專利名稱：用于治療皰疹感染的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及施用包含免疫球蛋白的組合物，用于治療和/或預(yù)防皰疹感染和相關(guān)疾病狀態(tài)。本發(fā)明提供了與靜脈內(nèi)和局部施用本發(fā)明的組合物相關(guān)的方面。
背景技術(shù)：
皰疹病毒經(jīng)過(guò)了數(shù)百萬(wàn)年的進(jìn)化，并且是在自然界中高度散布的。業(yè)已在人類，非人靈長(zhǎng)類，和大部分其他哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中鑒定了所述家族的成員。皰疹病毒是有包膜的雙鏈DNA病毒，能感染攜帶帶負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)如硫酸肝素和/或氨基葡聚糖的細(xì)胞，此外，所述細(xì)胞在它們的表面上還攜帶有皰疹病毒進(jìn)入介體。所述病毒的特有特征是它們?cè)谑状胃腥局鬂摲谒鼈兊乃拗髦薪K生的能力，并且在受到各種各樣的內(nèi)部和外部刺激時(shí)通過(guò)潛伏的感染細(xì)胞或多或少經(jīng)常地再活化。
單純皰疹病毒(HSV)能夠在免疫受損(immunocompromised)患者和新生兒中導(dǎo)致嚴(yán)重的威脅生命的感染，而在免疫活性宿主中表現(xiàn)出自限性疾病。在西方國(guó)家，HSV是散發(fā)性急性腦炎的主要發(fā)病原因，在不治療的情況下死亡率超過(guò)70％。盡管進(jìn)行抗病毒治療(例如無(wú)環(huán)鳥苷)，新生兒HSV感染具有不良的預(yù)后。25％在分娩時(shí)接觸皰疹的嬰兒會(huì)出現(xiàn)播散性皰疹感染，并且盡管進(jìn)行抗病毒治療也有40％的死亡率。因此，迫切需要治療威脅生命的HSV疾病的新途徑。
即使在免疫活性的人體內(nèi)，HSV也可能導(dǎo)致角膜感染，造成永久性疤痕，視力喪失和失明。上皮角膜炎是由HSV造成的眼感染的最常見表現(xiàn)。盡管可利用抗病毒劑和類固醇來(lái)抑制與急性皰疹性疾病相關(guān)的炎癥，慢性HSV持續(xù)導(dǎo)致顯著的眼發(fā)病率。因此，迫切需要治療HSV眼疾病的新途徑。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明一方面涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物單純皰疹病毒(HSV)感染的方法，通過(guò)給哺乳動(dòng)物靜脈內(nèi)施用有效量含有從混合人血漿制備的免疫球蛋白A(IgA)的組合物。所述哺乳動(dòng)物可以是人類新生兒。所述哺乳動(dòng)物可以是免疫受損的和/或患有皰疹性疾病。所述皰疹性疾病可以是腦炎，肺炎，肝炎，眼皰疹，水痘，帶狀皰疹，耳帶狀皰疹，zoster varicellosus，角膜炎，指單純皰疹，面皰疹，生殖器皰疹，外傷性皰疹，或皰疹性口炎。超過(guò)一種上述任意疾病可表征困擾哺乳動(dòng)物的皰疹性疾病。
在某些實(shí)施方案中，IgA占存在于所述組合物中的任何免疫球蛋白的至少大約35％-大約55％(作為占存在的總免疫球蛋白百分比的IgA最低量可以是大約35％-大約55％)。在其他實(shí)施方案中，IgA可以占存在于所述組合物中的任何免疫球蛋白的至少大約60％-大約80％。
另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物單純皰疹病毒(HSV)感染的方法，通過(guò)給哺乳動(dòng)物靜脈內(nèi)施用有效量的組合物，該組合物含有從混合人血漿制備的單體IgA，二聚IgA，和免疫球蛋白G(IgG)，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約35％-大約55％。在某些實(shí)施方案中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約60％-大約80％。在其他實(shí)施方案中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約70％-大約95％。在其他實(shí)施方案中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約60％，至少大約80％，或至少大約90％。
