包含lpa的化合物的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：3555980閱讀：902來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：包含lpa的化合物的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及能夠結合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的新的肽化合物，所述的化合物包括2個單獨的氨基酸序列，其中2個氨基酸序列中的至少一個能夠結合FGFR。本發明公開了該化合物的氨基酸序列并且記載了包括其的藥物組合物。本發明也涉及該化合物和包括其的藥物組合物用于治療和/或預防其中FGFR在病理中起作用的不同病理學狀況，和/或從該疾病康復的用途。本發明的新的肽化合物可通過配體呈遞組裝(Ligandpresenting assembly)(LPA)方法獲得。
            
背景技術：
            腦適應性(plasticity)和控制適應性的機制對于學習和記憶以及腦損傷后的功能恢復是很重要的。顯然神經營養性因子是在成人中樞神經系統(CNS)中持續調節腦適應性的分子種類中的一種，較少認識到但同樣深遠的是細胞粘附分子(CAMs)在適應性機制，例如長期增效作用、神經元保存和再生中的作用。然而反過來，CAMs也可改組細胞外空間并在例如阿爾茨海默氏病和多發性硬化狀況中產生驅動腦病理發展的紊亂。候選分子包括共享經典CAM許多特性的淀粉樣蛋白前體蛋白質，和可冒充為假CAM的β-淀粉樣蛋白。β-淀粉樣蛋白在阿爾茨海默氏病中起形成衰老斑的病灶作用，并且類似于CAMs提供組織神經營養性因子和其它CAMs的環境。在該環境中發展炎癥性應答并且可引發永久神經元損傷的惡性循環，所述損傷通過小神經膠質、補體和其它因子介導(Cotman等人(1998)Prog Neurobiol.55659-69)。
            
免疫球蛋白超家族的神經細胞粘附分子(CAMs)起核作用并且在發育早期和成人中的關鍵位點維持細胞群。除其粘連特性外，CAMs同嗜性和異嗜性相互作用可影響胞內的信號傳導。其可影響的事件包括細胞遷移、增殖、以及由其粘連性和信號傳輸特性所導致的分化。
            
神經細胞粘附分子NCAM是第一個被發現的神經CAM。由于已經集中研究過發現的NCAM，因此其現在已經被很好地表征(Ronn等人(2000)IntJ Dev Neurosci 18193-9)，NCAM屬于免疫球蛋白(Ig)超家族。其胞外部分由5個Ig-樣和2個纖粘連蛋白III型(F3)模塊(module)組成。NCAM幫助細胞-細胞和細胞-基底的相互作用。NCAM結合各種細胞外基質成分，例如肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素蛋白多糖、和不同類型的膠原。細胞-細胞相互作用主要通過NCAM同嗜性的相互作用而得到幫助。NCAM的不同模塊已經顯示實行不同的功能。因此，現在認為NCAM同嗜性結合依賴于最初的3個1g模塊。肝素結合序列局部化至Ig2模塊。NCAM也結合神經細胞粘附分子L1。認為這種相互作用發生在NCAM的第4個Ig模塊和L1上表達的寡甘露糖苷部分之間。NCAM的2個膜近側F3模塊已經顯示涉及成纖維細胞生長因子受體(FGFR)結合。
            
現在許多科研小組已經積累了大量證據表明支持NCAM-介導的軸突長出的胞內信號傳輸級聯與由于刺激FGFR而活化的信號轉導級聯相似(Povisen等人(2003)Neurochem Res 1127-41)。
            
成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)是4個緊密相關的受體蛋白質酪氨酸激酶的家族，包括3個Ig-樣的細胞外模塊和1個分開的酪氨酸-激酶細胞內模塊(Powers等人(2000)Endocr Relat Cancer 7165-97)。該受體被認為是形態發生、發育、血管生成和傷口愈合的關鍵調節子。FGFR活化和信號傳輸依賴于受體的二聚作用，其由FGFR天然配體、成纖維細胞生長因子(FGF)的高親合力結合誘導，并且它也需要細胞表面肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚酶的參與。成纖維細胞生長因子(FGFs)及其受體構成參與幾乎所有哺乳動物組織的許多發育和修復過程的精細信號系統，特別地它們在外周和中樞神經系統的功能中發揮重要的作用。因此，在FGF家族的23個成員當中，已經在腦中鑒定了10個(Jungnickel等人，(2004)Mol Cell and vonBohlen und Halbach(2003)Cell Tissue Res.313139-57)。
            
最近已經認為NCAM是FGFR的推定備選配體，低親合力結合配體新類別的成員。已經獲得證明NCAM和該受體之間的直接相互作用的證據(Kiselyov等人(2003)Structure(Camb)11691-701)。
            
最近已經認為已鑒定的涉及NCAM和FGFR之間直接相互作用、具有序列EVYVVAENQQGKSKA(FGL肽)的NCAM片段是用于治療多種病理失調的新候選藥物，在這些病理失調中FGFR活性的調節可能發揮重要的作用(WO 03/016351)。WO 03/016351描述了FGL肽由于結合和活化FGFR所產生的一些生物效應。根據WO 03/016351，單個拷貝(單體)肽體外呈遞至神經元細胞足夠促進細胞存活和分化作用。然而，為了獲得這種效果需要相當高濃度的這種肽。
            
肽序列，例如抗原性肽的多重呈遞已經被證明是體外擴大肽序列生物應答的有用方式(Berezin和Bock(2004)J Mol Neurosci.2233-39；Ronn等人(1999)NatBiotechnol 1710005)，并且它也已經有效用于體內動物模型(Cambon等人(2004)J Neurosci.174197-204)。
            
現在生物學活性肽序列的合成的樹枝狀聚合物正用于研究和一些臨床應用中。樹枝狀的聚合物由許多單體肽序列的拷貝組成，其在多個位點附著于核心分子由此形成支化聚合物。在核心基質中最常使用的氨基酸是賴氨酸，因為它具有2個可獲得支化反應的反應性氨基。賴氨酸核心上的肽序列多聚化被認為是多重抗原肽(MAP)呈遞(multiple antigen peptide(MAP)presentation)。在PCT/US90/02039中描述了MAP(s)(樹枝狀聚合的肽)的合成方法。
            
通常，2種途徑可用于合成樹枝狀聚合肽，即直接和間接的途徑。在兩個情形中，在Boc化學的情況下最初利用雙保護的Boc-Lys(Boc)，或在Fmoc化學的情況下利用Fmoc-Lys(Fmoc)將C-末端核心組裝到固相支持體上以獲得所需要程度的支化。
            
在直接途徑中通過眾所周知的Merrifield方法將特定的肽逐步組裝到賴氨酸基核心上來進行合成。這種逐步法產生具有C至N方向的肽。可人工合成串聯的肽鏈，或備選地可利用垂直去保護法將各個肽人工合成到核心的不同賴氨酸臂上。
            
盡管用于樹枝狀聚合肽合成的這個方法是便利的，最終產品的質量卻可能有問題，而且獲得明確產品的問題已經在文獻中有廣泛論述。在鏈式組裝期間出現問題。MAP型樹枝狀聚合物是大分子，其中各個單個肽鏈相互之間可能不受抑制地相互作用并且由此阻礙了與核心的高效偶連而導致產生需要費力純化的非同質化合物。通過例如電噴射質譜法(ES-MS)表示這些產品的特性是困難的，因此經常使用的樹枝狀的肽產品沒有充分的特性表示。
            
在間接途徑中通過使純化的未保護肽片段與核心基質偶連來進行合成。可使用2種常規方法用于這類連接，其分別以硫醇和羰基化學為基礎。
            
可通過在賴氨酸基質上摻入氯乙酰基基團然后偶連至純化的合成N-末端半胱氨酰肽以產生具有明確結構的樹枝狀聚合物來進行硫醇化學。通過利用賴氨酰基核心上的S-乙酰基和肽上的鹵代乙酰基可獲得反轉安置(reverse placement)而使硫醇在核心基質上。在羰基化學中在羰基和弱堿之間發生縮合。存在可用于這種反應的2類弱堿。第一種包括羥胺和肼，而第二種包括1，2-二-取代的部分，例如1，2-氨基乙硫醇和1，2-乙醇胺。分別在N-末端Cys和Thr或Ser中發現最后的2個基團，而縮合產物是噻唑烷和噁唑烷。可通過N-末端Ser、Thr或Cys的高碘酸鹽氧化作用獲得核心基質上的羰基。兩種方法都是本領域已知的(參見例如Lu等，(1991)MolImmunol 28623-630；Defoort等，(1992)Int J Pept Prot Res 40214-221；Drijfhout等，(1991)Int J Pept Prot Res 3727-32)。
            
與MAP型化合物相關的另一個問題是肽鏈的方向。在將所需要的肽逐步組裝到賴氨酸基核心上的直接途徑中僅僅只獲得具有C至N方向肽鏈的化合物。間接途徑提供兩個方向，C至N和N至C，但是該方法具有其它的主要缺點，例如由于二硫化物的氧化作用產生不合需要的副反應，導致不純的產品，存在于天然肽鏈中的半胱氨酸殘基的干擾，并且該方法需要優化每個合成。
            
發現肽序列增殖的最佳數目是有待解決的另一個問題。已經利用四-或八-聚合多聚物進行經MAP法的人工合成的樹枝狀肽聚合物的大部分研究。然而，包括15個或15個以上氨基酸的4-8個序列的化合物的體內應用受到該化合物穿透血腦屏障的能力問題的挑戰，如果該化合物用于治療腦，這個問題是決定性的。如果二聚體具有樹枝狀的四聚類似物的生物活性，則肽序列的二聚體可以解決這個問題。包括不同接頭的生物學活性肽二聚體的生產和用途也是本領域公知的(參見例如WO00/18791，WO00/24770)。
            
發明概述盡管由FGL的4個序列組成的FGL肽樹枝狀聚合形式已經被證明在大鼠體內是有效的(Cambon等人(2004)J Neurosci.174197-204)，本發明的作者發現初步認為樹枝狀聚合物可作為治療人類患者的藥物候選者。FGL肽樹枝狀四聚物的最終純化顯示MAP合成的產品是高度異質的并且表征其特性是很困難的。為了解決這個問題本發明的作者試圖利用已知的合成方法人工合成不同的FGF二聚體。令人驚訝地，具有與FGL樹枝狀聚合物相似生物活性的唯一FGL二聚體是通過如WO00/18791中所公開的配體呈遞組裝方法(LPA)產生的二聚體。其它的FGL二聚體，例如，如Goodwin等人(1998)Bioorg Med Chem Lett 82231-2234中公開的通過Cys殘基，或如Rajagopalan等人(1995)Int J Pept Protein Res 45173-179中公開的通過Lys殘基連接FGL序列的二聚體不具有相同的活性。
            
因此，本發明的第一個方面涉及一種包括2個單獨的肽序列的化合物，其中2個序列中的至少一個包括通式L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5的氨基酸序列，其中A、B、C、D中的一個選自疏水性的氨基酸殘基，A、B、C、D中的一個選自堿性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個選自酸性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個是Gly或Ala，以及L1、L2、L3、L4和L5選自化學鍵或具有n個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中n是0至5的整數，所述的肽序列通過通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]的接頭相互連接n和m獨立地是1至20的整數，X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、鹵素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、鹵素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m(CR2)p，其中p是0或1至20的整數，A和B獨立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、或取代的或未取代的芳香族部分。
            
通過LPA法獲得本發明所述的上述化合物。
            
在另一個方面，本發明涉及包括上述限定的化合物的藥物。
            
在另一個方面，本發明涉及利用上述化合物制造藥物來用于a)治療與手術后神經損傷、外傷性神經損傷、神經纖維髓鞘化減少、缺血后損傷相關的中樞和外周神經系統病癥，所述病癥例如起因于中風、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、亨廷頓(Huntington’s)病、癡呆，例如多血管梗塞癡呆，硬化癥、與糖尿病相關的神經退化、影響晝夜節律鐘或神經肌肉傳遞的疾病、以及精神分裂癥、情緒失調，例如狂躁抑郁癥；b)治療肌肉的疾病或病癥，包括例如器官移植后伴有神經肌肉連接功能障礙的病癥，或例如遺傳的或外傷的萎縮性肌肉疾病；治療各種器官的疾病或狀況，例如生殖腺的退化病癥、胰腺的退化病癥，例如I型和II型糖尿病，腎的退化病癥，例如腎病以及心、肝和腸的退化病癥；c)促進創傷-愈合；d)例如在急性心肌梗塞或血管生成后防止心肌細胞死亡；e)促進重建血管(revascularsation)；f)刺激學習和/或短時和/或長時記憶能力；g)防止由于局部缺血造成的細胞死亡；h)防止由于醇消費造成的機體損傷；i)治療朊病毒疾病；j)治療癌癥。 
            

            

            
圖1顯示合成LPA-型FGL二聚體(FGLL)的流程圖)圖2顯示了FGLL的HPLC純化圖譜圖3顯示了FGLD的HPLC純化圖譜圖4表明FGL肽對用多種神經毒劑處理的原代神經元(primary neuron)存活的影響。
            
使來自15天齡大鼠胚胎的多巴胺能神經元(DN)(a和b)在沒有或伴有各種濃度的肽的情況下以150,000個細胞/cm2的密度，在涂有聚-D-賴氨酸的24-孔細胞培養平板上生長6天再暴露于100μM 6-OHDA 2小時。改變培養基并加入多種濃度的FGLd。在固定培養物并用酪氨酸羥化酶免疫染色前使神經元另外生長24小時。
            
將來自19天齡大鼠胚胎的海馬神經元(HN)(c和d)以40,000個細胞/cm2的密度接種在聚-L-賴氨酸涂覆的8-孔permanox小室載片上并在含有20μM淀粉樣蛋白-β25-35肽(Aβ25-35)的培養基中，在存在多種濃度的FGLd的情況下生長24小時，再將其固定并用Hoechst 33258染色。
            
將來自出生后7天的大鼠的小腦粒狀神經元(CGN)(e和f)以100,000個細胞/cm2的密度在聚-L-賴氨酸涂覆的微孔板上在含有40mM KCl的培養基中生長7天，然后將培養基替換為含有5mM KCl、補充有多種濃度FGLd的培養基。培養2天后，固定培養物并用Hoechst 33258染色。
            
(a)-10ng/ml GDNF對用6-OHDA處理的多巴胺能神經元存活的影響。
            
(b)各種濃度的FGLd對用6-OHDA處理的多巴胺能神經元存活的影響。
            
(c)50ng/ml BDNF對用Aβ25-35處理的海馬培養物的影響。
            
(d)各種濃度的FGLd對用Aβ25-35處理的海馬神經元存活的影響。
            
(e)50ng/mlIGF-1對通過去除神經元的高鉀而誘導經受細胞程序性死亡的CGN培養物的影響。
            
(f)各種濃度的FGLd對被誘導經受細胞程序性死亡的CGN培養物的影響。
            
將來自針對各類培養物的至少4個獨立實驗的結果表示為與神經元總數相比較活的神經元的百分比±SEM。將被誘導經受細胞死亡而沒有FGL-處理的對照培養物設置為100％。當與未處理的對照相比時+p＜0.05，++p＜0.01。當與被誘導經受細胞死亡的培養物相比時*p＜0.05，**p＜0.01以及***p＜0.001。
            
圖5表明使神經元在高KCl培養基(40mM)生長6天后通過改變培養基至低KCl培養基(5mM KCl)而誘導經受細胞程序性死亡的CGN培養物中FGL肽對DNA-斷裂的影響。利用Apo-Alert細胞程序性死亡檢測試劑盒測量具有斷裂DNA的神經元的數目，并且通過計數評估TUNEL-陽性神經元部份。來自至少4個獨立實驗的結果顯示為DNA-斷裂的細胞相對于細胞總數±SEM，其中將低KCl中的對照培養物設置為100％。
            
(a)去除CGN培養物的高KCl對經受細胞程序性死亡的細胞數目的影響。
            
(b)FGLd在被誘導細胞程序性死亡的CGN培養物中的影響。
            
當與低KCl-處理的CGN培養物相比時*p＜0.05，**p＜0.01以及** *p＜0.001。
            
圖6顯示FGL對Erk1/2磷酸化的影響。使CGN以290,000個細胞/cm2的密度在聚-L-賴氨酸涂覆的微孔板上生長3天，隨后用FGLd處理10-90min，固定并用針對磷酸-p42/44的抗體染色。利用結晶紫染色劑評估神經元的總數。來自至少3個獨立實驗的結果表示為百分比±SEM，其中未處理的培養物設定為100％。當與對照相比時*p＜0.05以及**p＜0.01。
            
圖7顯示FGL對Akt磷酸化的影響。使CGN以290,000個細胞/cm2的密度在聚-L-賴氨酸涂覆的微孔板上生長3天，隨后用各種濃度的FGLL分別處理10或30分鐘，固定并用針對在Ser473上磷酸化的Akt的抗體染色。利用結晶紫染色劑評估神經元的總數。來自至少3個獨立實驗的結果表示為百分比±SEM，其中未處理的培養物設定為100％。當與對照相比時*p＜0.05。
            
圖8顯示FGFR、MEK和P13K的抑制劑對FGL-誘導的被誘導至經受細胞程序性死亡的CGN存活的影響。使CGN以100,000個細胞/cm2的密度在聚-L-賴氨酸涂覆的8-孔permanox載片上，含有40mM KCl的培養基中生長七天，此后將培養基改變為與FGLd一起的含有5mM KCl的培養基。此后加入各種濃度的MEK抑制劑PD98059(●)、P13K抑制劑LY294002(▲)和FGFR抑制劑SU5402(■)。在所有的情形中加入抑制劑后再加入10μg/ml FGLd。用肽和抑制劑培養2天后，固定培養物并用Hoechst 33258染色。來自至少4個單獨實驗的結果顯示為活神經元的數目相對于神經元總數的百分比±SEM，其中用FGLd處理的對照培養物設置為100％。
            
圖9顯示FGL肽對從多巴胺能的(●)、海馬(▲)和小腦顆粒神經元(■)突觸長出的影響。使多巴胺能神經元以100,000個細胞/cm2的密度在聚-D-賴氨酸涂覆的24-孔細胞培養平板上與各種濃度的FGLd生長72小時。隨后進行培養物的酪氨酸羥化酶免疫染色。將海馬神經元和CGN以10,000個細胞/cm2的密度接種在8-孔permanox小室載片上并在存在各種濃度的FGLd時培養24小時。隨后進行神經元的GAP-43免疫染色。來自各種神經元培養物的至少5個獨立實驗的結果顯示為百分比±SEM，其中未處理的對照設置為100％。當與對照相比時*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。
            
圖10顯示3種二聚形式的FGL肽對來自新生大鼠的海馬神經元突觸生長的影響。使海馬神經元的原代培養物以10,000個細胞/cm2的密度與各種濃度的FGLL(■)、FGLlys(▲)或FGLcys(●)生長24小時，然后進行GAP-43的免疫染色。來自至少4個獨立實驗的結果顯示為百分比±SEM，其中未處理的對照設置為100％。當與對照相比時*p＜0.01。
            
圖11顯示FGFR、MEK和P13K的抑制劑對CGN培養物中FGL-誘導的突觸長出的影響。使CGN以10,000個細胞/cm2的密度在8-孔permanox載片上，在存在FGL肽和抑制劑時生長24小時。加入濃度為12.5、25和50μM的PD98059(●)，同時加入10μg/ml的FGLd；再加入濃度為3.5、7和10μM的LY294002(▲)，同時加入27μg/ml的FGLd。加入濃度為20、40和80μM的SU5402(■)，同時加入27μg/ml的FGLd。固定處理的細胞后進行GAP-43免疫染色。來自至少4個獨立實驗的結果顯示為百分比+SEM，其中FGLd-處理的對照培養物設置為100％。虛線表明沒有FGLd-處理的培養物中的平均突觸長度。當與FGLd-處理的對照相比時*p＜0.05，**p＜0.01。
            
圖12顯示FGLd、FGL對照和溶劑對來自E19大鼠的海馬神經元原代培養物的FM 1-43脫色速率的影響。各個值表示4-8個實驗的平均值和表明S.E.M的誤差線。用5μg/ml FGLd處理任何時間段，以及用20μg/ml處理24小時對FM 1-43的卸載速率都沒有任何影響。相比之下，當與對照培養物相比時用20μg/ml FGLd處理1小時和48小時的培養物中，突觸顯示FM1-43的卸載速率顯著增長，表明在這些培養物中突觸前的應答增強。利用不成對的t檢驗比較該值。*p＝0.04(1h)以及**p＝0.0032(48h)。FGL對照是由序列EVYVVAENAAGKSKA(SEQ ID NO147)組成的對照肽。FGL序列的Gln殘基變為Ala的突變已經顯示消除了FGL活性(Kiselyov等人2003參見上文，cit)。
            
圖13表明FGLL、FGLD和FGL對照的早期枕部下給藥對大鼠記憶(社會認知測試)的影響，所述大鼠的認知損傷可通過腦室內(i.c.v.)-注射(25-35)β-淀粉樣蛋白片段來誘導。結果來自于A-β-誘導神經毒性后第7、10、和13天進行每只大鼠每次給藥5.0μg FGL的枕骨下給藥實驗。i.c.v.給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段后21天進行社會認知測試(Social Recognitiontest)，并且評估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期間確定幼仔所花費的時間之間的比率。小組中動物的數目為4至22不等。利用單向ANOVA(F(2，27)＝15.4，P＜0.0001)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(**p＜0.01)而定(Newman-Keuls post-test)。也在對照和V/V處理的小組之間與A-β/V小組(p＜0.001)相比觀察到統計上顯著的影響。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。′V/V′代表接受溶劑作為A-β和FGL的替代的大鼠。FGL對照如同上述。
            
圖14顯示FGLL和FGLd的早期枕骨下給藥對在大鼠的具帶皮層中形成淀粉樣蛋白覆蓋層的影響，其中在(25-35)β-淀粉樣蛋白(A-β)片段-誘導的神經毒性后第7、10和13天通過i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉樣蛋白片段(每只大鼠每次給藥5.0μg FGL)誘導大鼠的認知損傷。小組中動物的數目為3至13不等。利用單向ANOVA(F(2，18))＝5.2，p＝0.016)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(*p＜0.05和**p＜0.01)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V處理小組和A-β/V處理小組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.05)。A′-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖15顯示FGLL和FGLd的早期枕骨下給藥對大鼠海馬的CA3區域中形成淀粉樣蛋白覆蓋層的影響，其中在(25-35)β-淀粉樣蛋白(A-β)片段-誘導的神經毒性后第7、10和13天通過i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉樣蛋白片段(每只大鼠每次給藥5.0μgFGL)誘導大鼠的認知損傷。小組中動物的數目為2至12不等。利用單向ANOVA(F(2，15))＝9.54，p＝0.002)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V處理小組和A-β/V處理小組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.01)。A′-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖16顯示FGLL和FGLd的早期枕骨下給藥對大鼠海馬的神經元死亡的影響，其中通過i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉樣蛋白片段誘導大鼠的認知損傷。在(25-35)β-淀粉樣蛋白(A-β)片段-誘導的神經毒性后第7、10和13天每只大鼠每次枕骨下給藥5.0μg FGL對大鼠海馬的CA3區帶中神經元細胞死亡的影響。小組中動物的數目為4至8不等。利用單向ANOVA(F(3，17))＝13.76，p＜0.001)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在對照小組和A-β/V處理小組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.01)。A′-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖17表明社會認知測試中在(25-35)β-淀粉樣蛋白片段(A-β)-誘導的神經毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次給藥)的影響。i.c.v.給藥A-β片段后第44天進行社會認知測試，并且評估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期間確定幼仔所花費的時間之間的比率。每組動物的數目為4至5不等。當與A-β/V小組相比時，利用不成對的t檢驗分析結果，并且結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(*p＜0.05)而定。通過用A-β處理誘導顯著的短時記憶損傷(p＜0.05，對照和A-β/V之間的不成對t檢驗)。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖18顯示在A-β片段誘導神經毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次給藥)對大鼠具帶皮層中淀粉樣蛋白覆蓋層的影響。每組動物的數目為3至13不等。利用單向ANOVA(F(2，12)＝18.6，P＝0.002)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V處理組和A-β/V處理組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.001)。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖19顯示在(25-35)β-淀粉樣蛋白(A-β)片段誘導神經毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次給藥)對大鼠海馬的CA3區域中淀粉樣蛋白覆蓋層(amyloid burden)的影響。每組動物的數目為3至5不等。利用單向ANOVA(F(2，9)＝10.6，P＝0.004)分析結果，當與A-β/V小組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05(***p＜0.001)的p-值而定(Newman-Keuls post-test)。在對照處理組和A-β/V處理組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.01)。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖20顯示在(25-35)β-淀粉樣蛋白A-β片段誘導神經毒性后第7、10和13天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次給藥)對具帶皮層中神經元細胞死亡的影響。每組動物的數目為4至8不等。利用單向ANOVA(F(2，9)＝26.9，P＜0.001，Newman-Keuls post-test分析結果A-β/V小組與對照組相比(***p＜0.001)，以及與A-β/FGLL處理組相比(**p＜0.01)。當與A-β/V處理組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值而定(p＜0.001)。在對照處理組和A-β/V處理組之間觀察到統計上顯著的差異(p＜0.001)。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖21顯示社會認知測試中在i.c.v.施用(25-35)β-淀粉樣蛋白(A-β)片段后第7、10和13天對每只大鼠的溶劑、200μg FGLL、和400μg FGLL的3次鼻內給藥的影響。(25-35)β-淀粉樣蛋白(β-A)片段的i.c.v.給藥后第21天進行社會認知測試，并且評估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期間確定幼仔所花費的時間之間的比率。小組中動物的數目為3至8不等。結果顯示為平均值±SEM并且通過不成對的t檢驗加以分析(對照對A-β/V的p＜0.001)，單向ANOVA(F(2，19)＝5.6；p＝0.01；Newmann-Keulspost-test，A-β/V對A-β/FGLL，400的p＜0.05；以及A-β/V對A-β/FGLL，200的p＞0.05；而A-β/FGLL，400對A-β/FGLL，200的p＜0.05)。當與A-β/V處理組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p值而定(p＜0.05)。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖22顯示在i.c.v.施用(25-35)β-淀粉樣蛋白(β-A)后第7、10和13天對每只大鼠的溶劑、200μg FGLL、和400μg FGLL的3次鼻內給藥對具帶皮層中神經元細胞死亡的影響。小組中動物的數目為4至8不等。利用不成對t檢驗(對照組對A-β/V-處理組(p＜0.001)和單向ANOVA(F(2，16)＝8.6；p＝0.003)，具有Newman-Keuls post-test**p＜0.01的A-β/V對A-β/FGLL，400以及p＞0.05的A-β/V對A-β/FGLL，200)分析結果。當與A-β/V組相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(**p＜0.01)而定。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。
            
圖23顯示在開放場地測試(Open Field test)中5.9μg FGLd給藥對待測定起跳活性(Rearing Activity)的大鼠的影響。在(25-35)β-淀粉樣蛋白片段導致神經毒性后第7、10、和13天枕骨下應用所述肽。編號′1′、′2′、和′3′表明測量的周期′1′表示1-3min.，′2′表示8-10min.，以及′3′表示18-20min。′V/V′表示接受溶劑作為(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和FGLd的替代物的大鼠，每組動物的數目從9至11不等。′A-β′和′V′分別是(25-35)β-淀粉樣蛋白片段和溶劑的縮寫。利用不成對的t檢驗分析結果，并且當與第一測量周期((1-3min)相比時，結果顯著性視獲得小于0.05的p-值(*p＜0.05，**p＜0.01)而定。
            
圖24顯示在PND1、2和3時，每只大鼠幼仔通過鼻內施用2.6μg FGLL、FGLd、或FGL對照后，在PND4進行表面復原反射(Surface Righting Reflex)檢測的結果。各個處理組幼仔的數目是6。利用單向ANOVA(F＝4.05；P＝0.039)分析結果，并且Newman-Keuls測試顯示當與對照-和FGL時照組相比，FGLL(P＜0.05)和FGLd(P＜0.05)的統計上顯著的影響。FGL對照如同上述。
            
