專利名稱：用于治療病毒感染的核苷化合物的制作方法
技術領域：
本發明關于制備特定化合物的方法，所述化合物是用于治療至少部分上由黃病毒病毒家族中的病毒所介導的哺乳動物病毒感染。本發明也針對在這些方法中所利用的新穎中間體。
參考文獻下列出版物在本申請案中以上標數字引用1.Giangaspero，等人，Arch.Virol.增補，753-62(1993)；2.Giangaspero，等人，Int.J.STD.AIDS，4(5)300-302(1993)；3.Yolken，等人，Lancet，1(8637)517-20(1989)；4.Wilks，等人，Lancet，1(8629)107(1989)；5.Giangaspero，等人，Lancet，2110(1988)；6.Potts，等人，Lancet，1(8539)972-973(1987)；7.Cornberg，等人，″Hepatitis Ctherapeutic perspectives.″Forum(Genova)，11(2)154-62(2001)；8.Dymock，等人.，Antivir.Chem.Chemother.H(2)79-96(2000)；9.Devos，等人，國際專利申請公開案第WO 02/18404 A2號，2002年3月7日公開；10.Sommadossi，等人，國際專利申請公開案第WO 01/90121號，2001年5月23日公開；11.Carroll，S.S.，等人，國際專利申請公開案第WO 02057287號，2002年7月25日公開；12.Carroll，S.S.，等人，國際專利申請公開案第WO 02057425號，2002年7月25日公開；13.Roberts，等人，美國專利申請案第10/861,090號，2004年6月4日申請；
14.Roberts，等人，美國專利申請案第10/861,311號，2004年6月4日申請。
所有上述公開案和申請案以引用的方式全部并入本文中，引用的程度就如同已特定與個別地將各個公開案或申請案的整體揭示內容以引用的方式并入一般。
背景技術：
黃病毒病毒家族包含三個屬瘟疫病毒屬(pestivirus)、黃熱病毒屬(flavivirus)及肝炎病毒屬(hepacivirus)(丙型肝炎病毒)。在這些屬中，黃熱病毒及肝炎病毒代表著人類的重要病原體并在世界范圍內流行。有38種黃熱病毒與人類疾病相關，其包括登革熱(dengue fever)病毒、黃熱病毒及日本腦炎病毒。黃熱病毒引起大量急性發燒疾病和腦炎與出血疾病。目前，肝炎病毒已感染全世界近2％-3％的人口，并引起導致慢性肝病、硬化、肝細胞癌和肝衰竭的持續感染。人類瘟疫病毒尚未如動物瘟疫病毒一樣得到廣泛表征。然而，血清學研究指出人類存在相當大量的瘟疫病毒暴露。人類的瘟疫病毒感染涉及幾干種疾病，其包括(但不僅限于)先天性腦損傷、幼兒腸胃炎及人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者的慢性腹瀉。1-6目前，尚無用以預防或治療瘟疫病毒或黃熱病毒感染的抗病毒醫藥藥物。對于肝炎病毒(意即丙型肝炎病毒(HCV))感染而言，在美國干擾素α(IFN)為目前僅有的批準藥物。HCV為輸血后和散發性非甲型、非乙型肝炎感染的主要病原體。HCV感染在相當大部分慢性感染(且有傳染性)的帶菌者中潛伏，所述帶菌者可能許多年未經歷臨床癥狀。
目前，唯一可接受用于慢性HCV的治療為干擾素(IFN-α)，而且此需要至少六(6)個月的治療與/或病毒唑(Ribavirin)，其可抑制已感染細胞中的病毒復制且其也可改善一些人的肝功能。
IFN-α屬于天然存在的具有諸如抗病毒、免疫調節和抗腫瘤活性的特征性生物學作用的小蛋白質家族，所述小蛋白質是由大部分動物有核細胞響應幾種疾病尤其是病毒感染而產生和分泌的。IFN-α為影響細胞聯絡和免疫控制的重要生長與分化調節因子。然而，用干擾素治療HCV具有有限的長期功效，其中反應率為約25％。此外，用干擾素治療HCV常伴隨諸如疲勞、發燒、寒顫、頭痛、肌痛、關節痛、輕微脫發、精神疾病作用和相關病癥、自體免疫現象和相關病癥與甲狀腺功能障礙的副作用。
病毒唑(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，-4-三唑-3-甲酰胺)，即5′-單磷酸肌苷脫氫酶(IMPDH)抑制劑在HCV的治療中增強IFN-α的功效。盡管引入病毒唑，但50％以上的患者并未利用現有的干擾素-α(IFN)和病毒唑標準療法清除病毒。截至目前，慢性丙型肝炎的標準療法已改變成PEG-IFN加病毒唑的組合。然而，許多患者仍具有主要與病毒唑相關的顯著副作用。病毒唑在10％-20％以當前推薦劑量治療的患者中引起顯著的溶血作用，而且所述藥物具有致畸作用與胚胎毒性。
正在采取其他方法抵抗病毒。其包括(例如)應用反義寡核苷酸或核糖核酸酶抑制HCV復制。而且，認為直接抑制HCV蛋白并干擾病毒復制的低分子量化合物是控制HCV感染的引人注目的策略。認為NS3/4A絲氨酸蛋白酶、核糖核酸(RNA)解螺旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶是新藥物的潛在目標。7，8Devos等人9描述了嘌呤和嘧啶核苷衍生物和其作為HCV RNA復制抑制劑的用途。Sommadossi等人10描述了1′、2′或3′-經改質的核苷和其治療感染HCV宿主的用途。Carroll等人11，12描述了作為RNA依賴性RNA病毒聚合酶抑制劑的核苷。
近來，Roberts等人13，14揭示了某些7-(2′-經取代-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(視情況經取代的乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶化合物具有抗HCV的強效活性。這些參考文獻的全文都以引用的方式并入本文。
發明內容
本發明是針對可用于至少部分上由黃病毒病毒家族中的病毒所介導的哺乳動物病毒感染中的新穎化合物。特定言之，本發明是針對式I的化合物 其中Y是選自由一鍵結、-CH2-或-O-組成的群組；W、W1和W2各自獨立地選自由氫與醫藥上可接受的前藥組成的群組；與其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
在一較佳實施例中，Y為氧。
在另一較佳實施例中，W、W1和W2各自獨立地為氫或選自由下列各物組成的群組的醫藥上可接受的前藥酰基、氧酰基、膦酸基、磷酸基、磷酸酯、膦酰胺基、磷酰二胺基、磷酰胺單酯、環磷酰胺基、環磷酰二胺基、磷酰胺二酯和-C(O)CHR2NH2，其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。較佳地，R2為氨基酸側鏈。較佳地，W為氫，或W1為氫，或W2為氫。更佳地，W與W1為氫，或W與W2為氫，或W1與W2為氫。甚至更佳地，W、W1與W2為氫。
在又一較佳實施例中，W1與W2為氫，且W為氫或選自由下列各物組成的群組的醫藥上可接受的前藥酰基、氧酰基、膦酸基、磷酸酯、磷酸基、磷酰胺基、磷酰二胺基、磷酰胺單酯、環磷酰胺基、環磷酰二胺基、磷酰胺二酯和-C(O)CHR2NH2。
在一尤其較佳的實施例中，W1與W2為氫且W以下式表示 其中R2如上文定義，R3為氫或烷基，且R1是選自由下列各基團組成的群組烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。在一較佳實施例中，R2是衍生自L-氨基酸。
在另一尤其較佳的實施例中，W與W2為氫且W1以下式表示 其中R2如上文定義。
本發明一個尤其較佳的方面是針對式II的化合物
其中W是選自由氫與醫藥上可接受的前藥組成的群組；或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
本發明的較佳化合物包括下表I中所列的化合物表I
本發明的化合物作為抗病毒劑起作用或可用作制備如本文所述的抗病毒劑的中間體。
本發明也針對包含醫藥上可接受的稀釋劑和治療有效劑量的本文所述的化合物或一種或一種以上所述化合物的混合物的醫藥組合物。
本發明又進一步針對治療哺乳動物中至少部分上由諸如HCV的黃病毒病毒家族中的病毒所介導的病毒感染的方法，所述方法包含向已診斷為經所述病毒感染或有發展成所述病毒感染危險的哺乳動物投予包含醫藥上可接受的稀釋劑和治療有效劑量的如本文所述的化合物或一種或一種以上所述化合物的混合物的醫藥組合物。
在本發明的又一實施例中，提供治療或預防哺乳動物病毒感染的方法，其中本發明的化合物與投予治療有效劑量的一種或一種以上抗HCV活性劑組合投藥。抗HCV活性劑包括病毒唑、左旋韋林(levovirin)、韋拉咪定(viramidine)、胸腺素α-1、NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑和單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑，單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α或聚乙二醇化干擾素-α。較佳地，抗HCV的額外活性劑為單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α或聚乙二醇化干擾素-α。
具體實施例方式
本發明是針對治療諸如丙型肝炎病毒的黃病毒感染的化合物、組合物和方法。然而，在詳細描述本發明之前，首先對下列術語進行定義定義如本文所使用的術語“烷基”是指具有1至6個碳原子且更佳具有1至2個碳原子的烷基。此術語由諸如下列的基團例示說明甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和類似基團。
“經取代烷基”是指具有1至3個且較佳1至2個取代基的烷基，所述取代基選自由下列各基團組成的群組烷氧基、經取代烷氧基、酰基、酰胺基、酰氧基、氧酰基、氨基、經取代氨基、氨酰基、芳基、經取代芳基、芳氧基、經取代芳氧基、氰基、鹵素、羥基、硝基、羧基、羧基酯、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。
“烷氧基”是指“烷基-O-”基團，其包括(例如)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基及類似基團。
“經取代烷氧基”是指“經取代烷基-O-”基團。
“酰基”是指基團烷基-C(O)-、經取代烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、經取代烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、經取代炔基-C(O)-、環烷基-C(O)-、經取代環烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、經取代芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-、經取代雜芳基-C(O)、雜環基-C(O)-和經取代雜環基-C(O)-。
