抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑的制作方法

專利名稱：抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑。
背景技術：
腫瘤是顯示出自主過度增殖的細胞的集合，可以區分為可能最終致使患有腫瘤的動物死亡的惡性腫瘤(所謂癌癥)以及與惡性腫瘤不同的良性腫瘤，但是例外也很多，嚴格的區分是困難的(《巖波生物學詞典》第3版，第4頁)。
現在癌癥的三種主要的治療方法是外科的治療方法、藥物療法和放射線療法，實際上還可以廣泛地進行將這些療法與激光療法等組合的聯合療法。考慮到伴隨著治療的痛苦和轉移，當然非常寄希望于藥物療法，應此期望，開發、使用了許多抗癌藥，但是沒有一種藥對于所有的癌癥都有效。而且，單獨使用無法發揮充分效果的抗癌藥、由于強副作用的原因而無法長期使用的抗癌藥很多，多劑并用療法成為一般的療法。因此，非常希望開發出新的抗癌藥，尤其是抗癌效果好并且可以用簡便的方法長期使用的抗癌藥。
到現在為止在惡性腫瘤中還沒有發現對腦腫瘤特別有效的抗癌藥。如果按照腦腫瘤處理規程(平成14年7月31日發行，金原出版株式會社)，認為1969年至1993年間的腦腫瘤病例總數為8萬1千余例，大致患病數為10萬人中有8～10個左右。
根據原發性腦腫瘤的發生起始地或病理組織型，可將原發性腦腫瘤分為神經膠質瘤(glioma)、腦膜瘤(meningioma)等10余種。其中，尤其發生頻率、惡性程度都大的原發性腦腫瘤是神經膠質瘤，通過詳細的病理組織型可將神經膠質瘤分為成膠質細胞瘤(glioblastoma)、惡性星形細胞瘤(anaplastic astrocytoma)等7個種類。對于原發性腦腫瘤的惡性程度，可以使用疾病的階段(腫瘤的大小、有無遠距離轉移)以及組織學的惡性程度。如果按照腦腫瘤處理規程(同上)，可以將組織學的惡性程度分為G1至G4四個階段，分別對應于WHO1至WHO4。數字大的惡性程度高，例如，成膠質細胞瘤的惡性程度為G4(WHO4)、惡性星形細胞瘤的惡性程度為G3(WHO3)，G3、G4可分類為惡性。因此，應該以抗腦腫瘤劑作為首要目標的原發性腦腫瘤是神經膠質瘤，其中，尤其是惡性程度高的成膠質細胞瘤或惡性星形細胞瘤。
神經膠質瘤是在腦實質中發生且以浸潤性增殖的腫瘤，僅僅通過手術完全恢復是困難的。其中，尤其是成膠質細胞瘤在治療中最具抵抗性，5年存活率極低，為8％左右。化療劑中明確確認有效性的化療劑僅有烷化劑、替莫唑胺(Temozolomide)，現在還停留于將它們與放射線療法并用。另一方面，可以確認手術后放射線照射顯示出延命效果。
已經報道了如果使用特殊的使用方法，TNF-α對腦腫瘤有一定程度的抗腫瘤效果。例如，據報道在神經膠質瘤局部注射TNF-α時可獲得抗腫瘤效果(非專利文獻1)、通過動脈注射TNF-α可以獲得一定程度的抗腫瘤效果(非專利文獻2)。
但是，以TNF-α給藥時，盡管獲得了抗腫瘤效果，但存在所謂無法與延命效果相聯系的問題，實際上，還沒有在經TNF-α給藥的腦腫瘤患者中可獲得延命效果的報道。而且，還沒有在經TNF-α給藥的神經膠質瘤大鼠中觀察到延命效果。
另一方面，已知X-X’-(TNF的第4外顯子部分的氨基酸序列)(但是，X為一個氫原子、或是可以任意確定種類、數量的肽，X’為氨基酸殘基數為1～39個的肽，純堿性氨基酸殘基數相對于構成X和X’的氨基酸殘基數的比率超過14.5％)表示的多肽有抗腫瘤作用(專利文獻1)、序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽具有抗腫瘤作用(專利文獻2)。但是，并不知道這些多肽具有抗惡性神經膠質瘤的作用。
非專利文獻1Hayashi S等″Clinical significance of theexpression of nuclearfactor-kappa B，tumor necrosis factorreceptor type I(TNFR 1)，and c-myc in human malignantastrocytomas″Neurol.Med.Chir.，2001年，第41卷，第187～195頁。
非專利文獻2Harada K等″Antitumor effect ofintra-arterial tumor necrosis factor-alpha in rats withtransplanted intracerebral glioma and its evaluation by MRI″，腦神經外科，1995年，第23卷，第1069～1074頁專利文獻1特許第2544114號公報專利文獻2特公平8-17716號公報發明內容本發明的目的在于提供一種新型的抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑。
用于解決問題的手段為了解決上述問題，本發明提供了以下抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑。