圖25顯示在PND1、2和3時，每只大鼠幼仔通過鼻內施用2.6μg FGLL、FGLd、或FGL對照后，在PND6和PND9時進行負趨地性反射(NegativeGeotaxis Reflex)測試的結果。各個處理組幼仔的數目是6。利用單向ANOVA分析結果(FPND6＝5.14；PPND6＝0.008)。在PND6，當與對照-和FGLc(FGL對照)組相比時，對于FGLL(p＜0.05)和FGLd(**p＜0.01)組觀察到統計上顯著的影響。在PND 9時，沒有觀察到FGL的顯著影響(單向ANOVAFPND9＝0.94；PPND9＝0.44)。FGL對照如同上述。
            
圖26顯示體內試驗時間過程的圖解表示。
            
圖27顯示SEQ ID NO2(EFloop)的肽在低KCl濃度情況下在大鼠腦顆粒神經元培養物中對存活的影響。在相同培養條件下用胰島素生長因子1(IGF-1)處理對照細胞。
            
圖28顯示EFL肽(SEQ ID NO2)對大鼠海馬神經元的體外神經突發生(neuritogenic)的影響。將EFL處理的培養物中軸突的長度與用溶劑(磷酸鹽緩沖鹽水)處理的培養物中軸突的長度相比。
            
發明詳述1.化合物就開發用于多種疾病和病理情況治療的有效藥物來說，能夠調節成纖維細胞生長因子受體(FGFR)功能的化合物具有很大的重要性。因此，本發明的目的是提供能夠結合FGFR并調節FGFR活性的新的化合物。根據本發明，該化合物包括至少2個肽序列，其中2個序列中的至少一個包括為能夠低親合結合FGFR的氨基酸序列所共有的結構性基序。
            
1.肽序列因此，本發明的一個方面涉及2個單獨的肽序列，其中2個單獨肽序列中的至少一個包括通式L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5  
            
的氨基酸序列，其中A、B、C、D中的一個選自疏水性的氨基酸殘基，A、B、C、D中的一個選自堿性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個選自酸性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個是Gly或Ala，以及L1、L2、L3、L4和L5選自化學鍵或具有n個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中n是0至5的整數。
            
在本文中應用表示氨基酸殘基的標準一個字母代碼以及標準的3字母密碼。氨基酸的縮寫與生化命名法則Eur.J.Biochem，1984，vol.184，第9-37頁中IUPAC-IUB Joint Commission的建議一致。說明書和權利要求書自始至終使用天然氨基酸的3字母密碼或1字母代碼。其中沒有具體說明L或D形式，可理解所述的氨基酸具有天然的L形式，參照Pure & Appl.Chem.Vol.(56(5)第595-624頁(1984)或D形式，以便形成的肽可由L形或D形的氨基酸構成，或混合的L形和D形氨基酸的序列構成。
            
若沒有具體說明，可理解本發明的肽的C-末端氨基酸以游離羧酸的形態存在，這也可說明為″-OH″。然而，本發明化合物的C-末端氨基酸可以是酰胺化的衍生物，其表示為″-NH2″。其中沒有另外說明，多肽的N-末端氨基酸包括游離的氨基，這也可指定為″H-″。
            
若沒有具體說明，氨基酸可選自任何氨基酸，不管是天然存在或非天然存在的，例如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。因此，該組包括但不限于Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His Aib、Nal、Sar、Orn、賴氨酸同系物、DAP、DAPA和4Hyp。
            
同時可修飾本發明所述的化合物/肽，例如進行氨基酸的糖基化和/或乙酰化。
            
本發明所述的堿性氨基酸殘基由氨基酸Arg、Lys、和His的殘基代表，酸性氨基酸殘基由氨基酸Glu和Asp的殘基代表，而疏水性的氨基酸殘基由氨基酸Leu、Ile、Val、Phe、Trp、和Tyr的殘基代表。在優選的實施方案中，堿性氨基酸殘基由Arg或Lys代表。
            
1.1肽序列的長度本發明的化合物可包括2個單獨的肽片段，其一起包括6-160個氨基酸殘基之間，例如6-150個氨基酸殘基，例如6-140個氨基酸殘基，例如6-130個氨基酸殘基，例如6-120個氨基酸殘基，例如6-110個氨基酸殘基，例如6-100個氨基酸殘基，例如6-90個氨基酸殘基，例如6-80個氨基酸殘基，例如6-70個氨基酸殘基，例如6-60個氨基酸殘基，例如6-50個氨基酸殘基，例如6-40個氨基酸殘基，例如6-30個氨基酸殘基，例如6-20個氨基酸殘基，例如6-10個氨基酸殘基。因此，在一個實施方案中可改變化合物的2個單獨肽片段中任何一個的氨基酸序列長度。在另一個實施方案中，化合物的各個肽片段的序列可以是相同的。
            
措辭″單獨的肽片段/序列″在本文中指肽片段/序列(兩個或兩個以上)不是通過一個氨基酸序列中的肽鍵連續連接的，但它們可通過接頭，例如下文論述的接頭相互連接。
            
因此，化合物的任何一個單獨的肽序列可獨立地由3-80個氨基酸殘基組成，例如3-70個，例如3-60個，例如3-50個氨基酸殘基，例如3-30個氨基酸殘基，例如3-20個氨基酸殘基，例如3-15個氨基酸殘基，例如3-10個氨基酸殘基。
            
在另一個實施方案中，化合物的任何一個肽序列可獨立地具有為4--80個氨基酸殘基的長度，例如4-70個，例如4-60個，例如4-50個氨基酸殘基，例如4-40個氨基酸殘基，例如4-30個氨基酸殘基，例如4-20個氨基酸殘基，例如4-15個氨基酸殘基。
            
在進一步的實施方案中，該序列可獨立地具有5--80個氨基酸殘基的長度，例如5-70個，例如5-60個，例如5-50個氨基酸殘基，例如5-40個氨基酸殘基，例如5-30個氨基酸殘基，例如5-20個氨基酸殘基，例如5-15個氨基酸殘基，例如5-10個氨基酸殘基。
            
在更進一步的實施方案中，該序列可獨立地具有6--80個氨基酸殘基的長度，例如6-70個，例如6-60個，例如6-50個氨基酸殘基，例如6-40個氨基酸殘基，例如6-30個氨基酸殘基，例如6-20個氨基酸殘基，例如6-15個氨基酸殘基，例如6-10個氨基酸殘基。
            
本發明也涉及包括2個單獨氨基酸序列的化合物，其可獨立地具有7-80個氨基酸殘基的長度，例如7-70個，例如7-60個，例如7-50個氨基酸殘基，例如7-40個氨基酸殘基，例如7-30個氨基酸殘基，例如7-20個氨基酸殘基，例如7-15個氨基酸殘基，例如8、9、10、11、12、13或14個氨基酸殘基。
            
單獨序列的長度也可為8-80個氨基酸殘基，例如8-70個，例如8-60個，例如8-50個氨基酸殘基，例如8-40個氨基酸殘基，例如8-30個氨基酸殘基，例如8-20個氨基酸殘基。或它也可能為9-80個氨基酸殘基，例如9-70個氨基酸殘基，例如9-60個氨基酸殘基，例如9-50個氨基酸殘基，例如9-40個氨基酸殘基，例如9-30個氨基酸殘基，例如9-20個氨基酸殘基。
            
包括2個單獨氨基酸序列的化合物，其中兩個序列的任一個都具有10--80個氨基酸殘基的長度，例如10-70個氨基酸殘基，例如10-60個氨基酸殘基，例如10-50個氨基酸殘基，例如10-40個氨基酸殘基，例如10-30個氨基酸殘基，例如10-20個氨基酸殘基，也在本發明的范圍內。
            
在一個優選的實施方案中，化合物包括2個單獨氨基酸序列，其中任何一個序列可獨立地具有15-80個氨基酸殘基的長度，例如15-70個氨基酸殘基，例如15-60個氨基酸殘基，例如15-50個氨基酸殘基，例如15-40個氨基酸殘基，例如15-30個氨基酸殘基，例如15-20個。
            
在本發明另一個優選的實施方案中，化合物的2個氨基酸序列中任何一個的最小長度可獨立地為16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸殘基，以及最大的長度是36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個氨基酸殘基。也優選化合物中2個單獨序列中任何一個的長度為25和36個之間的氨基酸殘基。
            
在另一個優選的實施方案中，化合物肽片段的長度可獨立地具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸殘基。9至20個氨基酸殘基范圍中的單獨肽片段長度是最優選的。
            
在本發明另一個優選的實施方案中，化合物的2個肽序列中的至少一個來源于選自細胞粘附分子、細胞-表面受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、以及金屬蛋白酶、細胞外基質分子或生長因子的多肽序列。
            
2.2肽序列的起始因此，優選化合物的2個肽序列中的至少一個來源于選自細胞粘附分子、細胞-表面受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、和金屬蛋白酶、細胞外基質分子和生長因子的多肽序列。
            
本發明的作者最近已經鑒定了FGFR配體的新類別，其在1)結合FGFR的能力和2)其對于受體的結合位點的結構不同于FGFR的天然高親合配體FGFs。新的FGFR配體能夠在FGFR上的結合位點低親合結合受體，這也不同于已知的受體FGF結合位點。根據本申請，新的低親合FGFR配體的FGFR結合位點包括含有上述基序的序列。FGFR配體的新類別包括本申請所述的蛋白質，其可具有非依賴于FGFR活性的生物功能。此外，新的低親合FGFR配體可具有1)由于其結合和活化FGFR而實現的功能，以及2)通過另外的機制而實現的功能。功能(1)和功能(2)可具有不同的生物意義。由于結合受體的相對低的親合力，本發明所述的新配體不能夠調節已經由FGF引發的受體活化。根據本發明，低親合FGFR配體的新種類包括本領域已知的分子，如細胞粘附分子、細胞表面受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、以及金屬蛋白酶、細胞外基質分子或生長因子。
            
根據本發明，細胞粘附分子可選自-神經細胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.NosP13591、P13595-01、P13595)、-神經細胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)，-神經細胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.NoP36335)-神經膠質細胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.NoQ03696；90933)，-神經細胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No000533)，-神經膠質蛋白(Neuroglian)(Swiss-Prot Ass.NoP91767、P20241)，-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.NosQ92823、O15179、Q9QVN3-軸突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.NosQ02246、P22063、P28685)、-軸突-締合的細胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.NoNP_031544.1；Swiss-Prot Ass.NoQ8TC35)，-髓磷脂-締合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.NoP20917)，-神經細胞粘附分子BIG-1(Swiss-Prot Ass.NoQ62682)，-神經細胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.NoQ62845)，-成束蛋白(Fascilin)(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.NoP22648)，-神經細胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.NosQ9UQ52、P97528、Q9JMB8)、  
            
-神經細胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos094779，P07409，P97527)，-鈣粘著蛋白(Cadherin)(Swiss-Prot Ass.NoQ9VW71)，-連接粘著分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9JKD5、088792)，-神經細胞粘附F3/F11(接觸蛋白(Contactin))(Swiss-Prot Ass.NosQ63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、093250)，-神經束蛋白(Neurofascin)(Swiss-Prot Ass.NosQ90924、Q91Z60；O42414)，-B-淋巴細胞細胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.Nos；Q9R094、P20273)，-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.NosQ92859、P97603、Q90610、P97798)，-細胞胞間細胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.NosQ8TAM9、Q60625)或-半乳糖結合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot，Q9JKX2、Q9NZ03)，-半乳糖結合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.NoQ8K419；P38552)、或其片段、或其變體。
            
功能性的細胞-表面受體可選自-成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)(Swiss Prot Ass.NosQ9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)、-成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96KM2、P21802、Q63241)，-成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.NosQ95M13、AF487554、Q99052)，-成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.NoQ91742)，-神經營養蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.NoQ8WXJ5)，-白細胞抗原相關蛋白質-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.NosQ9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)，  
            
-腎升壓素(Nephrin)(nephrin)(Swiss-Prot Ass.NosQ925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.NosQ64699、Q13332、O75870)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體κ型(R-PTP-κ)(Swiss swissprot Prot Ass.NoQ15262)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.NosQ8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)，-Ephrin A型受體8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受體EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos009127、P29322)，-Ephrin A型-受體3(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受體ETK1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.NoP29318)，-Ephrin A型-受體2(Swiss-Prot Ass.NoQ8N3Z2)-胰島素受體(IR)(Swiss-Prot Ass.NoQ9PWN6)-胰島素-樣生長因子-1受體(IGF-1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)-胰島素-相關的受體(IRR)(Swiss-Prot Ass.NoP14616)，-酪氨酸-蛋白激酶受體Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos06805、P35590、Q06806)，-環形受體(Roundabout receptor)-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos044924、AF041082、Q9Y6N7)，-神經煙酸乙酰膽堿受體(Neuronal nicotinic acetylcholine receptor)α3亞基(CHRNA3)(Swiss Prot Ass.NosQ8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)，-神經乙酰膽堿受體α6亞基(Swiss-Prot Ass.NosQ15825、Q9ROW9)，-血小板源性生長因子受體β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.NosQ8R406、Q05030)，-白細胞介素-6受體(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.NoQ00560)，-白細胞介素-23受體(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.NoAF461422)，-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同細胞因子受體(Swiss-Prot Ass.NoP32927)，-細胞因子受體-樣分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.NoQ9JM58)，  
            
-I類細胞因子受體(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.NoQ9UHH5)-神經突起生長導向因子(Netrin)-1受體DCC(Swiss-Prot Ass.NoP43146)，-白細胞Fc受體-樣蛋白質(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96PJ6、Q96KM2)，-巨噬細胞清除受體2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.NoQ91YK7)，或-粒性白細胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.NoQ99062)，或其片段、或其變體。
            
根據本發明的硫酸乙酰肝素蛋白聚酶是基底膜蛋白聚糖(perlecan)(Swiss Prot Ass.NoP98160)，或其片段或其變體。
            
金屬蛋白酶可選自-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoQ05910)，-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.NosQ9H013、O35674)，-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoP78325)，-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos043184、Q61824)，-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.NosQ9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)，-ADAM-33前體(Swiss-Prot Ass.NosQ8R533、Q923W9)，-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.NosQ13433、Q61072)，-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.NosQ9H2U9、O35227、Q63180)-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.NoQ8R533)-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYV0、O88839、Q13444)，-包含金屬蛋白酶-去整合蛋白結構域的蛋白質(Metalloproteinase-desintegrin domain containing protein)(TECAM)(Swiss-Prot Ass.NoAF163291)，-金屬蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.NosO95204、Q9BS16)、或其片段或其變體。
            
細胞外基質分子可選自-膠原蛋白VII型(Swiss-Prot Ass.NoQ63870)，-纖粘連蛋白(Swiss-Prot Ass.NosQ95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)，或  
            
-肌腱蛋白(tenascin)-R(Swiss-Prot Ass.NosQ15568、O00531、Q90995、P10039)，或其片段、或其變體。
            
根據本發明的生長因子是細胞因子樣因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.NoO75462，或其片段、或其變體。
            
本文中術語″片段″是指具有預定蛋白質/多肽氨基酸序列長度的大約25-99％的氨基酸序列的多肽，所述的多肽是選自上述小組的預定多肽的功能性同系物。
            
本文中術語″變體″是指具有i)與預定多肽的序列50-100％同源的、和/或ii)包括其它化學部分，如各種翻譯后修飾的氨基酸殘基，例如磷酸化、酰化作用、氨基酸殘基的糖基化，和/或iii)與另外的生物分子，例如多肽、脂類或碳水化合物物理相關或化學結合，例如共價結合的氨基酸序列的多肽，所述的多肽是選自上述小組的預定多肽的功能同系物。術語″物理性締合的″是指通過疏水性或靜電相互作用締合的分子。
            
本文中術語預定多肽的″功能性同系物″是指具有預定多肽的一種或多種生物功能的分子，在優選的實施方案中，所述一個或多個預定多肽的生物功能通過結合和活化FGFR的機制而實現。
            
如上述已經討論到，本發明優選的功能性細胞-表面受體是選自成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)家族的受體。本發明所述的上述分子包括對FGFR的備選低親合結合位點，其不同于FGFs的已知FGFR高親合結合位點。
            
上述分子的低親合FGFR結合位點的特征在于它包括與序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)具有至少60％、更優選至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、更優選95％同源性的氨基酸序列，序列EVYVVAENQQGKSKA來源于神經細胞粘附分子(NCAM)，并且在本領域中是已知的，如NCAM的FGL肽。將一個氨基酸序列與另外氨基酸序列的同源性定義為2個排序序列中相同氨基酸的百分比。可利用公知的算法計算氨基酸序列之間的同源性，例如BLOSMM 30、BLOSMM 40、BLOSMM 45、BLOSMM 50、BLOSMM 55、BLOSMM 60、BLOSMM 62、BLOSMM 65、BLOSMM 70、BLOSMM 75、BLOSMM 80、BLOSMM 85、或BLOSMM 90。
            
在另外的實施方案中，上述分子的FGFR結合位點包括與序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)相比具有至少60％、更優選至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、更優選95％正性(positive)氨基酸相匹配的氨基酸序列。本申請定義這種序列為預定序列，例如SEQ IDNO1的變體。正性氨基酸相匹配定義為2個比較序列中具有相同位置的氨基酸的物理和/或化學特性所限定的同一性或相似性。本發明優選的正性氨基酸相匹配是K至R、E至D、L至M、Q至E、I至V、I至L、A至S、Y至W、K至Q、S至T、N至S以及Q至R。
            
在另外的實施方案中，FGFR的FGFR新結合位點可包括如下序列的同系物或片段，該序列i)與序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)具有至少60％、更優選至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、更優選95％的同源性，或ii)與序列EVYWAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)相比具有至少60％、更優選至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、更優選95％的正性氨基酸相匹配。
            
在另一實施方案中，本發明的新的低親合FGFR配體的FGFR結合位點其特征在于特定的3D特性，就是它基本上可由一個或多個″鏈-環-鏈″結構性基序組成。它是上述討論到的序列的優選特性。根據本發明，鏈-環-鏈結構是通式L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5的氨基酸序列的優選3D結構，其中A、B、C、D中的一個選自疏水性的氨基酸殘基，A、B、C、D中的一個選自堿性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個選自酸性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個是Gly或Ala，以及L1、L2、L3、L4和L5選自化學鍵或具有n個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中n是從0至5的整數。
            
根據本發明，2個單獨氨基酸序列的至少一個優選包括上述鑒定的結構性基序中的至少一個并且優選來源于任何上述分子。本發明所述的這種序列可選自SEQ ID NOs1-146中的任何序列。在一些實施方案中，2個單獨序列中的一個可選自下文鑒定的小組1至12中的一組序列，并且2個單獨序列中的另一個可選自另外組的序列。在其它的實施方案中，所述序列可選自相同組的序列。
            
因此，在一個實施方案中，所述化合物的一個氨基酸序列或所述序列的任一個氨基酸序列可獨立地選自第1組的序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)，NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)，ATNRQGKVKAFAHL(SEQ ID NO3)，RYVELYWADSQEFQK(SEQ ID NO4)VAENSRGKNVAKG(SEQ ID NO5)，GEYWCVAENQYGQR(SEQ ID NO6)，RLAALNGKGLGEIS(SEQ ID NO7)，KYIAENMKAQNVAKEI(SEQ ID NO8)，TIMGLKPETRYAVR(SEQ ID NO9)。
            
在另一個實施方案中，至少2個肽序列中的至少一個可選自由如下序列組成的第2組的序列NMGIWVQAENALG(SEQ ID NO11)，IWVQAENMLG(SEQ ID NO12)，EIWVEATNRLG(SEQ ID NO13)，VWVQAANALG(SEQ ID NO14)，EVWIEKDPAKGRI(SEQ ID NO15)，ATNKGGEVKKNGHL(SEQ ID NO16)。
            
在另一個實施方案中，至少2個肽序列中的至少一個可選自由如下序列組成的第3組的序列KYVELYLVADYLEFQK(SEQ ID NO17)，RYVELYVWDNAEFQ(SEQ ID NO18)，KYVELVIVADNREFQR(SEQ ID NO19)，KYIEYYLVLDNGEFKR(SEQ ID NO20)，RYLELYIVADHTLF(SEQ ID NO21)，KYVELFIVADDTVYRR(SEQ ID NO24)，KFIELFVVADEYVYRR(SEQ ID NO25)，KIVEKVIVADNSEVRK(SEQ ID NO26)，VELVIVADHSEAQK(SEQ ID NO27)  
            
另一個實施方案涉及選自由如下序列組成的第4組的序列VAENSRGKNIAKG(SEQ ID NO28)，IAENSRGKNVARG(SEQ ID NO29)，AENSRGKNSFRG(SEQ ID NO30)，IASNLRGRNLAKG(SEQ ID NO31)，IPENSLGKTYAKG(SEQ ID NO32)，IAENMKAQNEAK(SEQ ID NO33)。
            
在另一個實施方案中，該序列可選自由如下序列組成的第5組的序列GEYWCVAKNRVGQ(SEQ ID NO35)，GSYTCVAENMVGK(SEQ ID NO36)，GKYVCVGTNMVGER(SEQ ID NO37)，GNYTCWENEYG(SEQ ID NO38)，GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO39)，QYYCVENGYG(SEQ ID NO40)，GEYYQEAEQNGYG(SEQ ID NO41)，GNYTCLVENEYG(SEQ ID NO42)，GMYQCLAENAYG(SEQ ID NO43)，GMYQCAENTHG(SEQ ID NO44)，GIYYCLASNNYG(SEQ ID NO45)，GGYYCTADNSYG(SEQ ID NO46)，GEYQCFARNDYG(SEQ ID NO47)，GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO48)，GEYQCFARNKFG(SEQ IDNO49)，GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO50)，GGYYCTADNNYG(SEQ ID NO51)，GNYSCEAENAWGTK(SEQ ID NO52)，GEYTCLAENSLG(SEQ ID NO53)，GEYECVAENGRLG(SEQ ID NO54)，GNYTCVVENKFGR(SEQ ID NO55)，GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO56)，GEYFCVASNPIG(SEQ ID NO57)，  
            
EYTCIANNQAGE(SEQ ID NO58)，GMYQCVAENKHLG(SEQ ID NO59)，GEYMCTASNTIGQ(SEQ ID NO60)，EYVCIAENKAGEQ(SEQ ID NO61)，GDYTLIAKNEYGK(SEQ ID NO62)，GFYQCVAENEAG(SEQ ID NO63)，GKYECVATNSAGTR(SEQ ID NO64)，GEYFCVYNNSLG(SEQ ID NO65)，GEYECAATNAHGR(SEQ ID NO66)，GAYWCQGTNSVGK(SEQ ID NO67)，GTYSCVAENILG(SEQ ID NO68)。
            
在另一實施方案中，一個或兩個序列選自第6組RVAAVNGKGQGDYS(SEQ ID NO69)，RVAAINGCGIGPFS(SEQ ID NO70)，AVLNGKGLG(SEQ ID NO71)，RLAAKNRAGLGE(SEQ ID NO73)，RLGWTGKDLGEI(SEQ ID NO74)。
            
在另一實施方案中，所述序列可選自第7組TVTGLKPETSYMVK(SEQ ID NO75)，TITGLQPSTRYRV(SEQ ID NO77)，TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO78)，TLQGLRPETAYELR(SEQ ID NO79)，TLRGLRPETAYELR(SEQ ID NO80)，TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO81)，TISGLKPDTTY(SEQ ID NO83)，TLQGLKPDTAY(SEQ ID NO84)，LRGLKPWTQYAV(SEQ ID NO85)，IDGLEPDTEYIVR(SEQ ID NO86)，LQGLKPWTQYAI(SEQ ID NO87)，TITGLEPGTEYTIQ(SEQ ID NO88)，GLKPWTQYAV(SEQ ID NO89)，  
            
TLASLKPWTQYAV(SEQ ID NO90)，LMGLQPATEYIV(SEQ ID NO91)。
            
在其它的實施方案中，本發明可涉及包括第8、9、10或11組的序列的化合物，其中第8組由下列序列組成KGMGPMSEAVQFRT(SEQ ID NO92)，TLTGLKPDTTYDVK(SEQ ID NO93)，ISGLQPETSYSL(SEQ ID NO94)，TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO95)，TISGLTPETTYSI(SEQ ID NO96)，GNYSCLAENRLGR(SEQ ID NO97)，GNYTCWENRVG(SEQ ID NO98)，NGVLTGYVLRY(SEQ ID NO101)，NGVLTGYNLRY(SEQ ID NO102)，NGNLTGYLLQY(SEQ ID NO103)，VDENGVLTGYKIYY(SEQ ID NO104)，THNGALVGYSVRY(SEQ ID NO105)，NGILTEYILKY(SEQ ID NO106)，NGILIGYTLRY(SEQ ID NO107)，THSGQITGYKIRY(SEQ ID NO108)，NGKITGYIIYY(SEQ ID NO109)，NGILTEYTLKY(SEQ ID NO111)，LDPNGIITQYEISY(SEQ ID NO112)，NGKITGYIIYY(SEQ ID NO113)，第9組由下列序列組成HLEVQAFNGRGSGPA(SEQID NO114)，HLTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO115)，HLSVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO116)，HLAVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO117)，NLEVRAFNSAGDGP(SEQ ID NO118)，HLTVLAYNSKGAGP(SEQ ID NO119)，LRVLVFNGRGDGP(SEQ ID NO120)，  
            
HIDVSAFNSAGYGP(SEQ ID NO121)，HLAVELFNGR(SEQ ID NO122)，LELQSINFLGGQPA(SEQ ID NO123)，HFTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO124)，HLEVQAFNGRGSQPA(SEQ ID NO125)，第10組由下列序列組成VIADQPTFVKYLIK(SEQ ID NO126)，TIKGLRPGWYEGQ(SEQ ID NO127)，TLDDLAPDTTYLVQ(SEQ ID NO129)，TVSDVTPHAIYTVR(SEQ ID NO130)，IIRGLNASTRYLFR(SEQ ID NO131)，TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO132)，TLTGLKPGTEYEVR(SEQ ID NO133)，RVTGLTPKKTYEFR(SEQ ID NO135)，LTGLKPGTEYEFR(SEQ ID NO136)，以及第11組由下列序列組成EVRVQAVNGGGNGPP(SEQ ID NO137)，LIKVVAINDRGE(SEQ ID NO138)，WSIIAVNGREE(SEQ ID NO139)，WSVYAQNQNGE(SEQ ID NO140)，TISLVAEKGRHK(SEQ ID NO141)，HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO142)，HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO143)，HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO144)，EFRVRAVNGAGEG(SEQ ID NO145)，在一些實施方案中，該化合物可包括選自第12組序列的序列KYVEMFVWNHQRFQ(SEQ ID NO22)，RYVELFIWDKERY(SEQ ID NO23)，ALNGQGLGATS(SEQ ID NO72)，TLTGLKPSTRYRI(SEQ ID NO76)，TVSGLKPGTRY(SEQ ID NO82)，  
            
GTYHCVATNAHG(SEQ ID NO99)，LSHNGVLTGYLLSY(SEQ ID NO100)，LSHNGIFTLY(SEQ ID NO110)，TLTELSPSTQYTVK(SEQ ID NO128)，GPEHLMPSSTYVAR(SEQ ID NO134)，VARVRTRLAPGSRLS(SEQ ID NO146)。
            
或QFIAENMKSHNETKEV(SEQ ID NO34)。
            
本發明也涉及具有SEQ ID NOS1-146所示預定序列長度的至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少95％的上述肽序列的片段，其中片段和所述預定序列之間的氨基酸序列同源性是100％。本文中的變體定義為與選自SEQ ID NOS1-146的序列具有至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選95％同源性的氨基酸序列，或與選自SEQ IDNOS1-146的序列相比具有至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選95％正性氨基酸相匹配的氨基酸序列。正性氨基酸相配定義為2個比較序列中具有相同位置的氨基酸的物理和/或化學特性所限定的同一性或相似性。本發明優選的正性氨基酸相配是K至R、E至D、L至M、Q至E、l至V、l至L、A至S、Y至W、K至Q、S至T、N至S以及Q至R。將一個氨基酸序列與另一個氨基酸序列的同源性定義為2個排序序列中相同氨基酸的百分比。本文中同系物定義為與SEQ ID NOS1-146所示的任何序列具有小于60和大于19％，例如50-59％，例如55％，例如40-49％，例如45％，例如30-39％，例如35％，例如20-29％，例如25％同源性的氨基酸序列，其保持預定序列的一些物理特性，例如三維結構或一些功能特性，例如與另一個分子，特別是受體分子相互作用的能力。本文中同系物的變體定義為與選自SEQ ID NOS1-146的任何序列的同系物相比具有至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選95％正性氨基酸相匹配的氨基酸序列。正性氨基酸相匹配的優選實施方案如上述所限定的。本發明涉及保持了預定序列與下文限定的細胞-表面受體相互作用能力的片段、變體和同系物。
            