“酰胺基”是指-C(O)NR4R4基團，其中R4各自獨立地選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基，且其中各R4連同氮原子連接在一起形成雜環基或經取代雜環基環。
“酰氧基”是指基團烷基-C(O)O-、經取代烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、經取代烯基-C(O)O、炔基-C(O)O-、經取代炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、經取代芳基-C(O)O-、環烷基-C(O)O-、經取代環烷基-C(O)O-、雜芳基-C(O)O-、經取代雜芳基-C(O)O-、雜環基-C(O)O-和經取代雜環基-C(O)O-。
“氧酰基”是指基團烷基-OC(O)-、經取代烷基-OC(O)-、烯基-OC(O)-、經取代烯基-OC(O)、炔基-OC(O)-、經取代炔基-OC(O)-、芳基-OC(O)-、經取代芳基-OC(O)-、環烷基-OC(O)-、經取代環烷基-OC(O)-、雜芳基-OC(O)-、經取代雜芳基-OC(O)-、雜環基-OC(O)-和經取代雜環基-OC(O)-。
“烯基”是指具有2至6個碳原子且較佳2至4個碳原子并具有至少1個且較佳1-2個烯基不飽和位點的烯基。所述基團由乙烯基(乙烯-1-基)、烯丙基、丁-3-烯-1-基及類似基團例示說明。
“經取代烯基”是指具有1至3個取代基且較佳為1至2個取代基的烯基，所述取代基選自由下列各基團組成的群組烷氧基、經取代烷氧基、酰基、酰胺基、酰氧基、氨基、經取代氨基、氨酰基、芳基、經取代芳基、芳氧基、經取代芳氧基、氰基、鹵素、羥基、硝基、羧基、羧基酯、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基，其限制條件為任何羥基取代均不與乙烯基(不飽和)碳原子連接。較佳的經取代烯基是選自(但不限于)2，2-二氟乙烯-1-基、2-甲氧基乙烯-1-基和類似基團。
應了解適當時術語“經取代烯基”包括E(順式)與Z(反式)異構體。所述異構體可為純異構化合物或E與Z組份的混合物。
“炔基”是指具有至少1個炔基不飽和位點并具有2至6個碳原子且更佳2至4個碳原子的不飽和烴。較佳的炔基是選自(但不限于)乙炔-1-基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、1-甲基丙-2-炔-1-基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、丁炔-3-基和類似基團。
“經取代炔基”是指具有1至3個取代基且較佳1至2個取代基的炔基，所述取代基選自由下列各基團組成的群組烷氧基、經取代烷氧基、酰基、酰胺基、酰氧基、氨基、經取代氨基、氨酰基、芳基、經取代芳基、芳氧基、經取代芳氧基、氰基、鹵素、羥基、硝基、羧基、羧基酯、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。較佳的經取代炔基是選自(但不限于)2-氟乙炔-1-基、3，3，3-三氟丙炔-1-基、3-氨基丙炔-1-基、3-羥基丙炔-1-基和類似基團。
“氨基”是指-NH2基團。
“經取代氨基”是指-NR′R″基團，其中R′與R″獨立地選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基，且其中R′和R″連同與其結合的氮原子連接在一起形成雜環基或經取代雜環基，其限制條件是R′與R″不均為氫。當R′為氫且R″為烷基時，在本文中經取代氨基有時稱作烷氨基。當R′與R″均為烷基時，在本文中經取代氨基有時稱作二烷氨基。
“氨酰基”是指基團-NR5C(O)烷基、-NR5C(O)經取代烷基、-NR5C(O)環烷基、-NR5C(O)經取代環烷基、-NR5C(O)烯基、-NR5C(O)經取代烯基、-NR5C(O)炔基、-NR5C(O)經取代炔基、-NR5C(O)芳基、-NR5C(O)經取代芳基、-NR5C(O)雜芳基、-NR5C(O)經取代雜芳基、-NR5C(O)雜環基和-NR5C(O)經取代雜環基，其中R5為氫或烷基。
“芳基”或“Ar”是指具有單個環(例如苯基)或多個稠環(例如萘基或蒽基)的6至14個碳原子的單價芳族碳環基團，所述稠環可為或可不為芳族環(例如2-苯并惡唑啉酮、2H-1，4-苯并惡嗪-3(4H)-酮-7-基和類似基團)，其限制條件是連接點位于芳族碳原子。較佳的芳基包括苯基和萘基。
“經取代芳基”(包括“經取代苯基”)是指經1至3個取代基且較佳1至2個取代基取代的芳基或苯基，所述取代基選自由下列各基團組成的群組羥基、酰基、酰胺基、酰氧基、烷基、經取代烷基、烷氧基、經取代烷氧基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、氨基、經取代氨基、氨酰基、芳基、經取代芳基、芳氧基、經取代芳氧基、環烷氧基、經取代環烷氧基、羧基、羧基酯、氰基、硫醇、硫代烷基、經取代硫代烷基、硫代芳基、經取代硫代芳基、硫代雜芳基、經取代硫代雜芳基、硫代環烷基、經取代硫代環烷基、硫代雜環基、經取代硫代雜環基、環烷基、經取代環烷基、鹵基、硝基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基、雜芳氧基、經取代雜芳氧基、雜環氧基和經取代雜環氧基。
“芳氧基”是指芳基-O-基團，其包括(例如)苯氧基、萘氧基和類似基團。
“經取代芳氧基”是指經取代芳基-O-基團。
“羧基”是指-COOH或其鹽。
“羧基酯”是指基團-C(O)O-烷基、-C(O)O-經取代烷基、-C(O)O-芳基和-C(O)O-經取代芳基，其中烷基、經取代烷基、芳基和經取代芳基如本文定義。
“環烷基”是指具有單個或多個環的3至1O個碳原子的環烷基，一個或一個以上的所述環可為芳族或雜芳族環，其限制條件是連接點是經由環烷基環原子。所述基團包括(例如)金剛烷基、環丙基、環丁基、環戊基、環辛基和類似基團。
“經取代環烷基”是指具有1至5個取代基的飽和或不飽和但非芳族的環烷基，所述取代基選自由下列各基團組成的群組氧基(＝O)、硫基(＝S)、烷基、經取代烷基、烷氧基、經取代烷氧基、酰基、酰胺基、酰氧基、氨基、經取代氨基、氨酰基、芳基、經取代芳基、芳氧基、經取代芳氧基、氰基、鹵素、羥基、硝基、羧基、羧基酯、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。
“環烷氧基”是指-O-環烷基。
“經取代環烷氧基”是指-O-經取代環烷基。
“甲酰基”是指HC(O)-。
“鹵基”或“鹵素”是指氟基、氯基、溴基和碘基，且較佳為氟基或氯基。
“雜芳基”是指1至10個碳原子及環中1至4個雜原子的芳族基團，所述雜原子選自由氧、氮、硫組成的群組。所述硫和氮雜原子也可以其氧化形式存在，諸如＞N(O)、＞S(O)和＞S(O)2。所述雜芳基可具有單個環(例如吡啶基或呋喃基)或多個稠環(例如吲嗪基或苯并噻吩基)，其中所述稠環可為或可不為芳族環且/或含有雜原子，其限制條件是連接點是經由芳族雜芳基原子。較佳的雜芳基包括吡啶基、吡咯基、噻吩基、吲哚基、硫苯基和呋喃基。
“經取代雜芳基”是指經1至3個取代基取代的雜芳基，所述取代基選自與針對經取代芳基所定義者相同的的取代基群組。
“雜芳氧基”是指基團-O-雜芳基且“經取代雜芳氧基”是指基團-O-經取代雜芳基。
“雜環”或“雜環基”或“雜環烷基”是指具有單個環或多個稠環的飽和或不飽和基團(但非雜芳基)，其具有1至10個碳原子及環中1至4個選自由氮、氧、硫、＞S(O)和＞S(O)2組成的群組的雜原子，其中在稠環系統中，一個或一個以上的所述環可為環烷基、芳基或雜芳基，其限制條件是連接點是經由雜環。
“經取代雜環基”或“經取代雜環烷基”是指經1至3個取代基取代的雜環基，所述取代基與針對經取代環烷基所定義的取代基相同。
雜環和雜芳基的實例包括(但不限于)吖丁啶、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、二氫吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喏啉、喹唑啉、噌啉、喋啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、異噻唑、吩嗪、異惡唑、吩惡嗪、吩噻嗪、咪唑啶、咪唑啉、呱啶、呱嗪、吲哚啉、鄰苯二甲酰亞胺、1，2，3，4-四氫異喹啉、4，5，6，7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉基、硫代嗎啉基(亦稱為噻嗎啉基)、呱啶基、吡咯烷、四氫呋喃基和其類似物。
“雜環氧基”是指基團-O-雜環基且“經取代雜環氧基”是指基團-O-經取代雜環基。
“磷酸基”(phosphate)是指-OP(O)(OH)2基團(單磷酸根或磷酸基)、-OP(O)(OH)OP(O)(OH)2(二磷酸根或二磷酸基)和-OP(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2(三磷酸根或三磷酸基)或其鹽，包括其部分鹽。當然，應了解單磷酸根、二磷酸根和三磷酸根(磷酸基、二磷酸基和三磷酸基)的初始氧包括位于(例如)核糖5-位置處的氧原子。
“磷酸酯”是指如上所述的單磷酸基、二磷酸基和三磷酸基基團，其中一個或一個以上羥基經烷氧基取代。
“膦酸基”(phosphonate)是指-OP(O)(R6)(OH)基團或-OP(O)(R6)(OR6)基團或其鹽，包括其部分鹽，其中R6各自獨立地選自氫、烷基、經取代烷基、羧酸和羧基酯。當然，應了解膦酸基的初始氧包括位于(例如)核糖5-位置的氧原子。
“磷酰二胺基”(phosphorodiamidate)是指下述基團 其中各R7可相同或不同且各自為氫、烷基、經取代烷基、環烷基或經取代環烷基。尤其較佳的磷酰二胺基為下述基團 “磷酰胺單酯”是指下述基團，其中R2和R3如上文定義。在一較佳實施例中，R2衍生自L-氨基酸。
“磷酰胺二酯”是指下述基團，其中R1、R2和R3如上文定義。在一較佳實施例中，R2衍生自L-氨基酸。
“環磷酰胺基”是指下述基團，其中n為1至3，更佳地n為1至2。
“環磷酰二胺基”是指下述基團，其中n為1至3，更佳地n為1至2。
“膦酰胺基”(phosphonamidate)是指下述基團，其中R11為氫、烷基、經取代烷基、環烷基或經取代環烷基。
“硫醇”是指-SH基團。
“硫代烷基”或“烷基硫醚”或“硫代烷氧基”是指基團-S-烷基。
“經取代硫代烷基”或“經取代烷基硫醚”或“經取代硫代烷氧基”是指基團-S-經取代烷基。
“硫代環烷基”是指基團-S-環烷基且“經取代硫代環烷基”是指基團-S-經取代環烷基。
“硫代芳基”是指基團-S-芳基且“經取代硫代芳基”是指基團-S-經取代芳基。
“硫代雜芳基”是指基團-S-雜芳基且“經取代硫代雜芳基”是指基團-S-經取代雜芳基。
“硫代雜環烷基”是指基團-S-雜環基且“經取代硫代雜環基”是指基團-S-經取代雜環基。
術語“氨基酸側鏈”是指式R13NHCH(R12)COOH的α-氨基酸的R12取代基，其中R12是選自由氫、烷基、經取代烷基和芳基組成的群組，且R13為氫或連同R12和分別與R13和R12連接的氮和碳原子形成雜環。較佳地，α-氨基酸側鏈為20種天然存在的L氨基酸之一的側鏈。
