必需的成分有變得不穩定的趨勢。
另外，在作為提取對象的節肢動物為昆蟲培養細胞時，如果使用除了含有上述組成還含有氯化鈣和甘油而成的提取用液，可以得到蛋白質合成能力被進一步提高的昆蟲培養細胞提取液，所以優選。
在這種情況下，對氯化鈣的含量沒有特別限制，從能有效地發揮提高上述蛋白質合成能力的效果的觀點出發，優選0.1mM～10mM，更優選0.5mM～5mM。另外，對甘油的添加量沒有特別限制，但從能有效地發揮提高上述蛋白質合成能力的效果的觀點出發，優選將其添加至5(v/v)％～80(v/v)％，更優選添加至10(v/v)％～50(v/v)％。
對從節肢動物的組織或培養細胞提取出提取液的方法沒有特別限制，可以通過以往公知的適當的方法進行。
例如，作為節肢動物來源的提取物，當使用蠶組織來源的提取物或昆蟲培養細胞來源的提取物時，優選使用如上所述的組成的提取用液，按照本發明人等提出的提取方法制備提取液。
以下，分別對各情況進行詳述。
含有蠶組織來源的提取物的提取液的制備方法首先，按照常規方法，例如使用剪刀、鑷子、手術刀等器械，從蠶中摘取需要的組織。作為通過摘取得到的在后述的提取中使用的組織量，沒有特別限制，通常在1g～100g的范圍內。
接著，將摘取出的組織用如液氮凍結之后，在-80℃下凍結的研缽中磨碎，向其中添加上述的提取用液，進行提取操作。
或者，添加上述提取用液之后，也使提取用液凍結，然后用藥匙邊攪拌邊溶解，直至變成果子露(sherbet)狀(具體地說，直至變成濕的黃色涼爽狀態的冰)。然后，重新用液氮完全凍結之后，然后用藥匙邊攪拌邊溶解，直至變成果子露狀(具體地說，直至變成濕的黃色涼爽狀態的冰)。通過這樣的方法，可以有效地提取與蛋白質合成相關的成分，而且可以使其穩定化。
這樣，首先得到含有來自蠶組織的提取物的液狀物。
接著，離心分離在上述提取處理中得到的液狀物。該離心分離是在該領域中通常進行的條件(10,000×g～50,000×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘)下進行的。可以直接使用進行1次該離心分離之后的上清(上清A1)作為提取液，另外，可以在與上述相同的條件下對該上清A1進行再次離心分離，將得到的上清(上清A2)作為提取液。
另外，進一步使用上述提取用液從上述第一次離心分離之后的沉淀進行提取之后，在與上述相同的條件下進行離心分離得到上清(上清A3)，可以混合上述上清A1和上清A3，作為提取液進行制備。通過這樣混合上清A1和上清A3制備提取液，與將上清A1、上清A3單獨作為提取液的情況相比，蛋白質合成效率提高。另外，也可以進一步混合上清A2和上清A3，制備提取液。這樣，上述效果進一步被增強。當然也可以混合上述上清A1～上清A3，制備提取液。
在這種情況下，對制備的混合物(提取液)中的上清A1和/或上清A2(當混合雙方時為其總量)與上清A3的混合比例沒有特別限制，但從蛋白質的合成效率的觀點出發，體積比優選為10∶90～90∶10，更優選為20∶80～80∶20。
此外，也可以在如上所述分別進行制備之后，實施凝膠過濾，從凝膠過濾后的濾液中分取出在280nm下的吸光度最高的組分(fraction)附近，作為提取液進行制備。但是，從蛋白質的合成效率的觀點出發，優選不經過該凝膠過濾和組分的分取(fractionation)而作為提取液進行制備。
此外，在實施了上述凝膠過濾并從凝膠過濾之后的濾液中分取出在280nm下的吸光度最高的組分附近的情況下，具體地說，可以按照下述的步驟進行。
例如，使用脫鹽柱PD-10(Amersham Biosciences公司制)，按照常規方法，在如下所述的條件下進行即，在用凝膠過濾緩沖液平衡化柱之后，供給樣品，用上述提取用液洗脫。上述凝膠過濾用緩沖液優選向上述提取用液中進一步添加甘油而成的液體。通常添加甘油至5(v/v)％～40(v/v)％(優選20(v/v)％)即可。像通常利用凝膠過濾進行的操作那樣，可以將凝膠過濾得到的濾液的0.1mL～1mL作為1個組分，從有效地分取出具有高蛋白質合成能力的組分的觀點出發，優選將0.4mL～0.6mL作為1個組分接著，從凝膠過濾后的濾液分取出在280nm下的吸光度為10以上的組分。該處理使用例如Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等儀器，對各組分在上述280nm下的吸光度進行測定，分取出其吸光度最高的組分附近，將其作為提取液。
含有昆蟲培養細胞來源的提取物的提取液的制備方法在從昆蟲培養細胞制備提取液的情況下，優選通過本發明人等提出的、至少含有使懸浮在提取用液中的昆蟲培養細胞急劇凍結的工序的方法進行制備。在這里，“急劇地凍結”是指從交付凍結處理后的10秒以下、優選2秒以下，使昆蟲培養細胞凍結。另外，作為使昆蟲培養細胞急劇凍結的溫度，通常為-80℃以下，優選為-150℃以下。上述昆蟲培養細胞的急劇凍結，例如可以通過使用液氮或液氦等惰性氣體等來實現，優選使用容易得到且廉價的液氮進行凍結。
通過利用該方法從昆蟲培養細胞進行提取，可以在溫和的狀態下破碎細胞，可以在不破壞無細胞系蛋白質合成所必需的成分的情況下取出到細胞外，可以容易地制備蛋白質的合成量比以往更高的無細胞系蛋白質合成用提取液。進而，還可以防止混入來自使用器具等的RNA酶(RNase)等，另外，在是使用了界面活性劑等試劑的細胞破碎法的情況下，不會帶入有可能抑制翻譯反應之類的物質。
在上述本發明人等提出的提取液的制備方法中，如果至少包括上述急劇凍結的工序，則對其它工序沒有特別限制。例如，可以通過在研缽中使用研杵磨碎的方法、使用杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠(glass beads)的方法等在從大腸桿菌或小麥胚芽等得到無細胞系蛋白質合成用提取液時一直應用的各種手段，破碎昆蟲培養細胞，進行提取。其中，優選通過急劇地凍結上述昆蟲培養細胞之后，解凍，離心分離，來破碎昆蟲培養細胞。
在對上述已急劇凍結的昆蟲培養細胞進行解凍之后，進行離心分離時，解凍可以通過例如在-10℃～20℃的水浴或冰水浴中的解凍、在室溫(25℃)下的放置等實現，但為了防止蛋白質合成所必需的成分失活，確實可靠地防止蛋白質合成能力的降低，優選在0℃～20℃(特別是4℃～10℃)的水浴或冰水浴中進行解凍。已解凍的昆蟲培養細胞的離心分離可以在該區域通常進行的條件下(10,000×g～50,00×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘)下進行。在該離心分離后的上清中含有需要的昆蟲培養細胞的提取物。
細胞破碎之后，可以直接將上述離心分離之后的上清(上清B1)作為提取液，也可以將上清B1進一步離心分離(10,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分鐘～120分鐘)得到的上清(上清B2)作為提取液。進而，可以凝膠過濾上述上清B1或上清B2，從凝膠過濾后的濾液分取出280nm下的吸光度為10以上的組分(吸收大的組分)，將其作為提取液。在這種情況下，具體按照以下步驟進行。
首先，對上清B1或上清B2進行凝膠過濾，凝膠過濾可以適當使用例如脫鹽柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)，按照常規方法，在如下所述的條件下進行即可即，在用凝膠過濾用緩沖液平衡化柱之后，供給樣品，用上述凝膠過濾用緩沖液洗脫。作為上述凝膠過濾用緩沖液，可以沒有特別限制地使用以往公知的適當組成的緩沖液，例如可以使用含有10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6.5～8.5)、50mM～300mM的醋酸鉀、0.5mM～5mM的醋酸鎂、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF的凝膠過濾用緩沖液。凝膠過濾得到的濾液，可以像用通常的凝膠過濾進行操作那樣，將0.1mL～1mL作為1個組分，從有效地分取具有高蛋白質合成能力的組分的觀點出發，優選將0.4mL～0.6mL作為1個組分。
接著，例如使用Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等儀器，從凝膠過濾后的濾液分取出280nm下的吸光度為30以上的組分(吸收大的組分)，將其作為提取液。
另外，也可以進一步離心分離在上述凝膠過濾中得到的吸收大的組分，將得到的上清(上清B3)作為提取液。從除去抑制翻譯反應的不溶性的成分的理由出發，該凝膠過濾后的離心分離優選在30,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘的條件下進行。
此外，就供于本發明的制備方法的昆蟲培養細胞而言，為了避免帶入到在培養中使用的培養基的翻譯反應液中，在進行上述急劇凍結之前，不含有蛋白酶抑制劑和甘油，除此之外，優選預先用組成與上述昆蟲培養細胞用的適當提取用液相同的清洗液進行清洗。用清洗液的清洗是通過向昆蟲培養細胞中添加清洗液并對其進行離心分離(例如，700×g、10分鐘、4℃的條件)而進行的。為了完全地沖走培養基，清洗中使用的清洗液的量相對濕重1g的昆蟲培養細胞優選為5mL～100mL，更優選10mL～50mL。清洗次數優選進行1次～5次，更優選進行2次～4次。