在本發明的一個優選實施方案中，選擇的序列是EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO1)。在另一個實施方案中優選的序列是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)。
            
根據本發明，該化合物可包括選自上述序列(SEQ ID NO1-146)中任何的至少2個不同的單獨肽序列。該化合物還可包括具有與選自任何上述序列的氨基酸序列相同的2個單獨的序列。
            
在一個優選的實施方案中，該化合物包括2個相同的單獨肽序列，其中該序列是EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO1)。在另一個優選的實施方案中，該化合物包括2個相同的單獨肽序列，其中該序列是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)。在另一個優選的實施方案中，該化合物包括2個不同的單獨肽序列，其中該序列中的一個是EVYVVNAENQQGKSKA(SEQ ID NO1)，而另一個是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)。其它優選的實施方案包括包含2個單獨氨基酸序列的化合物，該氨基酸序列包括SEQ ID NO1或2的片段、變體或同系物，其中所述的片段、變體和同系物如上述所限定。在優選的實施方案中，SEQ ID NO1的片段、同系物或變體選自上述鑒定的第1、6、11和12組的SEQ ID NOs3-9、69-74、100、125和137-146的序列，而SEQ ID NO2的片段、同系物或變體選自上述鑒定的第7、9和10組的SEQID NOs75-91、114-123、126-132的序列。
            
在一個實施方案中化合物的2個單獨氨基序列中的至少一個基本上包括或由兩個或多個由一個肽鏈中的肽鍵共連接的SEQ ID NOS1-146的連續肽序列組成。在其它的實施方案中，共連接的肽序列可以是相同的，例如SEQ ID NO1在一個肽鏈中重復2至5次，或例如SEQ ID NO2在肽鏈中重復2至5次，或例如序列SEQ ID NO3-146中的任何序列在肽鏈中重復2至5次由此形成由相同單體組成的低聚物(多聚體)。在其它的實施方案中形成低聚物的肽片段單體可在氨基酸序列方面有差異，例如在由2個單體組成的低聚物(二聚體)中，其中一個具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，而另一個具有SEQ ID NO2，或SEQ ID NOS3-146所示序列組的任何氨基酸序列。根據本發明，低聚物(多聚體)可由2、3、4、5、6、7、8、9或10個重復序列(單體)組成。
            
由2個單獨肽序列組成的化合物通過接頭相互連接，其中所述的單獨肽序列中的每一個是SEQ ID NOS1-146中任何序列的單個拷貝，這是本發明優選的化合物。更優選的化合物中2個單獨肽序列中的每一個是SEQID NO1的序列，或化合物中2個單獨肽序列中的每一個是SEQ ID NO2的序列。
            
化合物中單獨肽序列的方向可以是N至C，C至N或是混合的。措辭″N至C方向″是指2個單獨的序列通過其N-末端氨基酸殘基與接頭相連，例如結構(COOH)肽序列(NH2)-接頭-(NH2)肽序列(COOH)的化合物。措辭″C至N方向″是指2個預定的序列通過其C-末端氨基酸殘基與接頭相連，例如結構(NH2)肽序列(COOH)-接頭-(COOH)肽序列(NH2)的化合物。術語″混合的方向″是指2個預定的序列通過其C末端氨基酸殘基或N-末端與接頭相連，例如一個肽序列通過其N-末端氨基酸殘基而另一個通過其C-末端氨基酸殘基，例如作為類型(NH2)肽序列(COOH)-接頭-(NH2)肽序列(COOH)的化合物。
            
1.3同類物根據本發明，化合物的2個單獨的肽序列通過接頭相連接。根據本發明，接頭分子選自非手性的二-、三-或四羧酸，所述的酸具有通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]其中n和m獨立地是從1至20的整數，X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、鹵素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、鹵素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、其中p是0或從1至20的整數，A和B獨立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分。
            
術語C1-10烷基是指具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基和叔丁基。
            
術語C2-10鏈烯基是指具有2-10個碳原子的直鏈或支鏈鏈烯基基團，例如乙炔基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
            
術語環狀部分是指環己烷和環戊烷。
            
術語芳香族部分是指苯基。
            
措辭″A和B形成環狀的、雜環的或芳香族部分″表示環己烷、哌啶、苯和吡啶。
            
根據本發明，使包括兩個或多個上述限定的氨基酸序列的2個單獨的肽序列相互連接以便這2個肽序列中的一個共價結合選自上述限定分子的接頭分子的2個羧基中的一個，而另一個肽序列共價結合所述接頭分子的另一個羧基。肽序列分別通過N-或C末端氨基酸殘基的氨基或羧基基團共價結合接頭。
            
因此，本發明的化合物具有通式COOH/CONH2-肽序列-NH-CO-接頭-CO-NH-肽序列-COOH/CONH2或NH2-肽序列-CO-NH-接頭-NH-CO-肽序列-NH2。
            
2.化合物的生產2.1單獨的肽序列的生產可通過任何常規的合成方法、重組DNA技術、該肽序列所來源的全長蛋白質的酶促裂解，或所述方法的組合來制備本發明的肽序列。
            
重組制劑因此，在一個實施方案中使用重組DNA技術生產本發明的肽。
            
可通過已建立的標準方法合成制備編碼肽或該肽所來源的相應全長蛋白質的DNA序列，例如由Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Lett.221859-1869所描述的磷酸脒方法，或由Matthes等人，1984，EMBO J.3801-805所描述的方法。根據磷酸脒方法，例如在自動的DNA合成儀中合成寡核苷酸，使其純化、退火、連接和克隆到合適的載體中。
            
也可通過斷裂編碼肽起源的相應全長蛋白質的DNA序列，根據標準方法利用DNA酶I制備編碼肽的DNA序列(Sambrook等人，MolecularcloningA Laboratory manual.2 rd ed.，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本發明涉及選自上述鑒定的蛋白質組的全長蛋白質。備選地可利用特異的限制內切核酸酶使本發明的編碼全長蛋白質的DNA變成片段。進一步利用Sambrook等人，分子克隆A Laboratory manual.2rd ed.，CSHL Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所描述的標準方法純化DNA的片段。
            
編碼全長蛋白質的DNA序列也可具有基因組或cDNA起源，例如根據標準技術通過制備基因組或cDNA文庫，以及利用合成的寡核苷酸探針雜交篩選編碼全部或部分全長蛋白質的DNA序列而獲得(cf.Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)。例如如US 4,683，202或Saiki等人，1988，Science 239487-491所描述的，也可利用特異的引物通過聚合酶鏈式反應制備DNA序列。
            
然后將DNA序列插入重組的表達載體，其可以是任何載體，其可便利地經受重組DNA方法。載體的選擇經常依賴于其將被導入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復制的載體，即以染色體外的實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如質粒。備選地，載體可以是當被導入宿主細胞時，整合到宿主細胞基因組中并與已經整合進入其中的染色體一起復制的載體。
            
在載體中，編碼肽或全長蛋白質的DNA序列應可操作地與合適的啟動子序列連接。啟動子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性并且可來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用于在哺乳動物細胞中指導編碼DNA序列轉錄的合適啟動子的實例是SV 40啟動子(Subramani等人，1981，Mol.Cell Biol.1854-864)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter等人，1983，Science 222809-814)或腺病毒2的主要晚期啟動子。用于昆蟲細胞的合適啟動子是多角體蛋白啟動子(Vasuvedan等人，1992，FEBS Lett.3117-11)。用于酵母宿主細胞的合適啟動子包括來自酵母糖分解基因(Hitzeman等人，1980，J.Biol.Chem.25512073-12080；Alber和Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1419-434)或乙醇脫氫酶基因(Young等人，1982，in Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals，Hollaender等人，eds.，Plenum Press，紐約)、或TPI1(US 4,599，311)或ADH2-4c(Russell等人，1983，Nature 304652-654)啟動子的啟動子。用于絲狀真菌宿主細胞的合適啟動子是例如ADH3啟動子(McKnight等人，1985，EMBO J.42093-2099)或tpiA啟動子。
            
也可將編碼DNA序列與合適的終止子可操作連接，例如人生長激素終止子(Palmiter等人，op.cit.)或(用于真菌宿主)TPI1(Alber和Kawasaki，op.cit.)或ADH3(McKnight等人，op.cit.)終止子。載體可進一步包括例如多聚腺苷酸信號(例如來自SV 40或腺病毒5 Elb區域)、轉錄增強序列(例如SV 40增強子)和翻譯增強序列(例如編碼腺病毒VA RNAs元件)的元件。
            
重組表達載體可進一步包括能夠使載體在所述的宿主細胞中復制的DNA序列。這種序列的實例(宿主細胞是哺乳動物細胞時)是復制的SV40原點。載體也可包括可選擇的標記，例如其產物補充宿主細胞中缺陷的基因，例如編碼二氫葉酸還原酶的基因(DHFR)或賦予藥物抗性的基因，例如新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。
            
用于連接分別編碼肽或全長蛋白質、啟動子和終止子的DNA序列，以及將其插入包含為復制所必需的信息的合適載體的方法是本領域的技術人員所公知的(參照，例如，Sambrook等人，op.cit.)。
            
為了獲得本發明的重組肽，可將編碼的DNA序列與第二個肽編碼序列和蛋白酶裂解位點編碼序列有效融合，產生編碼融合蛋白質的DNA結構，其中將蛋白酶裂解位點編碼序列置于HBP片段和第二個肽編碼DNA之間，將其插入重組表達載體，并且在重組的宿主細胞中表達。在一個實施方案中，所述的第二肽選自但不限于谷胱甘肽-S-還原酶、小牛胸腺素、細菌硫氧還原蛋白或人泛素天然的或合成的變體、或其肽。在另一個實施方案中，包括蛋白酶裂解位點的肽序列可以是具有氨基酸序列IEGR的因子Xa、具有氨基酸序列DDDDK的腸激酶、具有氨基酸序列LVPR/GS的凝血酶、或具有氨基酸序列XE裂解位點的水解無色桿菌(Acharombacter lyticus)。
            
被導入表達載體的宿主細胞可以是能夠表達肽或全長蛋白質的任何細胞，并且優選為真核細胞，例如無脊椎動物(昆蟲)細胞或脊椎動物細胞，例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞或哺乳動物細胞，特別是昆蟲和哺乳動物細胞。合適的哺乳動物細胞系的實例是HEK293(ATCCCRL-1573)、COS(ATCCCRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632，ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61)細胞系。轉染哺乳動物細胞并且表達被導入細胞的DNA序列的方法在例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1327-341；Loyter等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79422-426；Wigler等人，1978，Cell 14725；Corsaro和Pearson，1981，in Somatic Cell Genetics 7，p.603；Graham and vander Eb，1973，Virol.52456；和Neumann等人，1982，EMBO J.1841-845中有描述。
            
備選地，真菌細胞(包括酵母細胞)可用作宿主細胞。合適的酵母細胞的實例包括酵母屬(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.)，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的細胞。其它真菌細胞的實例是絲狀真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)或脈孢菌(Neurospora spp.)，特別是米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的細胞。在例如EP 238 023中描述了曲霉用于蛋白質表達的用途。
            
用于培養細胞的培養基可以是適于使哺乳動物細胞生長的任何常規培養基，例如含有適當添加物的含有血清或無血清的培養基，或用于使昆蟲、酵母或真菌細胞生長的合適培養基。可從商業供應商獲得合適的培養基或可根據公開的處方(例如，美國典型培養物保藏中心的目錄)制備合適的培養基。
            
然后可從培養基中通過常規方法回收由細胞重組產生的肽或全長蛋白質，包括通過離心或過濾從培養基分離宿主細胞，通過例如硫酸銨的鹽方法沉淀上清液或濾出液的蛋白質成分，通過多種色譜分析方法，例如HPLC、離子交換色譜法、親和色譜法等進行純化。
            
合成的制劑用于合成生產肽的方法是本領域公知的。可在Synthetic PeptidesAUser′s Guide(Advances in Molecular Biology)，Grant G.A.ed.，OxfordUniversity Press，2002中，或在Pharmaceutical FormulationDevelopment ofPeptides and Proteins，Frokjaer and Hovgaard eds.，Taylor和Francis，1999中發現生產合成肽的詳細說明以及實際建議。
            
可例如利用Fmoc化學和Acm-保護的半胱氨酸合成肽。純化后通過反相HPLC進一步加工肽以獲得例如環狀或C-或N-末端修飾的同工型。用于環化和末端修飾的方法是本領域已知的并且在上述引用的手冊中有描述。
            
在優選的實施方案中，合成生產，特別地通過序列輔助的肽合成(SAPS)方法生產本發明的肽序列。
            
序列輔助的肽合成(SAPS)可在裝備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯導管中分批合成肽，或以連續流動形式的聚酰胺固相法合成肽(Dryland，A.和Sheppard，R.C.，(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，125-137.)，其在完全自動的肽合成儀上利用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)作為N-a-氨基保護基以及用于側鏈功能的合適共有保護基團而實現。
            
下列是當使用SAPS用于合成本發明的肽片段時可能有用的化合物的列表以及方法的描述。
            
化合物和方法1.溶劑可使DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedelde-Haen，德國)經過用強陽離子交換樹脂填充的柱子，例如Lewatit S 100MB/H強酸，Bayer AG Leverkusen，德國進行純化，并且如果存在游離的胺則在使用前通過加入3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-Oli)產生黃色(Dhbt-O-陰離子)來分析游離的胺。
            
可直接使用DCM(二氯甲烷，分析純級，Riedelde-Maen，德國)而不用純化。
            
2.氨基酸Fmoc-保護的氨基酸和相應的五氟代苯基(Pfp)酯可從MilliGen，英國、NovaBiochem，瑞士、和Bachem，瑞士購買，并且來自NovaBiochem，瑞士的Dhbt-酯是合適的側鏈保護形式。
            
Boc保護的氨基酸可從Bachem，瑞士購買。
            
3.偶連試劑二異丙基碳二亞胺(DIC)可從RiedeIde-Hen，德國購買并在使用前進行蒸餾。
            
二環己基碳二亞胺(DCC)可從Merck-Schuchardt，Niinchen，德國購買并通過蒸餾純化。O-苯并三嗪基-N，N，N″，N″-四甲基脲陽離子四氟化碳(TBTU)(PerSeptive Biosystems Gmbtl Hamburg，德國)。
            
4.接頭HMPA，Novabiochem，瑞士；4-羥甲基苯甲酸，Novabiochem；4-甲氧基扁桃酸，Aldrich，德國；HMPB，Novabiochem；AM，Novabiochem；3-(4-羥甲基苯氧基)丙酸，Novabiochem，使其作為以DIC方式產生的預先1-羥基苯并三唑(HObt)酯與樹脂偶連。
            
可直接使用外消旋的4-甲氧基扁桃酸(98％純，Aldrich，德國)作為接頭或通過用(+)-辛可寧堿(85％純，Aldrich，德國)處理分解，產生旋光的接頭(+)-4-甲氧基扁桃酸、la×20＝+146(水)，其光學純度為95.8％，以及(-)-4-甲氧基扁桃酸，[al20＝-128.6(水)，光學純度為88.1％。將(+/)-4-甲氧基扁桃酸(A.Me Kenzie，D.J.C.Pirie，(1936)，Berichte 69，868；E.Knorr，(1904)，Berichte 37，3172).(+/-)-4-甲氧基扁桃酸(10g，54.89mmol；Aldrich，98％)的溶解物溶于500ml熱水(60-80℃)，輕輕倒出溶液并保持溫熱以除去不溶解的雜質。在60-80℃攪拌15分鐘并在冰中冷卻后溶液變得澄清。1h后通過過濾收集沉淀并在干燥器中干燥過夜，產生9.9g辛可寧堿鹽。從沸水(80ml)再結晶鹽；輕輕倒出溶液同時保持溫熱然后在冰中冷卻。1h后過濾收集沉淀，用冷水洗滌3次，并且在干燥器中干燥過夜產生7.84g(16.45mmol)。將辛可寧堿鹽(2g，4,2mmol)溶于40ml 2NHCl并且立刻用3×30ml二乙醚進行提取。用Na2SO4干燥并且蒸干乙醚相產生0.55g 4-甲氧基扁桃酸。評估釋放的4甲氧基扁桃酸的光學純度為18.5％([a]D20＝+270)。辛可寧堿鹽的第二次再結晶后，再釋放扁桃酸，如上所述評估光學純度為69.0％([a]D20＝+100.80)。第三次再結晶后產生95,8％的光學純度([a]D20＝4140.00)。
            
5.固相支持物在3種不同類型的固相支持體上利用在DMF中的0.05M或更高濃度Fmoc-保護的活化氨基酸合成根據Fmoc-策略產生的肽。
            
1)PEG-PS(接枝于聚苯乙烯的聚乙二醇；TentaGel S NH2樹脂，0.27mmol/g，Rapp Polymere，德國或NovaSyn TG樹脂，0.29mmol/g，Novabiochem，瑞士)；2)PepSyn凝膠(用肌氨酸甲酯功能化的聚二甲基丙烯酰胺樹脂，1.0mmol/g；MilliGen，英國)。
            
3)PepSyn K(硅藻土支持的用肌氨酸甲酯功能化的聚二甲基丙烯酰胺樹脂，0.11mmol/g；MilliGen，英國)。
            
可在附著有第一個氨基酸的Merrifield-樹脂(聚苯乙烯二乙烯基苯)(Novabiochem，瑞士)上合成根據Boc-策略合成的肽。
            
6.催化劑和其它試劑可從Aldrich，德國購買二異丙基乙胺(DIEA)，乙二胺來自Fluka，瑞士，哌啶來自Riedel-de When，法蘭克福，德國。
            
4-(N，N-二甲氨基)吡啶(DMAP)可從Fluka，瑞士購買并且用作涉及對稱酸酐的偶聯反應中的催化劑。
            
3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并-三嗪(Dhbt-OH)可從Fluka，瑞士獲得，I-羥基苯并三唑(HObt)來自NovaBiochem，瑞士。
            
7.偶連方法第一個氨基酸作為產生自適當的N-cc-保護的氨基酸和DIC的DMF中的對稱酸酐進行偶連。下列氨基酸作為從適當的N-保護的氨基酸和通過DIC方式或DMF中的TBTU制備的Pfp-或Dhbt-酯或預先HObt酯進行偶連。在Fmoc情況下通過在80℃進行茚三酮試驗檢驗所有的酰化作用以免在測試期間Fmoc去保護。
            
8.N-末端氨基酸-氨基(N-a-氨基)保護基的去保護。
            
通過用DMF中的20％哌啶(當分批合成時1×3以及1×7min)處理或使去保護溶劑通過樹脂(利用連續流動合成，10min，流速1ml/min)來進行Fmoc基團的去保護，然后用DMF洗滌直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后檢測不到黃色(Dhbt-O-)。通過用DCM中的TFA處理10×1.5min和1×20min，然后每次用DCM洗滌6×9min，每次用DCM中的10％三乙胺(v/v)中和2×1.5min，然后用DCM洗滌6×9min進行Boc基團的去保護。
            
9.用酸從樹脂切割肽。
            
通過用95％的三氟乙酸(TFA，Halocarbon Products Corporation，美國；Biesterfeld & Co.Hamburg，德國)-水v/v于r.t.處理2h從樹脂切割肽。用95％TFA-水洗滌過濾的樹脂并且在減壓下蒸發濾出液和洗滌液。用乙醚洗滌殘余物并從乙酸-水冷凍干燥。通過高效液相色譜(HPLC)分析粗制的冷凍干燥產物并通過飛行質譜(MALDI TOF MS)或電噴射電離作用質譜(ES-MS)的基質輔助的激光脫吸附電離時間進行鑒定。
            
10.用堿從樹脂切割肽。
            
用1M氫氧化鈉(10ml)于4℃處理干燥的樹脂(1g)并且在室溫下放置15min。將樹脂過濾到含有10％含水乙酸的培養瓶中。通過凍干法并經受凝膠過濾來分離所述肽。
            
11.用TFMSA從樹脂切割肽。
            
將干燥的樹脂(250mg)置于具有攪拌棒的圓底燒瓶中。加入苯硫基甲烷/乙烷二硫酚(ethanedithiol)(2∶1，750FII)，在冰中冷卻混合物，加入5ml TFA并且攪拌混合物5-10min。逐滴加入TFMSA(500KII)并且在室溫下(r.t.)繼續反應30-60min。加入乙醚后沉淀所述肽。
            
12.側鏈保護基的去保護優選地，使側鏈去保護同時從樹脂切割下肽。
            
13.預先形成的HObt-酯方法a.  
            
將3eq.的N-a-氨基保護的氨基酸與3eq.的HObt和3eq的DIC一起溶于DMF。將溶液在r.t.放置10分鐘然后加入樹脂，該樹脂已經在加入預活化的氨基酸前用在DMF中的0.2Dhbt-OH溶液洗滌。
            
方法b.  
            
將3eq.的N-a-氨基保護的氨基酸與3eq.的HObt，3eq的TBTU和4,5eq.的DIEA一起溶于DMF。將溶液放置在r.t.5分鐘然后加入樹脂。將預制的對稱酸酐6eq.N-u-氨基保護的氨基酸溶于DCM并冷卻至0℃。加入DCC(3eq.)使反應繼續10min。真空除去溶劑，將剩余物溶于DMF。過濾溶液并立刻加入樹脂然后加入0.1eq.的DMAP。
            
14.評估第一個N-a-氨基保護的氨基酸的偶連產率用5ml DMF中的20倍哌啶于r.t.處理3-5mg干燥Fmoc-保護的肽-樹脂10min，并且在301nm評估二苯并富烯哌啶(dibenzofulvenepiperidine)加合物的UV吸收。利用基于Fmoc-Ala-OH標準計算的附加系數(extensioncoefficient)e 301測定產率。在Boc-保護情況下，在除去Boc基團后根據茚三酮-方法評估偶連(Sarin，V.K.等人，(1981)，Anal.Biochem，117，147-157)。
            
15.在PepSyn K樹脂上合成肽通過乙二胺覆蓋干燥的PepSyn K(大約500mg)并在rt放置過夜。
            
排干樹脂并且用DMF 10×15ml洗滌，每次5min。排干后用DMF中的10％DIEA v/v洗滌樹脂(2×15ml，每次5min)，并且最后用DMF洗滌直到向排干的DMF添加Dhbt-OH仍檢測不到黃色。將3eq.的HMPA、3eq.的HObt和3eq.的DIC溶于10ml DMF并放置活化10min，其后將混合物加入樹脂并且繼續偶連24h。排干樹脂并用DMF(10×15ml，每次5min)洗滌，通過茚三酮試驗檢驗酰化作用。第一個氨基酸偶連為側鏈保護的預先形成的對稱酸酐(參見上文)，如上所述評估偶連產率。在所有情況中都超過70％。然后以如下所述的″連續的-流動方式″或″分批方式″繼續合成。
            
16.在PepSyn K上利用連續的流動技術合成延伸的肽。
            
將附著第一個氨基酸的樹脂(大約500mg)置于連接到完全自動的肽合成儀的柱子中。如上所述使Fmoc基團去保護。使剩余的該序列所述的氨基酸偶連為Fmoc-保護的，如果需要保護側鏈，Pfp酯(3eq.)中加入Dhbt-OH(leq.)。通過分光光度監測Dhbt-OH陰離子的黃色消失，自動測定每個偶連的終點。完成合成后，用DMF(10min流速1ml/min)、DCM(3×5ml，每次3min)，最后用二乙醚(每次3×5ml)洗滌肽-樹脂，從柱子移出并且在真空中干燥。
            
17.PepSyn K上繼續進行分批肽合成。
            
將附著第一個氨基酸的樹脂(大約500mg)置于裝備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯導管中，如上所述使Fmoc-基團去保護。使剩余的該序列所述的氨基酸偶連為預先Fmoc保護的，如果需要保護側鏈，如上所述在DMF(5ml)中制備HObt酯(3eq.)。除非另作說明繼續該偶聯2h。然后通過DMF洗滌(12min，流速1ml/min)除去過量的試劑。通過在80℃進行茚三酮試驗檢驗所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(10min流速1ml/min)、DCM(5×5ml，每次1min)，最后用二乙醚(5×5ml，每次1min)洗滌肽-樹脂，并且在真空中干燥。
            
18.PEG-PS上的分批肽合成。
            
將TentaGel S NH2或NovaSyn TG樹脂(250mg，0.27-0.29mmol/g)置于裝備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯導管中。使樹脂在DMF(5ml)中膨脹，并用DMF中的20％哌啶處理以保證在樹脂上存在未保護的氨基。排干樹脂并用DMF洗滌直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后檢測不到黃色。將HMPA(3eq.)偶連為如上所述的預先形成的HObt-酯，并且使偶連繼續24h。排干樹脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗滌，通過茚三酮試驗檢驗酰化作用。如上所述將第一個氨基酸偶連為預先形成的對稱酸酐。如上所述評估第一個Fmoc-保護的氨基酸的偶連產率。在所有情況中都超過60％。該序列所述的下列氨基酸偶連為預先Fmoc保護的，如果需要保護側鏈，如上所述制備HObt酯(3eq.)。繼續該偶聯2h。排干樹脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗滌，以除去過量的試劑。通過在80℃進行茚三酮試驗檢驗所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×5ml，每次5min)、DCM(3×5ml，每次1min)，最后用二乙醚(3×5ml，每次1min)洗滌肽-樹脂，并且在真空中干燥。
            
19.PepSyn凝膠上的分批肽合成將干燥的PepSyn凝膠樹脂(500mg，1mmol/g)置于裝備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯導管中。使樹脂在乙二胺(15ml)中膨脹并通過搖動輕輕攪拌20h。排干樹脂并且用DMF(10×15ml，每次5min)洗滌。排干后用DMF中的10％DIEA v/v洗滌樹脂(2×15ml，每次5min)，最后用DMF(5×15ml，每次5min)洗滌直到向排干的DMF添加Dhbt-OH后檢測不到黃色。將HMPA(3eq.)偶連為如上所述的預活化的HObt-酯(方法a)，并且使偶連繼續24h。排干樹脂并且用DMF(10×15ml，每次5min)洗滌。通過茚三酮試驗檢驗酰化作用。如上所述將第一個氨基酸偶連為預先側鏈保護的對稱酸酐。如上所述評估第一個Fmoc保護的氨基酸的偶連產率。在所有情況中都超過70％。使該序列所述的剩余氨基酸偶連為預先Fmoc保護的，如果需要保護側鏈，如上所述制備HObt酯(3eq.)(方法a)。繼續偶聯2h，必要時進行雙重偶連過夜。排干樹脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗滌，以除去過量的試劑。通過在80℃進行茚三酮試驗檢驗所有的酰化作用。如上所述使Fmoc基團去保護。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5min)、DCM(3×15ml，每次2min)，最后用二乙醚(3×15ml，每次2min)洗滌肽-樹脂，并且在真空中干燥。
            
19HPLC。
            
可在裝備有具有Waters Radial Pak 8×100mm C18反相柱的Waters 996光電二極管陣列檢測器的Waters 600E儀器上進行HPLC。緩沖液A是在水中的0.1vol％TFA，緩沖液B是90vol％乙腈，9.9vol％水和0.1vol％TFA。使緩沖液以1.5ml/min的流速泵出經過柱子，其中利用下列梯度0％-70％B的線性梯度(20min)，70-100％B的線性梯度(1min)，恒溶劑的100％B(5min)。2.恒溶劑的0％B(2min)，0-50％B的線性梯度(23min)，50-100％B的線性梯度(5min)，恒溶劑的100％B(5min)。
            