術語“醫藥上可接受的前藥”是指對一個或一個以上官能基進行的技術認可的改質，所述官能基在體內經代謝以提供本發明的化合物或其活性代謝物。所述官能基已為此項技術所熟知，其包括取代羥基與/或氨基的酰基，單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯，其中一個或一個以上側接羥基已轉化為烷氧基、經取代烷氧基、芳氧基或經取代芳氧基和類似基團。
術語“醫藥上可接受的鹽”是指一種化合物的醫藥上可接受的鹽，所述鹽衍生自此項技術中熟知的多種有機和無機抗衡離子，且其包括(僅作為實例)鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨和其類似物；且當所述分子含有堿性官能度時，所述鹽包括有機或無機酸的鹽，諸如鹽酸鹽、溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來鹽、草酸鹽和類似鹽。
術語“醫藥上可接受的部分鹽”是指具有一取代基的化合物，所述取代基能夠具有一個以上的成鹽基團，但實際上成鹽的基團小于所述基團的最大量。例如，二磷酸基可形成多種鹽，且如果僅部分離子化，則由此產生的基團在本文中有時稱為部分鹽。
應了解，在上文所定義的所有經取代基團中，本文不擬包括通過本身又具有另外取代基的定義取代基而獲得的聚合物(例如，經取代芳基具有經取代芳基作為取代基，而所述作為取代基者本身由經取代芳基取代，等等)。在所述情形下，所述取代基的最大數量為3。即上文的每一個定義均受到限制，例如經取代芳基限于-經取代芳基-(經取代芳基)-經取代芳基。
類似地，應了解上文的定義并不意欲包括不允許的取代模式(例如，經5個氟基取代的甲基或羥基α連接至烯系或炔系不飽和基)。所屬領域技術人員熟知所述不允許的取代模式。
通用合成方法本發明的方法采用易于獲得的起始材料并下述通用方法和程序。應了解所述方法中已給定典型或較佳處理條件(意即反應溫度、時間、反應物的摩爾比、溶劑、壓力等等)，除非另作說明，否則其他處理條件也可使用。最佳反應條件可隨所使用的特定反應物或溶劑而變化，但所述條件可由所屬領域技術人員根據常規最佳程序判定。
另外，本發明的方法使用防止某些官能基免于經歷不當反應所必需的保護基團。用于各種官能基的適當保護基團以及用于保護并去保護特定官能基的適當條件已為此項技術所熟知。例如，T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999及其中所引用的參考文獻中描述了多種保護基團。
而且，本發明的化合物含有一個或一個以上的手性中心，且所述化合物可經制備或分離成為純的立體異構體，意即為單獨的對映異構體或非對映異構體，或為立體異構體富集的混合物。除非另作說明，否則所有所述立體異構體(和立體異構體富集的混合物)均包括于本發明的范疇中。純的立體異構體(或立體異構體富集的混合物)可使用(例如)此項技術中熟知的旋光性起始材料或立體選擇試劑來制備。或者，所述化合物的外消旋混合物可使用(例如)手性管柱色譜法、手性解析劑和類似方法分離。
用于下述反應的起始材料通常為已知化合物或其可通過已知程序或對已知程序的明顯修改來制備。例如，許多起始材料可購自諸如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，Wisconsin，USA)、Bachem(Torrance，California，USA)、Emka-Chemce或Sigma(St.Louis，Missouri，USA)的貿易供應商。其他材料可通過描述于諸如以下的標準參考文獻內容中的程序或對程序的明顯修改來制備Fieser和Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，第1-15卷(John Wiley和Sons，1991)、Rodd′s Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷和增補(Elsevier Science Publishers，1989)、Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons，1991)、March′s Advanced Organic Chemistry，(John Wiley和Sons，第4版)和Larock的Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.，1989)。特定言之，本發明的化合物可通過通常有機化學技術中且尤其核苷與核苷酸類似物合成技術中已知的各種方法來制備。關于核苷與核苷酸類似物制備的綜述包括1)Michelson A.M.″TheChemistry of nucleosides and Nucleotides，″Academic Press，New York，1963；2)Goodman L.″Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry″Academic Press，New York，1974，第1卷，第2章；和3)″Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry，″編輯Zorbach W.和Tipson R.，Wiley，New York，1973，第1和2卷。
本發明化合物的合成通常遵循如下所述的匯集或線性合成途徑。下文的流程1說明用于制備7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶的兩種不同方法。
流程1
特定言之，在流程1中，市售4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物2通過在諸如DMF、乙腈和其類似物的適當惰性稀釋劑中與輕微過量且較佳為約1.05至2當量的N-碘-琥珀酰亞胺接觸而轉化成4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物3。反應通常在約0℃至約40℃下且較佳在環境條件下進行直至反應大體完成。較佳地，所述反應在黑暗中(例如在鋁箔覆蓋的反應室中)進行，且通常在約6至24小時內完成。4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物3可通過諸如過濾、蒸發和類似方法的常規方法分離。純化較佳通過結晶來實現，其中化合物3的產量超過90％。
在環境條件下，將4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物3并入諸如乙腈、DMF和其類似物的適當惰性溶劑中。將相對于化合物3通常為約1.01至1.1且較佳約1.04當量的輕微過量的氫化鈉逐份加入所述溶液中。伴隨攪拌將由此所得的系統在環境條件下維持約0.5至4小時且較佳約2小時的時間。一旦反應大體完成，即通過過濾自反應混合物中移除任何不可溶的顆粒。此濾液中化合物3的鈉鹽(未圖示)無需進一步純化即用于下一步驟中。
將1-甲氧基-2-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖，化合物8(描述于下文)單獨地溶解于諸如氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃和其類似物的適當惰性稀釋劑中，并將由此所得的系統冷卻至約0℃至10℃。通過使所述系統與氣態溴化氫反應就地制備相應的1-溴-2-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖(未圖示)，所述氣態溴化氫鼓泡穿過反應系統直至反應大體完成，反應完成通常發生于0.1至1小時內。通過較佳在不超過20℃的溫度下蒸發獲得由此產生的產物并在真空中(較佳在小于約15托的壓力下)移除殘余的痕量溴化氫。
在諸如乙腈、DMF和其類似物的適當溶劑中，將過量，通常約1.01至約2當量(更佳為1.5至2eq.)化合物3的鈉鹽與1-溴-2-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖組合。通常，將所述反應維持在環境條件下直至大體完成，反應完成通常發生于約6至約24小時內。通過常規程序分離由此產生的產物7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物4。較佳將反應溶液中和并蒸發溶劑。隨后，接著用例如甲苯、二甲苯和其類似物的適當溶劑濕磨化合物4。產物可經快速分離色譜隨后結晶加以純化。
接著，通過諸如使7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物4與BCl3接觸的常規程序移除二氯苯甲基保護基團以提供7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物5。較佳地，所述反應是在諸如氯仿、二氯甲烷和其類似物的惰性稀釋劑中進行。將反應混合物最初維持在約-60℃至約-80℃下歷經一段約1至4小時的時間，且隨后使其升溫至-40℃至0℃直至反應大體完成，反應完成通常于額外的1至24小時后發生。然后，用甲醇中止反應，且隨后通過堿較佳為氫氧化銨使pH水平升高至約7而中和反應。通過諸如過濾、蒸發、色譜法、沉淀和類似程序的常規方法分離由此產生的7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物5。
隨后，化合物5通過與過量的液氨接觸而使其4-氯基胺化。所述反應較佳于通常維持在約100至約500psi下的壓力反應器中在約75℃至約90℃的溫度下純凈地進行。反應持續進行直至大體完成，反應完成通常發生在約12至48小時內。通過諸如過濾、蒸發、色譜法、沉淀和類似程序的常規方法分離由此產生的7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物6。
如流程1所示，將7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物5或7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物6的碘基轉化成相應的(三甲基)硅烷基乙炔基。轉化是通過首先將化合物5或6溶解于諸如DMF、THF或諸如3∶7比率的DMF/THF混合物的適當惰性稀釋劑中實現。隨后，將催化劑量的碘化亞銅(CuI)與四(三苯膦)鈀(0)連同過量，通常1.1至2當量的(三甲基硅烷基)乙炔加入反應混合物中。所述反應較佳在諸如三乙胺的堿存在下進行，且較佳在惰性氣氛中進行。反應通常在約10℃至約30℃下進行并持續反應直至大體完成，反應完成通常在約12至48小時內發生。
通過諸如過濾、蒸發、色譜法、沉淀和類似程序的常規方法分離衍生自化合物5的產物，意即7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-(三甲基硅烷基乙炔基)吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物10。
通過諸如過濾、蒸發、色譜法、沉淀和類似程序的常規方法分離衍生自化合物6的產物，意即7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基-乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7。