(1)含有下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物的抗惡性神經膠質瘤劑(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
(2)根據前述(1)記載的抗惡性神經膠質瘤劑，其中，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
(3)根據前述(1)或(2)記載的抗惡性神經膠質瘤劑，其是動物用抗惡性神經膠質瘤劑。
(4)預防或治療惡性神經膠質瘤的方法，其是對人或動物以下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物給藥(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
(5)根據前述(4)記載的方法，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
(6)下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物的應用，其用于制備抗惡性神經膠質瘤劑(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
(7)根據前述(6)記載的應用，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
發明的效果本發明的抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑都有抗惡性神經膠質瘤作用，同時，由于與TNF-α相比其對正常細胞的毒性低，因此對于惡性神經膠質瘤患者和惡性神經膠質瘤動物的延命效果高。
具體實施例方式
本發明的抗惡性神經膠質瘤劑含有下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物。
(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(以下有時稱為“多肽(a)”的情況)。
(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽(以下有時稱為“多肽(b)”的情況)。
在序列號1或2記載的氨基酸序列中，第19位的氨基酸(Ala)至C末端的氨基酸(Leu)相當于人源TNF-α的第4外顯子部分的氨基酸序列。也就是說，在編碼人源TNF-α的第4外顯子部分的DNA(參照序列號3)的5’末端添加鳥嘌呤時，由其編碼的多肽的氨基酸序列相同。
序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加的氨基酸個數，并沒有特別的限定，只要保持抗惡性神經膠質瘤作用即可，其個數為1個或多個，缺失或取代涉及的具體范圍通常為1～14個，優選為1～2個，添加所涉及的具體范圍通常為1～45個，優選1～39個，更優選為1～6個。
對序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸的位置，并沒有特別的限定，只要保持抗惡性神經膠質瘤作用即可，但是優選在第1位氨基酸殘基(Met)至第18位氨基酸殘基(Val)的部分中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸、在第19位氨基酸(Ala)至C末端的氨基酸(Leu)的部分中不缺失、取代或添加1個或多個氨基酸。這是因為在序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽中，一方面認為N末端對空間構型不起作用，而另一方面認為C末端對空間構型起作用。
在第1位氨基酸殘基(Met)至第18位氨基酸殘基(Val)的部分中缺失、取代或添加的氨基酸個數，并沒有特別的限定，只要保持抗惡性神經膠質瘤作用即可，其個數為1個或多個，缺失或取代涉及的具體范圍通常為1～14個，優選為1～2個，添加所涉及的具體范圍通常為1～45個，優選1～39個，更優選為1～6個。這種情況下，雖然對缺失、取代或添加后的這部分氨基酸序列沒有特別的限定，但是優選純堿性氨基酸殘基數相對于這部分中氨基酸殘基總數的比率超過14.5％。這是因為TNF對敏感細胞(例如L-929細胞)顯示出抗腫瘤作用，TNF對完全不敏感細胞(例如T-24細胞(Science，第230卷，p.943-945(1985))也顯示出抗腫瘤作用(特許第2544114號公報)。