另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物皰疹性疾病的方法，通過(guò)給哺乳動(dòng)物局部施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的IgG。所述皰疹性疾病可以是水痘，帶狀皰疹，耳帶狀皰疹，zoster varicellosus，角膜炎，指單純皰疹，面皰疹，生殖器皰疹，外傷性皰疹，或皰疹性口炎。
另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物眼皰疹性疾病的方法，通過(guò)給哺乳動(dòng)物局部施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的IgG。所述皰疹性疾病可以是角膜炎。
另一方面，治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物眼皰疹性疾病的方法是通過(guò)直接對(duì)哺乳動(dòng)物受感染的眼施用含有有效量從混合人血漿制備的IgG的懸浮液。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1A和1B顯示分別來(lái)自第一和第二大小排阻(凝膠過(guò)濾)層析柱的免疫球蛋白洗脫曲線的示意圖。
圖2顯示純化的IgA(在第二個(gè)大小排阻層析純化步驟之后)的SDS-PAGE，遷移的主要條帶為160kDa，次要條帶為150kDa。
圖3A和3B分別表示本發(fā)明的IgA制劑(在第二次大小排阻層析純化之后)的非還原SDS-PAGE和western印跡。在圖3A中，環(huán)繞特定條帶的″方框″從右到左表示完整的IgA，完整的IgG，IgM的μh-鏈，和完整的IgA?！錓gA Bayer″是按照本發(fā)明方法制備的IgA。
圖4A和4B分別顯示還原性SDS-PAGE和western印跡，對(duì)應(yīng)于在圖3A和3B中所示的非還原條件下進(jìn)行的分析。在圖4A中，環(huán)繞特定條帶的方框從右到左表示αh-鏈(60kDa)，γh-鏈(55kDa)，μh-鏈(70kDa)，和αh-鏈(60kDa)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了通過(guò)靜脈內(nèi)施用人血清的單體IgA(mIgA)和/或二聚IgA(dIgA)級(jí)分而治療和預(yù)防播散性HSV疾病的新方法。與通過(guò)本發(fā)明獲得的結(jié)果形成對(duì)比，以前提出，HSV保護(hù)不能夠通過(guò)耗盡IgG的血清獲得(參見Raizman，M.B.和C.S.Foster，Curr.Eye.Res.7823-829(1988))。因此，本發(fā)明的IgA組合物以前未曾被用于治療HSV感染。
IgA級(jí)分具有巨大的商業(yè)價(jià)值，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ亲鳛閺娜搜逯屑兓疘gG的副產(chǎn)物丟棄的。另外，與其他免疫球蛋白相比使用IgA是有利的，因?yàn)镮gA不會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑，并且只會(huì)緩慢地激活替代補(bǔ)體途徑。因此，IgA不會(huì)促進(jìn)炎癥。
本發(fā)明還提供了通過(guò)局部治療，使用從混合人血漿中純化的人IgG來(lái)治療和預(yù)防HSV疾病的新方法。本發(fā)明的這一方面的其他優(yōu)點(diǎn)是，不必需注射免疫球蛋白?；颊呖梢杂醚塾弥苿┲械木植坑肐gG治療自己。來(lái)自混合人血漿的IgG適合這一目的，而不需要基于HSV中和抗體水平篩選血液供體。對(duì)于眼皰疹性疾病的治療或預(yù)防而言，本發(fā)明的組合物可以直接施用到受感染眼的角膜上。不過(guò)，本發(fā)明的局部施用并不局限于眼疾病。本發(fā)明的IgG組合物可以局部施用于HSV-相關(guān)疾病的其他表現(xiàn)。