隨后，可通過經由常規方法使用氫氧化銨、碳酸鉀或氟化物陰離子發生的脫硅烷基化作用將化合物7轉化為乙炔衍生物(-C≡CH)。例如，使7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基-乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7與氫氧化銨在甲醇中反應提供化合物1。
另外，可以化合物10通過使其與濃氨水反應而采用脫硅烷基化作用和氨基化作用提供化合物1。
在一替代性實施例中，首先如上文所述將化合物3用三甲基硅烷基乙炔處理以形成化合物5a。可使化合物5a與上述2′-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖偶合以形成化合物7a。最后將2，4-二氯苯甲基保護基自所述糖移除而提供化合物10。
下文的流程2說明制備7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物1中的合成變化。
流程2
在流程2中，以如上所述的方法將7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物4胺化以提供7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物12。此化合物充當可用于制備7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物1的多種反應流程的焦點。
在第一實施例中，使用三氯化硼以上文流程1中所述的方式移除化合物12的羥基保護基以提供7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物6。接著，如上文所述在堿存在下，使用催化劑量的碘化亞銅(CuI)與四(三苯膦)鈀(0)連同過量，通常1.1至2當量的(三甲基硅烷基)乙炔將化合物6轉化成相應的7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7。
在一實施例中，如上文所述將7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基-乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7脫硅烷基化以提供化合物1。
在另一實施例中，如上文所述在堿存在下，使用催化劑量的碘化亞銅(CuI)與四(三苯膦)鈀(0)連同過量，通常1.1至2當量的(三甲基硅烷基)乙炔將化合物12轉化成相應的7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物13。
使化合物13經歷脫硅烷基化作用且移除羥基保護基以提供化合物1。如流程2中所示，這兩個步驟的順序并非重要因素，且在一實施例中，首先以上文所述的方式進行脫硅烷基化作用以提供7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物14，接著也如上文所述，使化合物14經歷羥基保護基團的移除以提供化合物1。在另一實施例中，首先進行羥基保護基團的移除以提供7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基-乙炔基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7，接著使其經歷脫硅烷基化作用以提供化合物1。
或者，可通過使化合物4與如上文所述的三甲基硅烷基乙炔反應來制備化合物7a。可如上文所述移除化合物7a的三甲基硅烷基而提供化合物15。通過自化合物15移除苯甲基保護基來制備化合物16。使用如上所述的技術將化合物15胺化而提供化合物1。
在另一替代性方法中，化合物7a可通過經液氨胺化而直接轉化成化合物14。
上文流程1與2中所使用的2-經取代核糖可由此項技術中熟知的方法制備。例如，這些化合物的一種起始材料為經2′-OH與2′-H適當取代的糖。所述糖可購得或通過包括標準差向異構、取代、氧化與/或還原技術的任何已知方法制備。例如，可使用市售1，3，5-三-鄰-苯甲酰基-α-D-呋喃核糖(Pfanstiel Laboratories，Inc.)。隨后，可在適當的溫度下于相容溶劑中，利用適當的氧化劑將經取代糖氧化而得到2′-經改質糖。可能的氧化劑為(例如)戴斯-馬丁高碘烷(Dess-Martin periodine)試劑、DMSO中的AC2O+DCC、斯文氧化(Swern oxidation)(DMSO、草酰氯、三乙胺)、瓊斯(Jones)試劑(鉻酸與硫酸的混合物)、科林斯試劑(Collins′s reagent)(聯吡啶氧化鉻(VI)、科里氏(Corey′s)試劑(氯鉻酸吡啶嗡鹽)、重鉻酸吡啶嗡鹽、重鉻酸、高錳酸鉀、MnO2、四氧化釕，負載于聚合物上的諸如鉻酸或高錳酸鹽的相轉移催化劑、Cl2-吡啶、H2O2-鉬酸銨、NaBrO2-CAN、HOAc中的NaOCl、亞鉻酸銅、氧化銅、雷尼鎳(Raney nickel)、乙酸鈀、麥爾外因-彭道夫-沃萊(Meerwin-Pondorf-Verley)試劑(叔丁醇鋁與另一種酮)和N-溴代琥珀酰亞胺。
使用適當的非質子溶劑在適當的溫度下使諸如格林尼亞(Grignard)試劑、有機鋰、二烷基銅鋰或TBAF中的CH3-SiMe3的有機金屬碳親核試劑與酮偶合得到2′-甲基糖。例如，可如Wolfe等人1997.J.Org.Chem.621754-1759中所述使用CH3MgBr/TiCl4或CH3MgBr/CeCl3。可視情況將甲基化糖通過如Greene等人Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，第2版，1991中所教示的所屬領域技術人員熟知的方法以適當的保護基保護，較佳以酰基、經取代烷基或硅烷基保護。
除上文所述外，本文所述合成方法中所使用的2′-C-經取代糖已為此項技術所熟知，且其(例如)由Sommadossi等人10與Carrol等人11，12描述，所有上述文獻的全文以引用的方式并入本文。
下文的流程3描述可用于與本文所述的堿偶合的經保護糖的替代性合成方法。
流程3 其中Ph為苯基且X’為諸如鹵基的適當的離去基團上文流程1中糖a的形成是自市售D-核糖起始如Mandal，S.B.，等人，Synth.Commun.，1993，9，第1239頁所述來實現。為形成糖b而對羥基的保護描述于Witty，D.R.，等人Tet.Lett.，1990，31，第4787頁中。糖c與d是使用Ning，J.等人Carbohydr.Res.，2001，330，第165頁的方法與本文所述的方法制備。糖e是通過使用對如本文所述與CH3MgBr或其他適當有機金屬的格林尼亞反應的修改而制備(無需鈦/鈰)。最后，在隨后的偶合反應中所使用的鹵化糖(X′＝鹵基)是使用與上文制備糖b所使用的相同保護方法制備。所述鹵化作用描述于Seela的美國專利第6,211,158號中。
隨后，可通過所屬領域技術人員熟知的方法，如Greene等人于Protective Groups inOrganic Synthesis，Jon Wiley and Sons，第2版，1991中所教示去保護任何所述核苷。
制備可用于與雜環堿偶合的經保護糖的一替代性方法詳細描述于下文的流程4中。
流程4 在流程4中，化合物g羥基的甲基化作用經由常規方法進行以提供化合物h。化合物h的2、3和5位羥基各自經2，4-二氯苯甲基保護以提供化合物i。在例如約0℃至5℃的低溫下，于諸如二氯甲烷、氯仿和其類似物的適當溶劑中經由使化合物i與氯化亞錫接觸進行對化合物i上2-(2′，4′-二氯苯甲基)基團的選擇性去保護，直至反應完成(例如24-72小時)而提供化合物j。如本文所述進行2-羥基的氧化以提供化合物k。也如本文所述進行甲基化以提供化合物1。
可使用下列前藥制備綜述中所描述的方法來實現使用根據上文所制備的化合物作為起始材料制備W、W1或W2不為氫的的化合物1)Cooperwood，J.S.等人″Nucleoside and Nucleotide prodrugs，″編輯Chu，C.K.Recent Advances in nucleosides(2002)，92-147。
2)Zemlicka，J.等人，Biochimica et Biophysica Acta(2002)，158(2-3)，276-286。
3)Wagner，C.等人，，Medicinal Research Reviews(2002)，20(6)，417-451。
4)Meier，C.等人.，Synlett(1998)，(3)，233-242。
舉例而言，1-[5-(炔基)-4-氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶]-2′-C-甲基-β-D-核呋喃糖苷化合物的5′-羥基向磷酸基、二磷酸基或三磷酸基類似物的轉化可使用D.W.Hutchinson，(編輯Leroy b.Townsend)″The Synthesis，reaction and Properties of Nucleoside Mono-，Di-，Tri-，and tertaphosphate and nucleosides with Changes in the Phosphoryl Residue，″Chemistry ofNucleosides and Nucleotides，Plenum Press，(1991)2中描述的方法制備。
核呋喃糖苷上氨基酸酯的制備可如下文流程5中所示來實現流程5 將所需boc-經保護氨基酸(較佳為L-氨基酸)與N，N′-羰基二咪唑溶解于諸如THF的惰性溶劑中。將反應混合物在約20與約40℃之間保持約0.5至24小時。將于諸如DMF的惰性溶劑中含有輕微過量的所需核苷的溶液加入Boc-經保護氨基酸混合物中，并將其在約40至約80℃下加熱約2至約24小時。使用諸如蒸發、沉淀、過濾、結晶、色譜法和類似方法的常規技術單離并分離結構異構體的混合物。
接著，使用(例如)1∶1v/v的TFA/DCM溶液在約20與約40℃之間將所需酯酸化約0.1至約1小時并進行蒸發。將殘余物溶解于水中，并將其于約0至約30℃下保持約2至約24小時。可通過RP-HPLC使用標準技術和條件分離混合物并單離所需產物。
盡管上述流程說明脫氮雜嘌呤前藥的制備，但此方法可用于任何所需核苷化合物上。同樣，氨基酸可經對反應條件適當的任何保護性基團保護。這些保護性基團已為此項技術所熟知。
核呋喃糖苷上其他烷基酯的制備可如下文流程6中所示來實現流程6 將化合物1溶解于諸如吡啶的無水溶劑中，并加入諸如叔丁基氯二苯基硅烷的鹵代硅烷以于糖的5′-位處形成保護基。可使用可針對5′-位且可經正確移除而形成最終所需3′-酯的任何保護基團。此反應在約10至40℃的溫度下進行約4至24小時。將所需酰基氯加入經保護核苷，化合物30中，并攪拌約4至約24小時以形成化合物31。可使用諸如分離、結晶、萃取、過濾、色譜法和類似方法的標準技術分離并純化所述化合物31。化合物32是通過移除5′-位處的保護基來制備。此可通過使化合物30與1M四丁基氟化銨的THF溶液反應實現。使用諸如分離、結晶、萃取、過濾、色譜法和類似方法的標準技術分離并純化最終產物。