多肽(a)和(b)中也包括添加了糖鏈的多肽和沒有添加糖鏈的多肽的任一個。多肽上添加的糖鏈的種類、位置等根據制備多肽時使用的宿主細胞的種類而不同，但是添加了糖鏈的多肽上還含有使用任意一種宿主細胞獲得的多肽。而且，多肽(a)和(b)中還含有其藥學上允許的鹽，作為其具體的例子，可以列舉有鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨等無毒性的堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽等。而且，上述鹽中，還含有通過多肽或者氨基酸與適當的有機酸或無機酸的反應而產生的無毒性酸加成鹽。作為代表性的無毒性酸加成鹽，可以列舉有例如鹽酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、p-甲苯磺酸鹽(tosylate)、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、羥乙酸鹽、馬來酸鹽、抗壞血酸鹽、苯磺酸鹽等。
可以使用編碼各個多肽的DNA按照常規方法制備多肽(a)和(b)。編碼多肽(a)和(b)的DNA可以根據其堿基序列通過化學合成獲得。可以使用市售的DNA合成儀、例如利用硫代亞磷酸酯法的DNA合成儀(島津制作所制)、利用氨基磷酸酯法的DNA合成儀(Perkin-Elmer制)進行DNA的化學合成。而且，可以通過在編碼TNF-α的第4外顯子部分的DNA上通過定點誘變法人為導入變異而獲得編碼多肽(a)和(b)的DNA。可以采用例如導入變異的試劑盒進行變異的導入，例如Mutant-K(TaKaRa公司制)、Mutant-G(TaKaRa公司制)和TaKaRa公司的體外誘變的LA-PCR系列試劑盒。
按照以下步驟，可以通過在宿主細胞中表達編碼各個多肽的DNA制備多肽(a)和(b)。
在制備重組載體時，制備含有編碼目的多肽的編碼區域的適當長度的DNA片段。而且，制備出取代堿基的DNA，以使對于在宿主細胞中表達編碼目的多肽的編碼區域的堿基序列的最適密碼子。
通過在適當的表達載體的啟動子的下游插入該DNA片段制備重組載體，通過在適當的宿主細胞中導入該重組載體，可以獲得產生目的多肽的轉化體。需要將上述DNA片段插入到載體中以便發揮其功能，載體可以含有啟動子、和增強子等的順式元件、剪接信號、poly A加尾信號、選擇性標記(例如，二氫葉酸鹽還原酶基因、氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因)、核糖體結合序列(SD序列)等。
作為表達載體，沒有特別的限定，只要可以在宿主細胞中自主復制即可，例如可以使用質粒載體、噬菌體載體、病毒載體等。作為質粒載體，可以列舉有例如來源于大腸桿菌的質粒(例如pRSET、pBR 322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19)、來源于枯草桿菌的質粒(例如，pUB110、pTP5)、來源于酵母的質粒(例如YEp13、YEp24、YCp50)，作為噬菌體載體，可以列舉有例如λ噬菌體(例如，Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP)，作為病毒載體，可以列舉有例如逆轉錄病毒、牛痘病毒和腺病毒等的動物病毒，桿狀病毒等的昆蟲病毒。
作為宿主細胞，可以使用原核細胞、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等任一種，只要能夠表達目的基因即可。而且，也可以使用動物個體、植物個體、蠶蟲體等。
以細菌作為宿主細胞時，可以使用例如屬于大腸桿菌(Escherichia coll)等的埃希桿菌屬、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等的桿菌屬屬、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等的假單胞菌屬、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等的根瘤菌屬的細菌作為宿主細胞。具體的是，可以使用大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue，大腸桿菌DHl、大腸桿菌K12、大腸桿菌JM109和大腸桿菌HB101等大腸桿菌，以及枯草桿菌MI 114、枯草桿菌207-21等枯草桿菌作為宿主細胞。這種情況下的啟動子，沒有特別的限定，只要可以在大腸桿菌等細菌中表達即可，可以使用例如trp啟動子、1ac啟動子、PL啟動子和PR啟動子等從大腸桿菌或噬菌體等獲得的啟動子。而且，也可以使用人為設計改變成像tac啟動子、lacT7啟動子、let I啟動子這樣的啟動子。
作為向細菌中導入重組載體的方法，沒有特別的限定，只要是在細菌中導入DNA得到的方法即可，可以使用例如采用鈣離子的方法、電穿孔法等。
以酵母作為宿主細胞時，可以使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等作為宿主細胞。這種情況下的啟動子，沒有特別的限定，只要可以在酵母中表達即可，可以使用例如gal1啟動子、gal10啟動子、熱激蛋白質啟動子、MFα1啟動子、PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、AOX1等啟動子。