對本發明的提取液中的節肢動物來源的提取物的含量沒有特別限制，優選以蛋白質濃度計為1mg/mL～200mg/mL，其中，更優選10mg/mL～100mg/mL。這是因為，該提取物的含量如果以蛋白質濃度計不到1mg/mL，無細胞系蛋白質合成所必需的成分的濃度變低，不能進行充分的合成反應，另外，還因為該提取物的含量如果以蛋白質濃度計超過200mg/mL，提取液自身具有高粘性，有可能難以操作。
此外，含有上述范圍的量的節肢動物來源的提取物的提取液，可以利用提取液的蛋白質濃度測定來制備。如同在該領域中通常進行的那樣，該蛋白質濃度測定例如按照如下步驟進行即，使用BCA蛋白質檢測試劑盒(Protein assay Kit)(PIERCE公司制)，相對2mL反應試劑，加入0.1mL樣品，在37℃下反應30分鐘，測定562nm下的吸光度。使用分光光度計(Ultrospec3300pro，Amersham Bioscience公司制)，測定562nm下的吸光度。作為對照，通常使用牛血清白蛋白(BSA)。
在無細胞系蛋白質合成方法中，例如使用如上所述制備而成的提取液，制備翻譯系用反應液或轉錄/翻譯系用反應液。在是翻譯系用反應液、轉錄/翻譯系用反應液的任何情況下，均優選制備成含有上述提取液10(v/v)％～80(v/v)％、特別是30(v/v)％～60(v/v)％。即，在整個反應液中，節肢動物來源的提取物的含量優選被制備成以蛋白質濃度計為0.1mg/mL～160mg/mL，更優選制備成3mg/mL～60mg/mL。該提取物的含量如果以蛋白質濃度計不到0.1mg/mL或超過160mg/mL，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
以下將使用含有節肢動物來源的提取物的提取液的情況作為例子，對(1)翻譯系用反應液、(2)轉錄/翻譯系用反應液，分別進行說明。在使用含有節肢動物來源的提取物以外的提取物的提取液時，根據其來源適當設定必要的試劑或反應條件。
(1)翻譯系用反應液作為除了上述節肢動物來源提取液以外的成分，翻譯系用反應液優選至少含有翻譯模板、鉀鹽、鎂鹽、DTT、三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分、RNA酶抑制劑、tRNA、緩沖劑，為了實現本發明的目的即蛋白質的翻譯后修飾，含有微粒體膜，更具體地說是含有后述的節肢動物來源的微粒體膜。通過使用該翻譯系用反應液進行翻譯系合成反應，可以在短時間內合成大量的蛋白質。
就在翻譯系用反應液中含有的翻譯模板(mRNA)而言，對其堿基數沒有特別限制，只要可以合成目的蛋白質，所有mRNA不是相同的堿基數也可以。另外，只要序列與可以合成目的蛋白質的程度相同，各mRNA可以是缺失、置換、插入或附加幾個堿基的mRNA。mRNA可以用以往公知的適當的方法轉錄模板DNA(其制備如后所述)來制備，優選通過本身公知的體外(in vitro)轉錄來轉錄并制備模板DNA。體外轉錄例如可以利用RiboMax大規模RNA生產系統-T7(RiboMax Large Scale RNAproduction System-T7)(Promega公司制)等進行。mRNA在轉錄后利用本身公知的方法純化并分離，如后所述，可以作為無細胞系蛋白質合成用的翻譯模板用于翻譯系用反應液中。
在翻譯系用反應液中，從蛋白質合成的速度的觀點出發，翻譯模板優選含有翻譯模板1μg/mL～2000μg/mL，更優選含有10μg/mL～1000μg/mL。如果mRNA不到1μg/mL或超過2000μg/mL，蛋白質合成的速度有降低的趨勢。
在翻譯系用反應液中，從蛋白質的翻譯后的修飾效率的觀點出發，含有的節肢動物來源的微粒體膜在260nm的吸光度(以后稱為A260)為1～50(A260＝1～50)，優選為2～15(A260＝2～15)。這是因為，當微粒體膜在A260不到1時，翻譯后修飾有進行不充分的趨勢，如果超過50，有顯著抑制蛋白質合成本身的趨勢。進而，從蛋白質的翻譯后修飾效率的觀點出發，在翻譯反應液中，最好mRNA濃度(μg/mL)與節肢動物來源的微粒體膜濃度(A260)的比值為1∶0.1～5，優選0.3～2.3。
在求得mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值時的節肢動物來源的微粒體膜的純度，通常為A260/A280＝1.3～2.0，優選為1.4～1.8。該比值為1∶0.1～5(優選為0.3～2.3)是指反應液1mL中存在1μg mRNA時，微粒體膜的濃度在A260下為0.1～5(優選為0.3～2.3)。
該微粒體膜優選在翻譯開始時存在于反應液中，也可以根據需要適當調節其添加時期。
作為節肢動物來源的微粒體膜，是昆蟲組織(特別是蠶組織)、昆蟲培養細胞(特別是粉絲夜蛾卵細胞、草地夜蛾卵巢細胞)來源，只要是不失去微粒體膜的活性的方法即可，對其制備方法沒有限制，例如，基本上可以是基于Walter，P和Blobel，G的方法(酶學(Enzymol.96，pp.84-93，1983年)的方法，通過利用蔗糖密度梯度的超速離心分離而制備。即，將每1g昆蟲組織、或利用離心分離收集的昆蟲培養細胞懸浮于1～10ml的微粒體膜提取用液(提取液的組成可以根據使用的組織或細胞的種類適當變更)，然后，利用勻漿器(homonizer)(優選杜恩斯勻漿器)處理來破碎細胞。破碎后，通過離心分離等，除去細胞殘渣，回收上清。通過利用蔗糖密度梯度的超速離心分離，從已回收的上清分離出微粒體膜組分。更具體的制備方法在實施例中描述。
作為翻譯系用反應液中的鉀鹽，可以使用上述各種鉀鹽、優選醋酸鉀作為提取用液的成分。從與上述提取用液中的鉀鹽的情況相同的觀點出發，在該翻譯系用反應液中，優選含有鉀鹽10mM～500mM，更優選含有50mM～150mM。
作為翻譯系用反應液中的鎂鹽，可以優選使用上述各種鎂鹽、優選醋酸鎂作為提取用液的成分。從與上述提取用液中的鎂鹽的情況相同的觀點出發，在該翻譯系用反應液中，優選含有鎂鹽0.1mM～10mM，更優選含有0.5mM～3mM。
從與上述提取用液中的DTT的情況相同的觀點出發，翻譯系用反應液中的DTT優選含有0.1mM～10mM，更優選含有0.2mM～5mM。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，翻譯系用反應液中的三磷酸腺苷(以下有時稱為“ATP”)優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，ATP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，翻譯系用反應液中的三磷酸鳥苷(以下有時稱為“GTP”)優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，GTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質合成速度有降低的趨勢。
翻譯系反應液中的磷酸肌酸是用于持續合成蛋白質的成分，是為了再生ATP和GTP而配合的。從蛋白質合成的速度的觀點出發，優選在該反應液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更優選含有10mM～100mM。這是因為，磷酸肌酸如果不到1mM，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結果蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為磷酸肌酸如果超過200mM，起到抑制物質的作用，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應液中的肌酸激酶是用于持續合成蛋白質的成分，其配合目的是與磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。從蛋白質的合成速度的觀點出發，優選在該反應液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更優選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，肌酸激酶如果不到1μg/mL，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結果蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為肌酸激酶如果超過1000μg/mL，則起到抑制物質的作用，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應液中的氨基酸成分至少含有20種氨基酸，即纈氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20種氨基酸。在該氨基酸中也含有放射性同位素標記了的氨基酸。進而，根據需要，也可以含有修飾氨基酸。該氨基酸成分通常是以大致等量含有各種氨基酸而成的。