盡管上述流程說明脫氮雜嘌呤前藥的制備，但此方法可用于任何所需核苷化合物上。
功效、測試和投藥功效本發明提供具有包括抗丙型肝炎病毒的抗病毒活性的新穎化合物。本發明的化合物通過抑制涉及復制的酶(包括RNA依賴性RNA聚合酶)來抑制病毒復制。其也可抑制黃病毒家族中的病毒(諸如HCV)的活性或增殖中所利用的其他酶。
本發明的化合物也可用作前藥核苷。如此，其經吸收至細胞中且可于細胞內由激酶磷酸化成三磷酸鹽，且隨后成為聚合酶(NS5b)抑制劑且/或充當鏈終止子。
本發明的化合物可單獨使用或與治療病毒的其他化合物組合使用。
投藥與醫藥組合物一般而言，本發明的化合物將通過任何對于起到類似功效的藥劑可接受的投藥模式以治療有效劑量投予。本發明化合物(意即活性成份)的實際劑量將取決于多種因素，諸如待治療的疾病的嚴重程度、受試者的年齡與相對健康、所使用的化合物的效能、投藥途徑與形式和其他因素。所述藥物可一天投予一次以上，較佳為一天一次或兩次。
式I化合物的治療有效劑量可處于每天每公斤接受者體重約0.05至50mg，較佳約0.01-25mg/kg/day，更佳約0.5至10mg/kg/day的范圍內。因此，對于向70此的人投藥而言，劑量范圍最佳為每天約35-70mg。
一般而言，本發明的化合物將作為醫藥組合物通過下列途徑的任一種投藥口服、全身性(例如經皮、鼻內或通過栓劑)或非經腸(例如肌肉內、靜脈內或皮下)投藥。較佳的投藥方式為使用可根據痛苦程度調整的常規每日給藥方案口服。組合物可采用片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉劑、持續釋放配方、溶液、懸浮液、酏劑、氣霧劑或任何其他適當組合物的形式。另一投予本發明化合物的較佳方式為吸入。
配方的選擇取決于多種因素，諸如藥物投予模式和藥物物質的生物可用性。對于經由吸入傳遞而言，可將所述化合物調配成液體溶液、懸浮液、氣霧劑推進劑或干粉并裝載至適當的投藥分配器中。存在幾種類型的醫藥吸入裝置——噴霧器吸入器、定劑量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。噴霧器裝置產生高速氣流，其使治療劑(其調配成液體形式)以薄霧形式噴射而進入患者呼吸道。MDI通常為以壓縮氣體封裝的配方。一經致動，所述裝置即通過壓縮氣體排出經計量的治療劑，由此提供投予定量藥劑的可靠方法。DPI分配易流動粉劑形式的治療劑，所述粉劑可通過所述裝置分散于患者呼吸過程的吸氣氣流中。為獲得易流動粉劑，將所述治療劑以諸如乳糖的賦形劑調配。將經計量的治療劑以膠囊形式儲存并利用每次致動分配。
近來，基于可通過增加表面積(意即減少粒徑)增加生物可用性的原理已研發出尤其用于展示出不良生物可用性藥物的醫藥配方。例如，美國專利第4,107,288號描述具有10至1,000nm尺寸范圍內的顆粒的醫藥配方，其中活性材料負載于大分子交聯基質上。美國專利第5,145,684號描述了醫藥配方的制造，其中將藥物物質在表面改質劑的存在下粉碎成納米顆粒(平均粒徑400nm)且隨后將其分散于液體介質中而得到顯示顯著高生物可用性的醫藥配方。
組合物大體上包含式I化合物與至少一種醫藥上可接受的賦形劑的組合。可接受的賦形劑無毒、有助于投藥并對式I化合物的治療益處無不利影響。此賦形劑可為任何固體、液體、半固體，或對于氣霧劑組合物來說，可為所屬領域技術人員常用的氣體賦形劑。
固體醫藥賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、而粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油脂、氯化鈉、脫脂乳粉和其類似物。液體和半固體賦形劑可選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，所述油包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。較佳的液體載劑(特別是用于可注射溶液)包括水、食鹽水、右旋醣水溶液和乙二醇。
可使用壓縮氣體分散氣霧劑形式的本發明化合物。適于此目的的惰性氣體為氮氣、二氧化碳等。其他適當的醫藥賦形劑及其配方描述于Remington′s PharmaceuticalSciences，E.W.Martin編輯(Mack Publishing Company，第18版，1990)中。
配方中化合物的量可于所屬領域技術人員所使用的全范圍內變化。通常，所述配方將含有以重量百分比(wt％)計占總配方約0.01-99.99wt％的式I化合物，余量為一種或一種以上適當的醫藥賦形劑。較佳地，所述化合物以約1-80wt％的含量存在。含有式I化合物的代表性醫藥配方描述于下文。
此外，本發明針對一種醫藥組合物，其包含治療有效劑量的本發明化合物與治療有效劑量的另一種抗RNA依賴性RNA病毒(且詳言之為抗HCV)活性劑的組合。抗HCV活性劑包括(但不限于)病毒唑、左旋韋林、韋拉咪定、胸腺素α-1、HCV NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑或單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α(佩格干擾素(peginterferon)-α)、干擾素-α與病毒唑的組合、佩格干擾素-α與病毒唑的組合、干擾素-α與左旋韋林的組合和佩格干擾素-α與左旋韋林的組合。干擾素-α包括(但不限于)重組干擾素-α2a(諸如購自Hoffman-LaRoche，Nutley，NJ的ROFERON干擾素)、干擾素-α2b(諸如購自Schering Corp.，Kenilworth，New Jersey，USA的Intron-A干擾素)、復合干擾素和純凈的干擾素-α產品。關于病毒唑及其抗HCV活性的討論，參看J.O.Saunders與S.A.Raybuck，″Inosine Monophosphate DehydrogenaseConsideration ofStructure，Kinetics and Therapeutic Potential，″Ann.Rep.Med.Chem.，35201-210(2000)。
實例下文以及整個申請案的實例、下列縮寫具有以下含義。若未定義，則術語具有其通常所接受的含義。
AcOH 或＝乙酸HOAcAc2O ＝乙酸酐Ar ＝芳基氫atm ＝大氣壓CAN ＝硝酸鈰銨bs ＝寬峰cm ＝厘米d ＝雙重峰dd ＝兩組雙重峰dt ＝兩組三重峰DBU ＝1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯DCB ＝2，4-二氯苯甲基DCM ＝二氯甲烷DCC ＝二環己基碳化二亞胺DMEM＝杜貝卡氏(Delbecco′s)基本依格(eagles)培養基DMF ＝二甲基甲酰胺DMSO＝二甲基亞砜DTT ＝二硫基蘇糖醇EDTA＝乙二胺四乙酸Fmoc＝氯甲酸-9-芴基甲酯eq.或eq ＝當量g ＝克h或hr ＝小時HCV ＝丙型肝炎病毒HPLC＝高效液相色譜IC50＝50％抑制下的抑制濃度
IPTG ＝異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷IU ＝國際單位kg ＝公斤L ＝公升m ＝多重峰M ＝摩爾濃度Me ＝甲基mg ＝毫克min＝分鐘mL ＝毫升mm ＝毫米mM ＝毫摩爾濃度mmol ＝毫摩爾MS ＝質譜mp ＝熔點ng ＝納克nm ＝納米nM ＝納摩爾濃度NMR＝核磁共振NTA＝氮基三乙酸NTP＝核苷三磷酸RP HPLC＝反相高效液相色譜s ＝單峰t ＝三重峰TBAF ＝四丁基氟化銨TC50 ＝50％細胞毒性下的毒性濃度TEA＝TFA＝三氟乙酸THF＝四氫呋喃
Tlc或TLC ＝薄層色譜法UTP ＝尿苷三磷酸UV＝紫外線μL ＝微升μg ＝微克μM ＝微摩爾濃度v/v ＝體積比體積wt％ ＝重量百分比此外，除非另作報告，否則所有反應與熔解溫度均以攝氏度表示，且除非再另作指示，否則所有百分率為摩爾百分比。
在下文的實例中以及整個本申請案的其他部分，所主張的化合物使用下述編號系統 實例1糖中間體1-甲氧基-2-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖(化合物8)的合成標題化合物使用Martin，P.；Helv.Chim.Acta，1995，78，486與Carroll，等人的國際專利中請案WO 02/057287 A2中所述的方法制備。
實例27-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物1)的制備
步驟1.4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物3)將4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶10.75g(70mmol)(Toronto Research Chemicals，Inc)與N-碘代琥珀酰亞胺(16.8g，75mmol)溶解于400mL無水DMF中，并于環境溫度下在黑暗中置放過夜。蒸發溶劑。將黃色殘余物懸浮于熱的10％Na2SO3溶液中，過濾，用熱水洗滌兩次，并自乙醇結晶而得到14.6g(74.6％)呈灰白色結晶的標題化合物。將母液蒸發直至1/3體積，并再次自乙醇結晶而得到2.47g(12.3％)的標題產物。
總產率接近100％。
M.p.212-214(分解)UVλmax307，266，230，227nm(甲醇)MS277.93(M-H)，313(M+Cl)1H-NMR(DMSO-d6)12.94(s，1H，NH)，8.58(s，1H，H-2)，7.94(s，1H，H-8)。
步驟2.7-(2′-甲基-3′，5′-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物4)將上文所獲得的堿(化合物3)(33.5g，120mmol)懸浮于1000mL的CH3CN中。逐份加入NaH(5g，125mmol 60％于油中)并在室溫下攪拌反應混合物直至NaH溶解(約2小時)。將1-甲氧基-2-甲基-3，5-二-鄰-(2，4-二氯苯甲基)-D-呋喃核糖(化合物8，參看上述實例1)(33g，60mmol)溶解于1000mL DCM中，并于冰/水浴中冷卻至4℃。使HBr氣體鼓泡穿過DCM溶液約30min。用TLC通過起始糖的消失監測反應(乙醚/己烷9∶1v/v)。反應一完成，即以不高于20℃的浴溫蒸發溶劑并于高真空中保持30min以移除所有痕量的HBr。迅速過濾預制的堿3的鈉鹽溶液，并將濾液加入糖組份中。將反應于環境溫度下保持過夜，隨后以HCl/二惡烷中和并進行蒸發。加入甲苯(300mL)以形成淺褐色未反應雜環堿的沉淀物，將其過濾去除。將濾液濃縮至約150mL體積，并將其裝載于2L具有硅膠的玻璃過濾器上。將所述過濾器用1L甲苯洗滌，以甲苯中的10％乙酸乙酯(約9L溶劑)洗提產物。蒸發溶劑并自乙醇結晶殘余物而得到27.5g(55.6％)標題核苷。