作為向酵母中導入重組載體的方法，沒有特別的限定，只要是在酵母中導入DNA得到的方法即可，可以使用例如電穿孔法、原生質體法、醋酸鋰方法等。
以動物細胞作為宿主細胞時，可以使用猿細胞COS-7、Vero、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞、大鼠GH3、人FL細胞等作為宿主細胞。這種情況下的啟動子，沒有特別的限定，只要可以在動物細胞中表達即可，可以使用例如SRα啟動子、SV40啟動子、LTR(長末端重復)啟動子、CMV啟動子、人巨細胞病毒早期基因啟動子啟動子等。
作為向動物細胞中導入重組載體的方法，沒有特別的限定，只要是在動物細胞中導入DNA得到的方法即可，可以使用例如電穿孔法、磷酸鈣方法、脂質轉染法等。
以昆蟲細胞作為宿主時，可以使用草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的卵巢細胞、粉紋夜蝶(Trichoplusiani)的卵巢細胞、從蠶卵巢獲得的培養細胞等作為宿主細胞。作為草地貪夜蛾的卵巢細胞，可以舉例有Sf9、Sf21等，作為粉紋夜蝶的卵巢細胞，可以舉例有High 5、BTI-TN-5B1-4等(Invitrogen公司制)，作為從蠶卵巢獲得的培養細胞，可以舉例有家蠶(Bombyx mori)N4等。
作為向昆蟲細胞中導入重組載體的方法，沒有特別的限定，只要是在昆蟲細胞中導入DNA得到的方法即可，可以使用例如磷酸鈣法、脂質轉染法、電穿孔法等。
按照常規的培養方法培養導入了插入有編碼目的多肽的DNA的重組載體的轉化體。按照宿主細胞培養中使用的常規方法進行轉化體的培養。
作為培養以大腸桿菌和酵母等微生物作為宿主細胞獲得的轉化體的培養基，只要是含有該微生物能同化的碳源、氮源、無機鹽類等，并有效地進行轉化體培養的培養基，可以是天然培養基、合成培養基的任意一種。
作為碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、和淀粉等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，可以使用氨，氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、硫酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽，蛋白胨，肉浸出物，酵母提取物，玉米漿，酪蛋白水解物等。作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
在振蕩培養或通氣攪拌培養等好氧條件下進行轉化體的培養。培養溫度通常為28～37℃，培養時間為0.5～4天℃，在培養期間pH保持6.8～7.5。可以使用無機酸、有機酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進行pH的調整。而且，在培養時，根據需要還可以在培養基中添加氨芐青霉素和四環素等抗生素。
在培養經采用誘導型的啟動子作為啟動子的表達載體轉化的微生物時，根據需要還可以在培養基中添加誘導物。例如，在培養經采用1ac啟動子的表達載體轉化的微生物時，也可以在培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，在培養經采用TRP啟動子的表達載體轉化的微生物時，也可以在培養基中添加吲哚丙烯酸等。
培養以動物細胞作為宿主細胞獲得的轉化體的培養基，可以使用一般使用的RPMI1640培養基、Eagle的MEM培養基、α-MEM培養基、DMEM培養基，或在這些培養基中添加胎兒牛血清等的培養基。通常在5％CO2存在下，37℃下進行2～20天的轉化體的培養。而且，培養時，根據需要還可以在培養基中添加卡那霉素、青霉素、鏈霉素、新霉素、潮霉素、殺稻瘟菌素等抗生素。
培養以昆蟲細胞作為宿主細胞獲得的轉化體的培養基，可以使用一般使用的TNM-FH培養基(フア一ミンジエン公司制)、TC-100培養基(Gibco BRL公司制)、SF-900 II SFM培養基Gibco BRL公司制)，ExCell400，ExCell405(JRH生物技術科學公司制)等培養基。通常在22～28℃下進行3～20天的轉化體的培養。而且，培養時，根據需要還可以在培養基中添加慶大霉素等抗生素。
通過從轉化體的培養物收集目的多肽，可以獲得目的多肽。這里，培養上清、培養細胞、培養菌體、細胞或菌體破碎物都包括在“培養物”中。
目的多肽在轉化體的細胞中積蓄的情況下，通過離心分離培養物，收集培養物中的細胞，清洗該細胞后，破碎細胞，提取目的多肽。目的多肽被分泌到轉化體的細胞外的情況下，可以原樣使用培養上清，或通過離心分離等從培養上清除去細胞或菌體。
