專利名稱：包含互補肽的人工抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用互補肽檢測靶位蛋白的方法，所述肽是用作天然抗體替代物的人工抗體，其利用設計與蛋白質有結合親合力的互補肽的技術來制備，本發明也涉及分析靶位蛋白的方法。
背景技術：
根據遺傳算法(遺傳進化法)來發現互補肽的評估標準之一是疏水性值。疏水性值的平均值由肽每個位置上的氨基酸加上該位置之前和之后的氨基酸(該位置之前和之后的五個或幾個氨基酸；對于末端氨基酸，為0個氨基酸)來計算，而疏水性值通過具有平均值相反信號的值來評估。例如，當平均值為+3.0時，將值-3.0評估作為那個氨基酸位置上疏水性值的滿分。第二個評估指數為在相應位置上的氨基酸側鏈的相應大小。評估相應氨基酸的α氨基碳(與氨基酸側鏈相連的基團的碳原子)是否具有不妨礙其他氨基酸接近到5 距離的側鏈大小。當側鏈由于其大小而不妨礙其他側鏈靠近的時候，相應值被評估作為滿分，并根據干擾程度來扣減，由此評估互補肽。第三個評估指數為肽骨架的主鏈排列的一致性，用主鏈排列的一致性來評估互補肽。設計給定數量的肽(如300個肽)使它們與靶肽有相同數量的氨基酸，將這些肽生成候選肽庫，評估它們針對靶肽的互補性，將評估值存入電腦存儲器。當獲得了給定數量的評估肽庫時，在肽庫中選擇具有較高評估分值的2個較高等級的肽，通過打亂來修飾這些肽的氨基酸序列，或通過任意扣減氨基酸來設計其他候選肽，由此產生下一代的肽庫。對每個肽評估針對靶肽的互補性，將評估值存入電腦存儲器，再選擇2個較高等級的肽，通過前述相同方法來產生接下來的一代肽庫。重復這些過程，理想地應持續重復直至獲得所有肽都為滿分為止。按照更高等級來排序，排列出各個肽的評估記錄，由此產生列表，而具有較高等級的肽(如較高的300個肽)被存為記錄中的列表。該計算機程序軟件被稱為MIMETIC。合成滿分的或幾乎滿分的肽，評估其與含靶肽的蛋白質的結合親和性，從而將具有較高結合親和性的肽用作為人工抗體肽。
可選的，用抗原免疫鼠或兔，利用產生抗體的動物的血清作為抗血清，可從血清中純化出抗體。通過用骨髓瘤細胞株融合淋巴細胞來產生雜交瘤，所述淋巴細胞獲得自動物(如用抗原免疫的鼠)的脾細胞，克隆所期望的產生抗體的雜交瘤，使之產生單克隆抗體。可是，僅在運氣好時動物才識別所期望的表位并產生抗體。用噬菌體展示方法來產生抗表位的反應性抗體，所述表位不具有針對免疫動物的抗原性，這是一個相當復雜的方法。
發明概要因此，本發明的目的是設計互補肽，利用計算機程序(如MIMETIC)預計其能與抗原蛋白的靶肽部分反應。本發明的另一個目的是通過合成所期望的肽，使互補肽能用作人工抗體肽，從而確認肽的特異結合親和力。
本發明提供了利用計算機程序設計與抗原蛋白靶肽部分的氨基酸序列互補的肽的方法。為了研究與靶位蛋白的特異結合親和力，本發明也提供了具有高特異結合親和力的人工抗體肽，使合成肽能與靶位蛋白反應。
本發明中得到了結合任意蛋白靶位氨基酸序列的互補肽，所述肽用作人工抗體肽檢測抗原蛋白。設計程序軟件MIMETIC能用于設計互補肽。由于能自由地設計人工抗體肽，所述人工抗體肽與選作靶的蛋白質任意位置反應，因此不需要通過免疫動物來產生抗體的方法了。另外，由于能迅速生產抗新蛋白質的人工抗體肽，而且不要事先制備任何抗體，因此本發明的方法能容易地構成為用于檢測新蛋白質的方法。通過免疫動物來產生抗體的方法幾乎不能預見可以生產出抗動物物種間蛋白質共有的位點的抗體。可是，由于本發明的產生人工抗體肽的方法能產生與動物物種間共有位點反應的肽，因此可以容易地構成為檢測抗原蛋白的方法。當構建利用2個或更多抗體的檢測系統(如ELISA方法)和蛋白質陣列方法時，本發明的方法相當有用，因為其能夠設計生產出抗靶分子各分離位點的人工抗體肽。
優選的
具體實施例方式