M.p.67-701H-NMR(DMSO-d6)8.66(s，1H，H-2)，8.07(s，1H，H-8)，7.62-7.34(m，6H，二氯苯甲基)，6.22(s，1H，H-1′)，5.64(s，1H，H-3′)，4.78-4.55(m，4H，CH2-苯甲基，2′OH，H-4′)，4.20(s，2H，CH2-苯甲基)，3.97-3.93與3.78-3.75(dd，1H，H-5′)，0.92(s，3H，2′-甲基)MS743.99(M+H)。
步驟3.7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物5)在-70℃下，向來自先前步驟的化合物4(27.5g)的DCM(800mL)溶液中逐滴加入三氯化硼(1M于DCM中，400mL)。于-70℃下攪拌混合物2.5小時并另外于-20℃下攪拌過夜。通過加入甲醇/DCM(500mL，1∶1)中止反應，并于-20℃下攪拌所得混合物30min，隨后在相同溫度下以氨水將其中和。過濾固體并用甲醇/DCM(1∶1v/v)將其洗滌三次。將濾液與200mL硅膠組合，并將其蒸發直至干燥。使干燥殘余物于1500mL乙腈與300mL己烷之間分溶。收集乙腈，用己烷萃取3次，并蒸發。將殘余物溶解于乙酸乙酯(600mL)中并用水、鹽水洗滌5次，經硫酸鈉干燥并蒸發。通過硅膠快速分離色譜以1∶2v/v的甲醇/丙酮(約3公升)自少量未反應的堿純化殘余物。蒸發溶劑并自丙酮/己烷結晶殘余物而得到12.9g(82％)標題核苷5。
1H-NMR(DMSO-d6)8.84(s，1H，H-2)，8.20(s，1H，H-8)，6.21(s，1H，H-1′)，4.00-3.60(m，糖)，0.84(s，3H，2′-甲基)MS426.26(M+H)M.p.182-185。
步驟4.7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物6)在85℃下，將上文制備的核苷5(1.5g，3.5mmol)在金屬壓力反應器中用液氨處理24小時。蒸發氨之后，將殘余物粗品溶解于甲醇中，添加硅膠(約20mL)并濃縮至干燥。接著，將承載產物的硅膠裝載于丙酮中的硅膠柱(5×10cm)上且隨后洗提，收集50mL餾分。餾分2-8含有標題化合物。蒸發丙酮并自甲醇/乙腈結晶殘余物而得到1.2g(84％)標題核苷。
M.p.220-222(分解)1H-NMR(DMSO-d6)8.20(s，1H，H-2)，7.80(s，1H，H-8)，6.80-6.50(bs，2H，NH2)，6.09(s，1H，H-1’)，5.19(t，1H，糖)，5.13-5.11(m，2H，糖)，4.00-3.70(m，3H，糖)，3.60-3.20(m，1H，糖)，0.84(s，3H，2′-甲基)MS 407.32(M+H)。
步驟5.7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(三甲基硅烷基乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物7)將先前步驟中所合成的氨基核苷6(1.7g，4.2mmol)溶解于12mL無水DMF與28mL無水THF的混合物中。加入三乙胺(3.6mmol，0.5mL)和CuI(1mmol，80mg)并用氬氣填充燒瓶。加入四(三苯膦)鈀(0)(0.04mmol，46mg)接著最后加入(三甲基硅烷基)乙炔(1.5eq.)，并將混合物于氬氣下攪拌20小時。隨后蒸發溶劑，將殘余物溶解于丙酮中，且接著在玻璃過濾漏斗上經硅膠(5×10cm)過濾。蒸發丙酮，將殘余物溶解于乙腈中，并再次經相同尺寸的硅膠柱使用乙腈洗提來過濾。將乙腈濃縮至小體積，隨后加入約10體積的乙醚，且將溶液聲波處理5min。形成標題化合物的白色晶體，得到0.8g化合物7(71％)。
M.p.188-191(分解)1H-NMR(DMSO-d6)8.17(s，1H，H-2)，7.92(s，1H，H-8)，7.20-6.80(t，2H，NH2)，5.83(s，1H，H-1’)，3.75-3.20(m，糖)，0.45(s，3H，2′-甲基)，0(s，9H，Si(CH3)3)。
步驟6.標題化合物7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶(化合物1)的制備將硅烷基化核苷7(1g，2.6mmol)溶解于10mL甲醇中，加入10mL NH4OH，并將混合物于環境溫度下置放1小時。蒸發溶劑，將殘余物溶解于甲醇中并使其與硅膠(30mL)共蒸發。將干燥的二氧化硅裝載于具有硅膠的玻璃過濾器(4×6cm)上，用丙酮洗提化合物。蒸發溶劑并自甲醇/乙腈結晶殘余物，得到0.5g(62％)；M.p.209-219(分解)；MS 305.13(M+H)；1H-NMR(DMSO-d6)8.10(s，1H，H-2)，7.94(s，1H，H-8)，6.08(s，1H，H-1′)，5.32-5.13(m，3H，糖)，3.96-3.62(m，4H，糖)，0.68(s，3H，甲基)。
實例37-(2′-甲基-3′-鄰-L-纈氨酸酯-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶(22a)的制備此化合物的合成大體展示于流程5中。
將Boc-經保護L-纈氨酸(271mg，1.25mmol)與N，N′-羰基二咪唑(203mg，1.25mmol)溶解于5ml THF中，并將其于環境溫度下保持2小時。加入化合物1(300mg，1mmol)于5ml DMF中的溶液，并將混合物在65℃下加熱過夜。對反應混合物的HPLC分析證實起始核苷與5′-單酰基化產物(化合物21a)的存在。通過制備性RP HPLC以0至100％B(A-水中的0.1％TFA，B-CH3CN中的0.1％TFA)分離目標Boc纈氨酸衍生物(化合物21a)。產率為40％(1∶5的兩種異構體的混合物)。
主要異構體MS 504(M+1)；NMR(CD3OD)δ8.11&7.93(s，1H，堿)，6.23(s，1H，H-1′)，5.44(d，1H，H-3′)，4.27(dt，1H，H-4′)，4.02-3.96&3.75-3.70(dd，1H，H-5′a與H-5′b)，3.42(d，1H，α-H)，2.21(m，1H，β-H)，0.9(m，9H，Boc)，0.89(s，3H，2′-CH3)。
次要異構體MS 504(M+1)；NMR(CD3OD)δ8.92&8.10(s，1H，堿)，6.28(s，1H，H-1′)，5.53(d，1H，H-3′)，4.32(dt，1H，H-4′)，4.10-4.05&3.80-3.74(dd，1H，H-5′a與H-5′b)，3.43(d，1H，α-H)，2.21(m，1H，β-H)，1.3-0.9(m，15H，Boc&Val-CH3)，0.89(s，3H，2′-CH3)。
將來自先前步驟的酯在室溫下用1∶1v/v的TFA/DCM處理20min并進行蒸發。將殘余物溶解于水中并在10℃下置放過夜。通過RP HPLC以0至100％B分離混合物，緩沖液如上所述。收集具有最長滯留時間的化合物，進行蒸發并將其鑒定為核苷22a的3′-異構體。
MS 404.14(M+1)；UV(pH1)251nm，282nm；NMR(CD3OD)68.17&7.87(s，1H，堿)，6.21(s，1H，H-1′)，4.72(d，1H，a-H)，4.12-3.82(m，4H，糖)，2.28(m，1H，β-H)，1.08(dd，6H，Val-CH3)，0.84(s，3H，2′-CH3)。
在干燥條件下儲存3天或在溶液中儲存數小時之后，化合物轉換成兩種異構體的混合物。
實例47-(2′-甲基-3′-鄰-L-丙氨酸酯-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶(22b)的合成如上文所述用于22a的方法使用Boc-經保護L-丙氨酸合成化合物22b；MS 376.17(M+1)；NMR(CD3OD)δ8.61&8.28(s，1H，堿)，6.38(s，1H，H-1′)，4.12(m，5H，α-H&糖)，1.71(d，3H，Ala-CH3)，1.60(m，1H，β-H)，0.85(s，3H，2′-CH3)。
在干燥條件下儲存3小時或在溶液中儲存30min之后，化合物22b轉換成兩種異構體的混合物。
實例57-(2′-甲基-3′-鄰-三甲基乙酰基酯-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶(32，其中烷基為叔丁基)的合成將化合物1(150mg，0.5mmol)溶解于10mL無水吡啶中。隨后，加入叔丁基氯二苯基硅烷(274mL，1mmol)并使反應于室溫下維持16小時。將三甲基乙酰基氯加入反應混合物(90μL，0.75mmol)中，并將混合物攪拌16小時。將混合物溶解于70mL氯仿中并用水(30mL)、10％NaHCO3(30mL)萃取，經Na2SO4干燥，蒸發并與甲苯共蒸發以移除痕量吡啶。將由此產生的油狀物溶解于20mLTHF中，并加入2mL 1M四丁基氟化銨的THF溶液。在16小時內蒸發溶劑，并將由此產生的油狀物溶解于10mLDMF中，且通過制備性RP HPLC以0至100％B在20min中(F＝10ml/min.)進行分離。色譜柱Phenominex 250×20mm，Synergi 4μ，Hydro PP 80A。緩沖液A-水，緩沖液B-CH3CN。目標化合物的滯留時間為15min。收集相應的餾分，蒸發而得到淺褐色泡沫狀物。
MS 389.10(M+1)；H1NMR(DMSO-d6)8.20&7.80(s，1H，堿)，6.04(s，1H，H-1′)，3.92-3.80(m，6H，糖)，3.40(s，9H，CH3-乙酰基)，0.65(s，3H，CH3-2′)。
實例67-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶5′-三磷酸鹽的合成將7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶5′(0.1mmol)與無水DMF共蒸發3次，將其溶解于2mL PO(OMe)3中，冷卻至5℃并加入POCl3(35μL)與質子海綿(64mg)。將混合物于5℃下攪拌3小時，隨后加入四丁基焦磷酸銨(2mmol，4mL 0.5M于DMF中的溶液)并將混合物在相同溫度下另外保持2小時。用(Et3N)HCO3緩沖液(pH 7.5)隨后用水中止反應。蒸發溶劑，將殘余物溶解于甲醇(3mL)中并用乙醚(30mL)使其沉淀。通過離子交換(IE)HPLC在Vydac柱(250×10mm)上以0至100％B純化固體殘余物。緩沖液A為25mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH 3；緩沖液B為310mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH 3。收集最后峰，將其濃縮至5mL體積，且在Phenominex柱(250×20mm)上以緩沖液A中0至100％緩沖液B的梯度經RP HPLC再純化。緩沖液A為0.5M三乙基乙酸胺的水溶液，緩沖液B為0.5M三乙基乙酸胺的乙腈溶液。將含有標題化合物的餾分組合，蒸發，與水共蒸發3次，并自水中凍干；MS542.99(M-H)，270.99(1/2M-H)；