這樣獲得的多肽(a)或(b)可以通過溶劑提取法、用硫酸銨等的鹽析法脫鹽方法，用有機溶劑的沉淀法、二乙基氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾法、親和色譜法等方法純化。
還可以基于其氨基酸序列，通過Fmoc法(芴基甲基羥基羰基法)、tBoc法(t-丁基羥基羰基法)等化學合成法制備多肽(a)或(b)。這時，可以使用市售的肽合成儀。
本發明的抗神經膠質瘤也可以是僅由多肽(a)或(b)構成的，但是通常是與藥學上允許的1種以上的載體和/或添加劑一起按照常規方法被制成制劑。制劑時，可以是適當調節多肽(a)或(b)的配合量，通常為104～109U/mg，優選的是使用先例的范圍。作為使用先例，可以列舉有例如干擾素-α制劑Roferon-A600(中外制藥)(Roferon-A6百萬國際單位，人血清白蛋白5mg，氯化鈉9mg)、促紅細胞生成素制劑Epogin 90(中外制藥)(基因重組紅細胞生成素β9000國際單位，L-鹽酸組胺酸0.675mg，聚山梨醇酯800.025mg)(藥物添加劑百科全書2000，日本藥物添加劑協會編)。
作為藥學上允許的載體，可以列舉有例如水，藥學上允許的有機溶劑，膠原，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧乙烯基聚合物，海藻酸鈉，水溶性右旋糖酐，羧基-甲基-淀粉鈉，膠質，黃原膠，阿拉伯膠，酪蛋白，明膠，瓊脂，丙三醇，丙二醇，聚乙二醇，凡士林，石蠟，硬脂醇，硬脂酸，人血清白蛋白，甘露醇，山梨糖醇，乳糖等。
在制劑時使用的添加劑，可以列舉有例如賦形劑，崩解劑，矯味矯臭劑，填充劑，增容劑，粘合劑，濕潤劑，表面活性劑，潤滑劑，穩定劑，抗菌劑，緩沖液，等滲劑，螯合劑，pH調節劑，界面活性劑等，根據制劑的給藥單位狀態等，適當選擇這些添加劑。
作為給藥途徑，可以列舉有例如口服給藥；腦內，腹腔內，口腔內，呼吸道內，直腸內，皮下，肌肉內，靜脈內等非口服給藥途徑。并且，作為給藥劑型，可以列舉有例如片劑，散劑，注射劑，顆粒劑，噴霧劑，膠囊劑，糖漿劑，乳劑，栓劑，軟膏劑，貼劑等。
給藥量和給藥次數，要在主治醫生或獸醫的嚴格管理下，考慮給藥對象或動物的年齡、癥狀、體重、給藥效果等因素分別進行確定，但是對于人類成人(體重為60kg)，通過靜脈給藥的日劑量標準為100萬單位，通過動脈給藥的日劑量標準為200萬單位，通過經皮給藥的日劑量標準為100萬單位，這種日劑量可以一日一次給藥或者分多次給藥。并且，對于人以外的動物，例如牛、馬等大型動物，可以上述日劑量的1/60作為每1kg體重的給藥量標準進行給藥，對于雞等鳥類，可以以其兩倍量作為每1kg體重的給藥量標準進行給藥。
上述單位以WHO標準化的TNF-α的比活性作為指標，所述單位是基于各個多肽對于L-929細胞(Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America，1975年，第72卷，p.3666-3670)的細胞毒性求出的。
在加有5％胎兒牛血清的eagle基礎培養基(下面稱為“MEM”培養基)中培育L-929細胞，像100μL以及相同培養基中含有8×104個細胞這樣，在96平底孔板上培育L-929細胞。培育條件是37℃，2小時，5％CO2，100％H2O，可以使用常規的細胞培養使用的方法。然后，在培養基中以1μg/mL的終濃度添加放線菌素D，使培養液的液量達到150μL(放線菌素D是一種用于提高細胞感受性的經常使用的藥劑，其自身并不帶有L-929細胞來毒性)。立刻加入50μL經適當的MEM培養基稀釋的試樣(這時，可以適當調節稀釋率求出ED50)。進而，在上述條件下將最終液量變為200μL的L-929細胞培養18小時。
在測定細胞壞死活性時，首先除去所有的培養基，接著加入含有0.2％結晶紫的2％甲醇水溶液固定染色。結晶紫使所有有核細胞著色，產生細胞壞死而導致從平板底部游離的細胞沒有著色，因此可以直接測定細胞壞死活性。通過在OD590nm處的吸收測定染色度，通過與對照組的染色度比較，測定細胞壞死活性。按以下方式進行活性的定義。
求出L-929細胞能夠50％存活的試樣的稀釋率(N)。使用家兔TNS作為對照，使用2.4×106單位/mg/mL的TNF-α確定這種家兔TNS的活性n(單位/mL)。求出引起該家兔TNS的ED50的稀釋率(C)。
根據N/C×n計算出試樣的活性(單位/mL)。
序列號1記載的氨基酸序列構成的多肽對于小鼠的LD50為9.5×107單位/kg(BALB/C系統)，2.7×107單位/kg(C3H/He系統)，5.8×107單位/kg(C57BL/6系統)，序列號2記載的氨基酸序列構成的多肽對于小鼠的LD50為2.9×107單位/kg(BALB/C系統)，2.7×107單位/kg(C3H/He系統)，2.7×107單位/kg(C57BL/6系統)，比總共為1.0×107單位/kg(BALB/C系統)，7.8×106單位/kg(C3H/He系統)，5×107單位/kg(C57BL/6系統)的TNF-α值小得多。這樣，多肽(a)或(b)對正常細胞的毒性也比TNF-α的小得多，它們提高了本發明的抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑在臨床上的有效性。