實施例1利用分析程序(MIMETIC)自動設計出互補肽，其抗AIDS病毒(人免疫缺陷病毒-1(HIV-1))反轉錄酶(本文以下簡稱為RT)每個位置上的肽，設計的肽如表1所示。通過常規的固相方法，利用肽合成儀(商品名AMS 422多肽合成儀，其由ABiMED Co.生產)將芴基甲酯基(Fmoc)氨基酸按順序連結，由此來合成設計的肽。通過常規方法將合成肽從固體支持物上釋放出來，并除去保護基團。用乙醚沉淀來收獲所得的肽，并在干燥除去乙醚后用反相HPLC純化。感染了HIV-1的PLB細胞(公認的人淋巴細胞株)培養物的上清液位于超離心管中65％和15％蔗糖溶液的分層的最上層，以26,500rpm超離心1小時來收獲HIV-1顆粒。病毒RNA通過異硫氰酸胍法(Chomezynski，P.和Sacchi，N.，RNA Isolationfrom Cultured cells，Analytical Biochemistry，162156-159，1987)來提取，提取物溶于5mM Tris緩沖液中(pH7.5)待用。包含在總RNA樣品中的全長病毒基因組的量根據常規的核糖核酸酶保護法(Kaye，J.F.等，Cis-acting Sequences Involved in Human Immunodeficiency Virus Type 1RNA Packaging，J.Virol，696588-6592，1995；和Huang，Y.等，The Role ofNucleocapsid and U5 Stem/A rich Loop Sequence in tRNA(3Lys)GenomicPlacement and Initiation of Reverse Transcription in HumanImmunodeficiency Virus Type 1，J.Virol.，723907-3915，1997)來定量。病毒基因組結合于細胞中的tRNALys3上，其能用于測定RT活性。在37℃，將約5×107個分子的RNA基因組與50ng HIV-RT、10單位的RNase和dNTP(脫氧核酸)在20μl RT緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、60mM KCl、3mM MgCl2和10mM DTT)中反應15分鐘。分子末端的序列包含CTGCTA這六個堿基。用帶有5μCi放射性的32P-dCTP將一個堿基加入到tRNALys3中，進一步將六個堿基加入，使0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、5μCi32P-dCTP和0.05mM ddATP反應。乙醇沉淀來收獲延伸的引物，并在包含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠上用自動放射線照相術分析。將用于研究抗RT活性的測試肽加入到RT反應系統，并且測定加入的堿基序列的量。結果顯示，約20μM濃度的TLMA2993、PSTW1594和ESLA2340這3個肽能抑制RT活性50％。其余7個肽中沒有觀察到抑制活性，30％的設計出的肽顯示出了抑制活性。該結果顯示，能以相當高的概率設計出具有所期望活性的肽。表1中總結了這些結果。表1顯示了被認為涉及反轉錄酶(RT)的各種位置上的氨基酸序列和用MIMETIC對這些位置而自動設計出的肽的氨基酸序列。10個肽中，3個肽抑制了RT活性。
表1
對于ESLA2340來說，抗RT的50％抑制濃度為17μM，對于TLMA2993為15μM，對于PSTW1594為15μM。在其他互補肽中沒有觀察到抗RT的抑制活性。
以下將利用ESLA2340和TLMA2993來檢測HIV反轉錄酶(HIV-RT)，確認抑制反轉錄酶的活性，并利用這些互補肽來作為人工抗體肽。96孔板的孔事先用ESLA2340覆蓋。每個孔中加入稀釋的HIV-RT溶液并使該板于4℃靜置過夜，之后洗板并往每個孔加入生物素標記的TLMA2993。讓該板在室溫靜置1小時。再次洗板，之后將過氧化物酶標記的抗生物素蛋白加入其中，在室溫反應1小時。洗板以去除未反應的抗生物素蛋白，之后用常規方法，通過加入過氧化物酶的顯色劑在室溫進行顯色反應。顯示的顏色由HIV-RT濃度而定，其顯示出人工肽抗體能應用于夾心ELISA法。