在本發明中，從蛋白質合成的速度的觀點出發，在該反應液中，優選含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更優選含有10μM～200μM。這是因為，氨基酸成分如果不到1μM或超過1000μM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應液的中RNA酶抑制劑，是為了防止提取液中混在的節肢動物來源的RNA酶在無細胞系蛋白質合成時消化mRNA或tRNA而妨礙蛋白質的合成而配合的，在該反應液中優選含有0.1U/μL～100U/μL，更優選含有1U/μL～10U/μL。這是因為，RNA酶抑制劑如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趨勢，另外，還因為RNA酶抑制劑如果超過100U/μL，有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
翻譯系用反應液中的tRNA是以大致等量含有與上述20種氨基酸的種類對應的tRNA而成的。在本發明中，從蛋白質合成的速度的觀點出發，在該反應液中優選含有1μg/mL～1000μg/mL，更優選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，tRNA如果不到1μg/mL或超過1000μg/mL，蛋白質合成的速度有降低的趨勢。
作為翻譯系用反應液中含有的緩沖劑，可以優選使用與上述用于提取用液的緩沖劑相同的緩沖劑，由于相同的原因，優選使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，從與上述提取用液中的緩沖劑的情況相同的觀點出發，優選含有緩沖劑5mM～200mM，更優選含有10mM～50mM。
另外，翻譯系用反應液更優選進一步添加甘油。這是因為，如果添加甘油，在翻譯系合成反應中，可以穩定化蛋白質合成所必需的成分。添加甘油時，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。
進而，翻譯系用反應液優選含有乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四醋酸(以下有時稱為“EGTA”)。這是因為，如果含有EGTA，通過EGTA與提取液中的金屬離子形成螯合物而使核糖核酸酶、蛋白酶等失活，這樣可以抑制無細胞系蛋白質合成所必需的成分發生分解。從能夠很好地發揮上述分解抑制能力的觀點出發，該EGTA在上述反應液中優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，EGTA如果不到0.01mM，則有不能充分抑制必須成分的分解活性的趨勢，還因為如果超過10mM，則有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
即，作為翻譯系用反應液，優選在含有含節肢動物來源提取物的提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同時，含有50mM～150mM的醋酸鉀、0.5mM～3mM的醋酸鎂、0.2mM～5mM的DTT、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～200μM的氨基酸成分、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制劑、10μg/mL～500μg/mL的tRNA、10μg/mL～100μg/mL的翻譯模板、翻譯系反應液中在A260下為1～50的哺乳動物微粒體膜(與翻譯模板的濃度比為mRNA(μg/mL)∶微粒體膜濃度(A260)＝1∶0.1～5)、10mM～50mM的HEPES-KOH(pH6～8)而實現的。
另外，除了上述，更優選還含有0.1mM～5mM的EGTA而實現。
使用了上述翻譯系用反應液的無細胞系蛋白質合成反應(翻譯系合成反應)，在以往公知的如低溫恒溫槽中進行。反應溫度通常在10℃～40℃、優選在20℃～30℃的范圍內。這是因為，反應溫度如果不到10℃，蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為反應溫度如果超過40℃，必需的成分有變性的趨勢。反應的時間通常為1小時～72小時，優選3小時～24小時。
(2)轉錄/翻譯系用反應液作為除了上述提取液之外的成分，轉錄/翻譯系用反應液優選至少含有轉錄模板、RNA聚合酶、ATP、GTP、胞苷5’-三磷酸、尿苷5’-三磷酸、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分和tRNA，為了實現作為本發明的目的的對蛋白質的翻譯后修飾，含有微粒體膜，更具體地說含有節肢動物來源的微粒體膜。通過使用該轉錄/翻譯系用反應液進行轉錄/翻譯系合成反應，可以在短時間內合成大量的蛋白質。
此外，轉錄模板(模板DNA)只要至少含有啟動子序列和編碼蛋白質的結構基因，就可以是任意堿基序列、堿基數的模板。對結構基因編碼的蛋白質(包括肽)沒有特別限制，也可以具有對在活細胞中成為細胞毒的蛋白質進行編碼的堿基序列，另外，也可以具有編碼糖蛋白質的堿基序列。在模板DNA中，通常啟動子序列被配置在結構基因的5’上游側。作為啟動子序列，例如可以舉出以往公知的T7啟動子序列、SP6啟動子序列、T3啟動子序列等。
另外，本發明的模板DNA優選在結構基因的3’下游側具有終止子(terminator)序列。作為上述終止子序列，例如可以舉出以往公知的T7終止子序列、SP6終止子序列、T3終止子序列等。另外，從已合成的mRNA的穩定性等觀點出發，模板DNA也可以在結構基因的3’下游側具有多聚A序列。
該模板DNA也可以通過至少含有(1)連接已預先被分隔成多個區域的模板DNA的工序、(2)利用PCR對連接后的DNA進行擴增的工序的方法來合成。在這里，就區域的數量而言，可以通過一系列的連接反應和隨后的PCR被接合并擴增的區域為2個，為了進一步接合和擴增其它區域，必須進一步進行一系列的連接和PCR，所以優選被分隔為盡可能少的區域。該區域數優選為2個～5個，更優選為2個～3個，特別優選為2個。模板DNA被預先分隔，是為了在該模板DNA中不擴增區域內沒有的堿基序列部分、或在各區域中彼此重復的堿基序列部分，換言之，接合整個區域而成為模板DNA。已分隔的各區域可以是質粒DNA已被限制性酶切斷并制備而成的DNA，也可以是利用PCR擴增成的DNA，也可以是利用DNA合成機合成的DNA。
首先，在已預先分隔模板DNA的區域中，使彼此鄰接的區域連接。在進行連接反應時，最好將DNA的末端制備成雙方的DNA可以順向連結。具體地說，將要接合的兩個DNA的末端制備成平滑末端。或者是用相同的限制性酶切斷的片斷。另外，也可以通過T4多核苷酸激酶磷酸化一方DNA的末端，制備成可以有效連接的狀態。連接時使用的試劑或反應條件可以按照在該領域通常實施的條件進行。例如，使用NEB公司制快速連接試劑盒(Quick Ligation Kit)，按照流程(protocol)，混合DNA、反應緩沖液、快速T4連接酶，在25℃下孵育5分鐘即可。
接著，利用PCR擴增上述連接后的DNA。PCR可以沒有特別限制地使用市售的PCR用熱循環機(thermal cycler)等以往公知的裝置來進行。對PCR的條件沒有特別限制，在該領域中通常實施的條件下進行即可。例如使用東洋紡織公司制KOD plus，按照其流程即可。此時使用的引物使用以需要擴增的DNA的端部的序列為基礎制作的正義引物和反義引物。這樣，通過連接產生多種接合的DNA，但PCR只擴增需要的DNA。
進而，當模板DNA被分為3個以上的區域時，使用在上述PCR中擴增了的DNA和進一步接合的DNA，進行連接、PCR，制備模板DNA。
另外，本發明中的模板DNA優選進一步具有有促翻譯反應活性的序列(以下有時稱為“促翻譯反應序列”)。在此，“促翻譯反應序列”是指通過使用具有該促翻譯反應序列的模板DNA來進行無細胞系蛋白質合成反應，與使用沒有該促翻譯反應序列的模板DNA進行無細胞系蛋白質合成反應的情況相比，翻譯效率被提高到1.2倍以上(優選2倍以上)的序列。
作為該促翻譯反應活性序列，可以適當使用如上所述的具有促翻譯反應活性的公知的序列，沒有特別限制。作為促翻譯反應活性序列的具體例子，是蠶或桿狀病毒(baculovirus)中作為5’非翻譯區(5’UTR)公知的堿基序列。具體而言，可以舉出蠶的蠶絲蛋白L鏈基因的5’UTR的堿基序列、蠶的絲膠蛋白基因的5’UTR的堿基序列、AcNPV(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、BmCPV(家蠶胞質型多角體病毒Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、EsCPV(Euxoa scandes胞質型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、HcNPV(Hyphantria cunea核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、CrNPV(Choristoneura rosaceana核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、EoNPV(Ecotropis oblique核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、MnNPV(Malacosma neustria核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、SfNPV(草地夜蛾核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、WsNPV(Wiseana signata核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列等。這些促翻譯反應序列可以利用以往公知的任何方法得到。例如，可以使用公知的DNA合成機進行合成。