通過以本發明的抗惡性神經膠質瘤劑對人或動物給藥，可以預防或治療人或動物的惡性神經膠質瘤。惡性神經膠質瘤中，包括惡性星形細胞瘤/退行性星形細胞瘤(anaplastic astrocytoma)，成膠質細胞瘤(glioblastoma)，巨細胞成神經膠質細胞瘤(giant cellglioblastoma)，神經膠質肉瘤(gliosarcoma)，退行性少突神經膠質瘤(anaplastic oligodendroglioma)，退行性室管膜瘤(anaplasticependymoma)，脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)，退行性神經節神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)，成松果體細胞瘤(pineoblastoma)，髓上皮瘤(medulloepithelioma)，成室管膜細胞瘤(ependymoblastoma)，成神經管細胞瘤(medulloblastoma)，幕上原發性神經外胚層瘤(supratentorial primitive neuroectodermaltumor)，非典型畸胎樣/rhabdoid tumor(atypicalteratoid/rhabdoid tumor)等。作為動物，可以列舉有例如牛，綿羊，山羊，馬，豬，家兔，狗，貓，大鼠，小鼠等哺乳類；雞等鳥類。
實施例下面，通過制備例和試驗例詳細說明本發明。并且，下面將序列號1記載的氨基酸序列構成的多肽稱之為“TNF-SAM1”，序列號2記載的氨基酸序列構成的多肽稱之為“TNF-SAM2”。
注射劑將1×106單位(約250μg)的TNF-SAM1、TNF-SAM2或者它們的混合物溶解于1mL的生理鹽水中，制成注射液。
緩釋劑將1×106單位(約250μg)的TNF-SAM1、TNF-SAM2或者它們的混合物分類封入脂質體中，制成緩釋劑。
通過在大鼠腦室中移植了成膠質細胞瘤的C6神經膠質瘤細胞的有神經膠質瘤病癥動物的延命效果，研究TNF-SAM2的抗惡性神經膠質瘤作用。
麻醉大鼠(5周大的雄Wistar大鼠，體重150g～250g)，用腦定位插入裝置進行頭蓋切除術后，將5μL的生理鹽水中懸浮了1.6×104個C6成膠質細胞瘤(腦腫瘤細胞)的溶液注入到4mm的腦內深度。使用移植腦腫瘤細胞后第3天的大鼠作為腦腫瘤模式大鼠。各給藥組(A組為正常大鼠血清，B組為TNF-α，C組為TNF-SAM2)中平均使用5只腦腫瘤移植大鼠。各個給藥組中，制備試樣使含有3％正常大鼠血清，從頸動脈1次給藥。
結果示于表1。

如表1所示，TNF-α不僅完全沒有抗腦腫瘤效果，反而以7×106和20×106單位給藥還會比不給藥組(A組)更早死亡。而且，與不給藥組(A組)和TNF-α給藥組(B組)相比，TNF-SAM2以7×106單位給藥顯示出顯著的延命效果。
而且，由于據報道TNF-SAM2通過與烷化劑合用顯示出協同的抗腫瘤效果(Cancer Biotherapy，vol.9，p.359-367(1994年))，因此認為替莫唑胺和TNF-SAM2的結合療法對惡性神經膠質瘤有效果。
(1)病例1雖然對2001年發現惡性星形細胞瘤(GradeIII)的47歲的女性進行了手術，但只是部分切除。第1天給藥100mg雷莫司汀(Ranimustin)((甲基-6)-3-(2-氯乙烷)-3-亞硝基脲-6-脫氧-α-D-吡喃葡糖苷)；(methyl-6)-3-(2-chloroethyl)-3-nitrosoureido-6-deoxy-alpha-D-glucopyranoside；MCNU)100mg，進行放射性照射后第3天開始一周5次給藥100萬單位的TNF-SAM2。進行15次這樣的治療時，通過MRI腫瘤量顯示縮小50％以上。
(2)病例2對1997年發現成膠質細胞瘤(GradeIV)的50歲的女性通過手術進行次全切除術，但殘留腫瘤。5星期內進行5次與上述病例相同的治療。殘留的腫瘤在這期間沒有增殖。
序列表<110>杣源一郎<120>抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑<160>3<210>1<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF突變蛋白<400>1Met Val Arg Ser Ser Thr Arg Thr Pro Ser Arg Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Ash Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Ash Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala 6lu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Ash Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>2<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF突變蛋白<400>2Met Val Arg Ser Cys Thr Arg Thr Pro Ser Arg Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ash Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Ash Gly Val Glu Leu Arg Asp Ash Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile ASn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155
<210>3<211>422<212>DNA<213>智人<400>3caaaccctca agctgagggg cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg 60ccaatggcgt ggagctgaga gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca 120tctactccca ggtcctcttc aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc 180acaccatcag ccgcatcgcc gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca 240agagcccctg ccagagggag accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca 300tctatctggg aggggtctte cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc 360ggcccgacta tctcgacttt gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt 420ga42權利要求
1.含有下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物的抗惡性神經膠質瘤劑(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
2.根據權利要求1記載的抗惡性神經膠質瘤劑，其中，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
3.根據權利要求1或2記載的抗惡性神經膠質瘤劑，其是動物用抗惡性神經膠質瘤劑。
4.預防或治療惡性神經膠質瘤的方法，其是對人或動物以下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物給藥(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
5.根據權利要求4記載的方法，其中，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
6.下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物的應用，其用于制備抗惡性神經膠質瘤劑(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
7.根據權利要求6記載的用途，其中，前述(b)所示的多肽是序列號1或2記載的氨基酸序列中的第1位氨基酸至第18位氨基酸的部分中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽。
全文摘要
本發明目的在于提供一種新型的抗惡性神經膠質瘤劑和動物用抗惡性神經膠質瘤劑，為了實現這個目的，在本發明中，抗惡性神經膠質瘤劑含有下述(a)或(b)所示的多肽或它們的混合物(a)序列號1或2記載的氨基酸序列構成的多肽，(b)由序列號1或2記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的并且具有抗惡性神經膠質瘤作用的多肽。
文檔編號C07K14/435GK1874783SQ20048003228
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月29日 優先權日2003年10月31日
發明者杣源一郎, 稻川裕之, 河內千惠, 西澤孝志 申請人:杣源一郎