2.2化合物的LPA生產根據本發明優選通過LPA方法獲得令人感興趣的化合物。
            
LPA方法在WO 00/18791中公開了LPA方法。該方法基本上包括下列步驟(a)通過固相合成或片段偶連提供包括所需要序列的肽片段，該肽片段附著于固相；(b)必要時，使任何N-末端氨基去保護，同時肽片段仍然附著于固相，(c)使具有未保護N-末端基團的肽片段與非手性的二-三-或四羧酸起反應以提供具有環狀結構的構建體，以及(d)從固相切下該構建體以提供包括具有游離C-末端基團的該肽片段的LPA。
            
上述方法中，在步驟(d)前可進行下列步驟(c1)如果存在，使來源于步驟(c)中所使用的羧酸的任何N-保護基去保護，(c2)繼續固相合成或片段偶連以提供包括具有至少一個N-保護氨基末端氨基酸基團和/或附著的化學部分的所需要序列的肽片段，以及(c3)如果存在，使任何N-末端氨基(在步驟(d)之前或之后)去保護。
            
本方法提供i.a.LPAs提供本發明具有N至C方向的所需要的序列(步驟(c))。以及同時提供具有C至n方向的序列(步驟(c2))。
            
因此，為了獲得本發明的化合物，將附著于固相的2個肽鏈通過非手性的二-、三-或四羧酸方式進行組裝。
            
用于本方法的合適的非手性二-、三-或四羧酸具有通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]其中n和m獨立地是從1至20的整數，X是HN，A和B獨立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分。
            
在另一個實施方案中，用于本方法的合適的非手性二-、三-或四羧酸具有通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]其中n和m獨立地是0或從1至20的整數，X是H2N(CR2)pCR、或RHN(CR2)pCR，其中p是0或從1至20的整數，其中每個R是H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分。
            
在另一個實施方案中，用于本方法的合適的非手性二-、三-或四羧酸具有通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]其中n和m獨立地是0或從1至20的整數，X是HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、鹵素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，其中p是0或從1至20的整數，每個R獨立地是H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分。
            
在另一實施方案中，用于本方法的合適的非手性二-、三-或四羧酸具有通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]其中n和m獨立地是0或從1至20的整數，X是H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、鹵素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p，其中p是0或從1至20的整數，每個R獨立地是H、或取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分。
            
術語C1-10烷基是指具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基和叔丁基。
            
術語C2-10鏈烯基是指具有2-10個碳原子的直鏈或支鏈烯基基團，例如乙炔基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
            
術語環狀部分是指環己烷和環戊烷。
            
術語芳香族部分是指苯基。
            
措辭″A和B形成環狀、雜環或芳香族部分″表示環己烷、哌啶、苯和吡啶。
            
通過與羧酸起反應，獲得類型X(CO-序列)2-固相的構建體，其中如上述限定X。
            
術語″序列″在本文中是指包括天然存在和/或非天然存在的氨基酸的肽、PNA-序列、或肽模擬物。″天然存在的氨基酸″是指在自然界中發現的L-和D-形式的20種氨基酸。非天然存在的氨基酸是例如修飾過的天然存在的氨基酸。術語序列進一步是指包括一個或多個這種序列。合適的肽模擬物的實例在Marshal G.R.，(1993)Tetrahedron，493547-3558中有描述。術語″化學部分″表示增強LPA的溶解度或生物活性的實體，和用于指導LPA到達其靶或標志物的實體。用于序列的優選實施方案如上所述。
            
基團X容許直接或間接地延續相同序列或一個或多個不同序列和/或部分的分步合成或片段偶連。LPA中肽片段的方向(N至C或C至N)定義為根據需要確定。在一個實施方案中，本發明描述了具有N至C方向的LPAs，在另一個實施方案中，本發明涉及同時具有N至C和C至N序列表示的化合物，而在另一實施方案中該序列具有C至N的方向。
            
在X包括臨時保護的氨基功能的情況中，可直接在保護后進行合成或偶連。可利用半-當量的羧基酸保證所有含有羧基的基團的合適活化以提供環狀系統的有效形成(在步驟(c)中，參見上文)。在三-或四羧酸的情況下，可用二胺，例如乙二胺或用于進一步反應的，例如巰基、含氧的基團、氧代基團或羧基的適當功能化的胺使活化的羧基進一步衍生化。在二胺的情況下，可根據所需要的序列或化學部分直接延續肽合成或片段偶連。在優選的實施方案中，使用fmoc保護策略，但可根據合成或偶連策略使用任何氨基保護基團。實例是Boc-保護基團策略。
            
因為用一個或在雙官能化學部分的情況下用具有2個氨基酸基團的這種賴氨酸進行延續的分步合成或片段偶連，已經令人驚訝地發現與通過MAP合成獲得的常規四聚合賴氨酸樹枝狀聚合物相比可獲得更好的結果。此外，最佳的肽合成方法或偶連方法可用于附著于固相的單鏈，并且可在形成LPA前檢驗其均一性。可通過標準的肽合成方法同時進行固相切割和側鏈去保護(如上所述)。因此可獲得具有最佳的和清楚的組合物的最終產物。如果期望或需要，可容易地通過標準色譜法，例如HPLC或凝膠過濾來進行純化。
            
用于提供環狀結構的有利的二-、三-和四羧酸可選自亞氨基雙乙酸、2-氨基丙二酸、3-氨基戊二酸、3甲氨基戊二酸、3-氯谷氨酸、3-甲氧基羰基戊二酸、3-乙酰基戊二酸、戊二酸、丙三羧酸、3，4-雙-羧甲基己二酸、4-(2-羧乙基)-庚二酸、(3，5-雙-羧甲基-苯基)-乙酸、3，4-雙-羧甲基己二酸、苯-1，2，4，5-四羧酸、4-(3-羧基-烯丙氨基)-丁基-2-烯醇酸、4，4-亞氨基-二苯甲酸、1，4-二氫吡啶-3，5-二羧酸、5-氨基間苯二甲酸、2-氯丙二酸、3-羥基戊二酸、和苯-1，3，5-三羧酸。
            
可根據標準方法進行片段偶連(片段結合或片段縮合)，例如如PeptideSynthesis protocols，Methods in Molecular Biology Vol.，Chapter 15，303-316Nyfeler R，Pennington MW和Dunne BM Eds.，Humana Press，1994所描述的。因此，可在固相上合成片段，從固相切割具有完全保護基保護的片段，如上所述進行純化和表征。也可經過如上所述的其它技術獲得合適的片段。
            
本發明的優選實施方案是使用上述的LPA方法用于生產本發明的化合物。
            
3.生物活性根據本發明，該化合物可通過位于化合物肽序列內的結合位點結合和調節細胞表面受體的活性，所述的結合位點包括通式L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5的至少一個氨基酸序列，其中A、B、C、D中的一個選自疏水性的氨基酸殘基，A、B、C、D中的一個選自堿性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個選自酸性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個是Gly或Ala，以及L1、L2、L3、L4和L5選自具有n個氨基酸殘基的化學鍵或氨基酸序列，其中n是從0至5的整數。
            
因此，具有4至80個氨基酸殘基長度、包括上述受體結合結構性基序的所有肽序列都屬于本發明的范圍。肽序列的優選實施方案如上所述。在優選的實施方案中本發明涉及包括2個單獨序列的化合物，所述序列的每一個包括上述基序并且能夠結合FGFR。
            
受體因此，本發明的化合物是受體的配體，特別是功能性的細胞-表面受體的配體。
            
在本發明的內容中，細胞-表面受體定義為包括至少一個多肽鏈的任何分子，所述的分子與細胞的質膜相締合，其結合方式使得所述的分子能夠在膜外側接受信號，通過膜轉導信號，并且進一步通過誘導細胞內部分子水平的特定作用傳送所述的信號，例如誘導分子復合物的結合或解離，或引發生化反應，例如受體的自體磷酸化，或受體的蛋白水解切割來導致胞內信號轉導的開始。
            
本發明涉及功能性的細胞-表面受體。″功能性的細胞-表面受體″是指本發明的細胞-表面受體具有配體的可識別基團，這些配體與受體的結合誘導胞內信號轉導，其引起細胞的生理反應。生理反應，例如細胞的分化、增殖、存活、細胞程序性死亡或運動，依賴于涉及與受體相互作用的配體，和/或所述相互作用的特征，例如親合性或持續時間，和/或表達該受體的細胞的種類。術語″配體″定義為能夠結合受體并由此活化或抑制所述受體的化合物。受體的″活化″是指胞外結合配體后，所述受體變得能夠將″配體結合″的效力傳送進入生化反應級聯，其統稱為細胞內部的″受體信號傳導″或″信號轉導″，可引起上述的細胞生理學應答。受體的″抑制″是指胞外結合配體后，受體變得″沉默″或″失活″，而不再能引發通常啟動應答受體配體結合的生化反應級聯。根據本發明，上述特性的化合物能夠活化或抑制功能性的細胞-表面受體。
            
在優選的實施方案中本發明的功能性的細胞-表面受體是成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)家族的受體，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。在大部分優選的實施方案中，本發明的受體是FGFR1或其功能性的同系物。
            
術語″受體的功能性同系物″是指能夠i)胞外結合FGFR的配體并由此在細胞中活化受體依賴的信號轉導級聯的分子，和/或ii)胞內結合FGFR的適配分子并由此在細胞中活化受體依賴的信號轉導級聯的分子。
            
術語″結合″是指FGFR或FGFR同系物和具有FGFR結合位點的相對分子之間的直接或間接的相互作用。在本文中相對分子(counter molecule)是FGFR的胞外配體，或胞內適配分子(adapter molecule)。在本發明的內容中″適配分子″定義為能夠識別受體″活化狀態″的分子，其選擇性地結合這種受體并在細胞中通過誘導信號轉導反應級聯傳送″被活化的受體″的信號。可由例如STN、FRS、Grb、SHP2、PLCγ、或PIP3代表胞內適配分子。
            
受體的活化經常依賴于由配體結合誘導的受體二聚作用。因此，化合物促進受體分子的二聚作用(或多聚作用)的能力在本發明中是有益的特性。因此，在一個實施方案中本發明描述了能夠使FGFR二聚的化合物。經本發明化合物的受體二聚作用可在例如當受體環境中缺乏受體的天然高親合配體，例如FGF，以及受體是暫時性″沉默″、非活化的情況中發生。然而、在存在多種FGF之一時，受體被占據并且被這個FGF活化，因此本發明的化合物具有低的能力或根本不能調節通過FGF誘導的FGFR受體信號轉導。盡管如此，如果受體已經在FGF暴露前暴露于該化合物，那么本發明的化合物可通過占據備選的結合位點減弱天然高親合配體與FGFR的結合。由此可見本發明的化合物可調節依賴于FGF的受體信號傳輸。本領域中已知受體活化的細胞應答依賴于受體刺激的強度，其可例如通過配體與受體的相互作用親合力的值，和/或通過這種相互作用的持續時間來加以表征。因此，FGF和受體的相互作用的親合力和持續時間都可受本發明化合物的影響。因此，本發明的另一個實施方案是提供能夠調節通過高親合力配體誘導的受體信號傳輸的化合物。進一步的實施方案涉及1)能夠通過與所述的FGFR結合配體在本發明的結合位點進行競爭而抑制由上述的低親合力配體誘導的FGFR活化的化合物，2)能夠活化由上述低親合力配體或另一個分子抑制的FGFR的化合物，所述的另一個分子是天然的FGFR抑制劑或人工物質。
            
相互作用的親合力術語″相互作用″是指化合物與細胞-表面受體具有暫時的或永久的、直接或間接接觸。
            
可通過相互作用的親合力表征2個分子之間的相互作用。相互作用的親合力通常由以摩爾(M)表示的離解平衡常數，Kd值表示。Kd反映了受體分子與配體分子解離的速率和所述的配體分子結合所述受體分子的速率之間的比率，因此表示這2個分子之間結合強度的測量值。結合越強，Kd的值越低。
            
本發明涉及具有與FGFR相對低親合力結合的化合物。本發明的低親合力相互作用由具有范圍為10-3至10-8M值的Kd表征，例如從10-3至10-7M，例如從10-3至10-6M，例如從10-3至10-5M，或大約10-4M，或大約10-5M。
            
受體生物功能的調節當配體結合時細胞-表面受體誘導和/或維持細胞過程的能力在此定義為受體的″生物功能″。
            
本發明描述了能夠通過調節受體信號傳輸調節FGFR生物功能的化合物。″調節受體信號傳輸″是指活化或抑制信使分子級聯的產生，其通常發生在通過胞外刺激應答受體活化的細胞中。
            
通常通過表達所述受體的細胞的生理反應來反映受體信號傳輸的活化或抑制。因此，通過調節受體信號有可能調節細胞應答。
            
本發明優選涉及FGFR1-相關的信號傳輸的活化或抑制，其例如可通過如下方面的變化來反映i)FGFR1的酪氨酸磷酸化程度；ii)涉及任何FGFR1-相關的信號轉導途徑的一個或多個胞內蛋白質，例如STAT1、JNK、PLCy、ERK、STAT5、P13K、PKC、FRS2和/或GRB2蛋白質的活化狀態；和/或iii)細胞應答。
            
當涉及FGFR依賴的細胞應答時，本發明涉及下列細胞應答，選自但不限于細胞分化或去分化的誘導/抑制、細胞程序性死亡或細胞存活的誘導/抑制、細胞運動的誘導/抑制。
            
藥物細胞死亡在正常的神經元發育以及神經變性病癥的病理學，例如阿爾茨海默癥和Parkinson′s疾病中發揮重要的作用，其中通過程序性細胞死亡有50％的正發育的神經元被消除。已經證明FGFRs及其配體是發育期間和成年期間神經元存活的重要決定因素(Reuss and yon Bohlen undHalbach(2003)Cell tissue Res，139-57)。因此，能夠通過結合和活化FGFR促進神經元細胞存活的化合物是非常需要的。因此，一方面本發明描述了促進神經細胞存活的化合物，其可用作治療涉及神經細胞死亡病癥的藥物。然而，本發明的化合物還可用作促進另一類型細胞存活的藥物，例如不同類型的肌細胞，或備選地，用于促進另一類型細胞的細胞死亡，例如癌細胞，因為已經證明FGFR信號是肌肉和癌細胞的存活因子(Ozen等人(2001)J NatCancerInst.931783-90；Miyamoto等人(1998)J Cell Physio.17758-67Detilliux等人(2003)Cardiovasc Res.578-19)。
            
在健康的生物體中細胞-表面受體的活性受到嚴格調節。受體或受體的配體的突變、異常表達或加工導致受體活性的失常因此導致受體的機能障礙。受體的機能障礙隨后成為細胞機能障礙的原因，因為該細胞使用該受體誘導和/或維持各種細胞代謝過程。后者是疾病的表現形式。也已經表明FGFR信號傳輸的衰減導致許多不同病理情況的發生，例如糖尿病(Hart等人，Nature 2000，408864-8)。FGF受體的活化涉及正常的，以及病理的血管生成(Slavin，Cell Biol Int 1995，19431-44)。它對于骨骼肌細胞、心肌細胞和神經元的發育、增殖、功能和存活是重要的(Merle等人，J Biol Chem1995，270 17361-7；Cheng和Mattson，Neuron 1991，71031-41；Zhu等人，Mech Ageing Dev 1999，10877-85)。它在正常腎結構的維持中起作用(Cancilla等人，Kidney Int 2001，60147-55)，并且它涉及傷口愈合和癌癥疾病(Powers等人，Endocr Relat Cancer.2000，7165-97)。
            
本發明提供能夠調節FGFRs活性的化合物。因此，本發明涉及的所述化合物用做藥物，該藥物治療的疾病中FGFRs活性的調節可能被認為是治愈的必要條件。
            
因此，本發明的藥物在一個實施方案中是用于預防和/或治療1)中樞和外周神經系統、或肌肉或各種器官的疾病和狀況，和/或2)中樞和外周神經系統的疾病或狀況，例如手術后的神經損傷、外傷性神經損傷、神經纖維髓鞘化減少、缺血性損傷，例如其起因于中風、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病、癡呆，例如多血管梗塞癡呆、硬化癥、與糖尿病相關的神經退化、影響晝夜節律鐘或神經肌肉傳遞的疾病、以及精神分裂癥、情緒失調，例如狂躁抑郁癥；3)用于治療肌肉的疾病或狀況，包括例如在器官移植后的伴有神經肌肉連接功能減少的病癥，或例如遺傳的或外傷的肌肉萎縮性疾病；或用于治療各種器官的疾病或狀況，例如生殖腺的退化病癥、胰腺的退化病癥，例如I型和II型糖尿病，腎的退化病癥，例如腎病，以及心、肝和腸的退化病癥。
            
4)癌癥疾病，和/或  
            
5)朊病毒疾病。
            
本發明涉及需要新血管發生的任何類型的實體瘤癌癥。
            
本發明涉及選自羊瘙癢病(scrapie)、Creutzfeldt-Jakob疾病的朊病毒疾病。已經表明FGFRs在朊病毒疾病中扮演明顯的角色(Castelnau等人(1994)Exp Neurobiol.130407-10；Ye和Carp(2002)J Mol Neurosci.18179-88)。
            
在另一個實施方案中，本發明的化合物用于制造藥物，該藥物用于1)促進創傷愈合，和/或2)例如在急性心肌梗塞后、或血管生成后預防心肌細胞的細胞死亡，和/或3)重新血管化(revassularsation)。
            
FGFRs及其配體在CNS中發揮重要作用，特別地它們涉及與記憶和學習相關的過程(Reuss and von Bohlen und Halbach(2003)Cell Tissue Res.313139-57)。因此，在另一個實施方案中，本發明的化合物用于刺激學習和/或短期和/或長時記憶的能力。這個實施方案是本發明的優選實施方案之一。
            
在另一實施方案中本發明的化合物用于制造藥物，該藥物用于1)預防由于局部缺血造成的細胞死亡；2)預防由于飲酒造成的機體損傷；在另一個實施方案中本發明的化合物用于制造治療正常的、變性的或損傷的細胞的藥物，該細胞一般在體內表達一種或多種選自下列的蛋白質神經細胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.NosP13591、P13595-01、P13595)，-神經細胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)，-神經細胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.NoP36335)-神經膠質細胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.NoQ03696；Q90933)，-神經細胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No000533)，-神經膠質蛋白(Swiss-Prot Ass.NoP91767、P20241)，-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.NosQ92823、O15179、Q9QVN3-軸突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.NosQ02246、P22063、P28685)，  
            
-軸突-相關的細胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.NoNP_031544.1；Swiss-Prot Ass.NoQ8TC35)，-髓磷脂-結合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.NoP20917)，-神經細胞粘附分子BIG-1(Swiss-ProtAss.NoQ62682)，-神經細胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.NoQ62845)，-成束蛋白(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.NoP22648)，-神經細胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.NosQ9UQ52、P97528、Q9JMB8)，-神經細胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos094779，P07409，P97527)，-鈣粘著蛋白(Swiss-Prot Ass.NoQ9VW71)，-連接粘著分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9JKD5、088792)，-神經細胞粘附F3/F11(接觸蛋白)(Swiss-Prot Ass.NosQ63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、093250)，-神經束蛋白(Swiss-Prot Ass.NosQ90924、Q91Z60；O42414)，-B-淋巴細胞細胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.NosQ9R094、P20273)，-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.NosQ92859、P97603、Q90610、P97798)，-胞間的細胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.NosQ8TAM9、Q60625)或-半乳糖結合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot Ass.NosQ91VD1，Q9JKX2、Q9NZ03)，-半乳糖結合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.NoQ8K419；P38552)，-成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)(Swiss Prot Ass.NosQ9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)，-成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96KM2、P21802、Q63241)，-成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.NosQ95M13、AF487554、Q99052)，  
            
-成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.NoQ91742)，-神經營養蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.NoQ8WXJ5)，-白細胞抗原相關蛋白質-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.NosQ9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)，-腎升壓素(Swiss-Prot Ass.NosQ925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.NosQ64699、Q13332、O75870)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體κ型(R-PTP-κ)(Swiss swissprot Prot Ass.NoQ15262)，-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.NosQ8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)，-Ephrin A-型受體8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受體EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos009127、P29322)，-Ephrin A型-受體3(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受體ETK1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.NoP29318)，-Ephrin A型-受體2(Swiss-Prot Ass.NoQ8N3Z2)-胰島素受體(IR)(Swiss-Prot Ass.NoQ9PWN6)-胰島素-樣生長因子-1受體(IGF-1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)-胰島素-相關的受體(IRR)(Swiss-Prot Ass.NoP14616)，-酪氨酸-蛋白激酶受體Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos06805、P35590、Q06806)，-環形受體-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos044924、AF041082、Q9Y6N7)，-神經元煙堿乙酰膽堿受體α3亞基(CHRNA3)(Swiss Prot Ass.NosQ8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)，-神經元乙酰膽堿受體α6亞基(Swiss-Prot Ass.NosQ15825、Q9ROW9)，-血小板源性生長因子受體β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.NosQ8R406、Q05030)，-白細胞介素-6受體(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.NoQ00560)，-白細胞介素-23受體(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.NoAF461422)，-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同細胞因子受體(Swiss-Prot Ass.NoP32927)，-細胞因子受體-樣分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.NoQ9JM58)，-I類細胞因子受體(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.NoQ9UHH5)-神經突起生長導向因子(Netrin)-1受體DCC(Swiss-Prot Ass.NoP43146)，-白細胞Fc受體-樣蛋白質(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96PJ6、Q96KM2)，-巨噬細胞清除受體2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.NoQ91YK7)，或-粒性白細胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.NoQ99062)，-基底膜蛋白聚糖(Swiss Prot Ass.NoP98160)，-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoQ05910)，-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.NosQ9H013，O35674)，-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoP78325)，-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos043184，Q61824)，-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.NosQ9JLN6，Q61824，Q9XSL6，Q9UKQ2)，-ADAM-33前體(Swiss-Prot Ass.NosQ8R533、Q923W9)，-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.NosQ13433，Q61072)，-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.NoSQ9H2U9，O35227，Q63180)，-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.NoQ8R533)，-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYV0，O88839，Q13444)，-包含金屬蛋白酶-去整合蛋白結構域的蛋白質(TECAM)(Swiss-ProtAss.NoAF163291)，-金屬蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.NosO95204、Q9BS16)，-膠原VII型(Swiss-Prot Ass.NoQ63870)，-纖粘連蛋白(Swiss-ProtAss.Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)，或  
            
-肌腱蛋白-R(Swiss-Prot Ass.NosQ15568、O00531、Q90995、P10039)，-細胞因子樣因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.NoO75462)，-或其片段、或其變體。
            
特別地，本發明涉及正常的、變性的或損傷的NCAM呈遞細胞(presenting cell)。
            
本發明的藥物包括有效量的上述限定的一種或多種化合物，或包括一種或多種化合物以及藥物可接受的添加劑的藥物組合物。
            
因此，在另一個方面本發明也涉及包括本發明的至少一種化合物的藥物組合物。
            
本發明進一步的方面是生產藥物組合物的方法，包括將有效量的本發明的一種或多種化合物，或本發明的所述的藥物組合物與一種或多種藥物學上可接受的添加劑或載體混合。在一個實施方案中該化合物用于與修復裝置組合使用，其中該裝置是修復神經的導向裝置。因此，在進一步的方面，本發明涉及修復神經的導向裝置(prosthetic nerve guide)，其特征在于它包括一種或多種如上限定的化合物或藥物組合物。神經導向裝置是本領域已知的。
            
本發明涉及包括本發明化合物的藥物和/或藥物組合物用于治療或預防以下所論及的任何疾病和狀況的用途。
            
可適當地配制這種藥物和/或藥物組合物用于口服、皮下、肌內的、靜脈的、顱內的、鞘內的、腦室內的、鼻內的或肺內給藥。
            
基于本發明化合物的藥物和組合物的制劑發展中的策略一般相應于用于任何其它蛋白質基礎的藥物產物的制劑策略。在幾個教科書中研究了克服這些問題的潛在問題和所需要的指導，例如″Therapeutic Peptides andProtein Formulation.Processing and Delivery Systems″，Ed.A.K.Banga，Technomic Publishing AG，Basel，1995。
            
注射劑通常制備為液體溶液或懸浮液，適于注射前的溶液中或懸浮液中的固體形式。也可對制劑進行乳化。經常將活性成分與賦形劑混合，該賦形劑是藥物學上可接受的并且與活性成分相兼容。合適的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。此外，如果需要，該制劑可包含少量的輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑，或增強制劑的有效性或轉運的物質。
            
可通過本領域技術人員公知的技術制備本發明化合物的制劑。該制劑可包含藥物學上可接受的載體和賦形劑，包括微球體、脂質體、微膠囊、納米顆粒等。
            
可通過注射，任選地在活性成分發揮其效力的位點，適當地施用該制劑。適合于其它給藥模式的其它制劑包括栓劑、鼻用、肺內施用以及有時為口服的制劑。對于栓劑，傳統的粘合劑和載體包括聚乙二醇或甘油三酯。這種栓劑可由包含0.5％至10％，優選1-2％范圍的活性成分的混合物形成。口服的制劑包括常規使用的賦形劑，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續釋放制劑或粉劑的形式，并且一般包含10-95％，優選25-70％的活性成分。
            
其它的制劑適于鼻部和肺內給藥，例如吸入劑和氣霧劑。
            
活性化合物可配制為中性或鹽形式。藥物學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽化合物的自由氨基形成)，以及其與無機酸形成，例如鹽酸或磷酸，或與有機酸形成，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。與自由羧基形成的鹽也可來源于無機堿，例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物等，以及有機堿，例如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
            
該制劑以與配藥制劑相適合的方式施用，并且以治療有效量加以給藥。給藥量依賴于待治療的受試個體，包括例如受試個體的體重和年齡，待治療的疾病和疾病的階段。合適的劑量范圍是每次給藥每千克體重通常為幾百μg量的活性成分，優選范圍為每千克體重從大約0.1μg至5000μg的范圍。利用單體形式的化合物，合適的劑量經常是每千克體重從0.1μg至5000μg的范圍，例如每千克體重從大約0.1μg至3000μg的范圍，以及特別是每千克體重大約0.1μg至1000μg的范圍。利用多聚體形式的化合物，合適的劑量經常是每千克體重0.1μg至1000μg的范圍，例如每千克體重大約0.1μg至750μg的范圍，以及特別是每千克體重大約0.1μg至500μg的范圍，例如每千克體重大約0.1μg至250μg的范圍。特別地，當鼻部給藥時比通過其它途徑給藥使用較少的劑量。可一次進行給藥或可再加上后繼的給藥。劑量也可取決于給藥途徑并且可隨著待治療的受試個體的年齡和重量而變化。多聚體形式的優選劑量可在每70kg體重1mg至70mg的范圍中。
            
對于一些適應癥優選局部的或基本上局部的用藥。
            
對于其它適應癥，優選鼻內的用藥。
            
本發明的一些化合物是具有足夠活性的，但是對于其它一些，如果該制劑進一步包括藥物學上可接受的添加劑和/或載體可增強效力。這種添加劑和載體是本領域已知的。有時，包括促進將活性物質遞送至其靶的化合物是有益的。
            
在許多實例中，有必要多次施用該制劑。給藥可以是連續的輸注，例如心室內輸注或以多劑量給藥，例如一天多次，每日一次，一周多次，每周一次等。優選在個體已經經受可能導致細胞死亡的因素前或之后不久啟動藥物的給藥。優選地從該因素開始8小時內，例如因素開始5小時內施用該藥物。許多化合物顯示出長期效應，由此可長間隔地進行化合物的給藥，例如1周或2周。
            
在神經導向裝置的使用方面，可連續給藥或基于活性化合物的控制釋放以小部分給藥。此外，前體可用來控制釋放速率和/或釋放位點。另一種其它種植入物以及口腔給藥可同樣基于控制釋放和/或前體的使用。
            
治療在一個實施方案中利用本發明所述化合物/組合物的治療可用于誘導例如植入或移植的細胞的分化、調節增殖、刺激再生、神經元適應性(plasticity)和細胞存活。當利用具有長期效應的化合物時這是特別有用的。
            
在進一步的實施方案中，治療可用于刺激細胞的存活，該細胞處于由多種因素造成的死亡風險中，例如創傷和損傷、急性疾病、慢性疾病和/或紊亂，特別是通常導致細胞死亡的退行性疾病，其它的外界因素，例如可能導致形成自由基或具有細胞毒效應的醫藥和/或外科治療和/或診斷方法，例如X-射線和化療。關于化療本發明所述的FGFR載體在癌癥治療中是有用的。
            