上述促翻譯反應序列優選在模板DNA中被一個或幾個結合(introduce into)到上述結構基因的5’上游側。促翻譯反應序列在結構基因的5’上游側可以按照順向(5’→3’)結合，也可以按逆向(3’→5’)結合。另外，也可以結合兩個以上的促翻譯反應序列，在這種情況下，結合的促翻譯反應序列可以相同，也可以彼此不同。另外，當結合兩個以上促翻譯反應序列時，也可以不是全部促翻譯反應序列向相同的方向結合。促翻譯反應序列也可以在結構基因的5’上游側被結合成為與結構基因鄰接，也可以以與結構基因之間存在一個堿基以上的堿基序列的狀態進行結合。
進而，該模板除了上述序列以外，也可以導入需要的序列。具體而言，當純化已接受翻譯后修飾的蛋白質而在以后的實驗等中使用時，可以導入適當的序列。例如，有時優選進行純化以便容易進行交付電泳之前的SDS化。在利用鎳柱等進行純化的情況下，在該模板DNA上附加His-tag。
在轉錄/翻譯系用反應液中優選含有轉錄模板0.1μg/mL～8000μg/mL，更優選含有3μg/mL～600μg/mL。這是因為，如果轉錄模板不到0.1μg/mL或超過8000μg/mL時，蛋白質合成的速度有降低的趨勢。
在轉錄/翻譯系用反應液中，從蛋白質的翻譯后的修飾效率的觀點出發，節肢動物來源的微粒體膜在A260下含有1～50(A260＝1～50)，優選含有2～15(A260＝2～15)。這是因為，如果微粒體膜在A260下不到1，有不能充分進行翻譯后修飾的趨勢，如果超過50，會存在顯著抑制蛋白質合成本身的趨勢。進而，從蛋白質的翻譯后的修飾效率的觀點出發，在翻譯反應液中，最好mRNA濃度(μg/mL)和哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5，優選為0.3～2.3。
作為節肢動物來源微粒體膜，與在上述翻譯系用反應液中使用的相同，可以通過相同的制備方法利用。
在轉錄/翻譯系用反應液中使用的RNA聚合酶，可以根據轉錄模板具有的啟動子序列適當選擇。例如，當轉錄模板具有T7啟動子序列時，優選使用識別該序列的T7 RNA聚合酶。另外，當轉錄模板具有SP6或T3啟動子序列時，優選分別使用SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。
從mRNA合成的速度和蛋白質合成的速度的觀點出發，優選在轉錄/翻譯系用反應液中含有RNA聚合酶0.01U/μL～100U/μL，更優選含有0.1U/μL～10U/μL。這是因為，當RNA聚合酶不到0.01U/μL時，mRNA的合成量變少，蛋白質合成的速度有降低的趨勢，另外，還因為當RNA聚合酶超過100U/μL時，有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，轉錄/翻譯系用反應液中的ATP優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，ATP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，轉錄/翻譯系用反應液中的GTP優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，GTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，轉錄/翻譯系用反應液中的胞苷5’-三磷酸(下面有時稱為“CTP”)優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mm～5mM。這是因為，CTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，轉錄/翻譯系用反應液中的尿苷5’-三磷酸(下面有時稱為“UTP”)優選含有0.01mM～10mM，更優選含有0.1mM～5mM。這是因為，UTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中的磷酸肌酸是用于持續合成蛋白質的成分，配合目的是再生ATP和GTP。從蛋白質合成的速度的觀點出發，優選在轉錄/翻譯系用反應液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更優選含有10mM～100mM。這是因為，磷酸肌酸如果不到1mM，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結果蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為磷酸肌酸如果超過200mM，則成為抑制物質，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中的肌酸激酶是用于持續合成蛋白質的成分，配合目的是與磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。從蛋白質合成的速度的觀點出發，優選在轉錄/翻譯系用反應液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更優選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，肌酸激酶如果不到1μg/mL，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結果蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為肌酸激酶如果超過1000μg/mL，則成為抑制物質，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中的氨基酸成分至少含有20種氨基酸，即纈氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20種氨基酸。該氨基酸中也含有放射性同位素標記的氨基酸。進而，根據需要，也可以含有修飾氨基酸。該氨基酸成分通常分別大致等量含有各種氨基酸而成。
從蛋白質合成的速度的觀點出發，轉錄/翻譯系用反應液中優選含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更優選含有10μM～500μM。這是因為，氨基酸成分如果不到1μM或超過1000μM，蛋白質的合成速度有降低的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中的tRNA是大致等量含有與上述20種氨基酸的種類對應的tRNA而成的。從蛋白質合成的速度的觀點出發，在轉錄/翻譯系用反應液中tRNA優選含有1μg/mL～1000μg/mL，更優選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，tRNA如果不到1μg/mL或超過1000μg/mL，蛋白質合成的速度有降低的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中優選進一步含有鉀鹽、鎂鹽、DTT、RNA酶抑制劑、亞精胺和緩沖劑。
作為轉錄/翻譯系用反應液中的鉀鹽，可以優選使用上述各種鉀鹽、優選醋酸鉀作為提取用液的成分。從與上述提取用液中鉀鹽的情況相同的觀點出發，在該轉錄/翻譯系用反應液中，優選含有鉀鹽10mM～500mM，更優選含有50mM～150mM。
作為轉錄/翻譯系用反應液中的鎂鹽，可以優選使用上述各種鎂鹽、優選醋酸鎂作為提取用液的成分。從與上述提取用液中鎂鹽的情況相同的觀點出發，在該轉錄/翻譯系用反應液中，優選含有鎂鹽0.1mM～10mM，更優選含有0.5mM～3mM。
轉錄/翻譯系用反應液中的DTT是為了防止氧化而配合的物質，在該反應液中優選含有0.1mM～100mM，更優選含有0.2mM～20mM。這是因為，DTT如果不到0.1mM或超過100mM，蛋白質合成所必需的成分有變得不穩定的趨勢。
轉錄/翻譯系用反應液中的RNA酶抑制劑是為了防止在提取液中混在的節肢動物來源的RNA酶在轉錄/翻譯系合成反應時不希望地消化mRNA或tRNA而妨礙蛋白質的合成而添加的，在該反應液中優選含有0.1U/μL～100U/μL，更優選含有1U/μL～10U/μL。這是因為，RNA酶抑制劑如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趨勢，另外，還因為RNA酶抑制劑如果超過100U/μL，有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
上述亞精胺是為了促進在轉錄中的延伸反應而添加的，在轉錄/翻譯系用反應液中優選含有0.01mM～100mM，更優選含有0.05mM～10mM。這是因為，亞精胺如果不到0.01mM，mRNA的合成速度有降低，生成的mRNA的量變少，結果蛋白質合成的速度有降低的趨勢，另外，還因為亞精胺如果超過100mM，有抑制蛋白質合成反應的趨勢。