UV(0.1％TFA)λmax212.24，235.62，277.98；1HNMR8.01&7.59(s，各1H，堿)，6.00(s，1H，H-1′)，4.32-4.00(m，4H，糖)，3.55(s，1H，乙炔基)，0.65(s，3H，甲基-2′)；31P-NMR-8.60(d，IP，P-α)，-10.12(d，1P，P-γ)，-21.42(t，1P，P-β)。
實例77-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶5′-磷酸鹽的合成將7-(2′-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶5′(0.1mmol)與無水DMF共蒸發3次，將其溶解于2mL PO(OMe)3中，冷卻至5℃并加入POCl3(35μL)與質子海綿(64mg)。將混合物在5℃下攪拌3h。用(Et3N)HCO3緩沖液(pH7.5)隨后用水中止反應。蒸發溶劑，將殘余物溶解于甲醇(3mL)中并用乙醚(30mL)使其沉淀。通過離子交換HPLC在Vydac柱(250×10mm)上以0至100％B純化固體殘余物。緩沖液A為25mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH 3；緩沖液B為310mMNaH2PO4/Na2HPO4，pH 3。收集最后峰，將其濃縮至5mL體積，且在Phenominex柱(250×20mm)上以緩沖液A中0至100％緩沖液B的梯度經RP HPLC再純化。緩沖液A為0.5M三乙基乙酸胺的水溶液，緩沖液B為0.5M三乙基乙酸胺的乙腈溶液。將含有標題化合物的餾分組合，蒸發，與水共蒸發3次，并自水中凍干；MS384.12(M-H)；1H-NMR7.97&7.67(s，各1H，堿)，6.12(s，1H，H-1′)，4.10-3.85(m，4H，糖)，3.15(s，1H，乙炔基)，.87(s，3H，甲基-2′)；31P-NMR5.02(s，1P)。
比較實例A7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制備
向實例2步驟4的產物(50.0mg，0.123mmol)于3.2mL THF-DMF(2∶1v/v)中的溶液中加入CuI(9.2mg，0,048mmol)、TEA(16μL，0.113mmol)、四(三苯膦)鈀(0)(14.0mg，0.012mmol)并用氬氣脫氣溶液。將溶液冷卻至0℃并使丙炔氣體鼓泡穿過溶液1min。隨后，使反應緩慢升溫至室溫歷時4小時。將使丙炔饋入反應的程序再重復兩次直至由TLC觀察不到痕量的起始材料。在真空中濃縮反應混合物，將其吸收于DMF中并通過RP HPLC使用0至50％的水中乙腈梯度在Phenominex柱(250×20mm)上以10mL/min純化歷時30min而得到26mg(66％)的標題化合物；1H-NMR(CD3OD)8.07(s，1H)，7.67(s，1H)，6.19(s，1H)，4.11-3.84(m，4H，糖)，2.09(s，3H)，0.82(s，3H)；MS319.11(M+H)。
比較實例B7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(丁炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制備 向實例2步驟4的產物(50.0mg，0.123mmol)于3.2mL THF-DMF(2∶1v/v)中的溶液中加入CuI(9.2mg，0.048mmol)、TEA(16μL，0.113mmol)、四(三苯膦)鈀(0)(14.0mg，0.012mmol)并用氬氣脫氣溶液。將溶液冷卻至0℃并使丁炔氣體鼓泡穿過溶液1min。隨后，使反應緩慢升溫至室溫歷時4小時。在真空中濃縮反應混合物，將其吸收于DMF中并通過RP HPLC使用0至50％的水中乙腈梯度在Phenominex柱(250×20mm)上以10mL/min純化歷時30min而得到13mg(32％)的標題化合物；1H-NMR(CD3OD)8.08(s，1H)，7.67(s，1H)，6.19(s，1H)，4.11-3.80(m，4H，糖)，2.48(q，2H)，1.26(t，3H).0.83(s，3H)；MS333.13(M+H)。
比較實例C7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(3-羥基丙炔-1-基)-吡咯并[3-d]嘧啶的制備
制得實例2步驟4的產物(50.0mg，0.1231mmol)于5mL二甲基甲酰胺中的溶液。將所述溶液通過以氬氣鼓泡而脫氣同時進行聲波處理5min。向此溶液中加入三乙胺(16.0μL，0.1145mmol)、碘化銅(9.4mg，0.0492mmol)和四(三苯膦)鈀(0)(14.2mg，0.0123mmol)。接下來，加入炔丙氧基三甲基硅烷(113.7μL，0.7386mmol)。在氬氣下將混合物攪拌4小時。完成后，即在真空中濃縮混合物。將反應粗產物溶解于1mL二甲基甲酰胺中，用去離子水稀釋至50mL且隨后經硅藻土墊洗滌。將溶液再次濃縮至干燥，隨后再溶解于1.0mL二甲基甲酰胺和3.5mL水中。經HPLC純化標題化合物；1H-NMR(CD3OD)8.10(s，1H)，7.80(s，1H)，6.21(s，1H)，4.44(d，2H)，4.11-3.82(m，4H)，0.83(s，3H)；MS335.13(m/z)。
比較實例D7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(3-氨基丙炔-1-基)-吡咯并[2.3-d]嘧啶的制備 步驟1.丙-2-炔基-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯向炔丙胺(250μL，3.645mmol)的二異丙基乙胺(1.273mL，7.290mmol)溶液中加入溶解于7mL二甲基甲酰胺中的氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc)。在氬氣下于室溫中將混合物攪拌過夜。完成后，即在真空中壓縮溶液。執行乙酸乙酯/水萃取程序以分離產物；MS278.10(m/z)。
步驟2.7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(3-氨基丙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶制得實例2步驟4的產物(124.5mg，0.3065mmol)于10mL二甲基甲酰胺中的溶液，將所述溶液通過以氬氣鼓泡而脫氣同時進行聲波處理5min。向此溶液中加入三乙胺(39.7μL，0.2850mmol)、碘化銅(23.5mg，0.1226mmol)和四(三苯膦)鈀(0)(35.4mg，0.0307mmol)。加入來自步驟1的Fmoc-炔丙胺(465.9mg，0.1.680mmol)，并于氬氣下將混合物攪拌4h。完成后，即在真空中濃縮混合物。將反應粗產物溶解于1mLDMF中，且隨后用去離子水將其稀釋至50mL，且隨后經硅藻土墊洗滌。將溶液蒸發至干燥，并再溶解于1.0mL DMF和3.5mL水中。經HPLC純化標題化合物；1H-NMR(DMF-d7)8.17(s，1H)，8.08(s，1H)，6.28(s，1H)，5.80-5.32(m，3H)，4.19-3.82(m，4H)，3.37-3-30(m，2H)，0.83(s，3H)；MS334.15(m/z)。
生物學實例實例1.抗丙型肝炎的活性化合物可通過抑制HCV聚合酶，通過抑制復制循環中所需的其他酶或通過其他路徑顯示抗丙型肝炎活性。已發表多種可用以評估這些活性的分析。評估培養物中HCV病毒總增量的通用方法揭示于Miles等人的美國專利第5,738,985號中。體外分析已報導于Ferrari等人.Jril.of Vir.，731649-1654，1999；Ishii等人，Hepatology，291227-1235，1999；Lohmann等人，JnlofBio.Chem.，27410807-10815，1999；和Yamashita等人，Jnl of Bio.Chem.，27315479-15486，1998中。
Emory University于1996年9月27日申請(列出C.Hagedorn與A.Reinoldus為發明者)并主張1995年9月申請的美國臨時專利申請案第60/004,383號的優選權的WO97/12033描述了可用以評定本文所述化合物活性的HCV聚合酶分析。另一種HCV聚合酶分析已由Bartholomeusz等人報導于Hepatitis C Virus(HCV)RNA polymerase assayusing cloned HCV non-structural proteins；Antiviral Therapy 19961(增補版4)18-24中。
測量由于HCV藥物激酶活性降低的篩選法揭示于Katze等人的美國專利第6,030,785號、Delvecchio的美國專利第6,228,576號和Jubin等人的美國專利第5,759,795中。測量所提議的HCV藥物的蛋白酶抑制活性的篩選法揭示于Su等人的美國專利第5,861,267號、De Francesco等人的美國專利第5,739,002號和Houghton等人的美國專利第5,597,691號中。
實例2.復制子分析使用細胞系ET(Huh-lucubineo-ET)篩選用于HCV RNA依賴性RNA聚合酶的本發明的化合物。將所述ET細胞系以含有I389luc-ubi-neo/NS3-3VET(具有螢火蟲熒光素酶-泛素-新霉素磷酸轉移酶融合蛋白與含有細胞培養物適應性突變(E1202G、T1280I、K1846T)的EMCV-IRES驅動NS3-5B聚合蛋白質的復制子)的RNA轉錄物穩定轉染(Krieger等人，2001且未公開)。所述ET細胞生長于補充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、盤尼西林(Penicillin)(100IU/mL)/鏈霉素(100μg/mL)、1x非必需氨基酸與250μg/mL G418(“遺傳霉素(Geneticin)”)的DMEM中。其均可經由Life Technologies(Bethesda，MD)獲得。將所述細胞以0.5-1.0×104個細胞/孔涂布于96孔培養盤中并于加入核苷類似物之前培育24小時。隨后，將化合物添加至所述細胞以達成5或50μm的最終濃度。48-72小時后通過加入裂解緩沖液與基物(目錄號閃亮裂解(Glo-lysis)緩沖液E2661和明亮熒光素酶(Bright-Glo leuciferase)系統E2620 Promega，Madison，WI)來測量熒光素酶活性。細胞在分析過程中不應過于融合。繪制相對于無化合物對照組的復制抑制百分比曲線。在相同條件下，使用細胞增殖試劑WST-1(Roche，Germany)測定化合物的細胞毒性。選擇展示出抗病毒活性但無顯著細胞毒性的化合物測定IC50與TC50。對于這些測定而言，對各化合物使用6種稀釋度。通常將化合物稀釋3倍以跨越250倍的濃度范圍。通過用各濃度下的抑制％擬合下述方程式來計算IC50與TC50值抑制％＝100％/[(IC50/[I])b+1]其中b為希爾系數(Hill′s coefficient)。