因此，治療包括治療和/或預防涉及中樞和外周神經系統的細胞死亡疾病或狀況，例如手術后神經損傷，外傷性的神經損傷，例如，起因于脊髓損傷、神經纖維髓鞘化減少、缺血后損傷，例如起因于中風、多血管梗塞癡呆、多發性硬化、與糖尿病相關的神經退化、神經肌肉變性、精神分裂癥、阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、或亨廷頓病。
            
涉及肌肉的疾病或狀況也包括伴有神經肌肉連通功能損害的狀況，例如遺傳的或外傷性的肌肉萎縮性疾病；或用于治療各種器官的疾病或狀況，例如生殖腺的退化狀況、胰腺的退化狀況，例如I和II型糖尿病、腎的退化狀況，例如腎病，本發明所述的化合物可用于誘導分化、調節增殖、刺激再生、刺激神經元的適應性和存活，即刺激存活。
            
此外，該化合物和/或藥物組合物可用于例如在急性心肌梗塞后預防心肌細胞的細胞死亡，以誘導血管生成。此外，在一個實施方案中該化合物和/或藥物組合物可用于刺激心肌細胞的存活，例如急性心肌梗塞后的存活。在另一個方面，該化合物和/或藥物組合物用于例如損傷后的新血管再生。
            
該化合物和/或藥物組合物用于促進創傷愈合的用途也在本發明的范圍內。本化合物能夠刺激血管生成并且由此可促進傷口愈合過程。
            
本發明進一步公開了該化合物和/或藥物組合物在癌癥治療中的用途。FGFR活化的調節對于腫瘤血管生成、增殖和擴散是重要的。
            
在進一步的實施方案中，化合物和/或藥物組合物的用途是用于刺激學習的能力和/或短期和/或長期記憶的能力，因為FGFR對于神經細胞的分化是重要的。
            
在另一個實施方案中，本發明的化合物和/或藥物組合物用于治療由飲酒(alcohol consumption)所造成的機體損傷。特別涉及胎兒的發育畸形、長期神經行為改變、酒精肝疾病。
            
包括利用化合物和/或藥物組合物的朊病毒疾病治療是本發明的另一個實施方案。
            
特別地本發明的化合物和/或藥物組合物可用于治療臨床狀況，例如腫瘤，例如惡性腫瘤、良性贅生物、原位癌和不確定特性的腫瘤，內分泌腺的疾病，例如糖尿病、精神病，例如老年的和早老的器質性精神病、酒精中毒性精神病、藥物性神經病、短暫的器質性精神病狀況、阿爾茨海默氏病、大腦脂沉積癥、癲癇癥、麻痹性癡呆(general paresis)[梅毒]、肌震顫性綜合征、亨廷頓病、慢性舞蹈病、痙攣性假硬化(Jakob-Creutzfeldtdisease)、多發性硬化、腦的Pick′s疾病、梅毒、精神分裂癥、情感性精神病、神經紊亂、人格障礙，包括性格性神經機能病(character neurosis)、與器質性腦綜合征相關的非精神病人格障礙、妄想狂樣人格障礙、狂熱人格、妄想狂樣人格(紊亂)、妄想狂樣的特征、性變態和紊亂、智力遲鈍、神經系統和感覺器官中的疾病、認知異常、中樞神經系統的炎性疾病、例如腦膜炎、腦炎、大腦退化，例如阿爾茨海默氏病、Pick′s疾病、老年性腦退化、交通性腦積水、阻塞性腦積水、帕金森氏癥包括其它附加的蹄骨錐突部骨炎和異常活動紊亂、脊髓小腦疾病、小腦運動失調、Marie′s，Sanger-Brown、肌陣攣性小腦協同失調、原發性小腦退化，例如脊髓性肌萎縮、家族性青少年的、成年的脊髓性肌萎縮、運動神經病、肌萎縮性側索硬化、運動神經病、進行性延髓麻痹、假延髓病性麻痹、原發性脊髓側索硬化、其它的前角細胞疾病、前角細胞疾病、非特定的其它脊髓疾病、脊髓空洞癥和延髓空洞癥、血管的脊髓病、急性脊髓梗塞(栓塞)(非栓塞性的)、脊髓的動脈血栓、脊髓的水腫、亞急性壞死性脊髓病、其它分類疾病中的脊髓亞急性聯合變性、脊髓病、藥物-誘導的、輻射誘導的脊髓炎、自主神經系統的紊亂、外周自主神經紊亂、交感神經、副交感神經、或植物性系統的紊亂、家族性自主神經異常[家族性植物神經失調綜合征]、特發性的外周自主神經病、頸動脈竇暈厥或綜合癥、頸交感神經萎縮或麻痹、其它分類紊亂中的外周自主神經病、淀粉樣變性、外周神經系統疾病、臂神經叢病變、頸肋綜合征、肋骨鎖骨綜合征、前斜角肌綜合癥、胸部出口綜合征(thoracic outlet syndrome)、臂神經炎或脊神經根炎、包括新生兒在內的。炎癥性的和中毒的神經病，包括急性感染性多發性神經炎、格林-巴利綜合征、感染后多神經炎、膠原血管病中的多發性神經病、影響眼睛多層結構的病癥、化膿性的眼內炎、耳朵和乳突的疾病、慢性風濕性心臟病、缺血性心臟病、心律不齊、肺系中的疾病、新生兒中的器官和軟組織異常，包括神經系統在內，分娩和生產中麻醉藥或其它鎮靜物給藥的并發癥、皮膚疾病，包括感染、循環不足問題、損傷，包括在外科手術、擠壓傷、灼燒后的皮膚疾病。對神經和脊髓的損傷，包括神經分裂、連續性病變(有或沒有開放性創傷)、創傷性神經瘤(有或沒有開放性創傷)、外傷性的暫時麻痹(有或沒有開放性創傷)、醫藥方法期間的偶然穿刺或裂傷、對視神經和通路的損傷、視神經損傷、瞬間腦神經(second cranial nerve)、視交叉損傷、視路損傷、視皮層損傷、非特定的目盲、其它腦神經損傷、其它和非特定的神經損傷。由藥物、醫療用品和生物物質造成的毒害、遺傳的或外傷性的萎縮性肌肉紊亂；或用于治療各種器官的疾病或狀況，例如生殖腺的退化狀況、胰腺的退化狀況、例如I和II型糖尿病、腎的退化狀況，例如變性腎炎。羊瘙癢病、Creutzfeldt-Jakob疾病、Gerstmann-Straussler-Sheinker(GSS)疾病。根據本發明上述狀況和癥狀的治療和/或預防包括將有效量的化合物和/或藥物組合物施用于需要其的個體的步驟。
            
實施例實施例1.本發明的FGL肽(SEQ ID NO1)和其它肽的不同制劑的制備FGL的單獨肽鏈的固相合成通過如上所述的標準Fmoc-固相方法合成本發明的FGL和其它肽序列的單獨肽鏈，例如EFL肽。在TentaGel S RAM樹脂(90mg，0.22mmol/g)上進行用于實驗的肽的合成。將樹脂置于裝備有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯導管中。使樹脂在DMF中膨脹，并用DMF中的20％哌啶處理以保證在樹脂上出現未保護的氨基。然后排干樹脂并用DMF洗滌直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后檢測不到黃色。輪流除去Fmoc-基團使氨基酸一次一個地結合上去。在結合到延長的樹脂-結合的肽鏈前，經TBTU/HOBt在DMF中預活化Fmoc-氨基酸。為了除去Fmoc-基團，使用DMF中的哌啶溶液。
            
FGL二聚體的LPA生產通過利用如WO 00/18791中所描述的，利用TBTU/HOBt使Boc-亞氨基二乙酸結合至樹脂上的肽來制備本申請的FGL(FGLL)的LPA-型二聚體。為了減少副反應，用Boc-亞氨基二乙酸作為限制成分進行多重偶連。從樹脂切下肽，在存在TES時以水作為清除劑在TFA中的側鏈上同時使肽去保護以產生肽酰胺。通過蒸發減少TFA的量而使肽沉淀。通過反相HPLC進行FGLL的最后純化。HPLC的條件如下柱YMC ODS-AMQ，5μM，4.6×250mm，200A流量 1.0ml/min流動相   A0.12％TFA，95％H2O，5％ACNB0.1％TFA，95％ACN，5％H2O梯度 15％B至35％B  20min，35％B至95％B  1min并且保持5min。
            
檢測 二極管陣列檢測器190-400nm波長 220nm注射體積 20μl，  
            
FGLL的濃度 0.5mg/ml通過凍干分離HPLC純化的FGLL。FGLL合成的流程圖如圖1所示。圖2描繪了FGLL最后純化的HPLC洗脫圖譜。
            
縮寫氨基酸的縮寫與生化命名法則Eur.J.Biochem，1984，vol.184，第9-37頁中IUPAC-IUB Joint Commission的建議一致。
            
其它縮寫AcOH   乙酸TBTUO-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲陽離子四氟化碳IdaBoc亞氨基二乙酸MTBE   t-丁基甲醚DMF二甲基甲酰胺EtOH  乙醇，99,9％DIPEA  N-乙基-二異丙胺HOBt   1-羥基苯并三唑NMPN-甲基吡咯烷酮TFA三氟乙酸TES三乙基硅烷BocN-叔丁氧羰基Fmoc   9-芴基甲氧羰基TBu叔丁基HPLC   高壓液相色譜法R  酰胺-TG-樹脂AA 氨基酸FGLL的理化性質FGLL具有結構式 它由其N-末端上的接頭基團，氨基乙酸(N-(羧甲基)甘氨酸)共連接的15個氨基酸殘基的2個相同肽序列組成。FGLL的分子量是3394.8道爾頓。通過加入乙酸來防止肽化合物在濃縮水溶液(高于0,5mg/ml)中的非共價聚集。
            
FGLcys和FGLlys二聚物合成利用Goodwin等人(1998)Bio-org Med Chem Lett 82231-2234中所描述的固相合成來合成FGLcys二聚體，該二聚體由2個單獨的FGL序列組成，每個FGL序列中在通過S-S鍵結合的N-末端包含附加的半胱氨酸殘基。
            
利用Rajagopalan等人(1995)Int J Pept Protein Res.45173-179中所描述的固相合成制備FGLlys二聚體，該二聚體由2個單獨FGL單體序列構建，該單體序列通過其C-末端結合至賴氨酸。
            
FGL(FGLd)的樹枝狀聚合四聚物的合成根據例如PCT/US90/02039中所描述的標準方法合成FGL，FGLd的MAP-型樹枝狀聚合物。
            
圖3表明了最后純化FGLD的HPLC洗提圖譜。陰影部分表示了合成產品的異質性的水平。
            
實施例2.FGL的不同制劑對神經元體外存活的影響在本領域公知的存活測定中比較FGL肽的不同制劑的生物活性，并且如下進行詳細描述。
            
多巴胺能神經元(DN)從15天胚胎的Wistar大鼠胚胎制備多巴胺能神經元(Charles River，Sulzfeld，德國或Mollegaard，丹麥)。殺死懷孕的大鼠，取出子宮并且保存在冰上的Hank′s平衡鹽溶液中(HBSS；Gibco，BRL)。從胚胎的腦解剖中腦的腹側部分，在冰上的補充有5g葡萄糖/l(Sigma-Aldrich)的Gey′s平衡鹽溶液(GBSS；Gibco，BRL)中勻漿，然后進行胰蛋白酶消化。在存在DNAse1和大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich)時洗滌解離的細胞。
            
對于存活測定，如上所述將分離的神經元以150,000個細胞/cm2的密度接種在涂有聚-D-賴氨酸的24-孔細胞培養平板中。在沒有或具有各種濃度的FGL肽條件下放置神經元分化6天，其后加入100μM濃度的6-OHDA 2小時。通過將6-OHDA以10mM的濃度溶解在0.1％(w/v)焦亞硫酸鈉中以免氧化來制備原液。加入6-OHDA 2小時后，使培養基轉換為具有添加物和肽的Neurobasal培養基，并且使細胞培養物進一步培養24小時，固定并進行酪氨酸羥化酶免疫染色。如下文多巴胺能軸突向外生長測定中所描述的，自動記錄每個個體實驗中各個試驗條件的98個圖像。
            
海馬神經元(HN)為了實驗，如Ronn等人(1999)Nat Biotechnol.171000-5所描述的，從19天胚胎的Wistar大鼠胚胎或新生大鼠分離解離的海馬神經元。
            
簡而言之，從在冰冷的改進的Krebs Ringer溶液中的腦分離海馬，清除血管，通過破碎粗略地勻漿然后進行胰蛋白酶消化。在存在DNAse 1和大豆胰蛋白酶抑制劑時洗滌解離的細胞。
            
為了測定，將神經元以40,000個細胞/cm2的密度接種在涂有10μg/ml聚-L-賴氨酸的8-孔permanox載片上的Neurobasal培養基中。接種后15分鐘，加入終濃度為20μM的Aβ25-35。在接種前將Aβ25-35溶于無菌去離子水中至濃度為3mM，并根據Pigino等人(2001)J Neurosci.21834-42在37℃培養4天。這種處理誘導Aβ-肽片段的纖維化，由此增加其神經毒活性。如Kruman等人(1997)所描述的，用含有FGL肽的Neurobasal培養基培養神經元70小時，用4(v/v)甲醛固定，并用Hoechst 33258染色25分鐘。如海馬軸突向外生長測定所描述的在各個實驗中利用計算機輔助的熒光顯微術隨機記錄各組1000-1500個神經元的圖像。利用ProteinLaborator，哥本哈根大學開發的軟件包Prima計數來自死的和活的神經元的細胞核，并且評估活的神經元相對于神經元總數的百分率。
            
小腦顆粒神經元(CGN)如Drejer和Schousboe(1989)Neurochem Res.14751-4先前所描述的，從出生后7天的Wistar大鼠制備小腦顆粒神經元(cerebellar granule neuron)(CGN)。
            
為了實驗，在保存在冰上的改進的Krebs-Ringer溶液中解剖小腦組織，并且如上述對海馬神經元所描述的進行處理。在含有5％CO2的加濕環境中于37℃培養所有的細胞培養物。根據國家的動物保護原則處理所有的動物。
            
將CGN的原始培養物以100,000個細胞/cm2的密度接種在Neurobasal-A培養基(Gibco，BRL)中的涂有聚-L-賴氨酸的8-孔permanox載片上，其補充有2％(v/v)的B27，0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和KCl，使得培養基中KCl的終濃度為40mM。
            
接種后24小時，加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C；Sigma-Aldrich)至終濃度為10μM以避免膠質細胞增殖，其后容許神經元進一步在37℃分化6天。通過排干兩次和將培養基改變為補充有1％(v/v)谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素、3.5g D-葡萄糖/l和1％(v/v)丙酮酸鈉(Gibco BRL)、與各種濃度的肽一起的Basal Medium Eagle(BME；Gibco BRL)誘導程序性細胞死亡。由此培養物中鉀的濃度減少為5mM KCl。誘導細胞程序性死亡后2天，如使用海馬神經元的存活測定所描述的用4％甲醛固定細胞并用Hoechst 33258染色。
            
如D′Mello等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA.9010989-93所描述的進行測定。
            
利用CGN培養物的其它存活測定。
            
1.PACE測定根據Versteeg等人(2000)FEBS Lett.46569-73進行磷酸化的Erk1/2和Akt相對于CGN總數的檢測。
            
為了實驗，將CGN以290,000個細胞/cm2的密度接種在涂有聚-L-賴氨酸的96-孔微孔板中。使神經元生長在補充有0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Neurobasal-A培養基中。接種后24小時，如上所述向培養物加入Ara-C。培養72小時后，將培養基的一半替換為含有待測試肽的Neurobasal-A培養基。對于Erk1/2磷酸化測定，使培養物進一步培養0-90分鐘，以70g離心8分鐘，用4％(v/v)甲醛固定，并利用磷酸-p42-44兔第一抗體和過氧化物酶-偶聯的抗兔第二抗體進行免疫染色。對于磷酸化Akt的檢測，使培養物進一步培養10或30分鐘，以70g離心8分鐘，用4％(v/v)甲醛固定，并利用針對在Ser473磷酸化的Akt多克隆抗體和過氧化物酶-偶聯的第二抗體。通過用結晶紫染色評估兩個磷酸化測定中的神經元總數。
            
2.TUNEL測定將CGN以60,000個細胞/em2的密度接種在涂有聚-L-賴氨酸的8-孔permanox載片上。使培養物生長在補充有2％(v/v)B27，0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和40mM KCl(終濃度)的Neurobasal-A培養基中6天，并如上述CGN存活測定所描述的誘導細胞程序性死亡。誘導細胞程序性死亡24小時后，固定培養物并且利用ApoAlert細胞程序性死亡檢測試劑盒，基本上如制造商所描述的測量DNA-斷裂的程度。簡而言之，用熒光素-dUTP酶促標記雙鏈DNA分子的鈍末端，并且用濃度為750ng/ml的碘化丙啶染色所有的神經元。利用與裝備有油浸60×1.4NA物鏡的Nikon Eclipse TE 200共聚焦顯微鏡偶連(Nikon，東京，日本)的BioRad輻射激光掃描系統2000從各個實驗中的各組獲得至少200個神經元的圖像。通過計數測定TUNEL-陽性神經元的分數。
            
結果FGL促進多巴胺能的、海馬和小腦顆粒神經元的存活因為FGL是具有生長因子-樣活性的FGF受體的拮抗劑，研究FGL是否可在各種神經毒狀況下起神經保護劑的作用。通過添加6-OHDA誘導多巴胺能神經元中的細胞死亡。在圖4a中能夠看出與未處理的對照相比暴露于6-OHDA后強烈減少了活的多巴胺能神經元的數目。加入10ng/ml神經膠質衍生的神經營養性因子(GDNF)部分地預防了這種神經元損失(與設置為100％的6-OHDA-處理的對照細胞相比為150％)。當存在各種濃度的FGLd而使培養物生長時(圖4b)，用6-OHDA處理的多巴胺能神經元在濃度為1μg/ml的FGLd下其存活在統計學上顯著增加大約135％的最大挽救并且該效果顯示出圓錐形的劑量反應關系。
            
因此，在使用6-OHDA作為神經毒化合物的存活模型中FGLd能夠挽救多巴胺能神經元至與GDNF大約相同的程度。
            
也測試FGLd是否能夠保護海馬神經元免于由Aβ25-35誘導的死亡。用與各種濃度的FGLd一起的預聚集的Aβ25-35培養海馬神經元的培養物。在圖4c中能夠看出用20μM Aβ25-35處理海馬細胞培養物可誘導中-低程度的神經元細胞的損失。這種損失可部分地通過50ng/ml腦衍生的神經營養性因子(BDNF)挽救。如圖4d所示，用0.1-50μg/ml濃度范圍的FGLd處理也從由20μM Aβ25-35誘導的神經退化部分地挽救了海馬神經元。FGLd-誘導的神經保護達到濃度為0.3μg/ml FGLd(與Aβ25-35-處理的對照相比為110％)的最大水平，保持多于或少于在FGLd濃度達到50μg/ml時的恒定值。
            
因此，FGLd可保護海馬神經元抵抗Aβ25-35肽的神經毒作用，其達到用BDNF處理所獲得的相同程度。
            
先前已經表明如果CGN的原始培養物生長在高水平的KCl中，并且隨后減少KCl的濃度，可誘導細胞程序性死亡。在于40mM KCl中誘導分化七天的CGN培養物中研究FGLd的神經保護效果。隨后KCl濃度減少為5mM，2天后評估細胞存活力。如圖4e所示，低KCl濃度誘導CGN培養物中的細胞死亡，并且這可通過用胰島素-樣生長因子1(IGF-1)處理而加以挽救。如圖4f所示，也可通過用FGLd處理部分地防止細胞死亡。在肽濃度為1-10μg/ml之間看到與生長在低KCl濃度下的對照相比達到135％的最大神經保護。
            
因此，該結果表明FGL能夠體外促進多巴胺能的、海馬和小腦顆粒神經元的存活。
            
FGL保護小腦顆粒神經元抵抗細胞程序性死亡為了進一步表征FGLd的神經保護作用機制，測量去除KCl的CGN中DNA-斷裂(通常與細胞程序性死亡相關)的程度(如Eldadah等人，(2000)J Neurosci.20179-86所描述的)。維持在高KCl培養基中的CGN顯示具有斷裂DNA的極少神經元。大部分用低KCl處理的細胞顯示DNA-斷裂。在用濃度為10-20μg/ml的FGLd處理的CGN培養物中，當除去KCl時幾乎沒有神經元顯示斷裂的DNA。相比之下，對照的肽、FGL9、具有雙重丙氨酸取代的10diAlad沒有顯示出神經保護作用。隨后定量FGLd的神經保護作用，并且在圖5中能夠看出與維持在高KCl培養基中的CGN相比，除去KCl導致含有斷裂DNA的CGN的數目明顯增加。用對照的肽、FGL9、10diAlad進行處理不能從細胞程序性死亡挽救CGN。加入各種濃度的FGLd減少了細胞程序性死亡的CGN的數目，FGLd在10-15μg/ml的濃度時，相對于沒有FGLd處理的，其對細胞程序性死亡的神經元有40％的最大挽救。
            
FGL-誘導的信號轉導導致Erk和Akt的磷酸化FGL肽已經顯示結合和活化FGFR。起源于FGFR的信號通路-途徑尤其包括Ras-MAPK途徑，如MAPK Erk1/2和P13K途徑的活化所反映的，其活化了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt。已知兩個途徑都涉及神經元的分化和存活。因此FGL的軸突長出和存活促進效果可取決于MAPK和P13K途徑的活化。因此研究Erk1/2和Akt是否應答了FGL肽對CGN培養物的處理而被磷酸化。從圖8看來與5μg/ml的濃度相比濃度為10μg/ml的肽誘導Erk1/2的持續磷酸化，其不能誘導Erk1/2的磷酸化。用FGLd刺激10分鐘后可看到這種活化(與對照培養物相比為115-120％)并且持續至少90分鐘。
            
將CGN培養物暴露于該肽10或30分鐘后分析經FGL的Akt磷酸化(圖7)。在0.5μg/ml以上濃度中暴露10分鐘時間段導致與未處理的對照相比Akt磷酸化的顯著增加。在肽濃度為1μg/ml磷酸化水平達到最大量，并且在劑量增加達到20μg/ml時保持相對恒定。在30分鐘的暴露時間，沒有檢測到Akt的磷酸化，表明Akt的活化與Erk1/2的磷酸化反應相比是暫時的并且在30分鐘內終止。
            
因此，該結果表明FGL誘導MAPK途徑的持續(至少90分鐘)活化以及Akt的暫時(10分鐘)活化。
            
FGL通過FGFR、MEK和P13K促進神經元細胞存活為了研究FGFR、MEK和P13K是否也涉及FGL-誘導的存活，用上文描述的抑制劑處理被誘導經受細胞程序性死亡的CGN培養物。如圖8所示，用FGLd但沒有抑制劑處理的細胞程序性死亡-誘導的CGN培養物中細胞的存活設置為100％，并且未用FGLd處理的細胞程序性死亡-誘導的對照神經元(用虛線標記)與FGLd-處理的神經元相比具有更低的存活率。FGFR抑制劑、SU5402(■)顯著抑制了對FGLd濃度已經為20μM的存活應答，并且40μM SU5402的濃度減少了FGLd-誘導的存活至未處理的細胞程序性死亡-誘導的對照神經元的存活率。MEK抑制劑、PD98059(●)抑制了經FGLd誘導的細胞存活至濃度為12.5μM的對照培養物的水平。P13K抑制劑LY294002(▲)顯著抑制了濃度為3.5μM的FGLd-誘導的細胞存活。表明LY294002是神經元存活的非常有效的和全身性的抑制劑。
            
因此，CGN培養物除去KCl后，FGL-誘導的存活取決于FGFR和胞內激酶MEK和P13K的活化。結果表明LY294002是神經元存活的最有效的抑制劑，然后是MEK抑制劑，PD98059，其在軸突長出測定中比在存活測定(見下文)中有效性似乎差一些，可能表明FGL-誘導的MEK活化的主要功能是神經保護，而不是分化。
            
實施例3.通過FGL的不同制劑體外刺激軸突向外生長如上所述制備DN、HN和CGN的原代培養物。
            
多巴胺能神經元(DN)將DN以100,000個細胞/cm2的密度接種在24-孔細胞培養平板中(先前涂有12.5μg/ml聚-D-賴氨酸；Sigma-Aldrich)的含有50％(v/v)Optimem1(Gibco，BRL)、25％(v/v)馬血清(Gibco，BRL)、25％(v/v)HBSS和5g葡萄糖/1的培養基中。在將培養基轉換為補充有2％(v/v)B27 Neurobasal添加物、0.5％(v/v)谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(所有的來自Gibco，BRL)，沒有或具有各種濃度肽的Neurobasal培養基前放置細胞以貼附1-2小時。培養72小時后，用4％(v/v)甲醛固定神經元并利用針對酪氨酸羥化酶的第一小鼠單克隆抗體和生物素化的羊抗小鼠第二抗體，然后用過氧化物酶偶聯的鏈霉抗生物素培養進行免疫染色。利用由Walmod等人(2002)Toxicol Appf Pharmacol.1811-15描述的計算機化的顯微鏡操作裝置自動記錄各個個體實驗中每個試驗條件的98個圖像。簡而言之，操作裝置由裝備有機動的、可動顯微鏡載物臺(LUDL Electronic ProductionLtd，Hawthorne，NY，美國)、10x物鏡和1100模擬設備b/w CCD攝像機(DFA，丹麥)的Eclipse TE 300倒置顯微鏡(Nikon東京，日本)組成。根據Ronn等人，(2000)J Neurosci Methods.10025-32)使用Protein Laboratory(哥本哈根大學，丹麥)開發的軟件包Prima進行軸突長度的立體空間基礎的測定。
            
海馬神經元(HN)和小腦顆粒神經元(CGN)將生后的HN或CGN以10,000個細胞/cm2的密度接種在于Neurobasal培養基中的未涂覆的8-孔permanox Lab-Tek小室載片上，其中補充有0.4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)、2％(v/v)B27 Neurobasal添加物、1％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2％1M HEPES(所有的來自Gibco，BRL)。加入沒有或具有各種信號轉導途徑的抑制劑的肽溶液至總體積為300μl/cm2，并且于37℃培養載片。24小時后，用4％(v/v)甲醛固定神經元20分鐘，此后利用針對GAP-43的第一兔抗體和Alexa Fluor第二山羊抗-兔抗體進行免疫染色。通過利用如先前描述的計算機輔助的熒光顯微術系統地獲得各個單獨實驗中各組的至少200個神經元的圖像(Ronn等人，2000op.cit.)。簡而言之，使用具有與攝像機偶連的Nikon Plan 20×物鏡(Nikon，東京，日本)的Nikon Diaphot倒置顯微鏡進行記錄。使用如上所述用于多巴胺能軸突向外生長測定的相同軟件包加工記錄的圖像。
            
結果FGL誘導多巴胺能的、海馬和小腦顆粒神經元原始培養物的軸突向外生長已經表明單體形式的FGL可誘導從初始海馬神經元長出軸突。眾所周知多聚體形式的肽配體比單體形式具有針對受體活化的更高效力(上文所述)。因此，制備各種二聚和四聚形式的FGL并且使用多巴胺能的、海馬和小腦顆粒神經元(CGN)的原代培養物測試其軸突長出刺激能力。
            
在缺乏或存在四聚(樹枝狀聚合)的FGL肽(FGLd)時使培養物生長。隨后定量通過所有3類神經元的FGLd誘導的軸突長出并且顯示在圖9中。用FGLd (●)處理的多巴胺能神經元顯示出統計學上顯著的劑量依賴方式的軸突長度增加，其在濃度為1μg/ml FGLd時獲得最大的平均軸突長度(與未處理的對照相比為125％)。用FGLd(▲)處理的海馬神經元在0.04μg/ml劑量的FGLd時顯示出軸突長度增加，達到類似平臺期的水平，與使用濃度達到20μg/ml的FGLd的未處理的對照培養物相比具有大約150％的刺激。用FGLd(■)處理的CGN培養物也顯示出劑量依賴的軸突長出反應。與未處理的對照相比在50μg/ml FGLd的濃度時可看到255％的最大刺激。
            
選擇海馬神經元的原代培養物來測試3種不同二聚形式的FGL肽、FGLL、FGLlys和FGLcys對軸突長出的影響。如圖10所示，二聚的賴氨酸樹枝狀聚合物、FGLlys(▲)和FGLcys(·)都不能以所測試的任何濃度刺激軸突長出。相比之下，FGLL(■)誘導顯著的軸突長出反應，其顯示劑量依賴的關系，具有在1μg/ml濃度時達到最大刺激的鐘形曲線。與未處理的對照相比最大刺激是155％(圖10)，其與由FGLd誘導的反應粗略相同(參見圖9)。
            
由FGL誘導的軸突長出涉及FGFR、MEK和PI3K的活化為了闡明FGFR、MEK和P13K活化的生物相關性，測試這些激酶的抑制劑對CGN中由FGLd誘導的軸突長出的影響。已知FGFR抑制劑，SU5402，通過與受體催化結構域的相互作用抑制FGFR亞類1的酪氨酸激酶活性。在圖11中將FGLd-處理的CGN培養物中平均的軸突長度設置為100％，并且將未用FGLd處理的對照神經元的平均軸突長度標記為虛線。看來SU5402(■)在80μM濃度時顯著抑制FGLd-誘導的軸突長出(至初始值的35％)。用MEK抑制劑PD98059(●)以上述25μM的濃度處理統計學上顯著地減少由FGLd誘導的軸突長出至75％。P13K抑制劑LY294002(▲)也已經以3.5μM的濃度顯著地抑制FGLd-誘導的軸突長出至90％，在10μMLY294002的濃度時軸突長出對FGLd的應答幾乎減少至50％，其比未處理的對照神經元更低。SU5402和LY294002對未用FGLd處理的對照培養物中的軸突長出沒有顯著的影響(數據未顯示)。先前已經發現PD98059不影<p>  
            
     
            
CHAIN A DIFF-AREA858.0(此鏈的總面積11223.0的7.65％)表6.接觸VEGF的G6-23殘基殘基1:211指輕鏈。殘基1001:1223指重鏈。
            
     
            
(對照)并且與加入FGL的培養物相比較。
            
統計數值(+FGL vs.對照處理)*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001表2.FGL肽對大鼠CGN、DN和HN原代培養物中軸突長出的影響總結。
            
統計數值(+FGL vs.對照處理)*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001PND＝生后天數；E＝胚胎的天數  
            
     
            
結論1.FGL肽是多種神經元細胞類型的體外存活促進化合物，其在神經退化紊亂的治療中是必需的.  
            