作為轉錄/翻譯系用反應液中含有的緩沖劑，可以適當使用與上述用于提取用液的緩沖劑相同的緩沖劑，由于相同的原因，優選使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，從與上述提取用液中的緩沖劑的情況相同的觀點出發，優選含有緩沖劑1mM～200mM，更優選含有5mM～50mM。
另外，轉錄/翻譯系用反應液更優選進一步添加甘油。這是因為，如果添加甘油，在轉錄/翻譯系合成反應中，存在可以穩定化蛋白質合成所必需的成分的優點。添加甘油時，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。
即，作為轉錄/翻譯系用反應液，優選在含有該提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同時，還含有3μg/mL～600μg/mL的轉錄模板、轉錄/翻譯系反應液中在A260下為1～50的哺乳動物微粒體膜(與翻譯模板的最終濃度比值為mRNA(μg/mL)∶微粒體膜濃度(A260)＝1∶0.1～0.5的量)、0.1U/μL～10U/μL的RNA聚合酶、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、0.1mM～5mM的CTP、0.1mM～5mM的UTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～500μM的氨基酸成分、10μg/mL～500μg/mL的tRNA。進而，優選含有50mM～150mM的醋酸鉀、0.5mM～3mM的醋酸鎂、0.2mM～20mM的DTT、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制劑、0.05mM～10mM的亞精胺、5mM～50mM的HEPES-KOH(pH7.4)、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油來實現。
對于使用了上述轉錄/翻譯系用反應液的無細胞系蛋白質合成反應(轉錄/翻譯系合成反應)，與上述翻譯系用反應液的情況相同，可以在以往公知的如低溫恒溫槽中進行。轉錄工序的反應溫度通常在10℃～60℃、優選在20℃～50℃的范圍內。這是因為，轉錄工序的反應溫度如果不到10℃，轉錄的速度有降低的趨勢，另外轉錄工序的反應溫度如果超過60℃，反應所必需的成分有變性的趨勢。另外，翻譯工序的溫度通常在10℃～40℃，優選在20℃～30℃的范圍內。這是因為，翻譯工序的反應溫度如果不到10℃，蛋白質的合成速度有降低的趨勢，另外翻譯工序的反應溫度如果超過40℃，反應所必需的成分有變性的趨勢。
在轉錄/翻譯系合成反應中，從可以連續實施轉錄/翻譯工序的觀點出發，特別優選以對兩個工序較適合的20℃～30℃的范圍進行反應。整個工序加在一起的反應的時間為1小時～72小時，優選為3小時～24小時。
對可以使用上述翻譯系用反應液、轉錄/翻譯系用反應液合成的蛋白質，沒有特別限制，鑒于本發明的目的，優選進行翻譯后的修飾的蛋白質。合成的蛋白質的量可以通過酶的活性測定、SDS-PAGE、免疫檢測法等進行測定。可以通過將已合成的蛋白質供給到SDS-PAGE、熒光顯影(fluorography)，根據在微粒體膜存在下、不存在下的分子量的變化或對蛋白酶處理的敏感性，來判定是否恰當地進行了翻譯后的修飾。
實施例下面利用實施例對本發明進一步詳細說明，但這些實施例不對本發明有任何限定。
(1)表達質粒的制備在翻譯后修飾中，將糖鏈修飾(N-糖基化)作為模型，使用已知產生糖鏈修飾的pro-TNF-GLC(在蛋白質的成熟區域內人為地導入N-糖基化部位的突變型人抗腫瘤因子)，嘗試該糖蛋白質的體外合成。圖1表示構建的表達質粒的模式圖。另外，將使用的多角體蛋白5’-UTR的堿基序列表示為序列號1，將pro-TNF-GLC基因的全堿基序列表示為序列號2。
表達質粒的構建是通過將pTNT載體(Promega公司制)作為模板，使用在序列號3和序列號4所示的堿基序列的末端附加了BamHI位點的PCR引物，在BamHI消化后進行自身連接(selfligation)，由此在多克隆位點的XhoI位點的前方導入BamHI位點。進而，使用在序列號5和6顯示堿基序列的PCR引物，進行PCR，在HindIII消化后進行自身連接，由此將在pTNT載體中原本存在的緊鄰T7終止子序列后方的BamHI位點變為HindIII位點。接著，利用PCR，從BamHI位點到T7啟動子進行擴增，將此間合成如上所述的多角體蛋白5’-UTR的正義鏈和反義鏈并使其退火后的產物作為插入片斷而使其連接，這樣，構建改變(modified)型pTNT載體。退火的插入序列制備方法如下所述進行。利用T4多核苷酸激酶(TOYOBO公司制)對已合成的正義鏈、反義鏈進行5’末端磷酸化。反應后，混合正義鏈和反義鏈，95℃、熱處理5分鐘。將其靜置直至達到室溫，進行退火。利用乙醇沉淀進行純化后，使其溶解于水中。利用SigmaSpin后反應純化柱(SigmaSpin Post Reaction Purification Column)(Sigma公司制)，除去過剩的ATP之后，再次用乙醇沉淀進行純化。
接著，用BamHI-EcoRI消化該改變型pTNT載體，同樣用BamHI-EcoRI消化已在pBluescript載體的BamHI-EcoRI位點導入pro-TNFGLC cDNA的質粒，得到約0.7Kb的DNA片斷(pro-TNF-GLC cDNA)，將該DNA片斷作為插入片斷與該改變型pTNT載體連接，構建體外pro-TNF-GLC基因轉錄用質粒-I。
另外，還制作已在轉錄用質粒-I內的pro-TNF GLC的下游插入組氨酸標簽的體外pro-TNF GLC基因轉錄用質粒-II。就轉錄用質粒-II而言，在用SmaI消化改變型pTNT載體之后，將此間合成序列號7中記載的組氨酸標簽的正義鏈、反義鏈并使其退火產生的產物作為插入片斷，使其連接，由此構建改變型pTNT載體(His-Tag)。用BamHI-EcoRI消化該載體，將轉錄用質粒-I作為模板，使用在序列號8和序列號9中記載的PCR引物并擴增，得到約0.7Kb的DNA片斷，將其作為插入片斷并進行連接，由此制作。
全部PCR條件是使用KOD-plus(TOYOBO公司制)，在96℃下使模板DNA變性2分鐘，然后進行96℃15秒、50℃30秒、68℃5分鐘的循環反應30次。
已構建的質粒的堿基序列是將DNA 250ng作為模板，使用大染料終止子循環測序FS快速反應試劑盒(Big Dye Terminator Cycle Sequence FSReady Reaction Kit)(ABI公司制)，進行PCR(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分鐘、25個循環反應)，用ABI PRISM310遺傳分析器(GeneticAnalyzer)(ABI公司制)對反應液進行解析。
全部連接樣品在使用Ligation High(TOYOBO公司制)進行連接之后，轉化大腸桿菌DH5α(TOYOBO公司制)，利用堿-SDS法從轉化后的大腸桿菌制備質粒，進行DNA堿基序列的解析。
(2)體外轉錄反應和mRNA的純化用HindIII消化已在上述(1)中制備的質粒之后，利用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀進行純化。將得到的1μg DNA作為模板，使用RiboMax大規模RNA生產系統-T7(Promega公司制)，以20μL體系(scale)，37℃、4小時合成mRNA。反應后，添加1U的RQ1無RNA酶DNA酶(RNase Free DNase)(Promega公司制)，在37℃下孵育15分鐘，消化模板DNA。在利用苯酚-氯仿抽提除去蛋白質之后，進行乙醇沉淀。將得到的沉淀溶解于100μl滅菌水中，用NICK柱(Amersham公司制)進行純化，然后再次進行乙醇沉淀，用滅菌水溶解使其最終為A260/A280＝1.8～2.0、RNA濃度為2mg/mL。直接將這樣制備的mRNA用于無細胞系蛋白質合成。從轉錄用質粒-I轉錄得到的產物稱為mRNA-I、從轉錄用質粒-II轉錄得到的產物稱為mRNA-II。
(3)來自昆蟲培養細胞High Five、Sf21的微粒體膜制備方法(3-1)昆蟲培養細胞High Five以及Sf21的培養細胞數2.1×107個的昆蟲培養細胞High Five(Invitrogen公司制)，在已放入添加了L-谷氨酰胺的Express Five(Invitrogen公司制)無血清培養基的培養瓶(600cm2)內，27℃培養6天。結果變為細胞數1.0×108個、濕重1.2g。
用Sf-900IISFM(Invitrogen公司制)無血清培養基，在27℃下培養昆蟲培養細胞Sf21(Invitrogen公司制)。在125ml三角燒瓶內的培養基50ml中，在27℃、130rpm下，懸浮培養每1ml培養基細胞數為6.0×105個的Sf21，培養5天，結果變為細胞數1.0×108個、濕重3g。