本發(fā)明所提供的化合物可用于治療和預(yù)防由單純皰疹病毒所導(dǎo)致的疾病。以下適應(yīng)癥是作為解釋性例子列舉的，而不是要限定本發(fā)明的范圍1)治療和/或預(yù)防由皰疹病毒導(dǎo)致的患者的單純皰疹病毒感染，其疾病癥狀諸如眼皰疹，唇皰疹，生殖器皰疹，角膜炎，腦炎，肺炎，肝炎等；2)治療和/或預(yù)防免疫受損患者(例如，AIDS患者，移植受體，癌癥患者，遺傳性免疫缺陷患者)的單純皰疹病毒感染；3)治療和/或預(yù)防新生兒，嬰兒，幼兒和兒童中的單純皰疹病毒感染；4)對(duì)單純皰疹病毒陽(yáng)性患者的治療和/或預(yù)防，用于復(fù)發(fā)性皰疹性疾病的維持或抑制治療；和5)治療和/或預(yù)防老年人的單純皰疹病毒疾病。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″有效量″表示足以產(chǎn)生治療效果的量。一般，治療效果是通過(guò)誘導(dǎo)或增強(qiáng)生理學(xué)過(guò)程，阻斷或抑制生理學(xué)過(guò)程，或籠統(tǒng)而言實(shí)施有助于或促成疾病或病癥消除或根除的生物學(xué)功能而實(shí)現(xiàn)的疾病或病癥的客觀或主觀改善。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)″純化的″表示一種物質(zhì)業(yè)已從它的原始環(huán)境中移出，使得所述物質(zhì)的相對(duì)豐度相對(duì)該組合物的其他成分而言增加了?；蛘呋蛄硗猓撔g(shù)語(yǔ)可以僅用于表示業(yè)已從含有所述物質(zhì)的組合物中減少或去除了至少一種特定污染物。
術(shù)語(yǔ)″可藥用載體″表示適合與本發(fā)明的活性化合物混合的任何相容的無(wú)毒材料。
短語(yǔ)″從混合(pooled)血漿制備的″表示由該短語(yǔ)修飾的免疫球蛋白制劑是從來(lái)自血液供體的混合血漿中回收的。本發(fā)明的組合物不需要篩選所述供體以確定他們的HSV-中和抗體水平。
本發(fā)明涉及組合物以及將它們用于治療和/或預(yù)防皰疹病毒感染的醫(yī)學(xué)治療的用途，所述病毒包括1型和2型單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)，水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，巨細(xì)胞病毒(CMV)，和EB病毒(EBV)。本發(fā)明可用于治療和/或預(yù)防復(fù)發(fā)性1型和2型單純皰疹，帶狀皰疹(水痘，帶狀皰疹)，帶狀皰疹耳炎(zoster otisis)，zoster varicellosis，生殖器疣，或皰疹角膜炎，指單純皰疹，面皰疹，生殖器皰疹，外傷性皰疹，和皰疹性口炎。所述疾病和病癥是眾所周知的，并且可以由擁有普通技能的醫(yī)生容易地診斷。
本發(fā)明靜脈內(nèi)施用的組合物可用于治療和/或預(yù)防播散性感染，以便預(yù)防諸如皰疹性腦炎的皰疹相關(guān)疾病。所述組合物可用于治療和/或預(yù)防新生兒感染，以便治療或預(yù)防目前產(chǎn)生高死亡率的播散性感染。免疫受損個(gè)體，包括新生兒和老年人，特別易患所述疾病，并且通過(guò)施用本發(fā)明的組合物而受益。
盡管靜脈內(nèi)施用含有IgA的組合物能夠?yàn)榛加胁ド⑿园捳罡腥?例如，導(dǎo)致腦炎的感染)的對(duì)象提供特殊的裨益，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，這種治療還能夠使患有皰疹感染的任何常見表現(xiàn)的人獲益。類似地，盡管局部施用本發(fā)明的免疫球蛋白組合物能夠使患有皰疹感染的局部表現(xiàn)(例如，角膜炎)的對(duì)象直接受益，施用所述組合物能夠?yàn)樵馐懿ド⑿园捳罡腥居绊懙娜颂峁砸妗?br>
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)采用常規(guī)技術(shù)制備，將本發(fā)明的化合物與可藥用載體組合，并且選擇性地與可藥用的賦形劑組合，采用標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)技術(shù)。所述局部制劑還可以包括能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)式II或III的化合物通過(guò)皮膚或其他患病區(qū)域吸收或滲透的材料。
藥用組合物中活性成分，例如，本發(fā)明的免疫球蛋白制劑的量可以根據(jù)患者的需要，病毒感染的嚴(yán)重性，所使用特定化合物的效力，特定配方和需要的濃度而在大范圍內(nèi)改變或調(diào)整。一般，活性成分的用量占組合物重量的大約0.05％-大約25％，大約0.1％-大約10％wt，或占組合物重量的大約3％-大約16％。
對(duì)于外部組織感染，例如口腔，眼和皮膚，所述制劑可以作為含有活性成分的外用軟膏或霜?jiǎng)?yīng)用，所述活性成分的用量例如占組合物重量的大約0.05-大約25％，或大約0.1-大約10％w/w。在以軟膏形式配制時(shí)，所述活性成分可以是與石蠟族或水混溶性軟膏基質(zhì)一起使用的?；蛘?，所述活性成分可以是以霜?jiǎng)┬问脚c水包油霜?jiǎng)┗|(zhì)一起配制的。