2.FGL肽能夠體外誘導多種神經元細胞類型的軸突長出，并且FGL具有促進軸突和樹突生長的潛能，這在神經退化紊亂的治療中是必需的。
            
3.所有的單體FGLm，二聚FGLL和樹枝狀聚合的FGLD，FGL肽的制劑在促進存活和神經突長出中是有效的。
            
4.FGLL和FGLD在神經突長出的促進中比FGLm是多出200倍有效的。
            
5.FGLL在神經突長出的促進和存活中與FGLD一樣有效。
            
6.其它的FGL肽制劑，例如二聚的FGLlys和FGLcys在神經突長出的促進中是失活的。
            
實施例4.FGL對大鼠海馬神經元的初始細胞培養物的突觸適應性的影響在成人神經系統中，例如海馬的結構連續地經受適應性改變(plasticchange)以調整結構和功能。特別地，認為記憶的獲得需要已經建立的神經元連通的結構性和功能性變化。NCAM已經顯示在發育期間以及學習和記憶的神經元適應性中起重要作用(Weizl和Stork，(2003)News Physiol Sci.18147-50)；然而，這些影響的機制是未知的。本研究中探查了FGL肽是否能夠影響突觸的適應性(synaptic plasticity)。
            
在來自胚胎大鼠(E19)的海馬神經元的原代培養物中評估FGLd對囊泡翻轉的影響。如上所述制備培養物。體外13-16天后，向培養物加入FGLd并且培養1、24或48小時。培養48小時后，將FGFR-抑制劑(SU 5402)與FGLd一起同時加入一些培養物。
            
如Kiryushko等人(2003)J Biol Chem.27812325-34所描述的，用FGLd處理后用熒光膜探針FM 1-43標記神經元。然后利用Radiance 2000掃描系統和Nikon eclipse TE200共聚焦顯微鏡進行定時的圖像獲取來評估通過用90mM鉀去極化誘發的FM 1-43釋放(細胞脫色)的速率。
            
進一步利用在培養物中生長13天的初始胚胎(E19)海馬神經元中的神經突和突觸的雙重免疫染色來評估FGLd對突觸形成的影響。在固定和免疫染色前用FGLd培養細胞48或96小時。通過針對突觸素(synapto physin)的抗體檢測突觸并且通過針對生長-關聯的蛋白質-43的抗體(GAP-43-也稱為B-50或F1)標記神經突。如Ronn等人(2000)(op.cit.)所描述的檢驗免疫染色并通過共聚焦熒光顯微術定量。
            
結果用20μg/ml的FGLd處理海馬神經元1h和48h導致與對照相比，FM1-43脫色速率在統計上顯著增加(分別從0.008sec-1至0.016sec-1，和從0.013sec-1至0.028sec-1)；而24h處理沒有產生顯著的影響(圖12)。這表明FGLd導致遞質釋放的短期促進(1h)和突觸效力的長期增加(48h)。FGFR抑制劑SU5402消除FGLd的影響表明FGLd的影響是通過與FGFR相互作用而介導的。
            
海馬神經元的突觸素和GAP-43的雙重免疫染色表明將FGLd(20μg/ml)施用于海馬培養物48和96小時顯著增加了突觸的數目，反映為每100μM長度的軸突突觸素陽性斑點的數目增加大約20％(分別為2.40至2.96和2.73至3.24)。
            
這些結果表明FGL肽通過增加突觸前囊泡翻轉的比率和突觸數目來影響突觸的適應性。
            
實施例5.FGL對暴露于缺血性狀況的器官性海馬神經元切片培養物和分離的海馬原代培養物的影響腦對氧和葡萄糖的具有高消耗，并且幾乎唯一地依賴于用于能量產生的氧化磷酸化。缺氧和缺乏葡萄糖供給導致神經元的細胞損壞和死亡。對缺血性損傷的敏感度在腦的不同部分當中以及甚至不同的神經元群體中是不同的。海馬CA1區域的神經元是易受傷部位腦中的一個區域。
            
方法在本研究中，根據Stoppini等人的方法(1991)Neurosci Methods 37173-82研究了來自7-天齡Wistar大鼠的器官性(organotypic)海馬神經元切片培養物(OHSC)，以及根據Maar等人的方法(1997)J Neurosci Res.47163-72.研究來自1天齡大鼠的分離的海馬神經元原代培養物中除去氧和葡萄糖后(OGD)FGL肽對突觸適應性、神經元功能和易受傷部位的影響。在加入FGLd前維持原代細胞培養物11-12天并且維持OHSC 12-14天。
            
將原代細胞培養物和OHSC暴露于OGD 10和20分鐘。OGD后，再次用氧和葡萄糖供給培養物并且在導入OGD暴露后在1，4或24小時的時間點進行分析。在OGD之前24hr、即刻、或OGD后1hr或24hr加入FGLd(或對照的肽FGL)。在OGD前給藥，導入OGD時，從培養基移出FGLd。有時，只在OGD后4hr用FGLd處理切片培養物。此外，在一些設置組中與FGLd一起加入FGFR抑制劑，SU5402(25μM)。
            
在海馬神經元的培養物中，使用FM 1-43染色劑來評估突觸前的功能(如上所述)。根據Malich等人，(1997)Toxicology.124179-92利用MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯苯四唑溴化物]測定測量原代細胞培養物和OHSC中的細胞的活力。此外，根據Laake等人(1999)Brain Res BrainRes Protoc.4173-84利用碘化丙啶(PI)染色測量OHSC中的細胞的活力。
            
結果通過MTS測定所測量的，20min的OGD后1小時(31％)和4小時(30％)后分離的海馬細胞培養物的代謝活力與對照培養物相比顯著減低。當用FGLd處理細胞培養物(在OGD前24小時或OGD后即刻)時，減弱了OGD對代謝活力的影響。OHSC中的代謝活力顯示對OGD的不同應答。OGD后1小時，與對照相比代謝活力顯著增加(19％)，同時更長周期的恢復氧供應(24小時)導致代謝活力降低(24％)。在兩個時間點，在OGD前24小時用FGLd處理與對照相比導致海馬切片中代謝活力的正常化。在分離的細胞培養物和OHSC中，單獨的FGLd處理導致代謝活力增加。此外，如果FGFR-抑制劑SU 5402與FGLd一起存在，用FGLd預處理24小時沒有減弱OGD-誘導的代謝活力下降，表明FGLd可能通過FGFR活化影響代謝活力。
            
在分離的海馬細胞培養物中，高鉀刺激時前突觸小泡釋放(FM1-43脫色)的速率在統計學上通過FGLd處理是顯著增強的(0.04sec-1至0.06sec-1)，而OGD后在1h和4h分析時是降低的(兩者都為0.04sec-1至0.02sec-1)。如果在OGD前或OGD后即刻用FGLd處理細胞培養物24小時，FM1-43釋放比率中OGD誘導的降低受到減弱。此外，FGFR-抑制劑SU 5402消除了FGLd對FM1-43釋放中OGD-誘導的降低的影響。
            
在OHSC中，通過碘化丙啶(PI)染色評估OGD誘導延遲細胞損壞10分鐘。OGD后在4小時(0.3％至5.0％)和24小時(0.6％至23.1％)存在OHSC PI染色的顯著增加(全部CA1區域的％)。可通過用FGLd預處理切片24小時可幾乎完全消除這種影響。也通過在OGD后即刻用FGLd處理切片避免細胞損壞，但如果在OGD后推遲FGLd處理4小時則不能避免。對照肽FGLC沒有影響由OGD誘導的細胞損壞，如果用FGFR-抑制劑SU 5402與FGLd一起預培養切片，則PI染色與單獨的OGD相似。
            
討論當在暫時除去氧和葡萄糖前24小時或除去后即刻應用在兩個不同的體外模型系統中時，FGLd肽具有神經保護影響。OGD導致分離的海馬細胞培養物和OHSC中代謝活力減少，在兩個情況中用FGLd處理可部分地或完全地使OGD后代謝活力正常化。
            
已經報道缺血導致突觸傳遞增強或突觸傳遞減少，取決于所使用的模型和缺血性攻擊的嚴重度。在用于該研究的模型中，當鉀刺激時，20分鐘的OGD導致突觸前囊泡釋放減少，并且這種減少通過在OGD前24小時或OGD后即刻施用FGLd肽而減弱。
            
因此，對于所有的3種參數研究(代謝活力、突觸前囊泡釋放和細胞活力)，FGL肽可部分地或完全地抑制OGD的影響。此外，在所有的3種情況中通過FGFR-抑制劑SU 5402抑制FGL的這種神經保護能力，表明FGFR活性是為FGL作用所必需的。
            
實施例6.FGL對大鼠的社會行為和β-淀粉樣蛋白誘導神經毒性的體內影響。
            
模型的說明本研究使用大鼠模型，其中通過(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段誘導神經毒性和認知損傷(參見Maurice T.等人(1996)(Brain Res.706181-93)和Delobette S.，等人(1997)Eur JPharmacol.3191-4)。通過大鼠中(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段誘導的短時記憶缺失對于研究具有特殊的重要性，正如其類似于阿爾茨海默氏病的一個臨床表現。利用3種不同的行為測試評估大鼠中的短時記憶缺失Social Recognition(Kogan等人，(2000)Hippocampus1047-56)、Open Field(Cerbone和Sadile，(1994)Neurosci Biobehav Rev.18497-518.；Vianna等人，(2000)Learn Mem.7333-40)和Y-maze(Clayton &amp;Williams，(2000)Neurobiol Learn Mem.74135-45)測試，此外，對處死時收集的腦組織進行神經病理學的研究。枕骨下或鼻內施用FGL肽。
            
方法具有早期處理的代表性的社會認知研究的時間安排用圖解顯示在圖26(A)中。
            
適應環境5天時間后，用(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段(A-β)處理大鼠(每個動物25μg)，在腦的右側腦室(第0天)進行i.c.v.注射。
            
在第7、10和13天或在第30、33和36天枕骨下(每個動物每次給藥5μg)或鼻內(每個動物每次給藥400μg)施用FGL肽(FGLL或FGLd)。利用Social Recognition測試、Open Field 測試或Light-dark DiscriminatingY-maze評估動物的行為。在第28-30天或第51天，在(25-35)β-淀粉樣蛋白片段的i.c.v.給藥后，處死動物，并且在選擇的研究中，收集腦組織，用A-β特異的抗體免疫染色組織切片，計算淀粉樣蛋白-覆蓋層作為A-β陽性區域的百分比。此外，利用幾何學方法計算腦切片中所選擇區域中神經元的數目。
            
(25-35)A-β/載體-給藥對社會行為和記憶的影響在Social Recognition測試中，與接受載體(V)的對照動物相比，在接受(25-35)β-淀粉樣蛋白片段的大鼠中發現在第二試驗期間確定年幼大鼠花費的時間有增加。在Open Field測試中，(25-35)β-淀粉樣蛋白片段-處理的大鼠與對照動物組中所表明的降低相比，沒有降低20-分鐘測試期間探查的活力。在用陽性食物加強的Light-dark Discriminating Y-maze中，用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理的大鼠表明了誤差(進入錯誤的橋臂)數目的增加。
            
因此，在所有的3個測試中，(25-35)β-淀粉樣蛋白片段的i.c.v.給藥導致如短時記憶損傷所呈現的認知缺失。
            
FGL給藥對通過i.c.v.-給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段誘導認知損傷的大鼠的行為和記憶的影響在幾個獨立研究中如下所述的不同體內測試中評估FGL的影響。
            
社會認知測試和神經組織病理學研究1i.c.v.給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段后，在第7、10和13天枕骨下施用FGL。在第14天，FGLd最后給藥的次日在社會認知測試中沒有觀察到FGLd的效果，并且安慰劑-處理的大鼠相對于單獨接受(25-35)β-淀粉樣蛋白片段或FGLd的大鼠在海馬CA3區域的神經組織病理學評估中沒有觀察到顯著的影響。
            
研究2i.c.v.給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段后在第7、10和13天枕骨下施用FGL。施用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段導致與對照大鼠相比，大鼠在第二次相遇時探查幼鼠所花費時間，以及在淀粉樣蛋白覆蓋層和神經元細胞死亡方面統計學上顯著增加。然而，用FGLL和FGLd處理與只用β-淀粉樣蛋白肽片段處理的動物相比時顯著減少了第二試驗期間處理動物探查幼大鼠所花費時間的增加。用FGLL和FGLd處理也顯著減少了具帶皮層(分別為從100％至39％ &amp; 42％)和海馬CA3區域中(分別為從100％至17％&amp; 44％)的淀粉樣蛋白覆蓋層。此外，當與只用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理的大鼠組相比時，FGLL和FGLd導致海馬CA3區帶中神經元密度增加(分別為15至21 &amp; 22個神經元/mcm2×10-4)。圖解結果如圖13-16所示。
            
研究3i.c.v.給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白酶片段后，在第30、33和36天枕骨下施用FGLL。在第44天，FGLL最后給藥后一星期，當枕骨下施用FGLL時觀察到第二次暴露時大鼠探查新目標(年幼大鼠)所花費的時間與(25-35)A-β溶劑處理的對照大鼠相比的比率在統計學上顯著減少(從0.50至0.41)。此外，神經病理學研究顯示具帶皮層(從100％至24％)和海馬CA3區域(從100％至29％)中淀粉樣蛋白覆蓋層的統計上顯著的減少。此外，與只用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理的大鼠組相比，在具帶皮層中觀察到損傷神經元的百分比在統計上顯著減少(從27至21個神經元/mcm2×10-4)。圖解結果顯示在圖17-20中。
            
研究4i.c.v.給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段后，在第7、10和13天鼻內施用FGLL。用淀粉樣蛋白β肽誘導的處理誘導短期記憶缺失，其可通過用FGL-肽處理消除。在具帶皮層中，與只用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理的大鼠組相比，在應答FGLL給藥中觀察到神經元密度的統計學上顯著的增加(從11至14μM2×10-4)。圖解結果顯示在圖21-23中。
            
Open Field研究i.c.v.-給藥(25-35)β-淀粉樣蛋白片段后，在第7、10和13天接受枕骨下施用FGLd的大鼠顯示與在第14天，FGL最后給藥次日的第一次測量期間相比探測孔穴的時間在統計學上顯著減少(3.3s至0.1s)，在最后測量期間中進行繁殖(從7.0s至0.7s)所花費時間的統計學上顯著的減少。只用(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理的大鼠組顯示2個測量周期之間沒有統計上顯著的差異。在第14天運動活性未受影響。
            
伴隨陽性食物-加強的Light-dark Discriminating Y-maze研究接受FGLd枕骨下給藥的大鼠顯示在第25天，訓練的最后一天誤差數目在統計上顯著減少(從3.8至1.7)，同時與(25-35)β-淀粉樣蛋白片段處理得對照大鼠比較，在訓練的第21-24天沒有觀察到顯著差異。
            
討論用于這個研究的模型，(25-35)β-淀粉樣蛋白片段誘導神經毒性反映了在Alzheimer′s患者中看到的神經病理和認知損傷的許多方面。在這個模型中，(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段的i.c.v.給藥導致在(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段給藥后第14天開始β-淀粉樣蛋白肽的沉積，其導致神經元細胞死亡和認知損傷(短時記憶缺失)。
            
FGL肽的早期給藥實驗(在(25-35)β-淀粉樣蛋白片段的i.c.v.注射后第7、10和13天)清楚地表明枕骨下和鼻內施用FGL可防止短時記憶缺失、減少各種腦區域中β-淀粉樣蛋白覆蓋和減少神經元細胞死亡。在i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段后第30、33和36天，較后階段FGL肽的給藥改善了腦組織中神經病理學的變化和記憶缺失。
            
這些研究的重要方面是為了比較FGL給藥的不同途徑的有效性。獲得的結果清楚地表明FGL肽的鼻內給藥有效地減少了由用(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段處理誘導的記憶缺失，盡管鼻內施用FGL肽的效價與枕骨下施用該肽的效力相比要低很多。應該注意到鼻內施用FGL對記憶的影響是劑量依賴的。
            
總之，這些結果合起來表明FGL肽有減少由用(25-35)β-淀粉樣蛋白肽片段處理誘導的神經病理學和減少記憶缺失的潛能。這些發現也表明FGL肽具有用于治療患有阿爾茨海默氏病的患者中與β-淀粉樣蛋白沉積作用相關的認知缺失的治療學潛力。
            
實施例7.大鼠幼仔中感覺運動控制的發育未成熟嚙齒類的新生CNS是用于研究影響腦功能成熟的藥物的有用模型。位置調整(移動)的成熟需要運動和感覺系統的整合。分娩后第一個星期期間位置和運動功能的成熟與從腦干和皮層脊髓束在出生后(PND)3天到達胸水平和在出生后(PND)第6天到達腰水平的下行通路的生長有關。因此，可認為PND 3和PND 6之間的時間是對能夠改變感覺運動系統的出生后整合的因素效果敏感的時期。許多運動控制試驗是有效的，其可用于確定神經活性藥物，例如FGL的效果。在本研究中，選擇大鼠幼仔的表面復原反應表現(Surface Righting Response performance)(Tilney，1933)、支點運動表現(Pivoting Locomotion performance)(Altman等，(1975)Anim Behav.；23896-920)、負趨地性表現(Negative Geotaxis performance)[Henck等，(2001 Toxicol Sci.6280-91)、和前蹄懸掛表現(Forepaw Suspensionperformance)[Kimler等，(1998)Brain Res Dev Brain Res.10749-55)來評估FGL對感覺運動控制發育的影響。如圖26(B)所示圖解實驗的時程。
            
劑量-反應研究。評估大鼠幼仔在出生后(PND)第1、2和3天鼻內每天施用0.026、0.26和2.6μg FGLd對表面正位反射表現的影響。在這個研究中使用總共5窩幼仔，每窩由10個幼仔組成(5個雄性和5個雌性)。
            
與載體-處理的對照動物相比，在PND第5天給藥FGLd(每個幼仔每次施用2.6μg濃度)顯著改善了表面正位反射的表現(從3.4s至1.3s)。
            
感覺運動控制發育研究。評估在PND 1、2和3天鼻內每日接受2.6μg肽的大鼠幼仔中FGL對感覺運動控制發育(表面正位反射、負趨地性反射、支點運動和前蹄懸掛性能)的影響。在這個研究中使用總共6窩幼仔，每窩由10個幼仔組成(5個雄性和5個雌性)。
            
FGL的給藥與載體-處理的對照大鼠相比較，在PND 4天表面正位反射表現有統計上顯著的改善(從2.1s至1.6s)(圖24)以及在PND 6天負趨地性反射表現有統計上顯著的改善(從56.7％至80.0％)(圖25)，對支點運動活動或前蹄懸掛表現沒有影響。這表明FGL促進出生后的感覺運動控制發育，而不干擾其它的功能。另外，在PND 9天沒有觀察到對負趨地性表現有重要的影響，表明在PND 9天已經完成運動控制發育。
            
討論該結果證明FGL肽在出生后發育期間對CNS適應性起始過程調節的影響，并且表明FGL肽通過刺激FGF受體可能具有加速感覺-運動機能發育潛能。
            
實施例8.關聯性條件化恐懼實驗和Morris水迷宮實驗關聯性條件化恐懼實驗(Cordero等，(2003 Horm Be-hav.2003 Nov；44(4)338-45)和Morris水迷宮實驗(Morris R.(1984)J Neurosci Methods.1147-60)是評估學習和記憶的項目，并且用來比較正常對照大鼠和用藥物處理的大鼠的特性。
            
在關聯性條件化恐懼實驗中，當大鼠處于*導致由特有的不動性或′僵硬反應′組成的條件性恐懼反應發育的新環境條件下，后來又再次暴露于相同的環境，大鼠經受不可避免的打擊。
            
在Morris水迷宮實驗中，在發現隱藏平臺以逃避在水中游泳的空間訓練作業中評估大鼠。
            
本研究調查了訓練后給藥FGLd肽是否在嫌惡物和/或新處境的記憶鞏固調整中是有效的。
            
關聯性條件化恐懼實驗在第一天的實驗前每日處理大鼠120秒連續3天。在(訓練)第1天，大鼠接受每分鐘1-秒的沖擊(無條件刺激)，進行2分鐘。動物訓練后立即注射5μl FGLd(5μg)、對照肽(5μg)或溶劑。各個處理組由11-14只大鼠組成。總共評估39個動物。在第2、7和30天通過將它們放置在用于處理但沒有沖擊的小室中8分鐘來測試動物。每2秒使用隨時間取樣方法將每個大鼠列為″僵硬″或″活躍″。
            
如圖26(C)所示圖解實驗的時程。
            
當在處理后第2天(從50.5％至73.5％)和第7天(從30.0％至60.3％)測試動物時檢測到與接受安慰劑的大鼠或對照相比FGLd給藥后僵硬時間百分數有統計顯著的增加。這表明當在成年雄性Wistar大鼠中訓練后給藥時，FGLd能夠改善條件恐懼反應的長期保持力。
            
Morris水迷宮實驗在Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze test)研究中，在實驗前通過每日訓練120秒，進行5天(從第一4至0天)預訓練大鼠定位隱藏的平臺。在第1和2天，給大鼠其中平臺位置保持不變的3次連續試驗。120秒的最大測試期間內記錄大鼠能夠定位平臺的時間。在每個訓練試驗后的第1和2天使大鼠立即接受5μl FGLd肽(5μg)、對照肽(5μg)、或溶劑溶液。
            
訓練后24小時(第3天)和7天(第10天)測試動物。訓練后14天(第17天)，變化平臺的位置。在3個連續試驗中訓練大鼠發現平臺的新位置(″倒序學習(reversal learning)″)。總共評估48個動物。將動物分為3組，每試驗組由12-18個大鼠組成。
            
施用FGLd如同在Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze test)中所評估的改善了大鼠的長時記憶的鞏固。在第2天，FGLd、FGL、或溶劑第一次給藥的那一天，FGLd-處理的大鼠比未處理的大鼠(93.0s)能夠統計上顯著更快定位平臺(65.8s)。在第17天該影響也是統計學顯著的、表明改善了學習能力。
            
如圖26(D)所示圖解實驗的時程。
            
Open Field測試中的附加實驗表明FGLd沒有影響大鼠的情緒或運動行為。
            
討論  
            
CFC/MWM的研究結果證明FGLd對正常大鼠學習和記憶的長期效應。FGL可能通過觸發涉及長時記憶形成的信號傳導級聯來發揮作用。如上文所顯示的，FGL可調整通過FGFR的突觸適應性行為，其導致突觸前小泡翻轉(pre-synaptic vesicle turnover)的增加。這些結果一同表明FGL在患有學習和記憶損傷的患者治療中具有很好的治療學潛力。
            
實施例9.FGLL的體內藥學動力學血漿和CSF中FGLL的評估通過放射免疫測定評估大鼠和狗的血漿和CSF中所施用的FGLL的水平。
            
測定a)大鼠和狗的血漿樣品包含作為抗凝劑的肝素鋰。
            
b)FGLL是碘化的。使用lodogen方法進行碘化作用。在C18柱上從未摻入的I125純化碘化的肽。
            
c)重復進行測量。
            
1.將血漿(或CSF)樣品(20μl)加入含有EDTA的試管(n＝2)。使用包含非免疫性的兔血清(或來自對照動物的CSF)(20μl)的非特異結合(NSB)試管作為對照。
            
2.加入稀釋的放射性標記的FGLL(100μl；大約20,000cpm/試管的示蹤劑)。也制備只包含示蹤劑的對照管。
            
3.向所有的試管(除了對照試管)加入稀釋的抗血清樣品(1∶20,000的PAb268；100μl)。渦旋混合內容物。
            
4.在4℃孵育試管過夜。
            
5.向除包含示蹤劑的試管外的所有試管加入抗兔SAC-細胞溶液(0.1ml)。渦旋混合內容物然后在室溫下孵育30min。
            
6。向除包含示蹤劑的試管外的所有試管加入洗滌緩沖液(2ml)并且以3000rpm離心試管5分鐘。
            
7.棄去上清液控干試管不超過1分鐘。
            
8.再次向試管加入洗滌緩沖液(1.5ml)并且以3000rpm離心試管5分鐘。
            
9.棄去上清液控干試管不超過1分鐘。其后以3000rpm離心試管1分鐘。
            
10.所有的試管計數兩次第一次3分鐘，第二次10分鐘。
            
結果在FGLL濃度范圍為0.080ng/ml至20.48ng/ml的大鼠血漿中重復(n＝6)制備校準曲線的精確圖形。在整個濃度范圍內觀察到很好的精確性，直到0.160ng/ml都有可接受的準確度(＜25％)，其表示大鼠血漿中該量化測定的潛在下限(LLOQ)。增加計數時間提高了測定的精確性。
            
在FGLL濃度范圍為0.080ng/ml至20.48ng/ml的狗血漿中重復(n＝6)制備校準曲線的精確圖形。
            
利用計算機程序WinNonlin Pro 3.3版(Pharsight Corporation，美國)計算藥物動力學參數。低于量化極限(BLQ)的值在平均值計算中以0輸入。
            
也定義一些毒性動力學參數。測量的毒性動力學參數包括FGLL的最大血漿濃度(Cmax)，其出現時間(Tmax)，給藥后(post-dose)24小時的血漿濃度(C24)。通過線性梯形法則評估24小時劑量間隔(AUC24)內血漿FGLL.濃度-時間曲線下的面積。在鼻內給藥后AUC24值的計算中，樣品時間以給藥開始為基準(假設5次給藥過程中的每次之間有10分鐘的間斷)。通過擬合log濃度對于時間的線性回歸評估終速率常量(k)。終點半衰期(t1/2)計算為In2/k。
            
來自用50mg/kg靜脈內處理的2個大鼠的CSF中FGLL水平是321和269ng/ml。來自用100mg/kg皮下處理的其它大鼠的CSF中FGLL水平是242，92和81ng/ml。當腸胃外給藥時，這些數據提供FGLL進入CNS的證明。
            
第一劑量給藥后的毒性動力學取樣顯示組合的雄性和雌性暴露(50mg/kg/日，i.v.)AUC＝51,026h.ng/mL；Cmax＝20,951ng/mL.  
            