(3-2)微粒體膜制備方法來自昆蟲培養細胞High Five和Sf21的微粒體膜的制備，基本上以Walter，P和Blobel，G(1983)，酶學(Enzymol.)96，pp.84-93等的方法為基礎，通過利用蔗糖密度梯度的超速離心分離來制備。即，收集在上述(3-1)中培養的昆蟲培養細胞，用下述提取用液清洗1次(700×g、4℃、10分鐘的離心條件)，然后將每1g培養細胞懸浮于4ml的提取用液中。
30mM HEPES-KOH(pH7.9)、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、0.25mMEGTA、250mM蔗糖、2mM DTT、0.5mM PMSF 40mM HEPES-KOH(pH7.9)、100mM KOAc、1.5mM Mg(OAc)2、0.1mMEGTA、250mM蔗糖、2mM DTT、0.5mM PMSF懸浮后，通過將緊密安裝的杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)來回20次，破碎細胞。破碎后，100×g、4℃、10分鐘離心分離，除去細胞殘渣，回收上清。通過利用蔗糖的密度梯度的超速離心分離，從該上清中分離出微粒體膜組分。超速離心分離時，以1∶3的體積比(v/v)，從容器下方開始，按照順序，裝含有1.3M的蔗糖的提取用液和前面回收的上清。140000×g、4℃、2.5小時超速離心分離(使用HITACHI公司制超速離心分離機CP80MX和搖擺轉子(swing roter)P40ST)該樣品。超速離心分離后，棄去全部上清，每1g開始時的細胞濕重，用100μl的提取用液靜置懸浮沉淀，將其作為微粒體膜。該微粒體膜的A260/A280為1.4～1.5，A260約為150。
(4)無細胞系蛋白質合成(4-1)利用含有節肢動物來源的提取物的無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系蛋白質合成使用在上述(2)中制備的pro-TNF GLC的mRNA-I和在上述(3)中制備的微粒體膜，進行用含有節肢動物來源的提取物的無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系蛋白質合成。
(蠶提取液的制備)使用剪刀、鑷子、手術刀、刮勺，從15只5齡期第4天的蠶幼蟲摘取后部絲腺3.07g，將其在-80℃下凍結后，用研缽磨碎，使用下述組成的提取用液，進行抽提。
·20mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·2mMDTT·0.5mM PMSF提取后，用離心分離機(himacCR20B3(日立工機公司制))，在30，000×g、30分鐘、4℃的條件下，對得到的液狀物進行離心分離。
離心分離后，只分離上清，再次在30,000×g、10分鐘、4℃的條件下進行離心分離。離心分離后，只分離上清。加入含有20％甘油的提取用液，平衡化脫鹽柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)之后，將上清供給到其中，通過用上述提取用液洗脫，進行凝膠過濾。
使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，從凝膠過濾后的濾液的組分分取出在280nm下的吸光度為10以上的組分，得到5齡期的蠶幼蟲的后部絲腺來源的無細胞系蛋白質合成用提取液。
對于得到的提取液，使用BCA蛋白質檢測試劑盒(PIERCE公司制)，測定蛋白質濃度。首先，相對反應試劑2mL加入樣品0.1mL，在37℃下反應30分鐘，使用分光光度計(Ultrospec330pro、Amersham Bioscience公司制)，測定562nm下的吸光度。作為對照，使用BSA，制作校準線。
提取液中的蠶幼蟲的后部絲腺的含量以蛋白質濃度計為17.5mg/mL。
(昆蟲培養細胞提取液的制備)(1)High Five來源提取液細胞數為2.1×107個的昆蟲培養細胞High Five(Invitrogen公司制)，在已放入添加了L-谷氨酰胺的Express Five無血清培養基(Invitrogen公司制)的培養瓶(600cm2)內，27℃培養6天。結果變為細胞數1.0×108個、濕重1.21g。
接著，收集上述培養的昆蟲培養細胞，用下述組成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分鐘條件下離心分離)。
·60mM HEPES-KOH(pH7.9)·200mM 醋酸鉀·4mM醋酸鎂·4mMDTT向清洗后的昆蟲培養細胞中加1mL下述組成的提取用液，懸浮。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)
·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·2mM氯化鈣·20(v/v)％ 甘油·1mMDTT·1mMPMSF在液氮中急劇凍結該懸浮液。充分凍結后，在約4℃的冰水浴中解凍。完全解凍后，在30,000×g、4℃下離心分離10分鐘(himacCR20B3、日立工機公司制)，回收上清。將已回收的上清1.5mL上樣(apply)到用下述組成的凝膠過濾用緩沖液平衡化之后的PD-10脫鹽柱(AmershamBioscience公司制)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·1mMDTT·1mMPMSF上樣之后，用凝膠過濾用緩沖液4mL洗脫，使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm處的吸光度為30以上的組分，作為昆蟲培養細胞提取液。
(2)Sf21來源提取液在Sf900-II無血清培養基(Invitrogen公司制)中，27℃下培養昆蟲細胞Sf21(Invitrogen公司制)。在125ml三角燒瓶內的培養基50mL中，在27℃、130rpm下懸浮培養每1ml培養基細胞數為6.0×105個的Sf21，培養5天，結果變為每1ml培養基的細胞數為1.0×108個，濕重3g。
接著，收集上述培養的昆蟲細胞，用下述組成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分鐘條件下離心分離)，然后，將其懸浮于3mL的下述組成的提取用液中。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)
·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·2mM氯化鈣·1mMDTT[提取用液的組成]·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸鉀·2mM 醋酸鎂·2mM 氯化鈣·20(v/v)％甘油·1mM DTT·0.5mMPMSF在液氮中急劇凍結該細胞懸浮液。充分凍結后，在約4℃的冰水浴中解凍。完全解凍后，在30,000×g、4℃下離心分離10分鐘(himacCR20B3、日立工機公司制)，回收上清1A。將回收后的上清1A進一步在45,000×g、4℃下離心分離(himacCR20B3、日立工機公司制)30分鐘，回收上清1B。將2.5mL已回收的上清1B上樣到用下述組成的凝膠過濾用緩沖液平衡化之后的PD-10脫鹽柱(Amersham Bioscience公司制)中。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·1mMDTT·0.5mM PMSF上樣之后，用凝膠過濾用緩沖液3mL洗脫，使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm處吸光度為30以上的組分，將其作為昆蟲細胞提取液。
對蠶后部絲腺來源提取液、昆蟲培養細胞(High Five、Sf21)來源提取液這3種，進行無細胞系蛋白質合成。另外，此時，在各反應開始時刻，以各種濃度添加在上述(3)中制備的節肢動物來源的微粒體膜，通過使其共反應，進行蛋白質的糖基化。另外，在參考例中，使用狗胰腺微粒體膜(Promega公司制)，代替節肢動物來源的微粒體膜。
下面記載了使用各種提取液的情況下的反應組成，各成分的濃度只要沒有事先說明，均用反應液中的最終濃度表示。
使用蠶后部絲腺來源提取液的合成·昆蟲來源微粒體膜(反應液1μl中A260＝0～50)·50(v/v)％節肢動物來源(蠶后部絲腺來源)提取液·160μg/mLmRNA·30mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM醋酸鉀·1.5mM醋酸鎂·0.5mMDTT·10(v/v)％甘油·0.75mM ATP·0.5mMGTP·0.25mM EGTA·25mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·100μM 氨基酸(20種)·2U/μL RNA酶抑制劑·100μg/mLtRNA分別使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20種)(Sigma公司制)、RNA酶抑制劑(寶酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。
作為反應裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。翻譯反應在反應溫度25℃下進行6小時，反應液量為25μL。