下文的表II與III中給出本發明的化合物與本發明的化合物的某些同系物和類似物的資料。
表II
為形成下表III中所示的5-乙基核苷，在氫存于下升高壓力下較佳在諸如甲醇的溶劑中使用Pd/C將5-乙炔核苷，化合物1氫化。
表III
實例3.重組HCV-NS5b的克隆與表達如Lohmann，V.，等人(1999)Science 285，110-113所述，通過PCR使用下列引物自pFKI3891uc/NS3-3′/ET克隆NS5b蛋白的編碼序列aggacatggatccgcggggtcgggcacgagacag(SEQ.ID.NO.1)aaggctggcatgcactcaatgtcctacacatggac(SEQ.ID.NO.2)
經克隆的片段失去C端21個氨基酸殘基。將經克隆的片段插入在蛋白質的羧基端提供抗原決定基標記(His)6的IPTG-可誘導表達質粒。
重組酶在XL-1細胞中表達，并于誘導表達之后，使用親和色譜法在鎳-NTA柱上純化所述蛋白質。儲存條件為-20℃下，10mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、20％甘油。
實例4.HCV-NS 5b酶分析通過測量使用經生物素標記、雜聚模板(其包括一部分HCV基因組)而并入RNA產物的經放射性標記的UTP來分析聚合酶活性。通常，分析混合物(50μL)含有10mMTris-HCl(pH 7.5)、5mM MgCl2、0.2mM EDTA、10mM KCl、1單元/微升RNAsin、1mM DTT、10μM各NTP(包括[3H]-UTP)和10ng/μL雜聚模板。首先將測試化合物溶解于100％DMSO中，且另外在含有5％DMSO的水性緩沖液中稀釋。通常，化合物的測試濃度介于1nM與100μM之間。反應以酶的加入開始并使反應在37℃下持續2小時。用8μL 100mM EDTA中止反應，并將反應混合物(30μL)轉移至涂布抗生蛋白鏈菌素的閃爍親近微量滴定板(FlashPlates)并于4℃下培育過夜。通過閃爍計數測定放射性的并入。
配方實例以下為含有本發明化合物的代表性醫藥配方。
實例1片劑配方將下列成份充分混合并將其壓制成單刻痕片劑。
每片成份的量，mg本發明的化合物 400玉米淀粉50交聯羧甲纖維素鈉25乳糖120硬脂酸鎂5實例2膠囊配方將下列成份充分混合并將其裝載至硬質明膠膠囊中。
每膠囊成份的量，mg本發明的化合物 200乳糖，經噴霧干燥148硬脂酸鎂2實例3懸浮液配方將下列成份混合以形成用于口服投藥的懸浮液。
成份量本發明的化合物 1.0g富馬酸 0.5g氯化鈉 2.0g對羥基苯甲酸甲酯0.15g對羥基苯甲酸丙酯0.05g顆粒狀糖25.0g山梨糖醇(70％溶液) 13.00g維格姆K(Veegum K)(Vanderbilt Co.) 1.0g調味劑 0.035mL著色劑 0.5mg蒸餾水 適量至100mL實例4注射用配方將下列成份混合以形成注射用配方。
成份量本發明的化合物 0.2mg-20mg乙酸鈉緩沖溶液，0.4M2.0mLHCl(1N)或NaOH(1N) 適量至適當pH水(蒸餾、無菌) 適量至20mL
實例5栓劑配方通過將本發明的化合物與WitepsolH-15(飽和植物脂肪酸的甘油三酯，Riches-Nelson，Inc.，New York)混合來制備總重量為2.5g的栓劑，且其具有下列組合物成份 量本發明的化合物500mgWitepsolH-15余量
權利要求
1.一種式I的化合物 其中Y是選自由一鍵結、-CH2-或-O-組成的群組；W、W1和W2各自獨立地選自由氫和醫藥上可接受的前藥組成的群組；和其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中Y為氧。
3.根據權利要求1所述的化合物，其中W、W1和W2各自獨立地為氫或選自由下列各物組成的群組的醫藥上可接受的前藥酰基、氧酰基、膦酸基、磷酸基、磷酸酯、膦酰胺基、磷酰二胺基、磷酰胺單酯、環磷酰胺基、環磷酰二胺基、磷酰胺二酯和-C(O)CHR2NH2，其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和氨基酸側鏈。
4.根據權利要求3所述的化合物，其中W為氫，或W1為氫，或W2為氫。
5.根據權利要求3所述的化合物，其中W與W1為氫，或W與W2為氫，或W1與W2為氫。
6.根據權利要求3所述的化合物，其中W、W1和W2為氫。
7.根據權利要求5所述的化合物，其中W1和W2為氫且W為氫或選自由下列各物組成的群組的醫藥上可接受的前藥酰基、氧酰基、膦酸基、磷酸酯、磷酸基、膦酰胺基、磷酰二胺基、磷酰胺單酯、環磷酰胺基、環磷酰二胺基、磷酰胺二酯和-C(O)CHR2NH2，其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和氨基酸側鏈。
8.根據權利要求7所述的化合物，其中W1和W2為氫且W由下式表示 其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和一氨基酸側鏈；R2為氫或烷基；且R1是選自由下列各基團組成的群組烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。
9.根據權利要求5所述的化合物，其中W和W2為氫且W1由下式表示 其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和一氨基酸側鏈。
10.一種式II的化合物 其中W是選自由氫和醫藥上可接受的前藥組成的群組；或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
11.根據權利要求10所述的化合物，其中W獨立地為氫或選自由下列各物組成的群組的醫藥上可接受的前藥酰基、氧酰基、膦酸基、磷酸基、磷酸酯、膦酰胺基、磷酰二胺基、磷酰胺單酯、環磷酰胺基、環磷酰二胺基、磷酰胺二酯和-C(O)CHR2NH2，其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和一氨基酸側鏈。
12.根據權利要求11所述的化合物，其中W以下式表示 其中R2是選自由下列各物組成的群組氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基、經取代雜環基和一氨基酸側鏈；R3為氫或烷基；且R1是選自由下列各基團組成的群組烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環基和經取代雜環基。
13.一種7-(2′-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
14.一種7-(2′-C-甲基-5′-磷酸基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
15.一種7-(2′-C-甲基-5′-二磷酸基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-[乙炔-1-基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
16.一種7-(2′-甲基-5′-三磷酸基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
17.一種7-(2′-C-甲基-5′-(苯氧基-L-丙氨酰基)磷酸基-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
18.一種7-(2′-甲基-3′-鄰-L-纈氨酸酯-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
19.一種7-(2′-甲基-3′-鄰-L-丙氨酸酯-β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-5-(乙炔-1-基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶或其醫藥上可接受的鹽或部分鹽。
20.一種醫藥組合物，其包含醫藥上可接受的稀釋劑和治療有效劑量的根據權利要求1至19中任一項所述的化合物或一種或一種以上所述化合物的混合物。
21.根據權利要求20所述的醫藥組合物，其中所述組合物進一步包含治療有效劑量的一種或一種以上抗HCV活性劑。
22.根據權利要求21所述的醫藥組合物，其中所述一種或一種以上藥劑是選自由下列各物組成的群組病毒唑(ribavirin)、左旋韋林(levovirin)、胸腺素α-1、NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑和單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑，單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α或聚乙二醇化干擾素-α。
23.根據權利要求22所述的醫藥組合物，其中所述一種或一種以上藥劑為單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α或聚乙二醇化干擾素-α。
24.一種治療和/或抑制哺乳動物的病毒感染的方法，所述感染至少部分地由黃病毒(flaviviridae)病毒家族中的病毒介導，所述方法包含向已診斷為被所述病毒感染或有發展成所述病毒感染危險的所述哺乳動物投予根據權利要求20所述的醫藥組合物。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述病毒為丙型肝炎病毒。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述醫藥組合物進一步包含治療有效劑量的一種或一種以上抗HCV活性劑。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述一種或一種以上藥劑是選自由下列各物組成的群組病毒唑、左旋韋林、韋拉咪定(viramidine)、胸腺素α-1、NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑和單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑，單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述一種或一種以上藥劑為單獨或與病毒唑或左旋韋林組合的干擾素-α或聚乙二醇化干擾素-α。
全文摘要
本發明揭示用于治療由諸如丙型肝炎病毒的黃病毒(Flaviviridae)家族病毒所引起的病毒感染的化合物、組合物和方法。
文檔編號C07H19/00GK1871250SQ200480031580
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月20日 優先權日2003年10月27日
發明者杰西·D·凱歇爾, 克里斯托弗·唐·羅伯茨, 納塔莉婭·B·佳特基娜 申請人:健亞生物科技公司