組合的雄性和雌性暴露(100mg/kg/日，s.c.)AUC＝50，119h.ng/mL；Cmax＝8,346ng/mL.  
            
表12顯示在接受劑量為15，30和75mg/kg s.c.的FGLL狗中計算的毒性動力學參數。
            
     
            
     
            
來自3只狗的CSF在第8天最后劑量后1小時取樣)中FGLL的平均水平為從動物編號2的4.1ng/ml至動物編號3的8.1ng/ml，表明皮下給藥后FGLL穿透進入CNS。
            
實施例10.SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的肽片段的體外影響SEQ ID NO2的單個單體肽，EFL肽，能夠在如上所述的實驗設置組中強烈刺激大鼠海馬神經元的神經突長出并且刺激大鼠小腦神經元的存活(該效果相應地由圖27和28所示)。EFL肽來源于NCAM的Fn 3，2模塊(module)并且代表該模塊的E鏈-環-G鏈部分。為了實驗如上所述合成該肽。肽的神經突發生活性是FGFR1依賴的，因為經該肽的刺激受到FGFR1抑制劑，SU54402的特異阻斷。該肽也能夠在表達該受體的細胞中結合和刺激FGFR1，其中該肽誘導受體磷酸化作用(在濃度為20μg/ml時大于300％)。利用下列測定研究FGFR1的磷酸化。通過使用從大鼠PC12細胞系分離的RNA的RT-PCR克隆大鼠FGFR1(IIIC同工型)的cDNA，并將其插入pcDNA3.1(+)質粒(Invitrogen)，該質粒容許表達與六組氨酸N-末端融合的FGFR1。在60mm平皿的完全培養基(補充有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg ml鏈霉素和58.4g/l Glutamax的DMEM 1965)中培養～8×105個HEK293細胞24h，然后利用Lipofect AMINPLUStm試劑盒按照制造商的指導(Gibco BRL)用0.2μg質粒(具有FGFR)進行轉染。在完全培養基中使細胞再生長24hrs、然后轉入饑餓培養基(DMEM 1965)過夜。用溶解在8M尿素、1mM原釩酸鹽(在PBS中)中的EFL單體刺激FGFR轉染的細胞20min，并且如下借助于His-tag從溶解產物進行純化將溶解產物加載到Ni2+/NTA-瓊脂糖凝膠(Qiagen)上，用溶解緩沖液加上10mM咪唑洗滌，用溶解緩沖液加上250mM咪唑洗提FGFR。通過使用抗pentahis(Qiagen)或抗磷酸酪氨酸(PY20，Transduction Laboratories)抗體的免疫印跡法分析純化的FGFR。通過化學熒光顯示條帶，使用GeneGnome儀器(SynGene)測量條帶密度。
            
在如上所述的測定中還研究了來源于軸突-締合的細胞粘著分子[NCBINP_031544.1]序列的肽。所選擇的肽是SEQ ID NO5所示的序列的11個氨基酸的片段，其從C-末端具有2個氨基酸截短。類似于FGL和EFL肽，該肽在體外能夠顯著刺激大鼠海馬神經元的神經突向外生長。在0.3μg/ml濃度的肽觀察到軸突長度增加500％的最大效果。
            
序列表&lt;110&gt;恩卡姆醫藥公司(ENKAM Pharmaceutical A/S)&lt;120&gt;包含LPA的化合物&lt;130&gt;P 770 PC00&lt;160&gt;146&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM Fn III，2[Swiss-ProtP13591]FGFR結合基序&lt;400&gt;1Glu Val Tyr Val Val Ala Glu Asn Gln Gln Gly Lys Ser Lys Ala1   5   10  15&lt;210&gt;2&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;白細胞介素-6受體β鏈[Swiss-ProtQ00560]FGFR結合基序&lt;400&gt;2Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn A1a Leu G1y Lys Lys Val1   5   10  15&lt;210&gt;3&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖基底膜蛋白聚糖[Swiss-ProtP98160]FGFR結合基序&lt;400&gt;3Ala Thr Asn Arg Gln Gly Lys Val Lys Ala Phe Ala His Leu1   5   10&lt;210&gt;4&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;解聚素和金屬蛋白酶區域8(ADAM-8)[Swiss-ProtQ05910]FGFR結合基序&lt;400&gt;4Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Val Val Ala Asp Ser Gln Glu Phe Gln Lys  
            
1   5   10  15&lt;210&gt;5&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;軸突相關的細胞粘附分子[NCBINP_446331]FGFR結合基序&lt;400&gt;5Val Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Val Ala Lys Gly1   5   10&lt;210&gt;6&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;髓磷脂相關糖蛋白(MAG)[Swiss-ProtP20917]FGFR結合基序&lt;400&gt;6Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln Arg1   5   10&lt;210&gt;7&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM的區域FIII，1[Swiss-ProtP13591]FGFR結合基序&lt;400&gt;7Arg Leu Ala Ala Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser1   5   10&lt;210&gt;8&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經煙酸乙酰膽堿受體α3亞基(CHRNA 3)[Swiss-ProtQ8VHH6/P04757/Q8R4G9/P32297]FGFR結合基序&lt;400&gt;8Lys Tyr Ile Ala Glu Asn Met Lys Ala Gln Asn Val Ala Lys Glu Ile1   5   10  15&lt;210&gt;9&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM的FTTT，1區域(Swiss-ProtP13591)FGFR結合基序  
            
&lt;400&gt;9Thr Ile Met Gly Leu Lys Pro Glu Thr Arg Tyr Ala Val Arg1   5   10&lt;210&gt;10&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;粒細胞集落刺激因子受體前體(G-CSF-R；CD114抗原)[Swiss-ProtQ99062]FGFR結合基序&lt;400&gt;10Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser Ala Ala Thr Glu Phe Lys Thr1   5   10&lt;210&gt;11&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM Fn III，1[Swiss-ProtP13591]FGFR結合基序&lt;400&gt;11Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;12&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;粒細胞集落刺激因子受體前體(G-CSF-R；CD114抗原)[Swiss-ProtP40223]FGFR結合基序&lt;400&gt;12Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;13&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;細胞因子樣因子-1前體(CLF-1)[Swiss-ProtO75462]FGFR結合基序&lt;400&gt;13Glu Ile Trp Val Glu Ala Thr Asn Arg Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;14&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列  
            
&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;白細胞介素-23受體(IL-23R)[Q8NFQ9]FGFR結合基序&lt;400&gt;14Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;15&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;補體因子1q，α多肽(ClQA)[Swiss-ProtQ9DCM6]FGFR結合基序&lt;400&gt;15Glu Val Trp Ile Glu Lys Asp Pro Ala Lys Gly Arg Ile1   5   10&lt;210&gt;16&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;成束蛋白II前體(FAS2)[Swiss-ProtP22648]FGFR結合基序&lt;400&gt;16Ala Thr Asn Lys Gly Gly Glu Val Lys Lys Asn Gly His Leu1   5   10&lt;210&gt;17&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-19前體(EC 3.4.24.-)[Swiss-ProtQ9H013/O35674]FGFR結合基序&lt;400&gt;17Lys Tyr Val Glu Leu Tyr Leu Val Ala Asp Tyr Leu Glu Phe Gln Lys1   5   10  15&lt;210&gt;18&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-8前體(EC 3.4.24.-)[Swiss-ProtP78325]FGFR結合基序&lt;400&gt;18Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Val Val Val Asp Asn Ala Glu Phe Gln1   5   10  15  
            
&lt;210&gt;19&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-12前體(EC 3.4.24.-)[Swiss-ProtO43184；Q61824]FGFR結合基序&lt;400&gt;19Lys Tyr Val Glu Leu Val Ile Val Ala Asp Asn Arg Glu Phe Gln Arg1   5   10  15&lt;210&gt;20&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;包含蛋白質TECADAM的金屬蛋白酶解聚素區域[AF163291]FGFR結合基序&lt;400&gt;20Lys Tyr Ile Glu Tyr Tyr Val Val Leu Asp Asn Gly Glu Phe Lys Lys1   5   10  15&lt;210&gt;21&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-33前體(EC 3.4.24.-)[Swiss-ProtQ9BZ11/Q923W9]FGFR結合基序&lt;400&gt;21Arg Tyr Leu Glu Leu Tyr Ile Val Ala Asp His Thr Leu Phe1   5   10&lt;210&gt;22&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-1A受精蛋白α[Swiss-ProtQ8R533]FGFR結合基序&lt;400&gt;22Lys Tyr Val Glu Met Phe Val Val Val Asn His Gln Arg Phe Gln1   5   10  15&lt;210&gt;23&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-9[Swiss-ProtQ13433；Q61072]FGFR結合基序&lt;400&gt;23  
            
Arg Tyr Val Glu Leu Phe Ile Val Val Asp Lys Glu Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;24&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-7前體[Swiss-ProtQ9H2U9]FGFR結合基序&lt;400&gt;24Lys Tyr Val Glu Leu Phe Ile Val Ala Asp Asp Thr Val Tyr Arg Arg1   5   10  15&lt;210&gt;25&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-7前體[Swiss-ProtO35227；Q63180]FGFR結合基序&lt;400&gt;25Lys Phe Ile Glu Leu Phe Val Val Ala Asp Glu Tyr Val Tyr Arg Arg1   5   10  15&lt;210&gt;26&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-15前體[Swiss-ProtQ9QYV0；O88839]FGFR結合基序&lt;400&gt;26Lys Ile Val Glu Lys Val Ile Val Ala Asp Asn Ser Glu Val Arg Lys1   5   10  15&lt;210&gt;27&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ADAM-15前體[Swiss-ProtQ13444]FGFR結合基序&lt;400&gt;27Val Glu Leu Val Ile Val Ala Asp His Ser Glu Ala Gln Lys1   5   10&lt;210&gt;28&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附蛋白BIG-2前體[Swiss-ProtQ62845]FGFR結合基序&lt;400&gt;28Val Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Ile Ala Lys Gly1   5   10&lt;210&gt;29&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經元糖蛋白CNTN3[Swiss-ProtQ07409]FGFR結合基序&lt;400&gt;29Ile Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Val Ala Arg Gly1   5   10&lt;210&gt;30&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NB-2(HNB-2/NB-2)，接觸蛋白的神經細胞識別分子/F3亞組[Swiss-ProtO94779/P97527]FGFR結合基序&lt;400&gt;30Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Ser Phe Arg Gly1   5   10&lt;210&gt;31&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;HNB-3/NB-3[Swiss-ProtQ9UQ52/P97528/Q9JMB8]FGFR結合基序&lt;400&gt;31Ile Ala Ser Asn Leu Arg Gly Arg Asn Leu Ala Lys Gly1   5   10&lt;210&gt;32&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;推定的脂肪樣鈣粘蛋白前體(Drosiphila)[Swiss-ProtQ9VW71]FGFR結合基序&lt;400&gt;32Ile Pro Glu Asn Ser Leu Gly Lys Thr Tyr Ala Lys Gly1   5   10&lt;210&gt;33&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT  
            
&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經煙酸乙酰膽堿受體α3亞基(CHRNA3)[Swiss-ProtQ8VHH6/P04757/Q8R4G9/P32297]FGFR結合基序&lt;400&gt;33Ile Ala Glu Asn Met Lys Ala Gln Asn Glu Ala Lys1   5   10&lt;210&gt;34&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經乙酰膽堿受體蛋白，α-6鏈前體(CHRNA6)[Swiss-protQ15825]FGFR結合基序&lt;400&gt;34Gln Phe Ile Ala Glu Asn Met Lys Ser His Asn Glu Thr Lys Glu Val1   5   10  15&lt;210&gt;35&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ROBO-1[O44924]FGFR結合基序&lt;400&gt;35Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Lys Asn Arg Val Gly Gln1   5   10&lt;210&gt;36&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ROBO-1[AF041082；Q9Y6N7]FGFR結合基序&lt;400&gt;36Gly Ser Tyr Thr Cys Val Ala Glu Asn Met Val Gly Lys1   5   10&lt;210&gt;37&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ROBO-1[AF041082；Q9Y6N7]FGFR結合基序&lt;400&gt;37Gly Lys Tyr Val Cys Val Gly Thr Asn Met Val Gly Glu Arg1   5   10  
            
&lt;210&gt;38&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;FGFR2[Q96KM2；P21802]FGFR結合基序&lt;400&gt;38Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;39&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;FGFR2[Q63241]FGFR結合位點&lt;400&gt;39Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly1   5   10&lt;210&gt;40&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Fc受體樣蛋白1[Q96KM2]/IFGP 1片段[Q96PJ6]FGFR結合基序&lt;400&gt;40Gln Tyr Tyr Cys Val Ala Glu Asn Gly Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;41&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接合粘附分子(JAM-1)[Q9JKD5/O88792]FGFR結合基序&lt;400&gt;41Gly Glu Tyr Tyr Gln Glu Ala Glu Gln Asn Gly Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;42&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;400&gt;42Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Glu Tyr Gly1   5   10  
            
&lt;210&gt;43&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接觸蛋白前體(神經粘附分子F3)[Q63198；/P1260；Q12860]FGFR結合基序&lt;400&gt;43Gly Met Tyr Gln Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;44&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接觸蛋白前體(神經粘附分子F3/F11)[Q28106]FGFR結合基序&lt;400&gt;44Gly Met Tyr Gln Cys Ala Glu Asn Thr His Gly1   5   10&lt;210&gt;45&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接觸蛋白前體(神經粘附分子F3/F11)[Q28106]FGFR結合基序&lt;400&gt;45Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Ser Asn Asn Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;46&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;IFGP2[Q96PJ5]FGFR結合基序&lt;400&gt;46Gly Gly Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Ser Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;47&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白前體[Q90924]FGFR結合基序&lt;400&gt;47  
            
Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Asp Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;48&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白[Q90924]FGFR結合基序&lt;400&gt;48Gly Glu Tyr Phe Cys Leu Ala Ser Asn Lys Met Gly1   5   10&lt;210&gt;49&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白155Da同種型[Q91Z60]FGFR結合基序&lt;400&gt;49Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Lys Phe Gly1   5   10&lt;210&gt;50&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白155Da同種型[Q91Z60]FGFR結合基序&lt;400&gt;50Gly Glu Tyr Phe Cys Leu Ala Ser Asn Lys Met Gly1   5   10&lt;210&gt;51&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;巨噬細胞消除受體2(MSR2)[Q91YK7]FGFR結合基序&lt;400&gt;51Gly Gly Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Asn Tyr Gly1   5   10&lt;210&gt;52&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;巨噬細胞消除受體2(MSR2)[Q91YK7]FGFR結合基序&lt;400&gt;52Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Glu Asn Ala Trp Gly Thr Lys1   5   10&lt;210&gt;53&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子L1[Q9QYQ7；Q9QY38；P11627；Q05695；P32004]FGFR結合基序&lt;400&gt;53Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Glu Asn Ser Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;54&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經膠質細胞粘附分子Ng-CAM[Q03696]FGFR結合基序&lt;400&gt;54Gly Glu Tyr Glu Cys Val Ala Glu Asn Gly Arg Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;55&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;FGFR3[Q95M13；AF487554；Q99052]FGFR結合基序&lt;400&gt;55Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Arg1   5   10&lt;210&gt;56&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;FGFR3[Q95M13；Q99052]FGFR結合基序&lt;400&gt;56Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly1   5   10&lt;210&gt;57&lt;211&gt;12  
            
&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子2(NCAM2)[P36335]FGFR結合基序&lt;400&gt;57Gly Glu Tyr Phe Cys Val Ala Ser Asn Pro Ile Gly1   5   10&lt;210&gt;58&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子2(NCAM2)[P36335]FGFR結合基序&lt;400&gt;58Glu Tyr Thr Cys Ile Ala Asn Asn Gln Ala Gly Glu1   5   10&lt;210&gt;59&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Axonin-1(TAG-1)[Q02246；P22063；P28685]FGFR結合基序&lt;400&gt;59Gly Met Tyr Gln Cys Val Ala Glu Asn Lys His Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;60&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子NCAM-140[P13595]FGFR結合基序&lt;400&gt;60Gly Glu Tyr Met Cys Thr Ala Ser Asn Thr Ile Gly Gln1   5   10&lt;210&gt;61&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子NCAM-140[P13595]FGFR結合基序&lt;400&gt;61Glu Tyr Val Cys Ile Ala Glu Asn Lys Ala Gly Glu Gln1   5   10  
            
&lt;210&gt;62&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經營養因子受體酪氨酸激酶型2(NTRKT)[Q8WXJ5]FGFR結合基序&lt;400&gt;62Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys1   5   10&lt;210&gt;63&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;結腸直腸癌抑制素DCC[P43146]FGFR結合基序&lt;400&gt;63Gly Phe Tyr Gln Cys Val Ala Glu Asn Glu Ala Gly1   5   10&lt;210&gt;64&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;酪氨酸磷酸酶LAR(ptprf)[Q9EQ17；Q64604；P23468]FGFR結合基序&lt;400&gt;64Gly Lys Tyr Glu Cys Val Ala Thr Asn·Ser Ala Gly Thr Arg1   510&lt;210&gt;65&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;血小板衍生的生長因子受體β(PDGFRB)[Q8R406；Q05030]FGFR結合基序&lt;400&gt;65Gly Glu Tyr Phe Cys Val Tyr Asn Asn Ser Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;66&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;細胞間粘附分子-5(ICAM-5，telencephalin)[Q8TAM9；Q60625]FGFR結合基序  
            
&lt;400&gt;66Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Ala Thr Asn Ala His Gly Arg1   5   10&lt;210&gt;67&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;B細胞受體CD22前體(Leu-14；B淋巴細胞粘附分子)[P20273]FGFR結合基序&lt;400&gt;67Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys1   5   10&lt;210&gt;68&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;B細胞受體CD22前體(Leu-14；B淋巴細胞粘附分子)[P20273]FGFR結合基序&lt;400&gt;68Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly1   5   10&lt;210&gt;69&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM-2[Swiss-Prot015394；035136]FGFR結合基序&lt;400&gt;69Arg Val Ala Ala Val Asn Gly Lys Gly Gln Gly Asp Tyr Ser1   5   10&lt;210&gt;70&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;HCF-2(宿主細胞因子2)[Swiss-ProtQ9Y5Z7]FGFR結合基序FGFR結合基序&lt;400&gt;70Arg Val Ala Ala Ile Asn Gly Cys Gly Ile Gly Pro Phe Ser1   5   10&lt;210&gt;71&lt;211&gt;9&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列  
            
&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ICLN(氯化物途徑調節器，誘導物)[Swiss-ProtP97506；Q9NRD2；Q61189；P54105]FGFR結合基序&lt;400&gt;71Ala Val Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly1   5&lt;210&gt;72&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;半乳凝素-12[Swiss-ProtQ91VD1；Q9JKX2；Q9NZ03]FGFR結合基序&lt;400&gt;72Ala Leu Asn Gly Gln Gly Leu Gly Ala Thr Ser1   5   10&lt;210&gt;73&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;人受體樣蛋白酪氨酸磷酸酶白細胞共同抗原抗原相關分子(PTPRF)[Swiss-ProtP10586]FGFR結合基序&lt;400&gt;73Arg Leu Ala Ala Lys Asn Arg Ala Gly Leu Gly Glu1   5   10&lt;210&gt;74&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;天然抗性相關的巨噬細胞蛋白質1(NRAMP-1，SLC11 A1)[Swiss-Prot077741]FGFR結合基序&lt;400&gt;74Arg Leu Gly Val Val Thr Gly Lys Asp Leu Gly Glu Ile1   5   10&lt;210&gt;75&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NCAM2(180kDa同種型前體)[Swiss-ProtP36335]FGFR結合基序&lt;400&gt;75Thr Val Thr Gly Leu Lys Pro Glu Thr Ser Tyr Met Val Lys1   5   10&lt;210&gt;76  
            
&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;腎升壓素(Nephrin)[Swiss-ProtQ925S5；Q9JIX2；Q9ET59；Q9R044；Q9QZS7]FGFR結合基序&lt;400&gt;76Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Ser Thr Arg Tyr Arg Ile1   5   10&lt;210&gt;77&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;腎升壓素[Swiss-ProtO60500]FGFR結合基序&lt;400&gt;77Thr Leu Thr Gly Leu Gln Pro Ser Thr Arg Tyr Arg Val1   5   10&lt;210&gt;78&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;酪氨酸磷酸酶LAR(PTPRF)[Swiss-ProtQ9EQ17]FGFR結合基序&lt;400&gt;78Thr Leu Leu Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Ile Lys1   5   10&lt;210&gt;79&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;白細胞共同抗原相關磷酸酶ptp2前體(LAR-PTP2)[Swiss-ProtQ64605]FGFR結合基序&lt;400&gt;79Thr Leu Gln Gly Leu Arg Pro Glu Thr Ala Tyr Glu Leu Arg1   5   10&lt;210&gt;80&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶，受體型，S前體(EC 3.1.3.48)(蛋白酪氨酸磷酸酶sigma)(RPTP-sigma)[Swiss-ProtQ64699]FGFR結合基序&lt;400&gt;80  
            
Thr Leu Arg Gly Leu Arg Pro Glu Thr Ala Tyr Glu Leu Arg1   5   10&lt;210&gt;81&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;酪氨酸蛋白激酶受體Tie-1前體(TIE1.)(EC 2.7.1.112)[Swiss-ProtQ06805；P35590]FGFR結合基序&lt;400&gt;81Thr Leu Met Asn Leu Arg Pro Lys Thr Gly Tyr Ser Val Arg1   5   10&lt;210&gt;82&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;腎升壓素A型受體8前體(EPHA8..)(EC 2.7.1.112)(酪氨酸蛋白激酶受體EEK)(EPH-和ELK-相關激酶)][Swiss-ProtO09127；O09127；P29322]；FGFR結合基序&lt;400&gt;82Thr Val Ser Gly Leu Lys Pro Gly Thr Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;83&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;腎升壓素A型受體3前體(EC 2.7.1.112)(酪氨酸蛋白激酶受體ETK1)(CEK4)(EPHA 3..)[tnP29318]FGFR結合基序&lt;400&gt;83Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr1   5   10&lt;210&gt;84&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶受體型S前體(EC 3.1.3.48)(蛋白酪氨酸磷酸酶sigma，PTPRS)[Swiss-ProtQ13332]FGFR結合基序&lt;400&gt;84Thr Leu Gln Gly Leu Lys Pro Asp Thr Ala Tyr1   5   10&lt;210&gt;85&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列  
            
&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;胰島素受體[Swiss-ProtQ9PWN6]FGFR結合基序&lt;400&gt;85Leu Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val1   5   10&lt;210&gt;86&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;VII型膠原[Swiss-ProtQ63870]FGFR結合基序&lt;400&gt;86Ile Asp Gly Leu Glu Pro Asp Thr Glu Tyr Ile Val Arg1   5   10&lt;210&gt;87&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;胰島素樣生長激素-1受體前體[Swiss-ProtO73798]FGFR結合基序&lt;400&gt;87Leu Gln Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile1   5   10&lt;210&gt;88&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;纖連蛋白[Swiss-ProtQ95KV4；Q95KV5；P07589；Q28377；U42594；O95609]FGFR結合基序&lt;400&gt;88Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Gln1   5   10&lt;210&gt;89&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;胰島素樣生長激素I受體(IGF I受體β-亞單位，IGF I受體α-亞單位)[Swiss-ProtQ9QVW4；P08069；P24062；Q60751；P15127；P15208]FGFR結合基序&lt;400&gt;89Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val1   5   10  
            
&lt;210&gt;90&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;胰島素受體相關的蛋白前體(EC 2.7.1.112)(IRR)(IR-相關受體)[Swiss-ProtP14616]FGFR結合基序&lt;400&gt;90Thr Leu Ala Ser Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val1   5   10&lt;210&gt;91&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;肌腱蛋白-R結合腕蛋白-R(restrictin)[Swiss-ProtQ15568；O00531]FGFR結合基序&lt;400&gt;91Leu Met Gly Leu Gln Pro Ala Thr Glu Tyr Ile Val1   5   10&lt;210&gt;92&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Neogenin前體(NEO1..)[Swiss-ProtQ92859；P97603；Q90610；P97798]FGFR結合基序&lt;400&gt;92Lys Gly Met Gly Pro Met Ser Glu Ala Val Gln Phe Arg Thr1   5   10&lt;210&gt;93&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶受體型D(PTPRD，BA175E13.1)[Swiss-ProtQ8WX65；Q9IAJ1；P23468；Q64487]FGFR結合基序&lt;400&gt;93Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Val Lys1   5   10&lt;210&gt;94&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶受體型D(PTPRD，BA175E13.1)[Swiss-Prot  
            
Q8WX65；Q9IAJ1；P23468；Q64487]FGFR結合基序&lt;400&gt;94Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Thr Ser Tyr Ser Leu1   5   10&lt;210&gt;95&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶受體型F前體(EC 3.l.3.48)(LAR蛋白)(與白細胞抗原相關的)[Swiss-ProtQ64604；Q9QW67；P10586]FGFR結合基序&lt;400&gt;95Thr Leu Leu Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Ile Lys1   5   10&lt;210&gt;96&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶受體型F前體(EC 3.1.3.48)(與白細胞抗原相關的)[Swiss-ProtQ64604；Q9QW67；P10586]FGFR結合基序&lt;400&gt;96Thr Ile Ser Gly Leu Thr Pro Glu Thr Thr Tyr Ser Ile1   5   10&lt;210&gt;97&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;CD22[Q9R094]FGFR結合基序&lt;400&gt;97Gly Asn Tyr Ser Cys Leu Ala Glu Asn Arg Leu Gly Arg1   5   10&lt;210&gt;98&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;FGFR-4[Q91742]FGFR結合基序&lt;400&gt;98Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Arg Val Gly1   5   10&lt;210&gt;99  
            
&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;ICAM-5[Q8TAM9]FGFR結合基序&lt;400&gt;99Gly Thr Tyr His Cys Val Ala Thr Asn Ala His Gly1   5   10&lt;210&gt;100&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Ll的FIII，4FGFR結合基序[Swiss-ProtQ9QY38]&lt;400&gt;100Leu Ser His Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Ser Tyr1   5   10&lt;210&gt;101&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經元-神經膠質細胞粘附分子(Ng-CaM)前體。[Gallus gallus]；[Swiss-ProtQ90933]FGFR結合基序&lt;400&gt;101Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Val Leu Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;102&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白前體。[Gallus gallus]；[Swiss-Prot；O42414]FGFR結合基序&lt;400&gt;102Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Asn Leu Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;103&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;(CALL)神經細胞粘附分子[人(Homo sapiens)][Swiss-ProtO00533]FGFR結合基序&lt;400&gt;103  
            
Asn Gly Asn Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Gln Tyr1   5   10&lt;210&gt;104&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;f神經膠質蛋白[Manduca sexta][Swiss-ProtP91767]FGFR結合基序&lt;400&gt;104Val Asp Glu Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Lys Ile Tyr Tyr1   5   10&lt;210&gt;105&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶sigma[Swiss-ProtO75870]；和[Swiss-ProtQ13332][人(Homo sapiens)]FGFR結合基序&lt;400&gt;105Thr His Asn Gly Ala Leu Val Gly Tyr Ser Val Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;106&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NR-CaM 12[Rattus sp]，[Swiss-ProtQ9QVN3]FGFR結合基序&lt;400&gt;106Asn Gly Ile Leu Thr Glu Tyr Ile Leu Lys Tyr1   5   10&lt;210&gt;107&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經束蛋白155kDa同種型[Rattus norvegicus]，[Swiss-ProtQ91Z60]FGFR結合基序&lt;400&gt;107Asn Gly Ile Leu Ile Gly Tyr Thr Leu Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;108&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Neogenin(片段)。[Gallus gallus]，[Swiss-ProtQ90610]FGFR結合基序&lt;400&gt;108Thr His Ser Gly Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Ile Arg Tyr1   5   10&lt;210&gt;109&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Neogenin(片段)。[Gallus gallus]，[Swiss-ProtQ90610]FGFR結合基序&lt;400&gt;109Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr1   5   10&lt;210&gt;110&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;金屬蛋白酶1(pitrilysin家族).[人(Homo sapiens)][Swiss-ProtQ9BSI6]FGFR結合基序&lt;400&gt;110Leu Ser His Asn Gly Ile Phe Thr Leu Tyr1   5   10&lt;210&gt;111&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;HBRAVO/Nr-CaM.[人(Homo sapiens)].[Swiss-ProtQ92823；O15179]FGFR結合基序&lt;400&gt;111Asn Gly Ile Leu Thr Glu Tyr Thr Leu Lys Tyr1   5   10&lt;210&gt;112&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;蛋白酪氨酸磷酸酶κ前體(EC 3.1.3.48)(R-PTP-kappa)。[人(Homo sapiens)][Swiss-ProtQ15262]FGFR結合基序&lt;400&gt;112Leu Asp Pro Asn Gly Ile Ile Thr Gln Tyr Glu Ile Ser Tyr1   5   10&lt;210&gt;113  
            