使用昆蟲培養細胞來源提取液的合成(1)使用High Five來源提取液的情況·昆蟲來源微粒體膜(反應液1μl中A260＝0～50)
·50(v/v)％ 節肢動物來源(High Five來源)提取液·320μg/mLmRNA·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸鉀·2mM 醋酸鎂·2mM DTT·10(v/v)％甘油·0.5mMATP·0.25mM GTP·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·80μM氨基酸(20種)·0.25mM EGTA·1U/μL RNA酶抑制劑·200μg/mLtRNA分別使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20種)(Sigma公司制)、RNA酶抑制劑(寶酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。
作為反應裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。翻譯反應在反應溫度25℃下進行8小時，反應液量為25μL。
(2)使用Sf21來源提取液的情況·昆蟲來源微粒體膜(反應液1μL中A260＝0～50)·50(v/v)％ 節肢動物來源(Sf21來源)提取液·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·1.5mM 醋酸鎂·2mM DTT·10(v/v)％ 甘油·0.25mMATP
·0.1mM GTP·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·80μM 氨基酸(20種)·0.1mM EGTA·1U/μL RNA酶抑制劑·200μg/mL tRNA·320μg/mL 外來mRNA(pro-TNF-GLC基因)分別使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20種)(Sigma公司制)、RNA酶抑制劑(寶酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。作為反應裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000。在反應液量為25μL、反應溫度為25℃、反應時間為6小時的條件下進行。
(4-2)利用含有哺乳動物來源的提取物的無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系蛋白質合成使用在上述(2)中制備的pro-TNF GLC的mRNA-II和在上述(3)中制備的微粒體膜，進行利用兔網織紅細胞提取液(RRL；Promega公司制)的無細胞系蛋白質合成。另外，此時，在各反應開始時刻，以各種濃度添加在上述(3)中制備的微粒體膜，使其共反應，由此進行蛋白質的糖基化。
·翻譯系反應液中A260＝0～50的微粒體膜·50(v/v)％ 兔網織紅細胞提取液17.5μl·2mg/mL mRNA 2μl·40U/μLRNA酶抑制劑 1μl·1mM氨基酸(20種) 1μl氨基酸(20種)使用的是Sigma公司制的產品，RNA酶抑制劑使用的是寶酒造公司制的產品。
作為反應裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。翻譯反應在反應溫度30℃下進行90分鐘，反應液量為25μL。
(5)利用上述(4)的無細胞系蛋白質合成而合成的翻譯反應產物的脫糖鏈為了確認在上述(4)中合成的N-糖基化蛋白質(pro-TNF GLC)為已被糖鏈修飾的糖蛋白質，用N型糖鏈分解酶進行脫糖鏈化。作為N型糖鏈分解酶，使用糖肽酶F(TAKARA公司制)，將其添加到翻譯反應結束后的反應液中，每10μl反應液中添加1μl，在25℃下反應2小時。
(6)N-糖基化蛋白質的檢測通過利用抗TNF抗體(R&D公司制)的Western Blot法和基于ECL-plus(Amersham公司制)的化學發光來檢測N-糖基化蛋白質。即，在昆蟲提取液中，在翻譯反應和脫糖鏈反應結束后，加入等量×2樣品緩沖液溶液(Sample Buffer Soln.)(Wako公司制)以用于SDS化，在95℃下進行3分鐘熱處理，提供給SDS-PAGE。在兔網織紅細胞提取液中，作為SDS化的前處理，相對反應液10μl，添加2μl的PMSF(40mM)、200μl的RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl PH7.5、150mM NaCl、1％Nonidet(諾乃洗滌劑)P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS)，使用攪拌子，在4℃下攪拌1小時。進而，用His-MicroSpin純化組件(His-MicroSpin Purification Module)(Amersham Bioscience公司制)，簡單地純化，將其作為樣品，加入等量的×2樣品緩沖液溶液(Wako公司制)，在95℃下進行3分鐘熱處理，提供給SDS-PAGE。電泳后，將蛋白質轉印到PVDF膜。用含有3％明膠的TTBS(20mM Tris、500mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.5)，在室溫下，緩慢振蕩轉印后的膜，進行封閉處理。封閉后，用TTBS振蕩10分鐘，清洗膜。在含有1/2000量的抗TNF抗體和1％明膠的TTBS中，緩慢反應2小時～12小時。在TCBS(20mM citrate，500mM NaCl，0.05％Tween-20，pH5.5)中，對膜進行振蕩清洗5分鐘×2次。在每100mL含有1％明膠的TCBS中加入33μl的蛋白G-辣根過氧化物酶偶聯(Protein G-Horseradish Peroxidase Conjugate)(Bio Rad公司制)后，在該液體中緩慢振蕩膜2小時，使其發生反應。在TTBS中振蕩清洗10分鐘之后，使用ECL-plus，進行化學發光，用X線膠卷(film)曝光后顯影。
(7)Western Blot的結果通過上述方法檢測的Western Blot結果顯示于圖2和圖3。
在圖2中，上段顯示使用蠶后部絲腺來源提取液(BML)在微粒體膜存在下進行翻譯的結果，中段顯示使用昆蟲培養細胞High Five提取液(HFL)、昆蟲培養細胞Sf21細胞提取液(Sf21L)，在微粒體膜存在下進行翻譯的結果。就添加的微粒體膜而言，從左開始分別添加狗胰腺微粒體膜(CMM，Promega公司制)、昆蟲培養細胞High Five來源微粒體膜(HFMM)、昆蟲培養細胞Sf21來源微粒體膜(Sf21MM)，與翻譯同時進行反應而成。微粒體膜的添加量用A260的值表示。
從這些結果可以明確在BML、FHL、Sf21L的所有提取液中，與添加狗胰腺微粒體膜時相比，在分別添加HFMM和Sf21MM的情況下產生的N-糖基化效率更高。另外，該漂移帶(shift band)在糖肽酶F消化下顯著減少，所以可以確認為N型糖鏈附加蛋白質。
以上表明通過在昆蟲來源提取液中添加昆蟲來源微粒體膜，可以更高效率地進行蛋白質的糖鏈修飾。
同樣地，圖3表示使用兔網織紅細胞提取液，在微粒體膜存在下進行翻譯的結果。就添加的微粒體膜而言，從左開始分別為昆蟲培養細胞HighFive來源微粒體膜(HFMM)、昆蟲培養細胞Sf21來源微粒體膜(Sf21MM)。可以明確在分別添加的情況下，高效率地產生N-糖基化。另外，該漂移帶(shift band)在糖肽酶F消化下顯著減少，所以可以確認為N型糖鏈附加蛋白質。
以上表明即使在兔網織紅細胞提取液中，通過添加昆蟲來源微粒體膜，可以高效率地進行蛋白質的糖鏈修飾。
此外，在說明序列表中的人工序列(Artificial Sequence)的文本(freetext)項目<223>中，序列號1表示EoNPV(桿狀病毒)多角體蛋白基因5’UTR的堿基序列；序列號2表示pro-TNF GLC cDNA的堿基序列；序列號3表示PCR引物；序列號4表示PCR引物；序列號5表示PCR引物；序列號6表示PCR引物；序列號7表示編碼His-Tag(組氨酸標簽)的DNA；序列號8表示PCR引物；序列號9表示PCR引物。
序列表<110>株式會社島津制作所、國立大學法人山口大學<120>無細胞系蛋白質合成中通過添加微粒體膜的翻譯后修飾方法<130>G104090WO<150>JP 2003-384387<151>2003-11-13<160>9<210>1<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(EoNPV多角體蛋白基因)<400>1agtattgtag tcctttcgta attgtttgtg aaatctaaaa tacaccgta 49<210>2<211>702<212>DNA<213>人<220>