實施例2用胰蛋白酶樣酶，如凝血酶和血纖維蛋白溶酶，截去從氨基末端到精氨酸92的序列，這樣，羧肽酶原R(以下本文中簡稱為ProCPR)轉化成有活性的羧肽酶R(以下本文中簡稱為CPR)。互補肽利用本發明的分析程序MIMETIC來自動設計，所述肽相應氨基酸序列包括從ProCPR氨基末端算起的氨基酸87開始的30、24、20、15或11個氨基酸，設計的肽如表2所示。用包含上述互補肽的20個和15個氨基酸的肽(所述肽列為表2的標注(1)和(2))，來分析由凝血酶-凝血調節蛋白復合物(以下本文中簡稱為T/TM)處理ProCPR的活化反應。通過常規的固相方法，利用肽合成儀(商品名AMS 422多肽合成儀，其由ABiMED Co.生產)將芴基甲酯基(Fmoc)氨基酸按順序連結，由此來合成設計的肽。通過常規方法將合成肽釋放出來，并除去保護基團。用乙醚沉淀來收獲所得的肽，并在干燥除去乙醚后用反相HPLC純化。將包含20個和15個氨基酸的純化的肽與ProCPR在室溫反應10分鐘，接著同T/TM復合物反應。加入馬尿酰-L-精氨酸(CPR底物)在37℃反應45分鐘，根據報道的方法(Komura，H.，等，Effect of Anticoagulants in Colorimetric Assay forBasic Carboxypeptidase，Microbiol.Immunol.，46115-117，2002)測定游離的馬尿酸。加入二十肽和十五肽時，T/TM復合物將ProCPR轉化為CPR的活性分別被加入的1μM肽所抑制。所研究觀察到的2個肽對作為靶位的ProCPR的抑制效應似乎顯示出了我們命名為MIMETIC的互補肽設計程序軟件的高效率。用彈性蛋白酶和胰蛋白酶活化ProCPR時，這些肽僅僅抑制由T/TM復合物產生的活化，不抑制彈性蛋白酶和胰蛋白酶產生的活化。針對所設計的ProCPR的互補肽如表2所示。表2顯示了由MIMETIC自動設計的模擬肽，其針對ProCPR氨基酸87下游的11、15、20、24或30個氨基酸。由于糖鏈據推測連接于精氨酸86，因此省略該氨基酸，包含氨基酸87及其后的肽作為靶肽。由于羧基一側的精氨酸92位于凝血酶的裂解位點，因此設計模擬肽以跳過精氨酸92。選擇包含20個和15個氨基酸的肽，用以研究肽對ProCPR與T/TM復合物活性的作用，發現了1μM濃度的2個肽都顯示出了抑制效應。
表2
(標注1)和(標注2)是用實際合成的肽確證了能抑制ProCPR活化的肽。
包含20個氨基酸的VGGRRTRARRVLLLVLTETH(以下本文中簡稱為VGG)被確證能抑制ProCPR活化，利用表面胞質團共振分析儀(由Biacore Co.生產)確認其能與ProCPR反應。用VGG覆蓋平板并洗板，然后將包含ProCPR的稀釋的人血漿加到板上，讓它們在室溫反應1小時。洗板除去過量的血漿，然后添加抗生物素標記的ProCPR的單克隆抗體10G1，接著讓其在室溫反應1小時。洗板除去過量的10G1抗體，加入過氧化物酶標記的抗生物素蛋白使剩下的10G1抗體反應。洗滌去除未反應的抗生物素蛋白，然后通過常規方法，加入過氧化物酶顯色劑，根據過氧化物酶酶反應強度使反應溶液顯色，用平板讀數裝置測定顏色強度。由于顯出的顏色由包含ProCPR的血漿的濃度而定，因此能確認覆蓋在板上的VGG能夠用作為人工肽抗體。
權利要求
1.檢測抗原的方法，其利用與靶蛋白反應的互補肽作為人工抗體。
2.權利要求1所述的與靶蛋白反應的互補肽，其用酶、放射性同位素、生物素或抗生物素蛋白標記。
3.包括互補肽的試劑盒，其利用權利要求1和2所述的抗相同抗原的至少2種互補肽，其中一種互補肽固定在固相上，而且與所述互補肽反應的抗原或與所述抗原反應的另一種互補肽用酶、放射性同位素或生物素標記。
4.權利要求3所述的試劑盒，其包括互補肽和天然抗體識別的抗原。
全文摘要
本發明要設計合成一種與抗原蛋白靶位互補的肽，確證了其能與靶位結合，并由此提供了一種用于檢測抗原蛋白的人工肽。也就是說，為了確認能提供針對靶位的人工抗體肽，通過利用諸如設計程序MIMETIC來構建具有互補肽特異結合性的人工抗體肽，所述程序用于自動設計與肽靶位氨基酸序列相互補的肽。
文檔編號C07K14/00GK1871515SQ200480030678
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月14日 優先權日2003年10月29日
發明者岡田秀親, 岡田則子 申請人:岡田 秀親, 岡田 則子