&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Neogenin前體(NEO1..).[Homo sapiens and Mus musculus][Swiss-ProtQ92859；P97798]FGFR結合基序&lt;400&gt;113Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr1   5   10&lt;210&gt;114&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附分子L1(SPLICE ISOFORM 2)[Homo sapiens[Swiss-ProtP32004]；[Mus musculus Swiss-ProtQ9QY38]FGFR結合基序&lt;400&gt;114His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gly Pro Ala1   5   10  15&lt;210&gt;115&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;NB-2.[Rattus norvegicus][Swiss-ProtP97527]FGFR結合基序&lt;400&gt;115His Leu Thr Val Arg Ala Tyr Asn Gly Ala Gly Tyr Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;116&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘附蛋白BIG-2前體。[Rattus norvegicus][Swiss-ProtQ62845]FGFR結合基序&lt;400&gt;116His Leu Ser Val Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Gly Pro Ser1   5   10  15&lt;210&gt;117&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;軸突相關的細胞粘附分子。[Homo sapiens].[Swiss-ProtQ8TC35]FGFR結合基序&lt;400&gt;117  
            
His Leu Ala Val Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Gly Pro Ser1   5   10  15&lt;210&gt;118&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接觸蛋白A/F3/F11[Xenopus laevis][Swiss-ProtO93250]FGFR結合基序&lt;400&gt;118Asn Leu Glu Val Arg Ala Phe Asn Ser Ala Gly Asp Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;119&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經細胞粘連因子CALL[Homo sapiens][Swiss-ProtO00533]FGFR結合基序&lt;400&gt;119His Leu Thr Val Leu Ala Tyr Asn Ser Lys Gly Ala Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;120&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經元-神經膠質細胞粘附分子(Ng-CaM)前體[Gallus gallus][Swiss-ProtQ909339]FGFR結合基序&lt;400&gt;120Leu Arg Val Leu Val Phe Asn Gly Arg Gly Asp Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;121&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;接觸蛋白前體(神經細胞識別分子F11)[Gallus gallus][Swiss-ProtP14781]FGFR結合基序&lt;400&gt;121His Ile Asp Val Ser Ala Phe Asn Ser Ala Gly Tyr Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;122&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;SLIT[Drosophila melanogaster][Swiss-ProtQ9XYV4]FGFR結合基序&lt;400&gt;122His Leu Ala Val Glu Leu Phe Asn Gly Arg1   5   10&lt;210&gt;123&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;半乳凝素-4[Mus musculus][Swiss-ProtQ8K419，P38552]FGFR結合基序&lt;400&gt;123Leu Glu Leu Gln Ser Ile Asn Phe Leu Gly Gly Gln Pro Ala1   5   10&lt;210&gt;124&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;HNB-2.[Homo sapiens]Swiss-ProtO94779FGFR結合基序&lt;400&gt;124His Phe Thr Val Arg Ala Tyr Asn Gly Ala Gly Tyr Gly Pro1   5   10&lt;210&gt;125&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;EFL肽(來自L1的FIII，3區)[Swiss-ProtP32004]FGFR結合基序&lt;400&gt;125His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gln Pro Ala1   5   10  15&lt;210&gt;126&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;神經膠質蛋白片段(Drosophila)[Swiss-protP202419]FGFR結合基序&lt;400&gt;126Val Ile Ala Asp Gln Pro Thr Phe Val Lys Tyr Leu Ile Lys1   5   10&lt;210&gt;127&lt;211&gt;14  
            
&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;纖連蛋白片段(牛的)[Swiss-protP07589]FGFR結合基序&lt;400&gt;127Thr Ile Lys Gly Leu Arg Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln1   5   10&lt;210&gt;128&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;肌腱蛋白(雞的)[Swiss-protP10039]FGFR結合基序&lt;400&gt;128Thr Leu Thr Glu Leu Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Thr Val Lys1   5   10&lt;210&gt;129&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;腎升壓素A型2[Swiss-protQ8N3Z2]FGFR結合基序&lt;400&gt;129Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln1   5   10&lt;210&gt;130&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;LAR[Swiss-prot Q9VIS8]FGFR結合基序&lt;400&gt;130Thr Val Ser Asp Val Thr Pro His Ala Ile Tyr Thr Val Arg1   5   10&lt;210&gt;131&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;RTK(Tie-1，hu)[Swiss-prot P35590]FGFR結合基序&lt;400&gt;131Ile Ile Arg Gly Leu Asn Ala Ser Thr Arg Tyr Leu Phe Arg1   5   10  
            
&lt;210&gt;132&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;RTK(Tie-1，hu)[Swiss-prot P35590]FGFR結合基序&lt;400&gt;132Thr Leu Met Asn Leu Arg Pro Lys Thr Gly Tyr Ser Val Arg1   5   10&lt;210&gt;133&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;共有序列(保守的區域數據庫)FGFR結合基序&lt;400&gt;133Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Glu Val Arg1   5   10&lt;210&gt;134&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;IL-3，I1-5和GmCsf的beta共同細胞因子受體[Swiss-prot P32927]FGFR結合基序&lt;400&gt;134Gly Pro Glu His Leu Met Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ala Arg1   5   10&lt;210&gt;135&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Unc-22(C.Elegance)[Swiss-protQ23550]FGFR結合基序&lt;400&gt;135Arg Val Thr Gly Leu Thr Pro Lys Lys Thr Tyr Glu Phe Arg1   5   10&lt;210&gt;136&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;共有序列(保守的區域數據庫)FGFR結合基序  
            
&lt;400&gt;136Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Glu Phe Arg1   5   10&lt;210&gt;137&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;共有序列(保守的區域數據庫)FGFR結合基序&lt;400&gt;137Glu Val Arg Val Gln Ala Val Asn Gly Gly Gly Asn Gly Pro Pro1   5   10  15&lt;210&gt;138&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;Drosophila Neuroglian [Swiss-protP20241]FGFR結合基序&lt;400&gt;138Leu Ile Lys Val Val Ala Ile Asn Asp Arg Gly Glu1   5   10&lt;210&gt;139&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;纖連蛋白(小鼠)[Swiss-protP11276]FGFR結合基序&lt;400&gt;139Val Val Ser Ile Ile Ala Val Asn Gly Arg Glu Glu1   5   10&lt;210&gt;140&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;纖連蛋白(牛)[Swiss-protP07589]FGFR結合基序&lt;400&gt;140Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Gln Asn Gly Glu1   5   10&lt;210&gt;141&lt;211&gt;12&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列  
            
&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;肌腱蛋白(雞)[Swiss-protQ90995]FGFR結合基序&lt;400&gt;141Thr Ile Ser Leu Val Ala Glu Lys Gly Arg His Lys1   5   10&lt;210&gt;142&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;L1(人，F3，EFL)[Swiss-protP32004]FGFR結合基序&lt;400&gt;142His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gly Pro Ala1   5   10  15&lt;210&gt;143&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;L1(小鼠，F3，EFL)[Swiss-protP11627]FGFR結合基序&lt;400&gt;143His Val Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Leu Gly Pro Ala1   5   10  15&lt;210&gt;144&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;L1(rat，F3，EFL)[Swiss-protQ05695]FGFR結合基序&lt;400&gt;144His Val Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Leu Gly Pro Ala1   5   10  15&lt;210&gt;145&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;共有序列(保守的區域數據庫)FGFR結合基序&lt;400&gt;145Glu Phe Arg Val Arg Ala Val Asn Gly Ala Gly Glu Gly1   5   10&lt;210&gt;146  
            
&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;IL-3，I1-5和GmCsf的beta共同細胞因子受體[Swiss-protP32927]FGFR結合基序&lt;400&gt;146Val Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ser Arg Leu Ser1   5   10  15&lt;210&gt;147&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;  
            
&lt;223&gt;對照肽(突變的FGL-肽)&lt;400&gt;1Glu Val Tyr Val Val Ala Glu Asn Ala Ala Gly Lys Ser Lys Ala1   5   10  1權利要求
            
1.一種包括2個單獨的肽序列的化合物，其中2個序列中的至少一個包括通式L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5的序列，其中A、B、C、D中的一個選自疏水性的氨基酸殘基，A、B、C、D中的一個選自堿性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個選自酸性氨基酸殘基、Asn或Gln，A、B、C、D中的一個是Gly或Ala，以及L1、L2、L3、L4和L5選自化學鍵或具有n個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中n是0至5的整數，其中所述的肽序列通過通式X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]的接頭相互連接n和m獨立地是1至20的整數，X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、鹵素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、鹵素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m(CR2)p，其中p是0或1至20的整數，A和B獨立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10鏈烯基、取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的環狀部分、取代的或未取代的雜環部分、或取代的或未取代的芳香族部分。
            
2.根據權利要求1的化合物，其中2個肽序列中的至少一個能夠結合功能性的細胞表面受體。
            
3.根據權利要求2的化合物，其中功能性的細胞表面受體是選自成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)家族的受體，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，或其功能性的同系物。
            
4.根據權利要求2的化合物，其中2個肽序列中的至少一個來源于選自細胞粘附分子、細胞-表面受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、和金屬蛋白酶、細胞外基質分子或生長因子的多肽序列。
            
5.根據權利要求4的化合物，其中細胞粘附分子選自-神經細胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.NosP13591、P13595-01、P13595)、-神經細胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、-神經細胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.NoP36335)-神經-膠質細胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.NoQ03696；Q90933)、-神經細胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No000533)、-神經膠質蛋白(Swiss-ProtAss.NoP91767、P20241)、-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.NosQ92823、O15179、Q9QVN3-軸突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.NosQ02246、P22063、P28685)、-軸突-締合的細胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.NoNP_031544.1；Swiss-Prot Ass.NoQ8TC35)、-髓磷脂-締合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.NoP20917)、-神經細胞粘附分子BIG-1(Swiss-Prot Ass.NoQ62682)、-神經細胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.NoQ62845)、-成束蛋白(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.NoP22648)、-神經細胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.NosQ9UQ52、P97528、Q9JMB8)-神經細胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos094779、P07409、P97527)、-鈣粘著蛋白(Swiss-Prot Ass.NoQ9VW71)、-連接粘著分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9JKD5、O88792)、-神經細胞粘附F3/F11(接觸蛋白)(Swiss-Prot Ass.NosQ63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、-神經束蛋白(Swiss-Prot Ass.NosQ90924、Q91Z60；O42414)、-B-淋巴細胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.NosQ9R094、P20273)、-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.NosQ92859、P97603、Q90610、P97798)，-細胞胞間細胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.NosQ8TAM9、Q60625)或-半乳糖結合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot，Q9JKX2、Q9NZ03)、-半乳糖結合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.NoQ8K419、P38552)、或其片段、或其變體。
            
6.根據權利要求4的化合物，其中細胞-表面受體選自-成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)(Swiss-Prot Ass.NosQ9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)、-成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96KM2、P21802、Q63241)、-成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.NosQ95M13、AF487554、Q99052)、-成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.NoQ91742)、-神經營養蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.NoQ8WXJ5)、-白細胞抗原相關蛋白-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.NosQ9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)、-腎升壓素(Swiss-ProtAss.NosQ925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.NosQ64699、Q13332、O75870)、-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體κ型(R-PTP-κ)(Swiss-Prot Ass.NoQ15262)、-蛋白質-酪氨酸磷酸酶受體D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.NosQ8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)、-Ephrin A型受體8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受體EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos009127、P29322)、-Ephrin A型受體3(EPHA3/酪氨酸-蛋白激酶受體ETK-1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.NoP29318)、-Ephrin A型受體2(Swiss-Prot Ass.NoQ8N3Z2)-胰島素受體(IR)(Swiss-Prot Ass.NoQ9PWN6)-胰島素-樣生長因子-1受體(IGF-1)(Swiss-ProtAss.NosQ9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)-胰島素-相關受體(IRR)(Swiss-Prot Ass.NoP14616)-酪氨酸蛋白激酶受體Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos06805、P35590、Q06806)、-環形受體-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos044924、AF041082、Q9Y6N7)、-神經煙酸乙酰膽堿受體α3亞基(CHRNA3)(Swiss-Prot Ass.NosQ8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)-神經乙酰膽堿受體α6亞基(Swiss-Prot Ass.NosQ15825、Q9ROW9)-血小板源性生長因子受體β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.NosQ8R406、Q05030)、-白細胞介素-6受體(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.NoQ00560)、-白細胞介素-23受體(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.NoAF461422)、-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同細胞因子受體(Swiss-Prot Ass.NoP32927)、-細胞因子受體-樣分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.NoQ9JM58)、-I類細胞因子受體(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.NoQ9UHH5)-神經突起生長導向因子-1受體DCC(Swiss-Prot Ass.NoP43146)、-白細胞Fc受體-樣蛋白質(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.NosQ96PJ6、Q96KM2)、-巨噬細胞清除受體2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.NoQ91YK7)、或-粒性白細胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.NoQ99062)、或其片段、或其變體。
            
7.根據權利要求4的化合物，其中硫酸乙酰肝素蛋白聚酶是基底膜蛋白聚糖(Swiss-ProtAss.NoP98160)，或其片段或其變體。
            
8.根據權利要求4的化合物，其中金屬蛋白酶選自-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoQ05910)、-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.NosQ9H013，O35674)、-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.NoP78325)、-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos043184，Q61824)、-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.NosQ9JLN6，Q61824，Q9XSL6，Q9UKQ2)、-ADAM-33前體(Swiss-Prot Ass.NosQ8R533、Q923W9)、-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.NosQ13433，Q61072)、-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.NoSQ9H2U9、O35227、Q63180)、-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.NoQ8R533)-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.NosQ9QYV0、O88839、Q13444)-包含金屬蛋白酶-去整合蛋白結構域的蛋白質(TECAM)(Swiss-ProtAss.NoAF163291)、-金屬蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.NosO95204、Q9BS16)、或其片段或其變體。
            
9.根據權利要求4的化合物，其中細胞外基質分子選自-膠原VII型(Swiss-Prot Ass.NoQ63870)、-纖粘連蛋白(Swiss-ProtAss.Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)、或-肌腱蛋白-R(Swiss-Prot Ass.NosQ15568、O00531、Q90995、P10039)、或其片段、或其變體。
            
10.根據權利要求4的化合物，其中生長因子是細胞因子樣因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.NoO75462)、或其片段、或其變體。
            
11.根據權利要求1至10中任一項的化合物，其中2個肽序列中的至少一個是具有選自下列氨基酸序列的肽片段EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)、NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)、ATNRQGKVKAFAHL(SEQ ID NO3)、RYVELYWADSQEFQK(SEQID NO4)VAENSRGKNVAKG(SEQ ID NO5)、GEYWCVAENQYGQR(SEQ ID NO6)、RLAALNGKGLGEIS(SEQ ID NO7)、KYIAENMKAQNVAKEI(SEQ ID NO8)、TIMGLKPETRYAVR(SEQ ID NO9)、KGLGEISAATEFKT(SEQ ID NO10)、NMGIWVQAENALG(SEQ ID NO11)、IWVQAENMLG(SEQ ID NO12)、EIWVEATNRLG(SEQ ID NO13)、VWVQAANALG(SEQ ID NO14)、EVWIEKDPAKGRI(SEQ ID NO15)、ATNKGGEVKKNGHL(SEQ ID NO16)、KYVELYLVADYLEFQK(SEQ ID NO17)、RYVELYVWDNAEFQ(SEQ ID NO18)、KYVELVIVADNREFQR(SEQ ID NO19)、KYIEYYLVLDNGEFKR(SEQ ID NO20)、RYLELYIVADHTLF(SEQ ID NO21)、KYVEMFWVNHQRFQ(SEQ ID NO22)、RYVELFIWDKERY(SEQ ID NO23)、KYVELFIVADDTVYRR(SEQ ID NO24)、KFIELFVVADEYVYRR(SEQ ID NO25)、KIVEKVIVADNSEVRK(SEQ ID NO26)、VEIVIVADHSEAQK(SEQ ID NO27)、VAENSRGKNIAKG(SEQ ID NO28)、IAENSRGKNVARG(SEQ ID NO29)、AENSRGKNSFRG(SEQ ID NO30)、IASNLRGRNLAKG(SEQ ID NO31)、IPENSLGKTYAKG(SEQ ID NO32)、IAENMKAQNEAK(SEQ ID NO33)、QFIAENMKSHNETKEV(SEQ ID NO34)、GEYWCVAKNRVGQ(SEQ ID NO35)、GSYTCVAENMVGK(SEQ ID NO36)、GKYVCVGTNMVGER(SEQ ID NO37)、GNYTCWENEYG(SEQ ID NO38)、GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO39)、QYYCVAENGYG(SEQ ID NO40)、GEYYQEAEQNGYG(SEQ ID NO41)、GNYTCLVENEYG(SEQ ID NO42)、GMYQCLAENAYG(SEQ ID NO43)、GMYQCAENTHG(SEQ ID NO44)、GIYYCLASNNYG(SEQ ID NO45)、GGYYCTADNSYG(SEQ ID NO46)、GEYQCFARNDYG(SEQ ID NO47)、GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO48)、GEYQCFARNKFG(SEQ ID NO49)、GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO50)、GGYYCTADNNYG(SEQ ID NO51)、GNYSCEAENAWGTK(SEQ ID NO52)、GEYTCLAENSLG(SEQ ID NO53)、GEYECVAENGRLG(SEQ ID NO54)、GNYTCWENKFGR(SEQ ID NO55)、GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO56)、GEYFCVASNPIG(SEQ ID NO57)、EYTCIANNQAGE(SEQ ID NO58)、GMYQCVAENKHLG(SEQ ID NO59)、GEYMCTASNTIGQ(SEQ ID NO60)、EYVCIAENKAGEQ(SEQ ID NO61)、GDYTLIAKNEYGK(SEQ ID NO62)、GFYQCVAENEAG(SEQ ID NO63)、GKYECVATNSAGTR(SEQ ID NO64)、GEYFCVYNNSLG(SEQ ID NO65)、GEYECAATNAHGR(SEQ ID NO66)、GAYWCQGTNSVGK(SEQ ID NO67)、GTYSCVAENILG(SEQ ID NO68)、RVAAVNGKGQGDYS(SEQ ID NO69)、RVAAINGCGIGPFS(SEQ ID NO70)、AVLNGKGLG(SEQ ID NO71)、ALNGQGLGATS(SEQ ID NO72)、RLAAKNRAGLGE(SEQ ID NO73)、RLGWTGKDLGEI(SEQ ID NO74)、TVTGLKPETSYMVK(SEQ ID NO75)、TLTGLKPSTRYRI(SEQ ID NO76)、TITGLQPSTRYRV(SEQ ID NO77)、TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO78)、TLQGLRPETAYELR(SEQ ID NO79)、TLRGLRPETAYELR(SEQ ID NO80)、TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO81)、TVSGLKPGTRY(SEQ ID NO82)、TISGLKPDTTY(SEQ ID NO83)、TLQGLKPDTAY(SEQ ID NO84)、LRGLKPWTQYAV(SEQ ID NO85)、IDGLEPDTEYIVR(SEQ ID NO86)、LQGLKPWTQYAI(SEQ ID NO87)、TITGLEPGTEYTIQ(SEQ ID NO88)、GLKPWTQYAV(SEQ ID NO89)、TLASLKPWTQYAV(SEQ ID NO90)、LMGLQPATEYIV(SEQ ID NO91)、KGMGPMSEAVQFRT(SEQ ID NO92)、TLTGLKPDTTYDVK(SEQ ID NO93)、ISGLQPETSYSL(SEQ ID NO94)、TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO95)、TISGLTPETTYSI(SEQ ID NO96)、GNYSCLAENRLGR(SEQ ID NO97)、GNYTCWENRVG(SEQ ID NO98)、GTYHCVATNAHG(SEQ ID NO99)、LSHNGVLTGYLLSY(SEQ ID NO100)、NGVLTGYVLRY(SEQ ID NO101)、NGVLTGYNLRY(SEQ ID NO102)、NGNLTGYLLQY(SEQ ID NO103)、VDENGVLTGYKIYY(SEQ ID NO104)、THNGALVGYSVRY (SEQ ID NO105)、NGILTEYILKY(SEQ ID NO106)、NGILIGYTLRY(SEQ ID NO107)、THSGQITGYKIRY(SEQ ID NO108)、NGKITGYIIYY(SEQ ID NO109)、LSHNGIFTLY(SEQ ID NO110)、NGILTEYTLKY(SEQ ID NO111)、LDPNGIITQYEISY(SEQ ID NO112)、NGKITGYIIYY(SEQ ID NO113)、HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO114)、HLTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO115)、HLSVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO116)、HLAVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO117)、NLEVRAFNSAGDGP(SEQ ID NO118)、HITVLAYNSKGAGP(SEQ ID NO119)、LRVLVFNGRGDGP(SEQ ID NO120)、HIDVSAFNSAGYGP(SEQ ID NO121)、HLAVELFNGR(SEQ ID NO122)、LELQSINFLGGQPA(SEQ iD NO123)、HFTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO124)、HLEVQAFNGRGSQPA(SEQ ID NO125)、VIADQPTFVKYLIK(SEQ ID NO126)、TIKGLRPGWYEGQ(SEQ ID NO127)、TLTELSPSTQYTVK(SEQ ID NO128)、TLDDLAPDTTYLVQ(SEQ ID NO129)、TVSDVTPHAIYTVR(SEQ ID NO130)、IIRGLNASTRYLFR(SEQ ID NO131)、TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO132)、TLTGLKPGTEYEVR(SEQ ID NO133)、GPEHLMPSSTYVAR(SEQ ID NO134)、RVTGLTPKKTYEFR(SEQ ID NO135)、LTGLKPGTEYEFR(SEQ ID NO136)、EVRVQAVNGGGNGPP(SEQ ID NO137)、LIKWAINDRGE(SEQ ID NO138)、VVSIIAVNGREE(SEQ ID NO139)、WSVYAQNQNGE(SEQ ID NO140)、TISLVAEKGRHK(SEQ ID NO141)、HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO142)、HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO143)、HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO144)、EFRVRAVNGAGEG(SEQ ID NO145)、或VARVRTRLAPGSRLS(SEQ ID NO146)，或或其片段、或其變體、或同系物。
            
12.根據權利要求1至10的化合物，其中2個肽序列中的至少一個是SEQ ID NO1(EVYVVAENQQGKSKA)，或所述序列的片段、變體、或同系物。
            
13.權利要求12的化合物，其中SEQ ID NO1的變體或同系物選自SEQ ID NOs2-9、100或125，
            
14.根據權利要求1至10的化合物，其中2個肽序列中的至少一個是SEQ ID NO2(NIEVWVEAENALGKKV)，或所述序列的片段、變體、或同系物。
            
15.根據前述任一權利要求的化合物，其中該化合物包括2個含有不同氨基酸序列的單獨肽片段，所述的不同氨基酸序列選自權利要求11中任何的肽片段。
            
16.根據前述任一權利要求的化合物，其中該化合物包括2個含有相同氨基酸序列的單獨肽片段，所述的氨基酸序列選自權利要求11中任何的肽片段。
            
17.根據權利要求16的化合物，其中肽片段獨立地具有序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO1)。
            
18.根據權利要求16的化合物，其中肽片段獨立地具有序列NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)。
            
19.根據權利要求15的化合物，其中2個肽片段中的一個具有序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO1)，而另一個具有序列NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO2)。
            
20.根據前述任何權利要求的化合物，所述的化合物通過制備能夠呈現如權利要求11中所限定序列的LPA的方法來獲得，包括步驟(a)提供包括所需要序列的固相合成或片段偶連配體，該配體附著于固相，(b)如果需要，使N-末端氨基酸基團去保護，同時該配體仍然附著于該固相，(c)使具有未保護N-末端基團的配體與非手性的二-三-或四羧酸起反應，以提供具有環狀結構的構建體，以及(d)從固相切下該構建體以提供包括具有游離C-末端基團的配體的LPA。
            
21.一種包括如權利要求1-20中所限定的化合物的藥物組合物。
            
22.權利要求1-20任一項所限定的化合物用于制造治療如下疾病的藥物中的用途與手術后神經損傷、外傷性神經損傷、神經纖維髓鞘化減少、缺血性損傷相關的中樞和外周神經系統病癥，該中樞和外周神經系統病癥例如起因于中風、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病、癡呆，例如多血管梗塞癡呆，硬化癥、與糖尿病相關的神經退化、影響晝夜節律鐘或神經肌肉傳遞的紊亂、以及精神分裂癥、情緒失調，例如狂躁抑郁癥；肌肉的疾病或病癥，包括例如器官移植后伴有神經肌肉連接功能受損的病癥，例如器官移植后的神經肌肉連接受損或例如遺傳的或外傷的肌肉萎縮性疾病；或各種器官的疾病或狀況，例如生殖腺的退化病癥、胰腺的退化病癥，例如I型和II型糖尿病，腎的退化病癥，例如腎病以及心、肝和腸的退化病癥。
            
23.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造治療手術后神經損傷、外傷性神經損傷、神經纖維髓鞘化減少、缺血后的損傷，例如起因于中風、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病、癡呆，例如多血管梗塞癡呆，硬化癥、與糖尿病相關的神經退化、影響晝夜節律鐘或神經肌肉傳遞的紊亂、以及精神分裂癥、情緒失調，例如狂躁抑郁癥的藥物的用途。
            
24.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造促進創傷愈合的藥物的用途。
            
25.權利要求1-20中任一項限定的化合物用于制造治療癌癥的藥物的用途。
            
26.根據權利要求25的用途，其中癌癥是需要新血管發生的任何類型的實體瘤。
            
27.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造例如在急性心肌梗塞后、或血管生成后預防心肌細胞死亡的藥物的用途。
            
28.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造再血管化的藥物的用途。
            
29.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造刺激學習能力和/或短時和/或長時記憶能力的藥物的用途。
            
30.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造預防由于局部缺血造成細胞死亡的藥物的用途。
            
31.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造預防由于醇消耗造成機體損傷的藥物的用途。
            
32.權利要求1-20中任一項所限定的化合物用于制造治療朊病毒疾病的藥物的用途。
            
33.權利要求22-31中任一項的藥物或權利要求21所述的藥物組合物用于治療如權利要求22-31中任一項所限定的疾病或病癥的用途。
            
34.一種治療有需要的個體的方法，包括步驟將權利要求1至20中任一項所限定的化合物、和/或權利要求21中所限定的藥物組合物、和/或權利要求22-31中任一項所限定的藥物施用于所述的個體。
            
全文摘要
            
本發明涉及能夠結合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的新的肽化合物，所述的化合物包括2個單獨的氨基酸序列，其中2個氨基酸序列中的至少一個能夠結合FGFR。本發明公開了該化合物的氨基酸序列并且記載了包括其的藥物組合物。本發明也涉及該化合物和包括其的藥物組合物用于治療或預防其中FGFR在病理中起作用的不同病理學狀況，和/或從該疾病康復的用途。本發明的新的肽化合物可通過配體呈遞組裝(LPA)方法獲得。
            
文檔編號C07K14/705GK1863820SQ200480029415 
            
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月6日 優先權日2003年8月7日
            
發明者莫滕·阿爾布雷克特森, 伊麗莎白·博克, 弗拉迪米爾·貝雷津, 阿恩·霍爾姆 申請人:恩卡姆醫藥公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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