<223>pro-TNF GLC<400>2atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag60acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180gaagagtccc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct240tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg300cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga360gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc420aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc480gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3ttggatcctg caaaaagaac20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gttcttggat ccctcgagaa t21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5cccaagctta aaaaacccct c21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>6aaaaagcttc ccctggcgta a 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼組氨酸標簽(His-Tag)DNA(His-Tag coding DNA)<400>7ccaccaccac caccaccact ga 22<210>8<211>26<212>KNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8cgggatccat gagcactgaa agcatg 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9cggaattcca gggcaatgat cccaaa 2權利要求
1.一種在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成方法，其中，包括在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
2.如權利要求1所述的方法，其中，在mRNA濃度(μg/ml)與節肢動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下進行翻譯反應。
3.如權利要求2所述的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
4.如權利要求1所述的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲組織提取出來的微粒體膜。
5.如權利要求4所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
6.如權利要求5所述的方法，其中，蠶組織為脂肪體。
7.如權利要求1所述的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲培養細胞提取出來的微粒體膜。
8.如權利要求7所述的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
9.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有節肢動物來源的提取物的提取液。
10.如權利要求9所述的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
11.如權利要求10所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
12.如權利要求11所述的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
13.如權利要求9所述的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲培養細胞提取的提取物。
14.如權利要求13所述的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
15.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有小麥胚芽來源的提取物的提取液。
16.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有哺乳動物培養細胞來源的提取物的提取液。
17.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有兔網織紅細胞來源的提取物的提取液。
18.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有大腸桿菌來源的提取物的提取液。
19.如權利要求1所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有酵母來源的提取物的提取液。
20.一種翻譯后的蛋白質的修飾方法，其中，在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成中，包括在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
21.如權利要求20所述的方法，其中，在mRNA濃度(μg/ml)與節肢動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下進行翻譯反應。
22.如權利要求21所述的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
23.如權利要求20所述的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲組織提取的微粒體膜。
24.如權利要求23所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
25.如權利要求24所述的方法，其中，蠶組織為脂肪體。
26.如權利要求20所述的方法，其中，節肢動物來源的微粒體膜為從昆蟲培養細胞提取出來的微粒體膜。
27.如權利要求26所述的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
28.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有節肢動物來源的提取物的提取液。
29.如權利要求28所述的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
30.如權利要求29所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
31.如權利要求30所述的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
32.如權利要求28所述的方法，其中，節肢動物來源的提取物為從昆蟲培養細胞提取的提取物。
33.如權利要求28所述的方法，其中，昆蟲培養細胞為粉絲夜蛾卵細胞來源或草地夜蛾卵巢細胞來源的培養細胞。
34.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有小麥胚芽來源的提取物的提取液。
35.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有哺乳動物培養細胞來源的提取物的提取液。
36.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有兔網織紅細胞來源的提取物的提取液。
37.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有大腸桿菌來源的提取物的提取液。
38.如權利要求20所述的方法，其中，無細胞系蛋白質合成用提取液為含有酵母來源的提取物的提取液。
39.如權利要求20所述的方法，其中，翻譯后的蛋白質的修飾為N-糖基化和/或信號序列的切除。
40.一種N-糖基化的蛋白質，其中，是利用權利要求1所述的蛋白質合成方法得到的。
41.一種切除了信號序列的蛋白質，其中，是利用權利要求1所述的蛋白質合成方法得到的。
全文摘要
本發明提供無細胞系蛋白質合成中的新型翻譯后修飾方法以及利用該翻譯后修飾反應的新型無細胞系蛋白質合成方法。是一種在使用無細胞系蛋白質合成用提取液的無細胞系中的蛋白質合成方法，其特征在于，在節肢動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應。
文檔編號C07K14/00GK1878869SQ20048003346
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月13日
發明者遠藤幸喜, 內海俊彥, 伊東昌章 申請人:株式會社島津制作所, 國立大學法人山口大學