適合在眼中局部施用的制劑包括滴眼劑，其中，本發(fā)明的組合物溶解或懸浮在合適的載體，特別是含水溶劑中。所述活性成分在所述制劑中的濃度可以是大約0.05-大約25％，有利的是大約0.5-大約10％。
適合在口腔中局部施用的制劑包括在調(diào)味基質(zhì)中含有本發(fā)明組合物的糖錠，所述調(diào)味基質(zhì)例如蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；在惰性基質(zhì)中含有所述活性成分的錠劑，所述惰性基質(zhì)例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠；和在合適的液體載體中含有活性成分的漱口水。
眼用劑型包括為了用作滴眼劑而制備的溶液和懸浮液，以提供本發(fā)明的組合物的即時(shí)治療水平；以及設(shè)計(jì)用于提供較緩慢的釋放速度或在就寢時(shí)使用的眼用軟膏。
本發(fā)明的滴眼劑劑型可選擇性地包括一種或多種合適的和可藥用的無(wú)活性賦形劑，包括但不局限于選自下列一組的防腐劑，包括但不局限于，苯扎氯銨，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，乙二胺四乙酸二鈉，硫柳汞，和三氯叔丁醇；選自下列一組的緩沖劑，包括但不局限于檸檬酸鈉，乙酸鈉，檸檬酸，和乳酸鈉；選自下列一組的媒介物，包括但不局限于，聚乙烯醇，羥甲基纖維素，鯨蠟醇，羧甲基纖維素，和羥丙基甲基纖維素；選自下列一組的pH調(diào)節(jié)劑，包括但不局限于，硫酸，氫氯酸，氫氧化鈉，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉；凈化水USP；泊洛沙姆407或188，聚山梨醇酯80；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚化合物；和礦物油USP。上述無(wú)活性賦形劑能夠提供多種功能，作為載體，媒介物，稀釋劑，粘合劑，防腐劑，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑，和其他配制助劑。
用于長(zhǎng)時(shí)間輸送所述制劑或在睡眠期間使用的眼用軟膏劑型可選擇性地包括一種或多種可藥用的無(wú)活性賦形劑，包括但不局限于三氯叔丁醇，聚乙烯礦物油凝膠，白礦脂USP，礦物油USP，礦脂和羊毛脂醇，凈化水USP，聚乙烯醇凝膠和類似產(chǎn)品。上述賦形劑具有多種功能，作為載體，媒介物，稀釋劑，粘合劑，防腐劑，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑，和其他配制助劑。
本發(fā)明的組合物還包括包含溶液和懸浮液的劑型，是為了用于向口腔粘膜應(yīng)用制備的，以提供所述制劑的即時(shí)治療水平。
本發(fā)明的口腔粘膜劑型可選擇性地包括一種或多種合適的和可藥用的無(wú)活性賦形劑，包括但不局限于，防腐劑，緩沖劑，媒介物，和pH調(diào)節(jié)劑，正如上文對(duì)于″滴眼劑″劑型所進(jìn)行的說(shuō)明。正如所指出的，上述無(wú)活性賦形劑具有多種功能，作為載體，媒介物，稀釋劑，粘合劑，防腐劑，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑，和其他配制助劑。
本發(fā)明的組合物還包括用于局部治療HSV感染的皮膚表現(xiàn)的劑型，它是以多種形式制備的，包括軟膏，凝膠和霜?jiǎng)?。所述制劑選擇性地包括一種或多種下列合適的和可藥用的賦形劑十四酸異丙酯NF，三乙醇胺NF，SD醇40(20％)，白礦脂USP，羊毛脂醇NF，礦物油USP，聚乙烯醇凝膠，鯨蠟基十八烷醇NF，乳酸USP，硬脂酸鈣，葡聚糖，硬脂酸-40-聚烴氧基酯，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，丙二醇，十二烷基硫酸鈉，聚乙二醇(PEG)堿，合成蜂蠟(B蠟)，乙酸鈣，凈化水USP和類似產(chǎn)品。上述賦形劑具有多種功能，作為載體，媒介物，稀釋劑，粘合劑，防腐劑，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑，和其他配制助劑。
本發(fā)明的組合物還包括用于局部使用以治療HSV感染特別是HSV-2感染的女性生殖器表現(xiàn)的劑型，該劑型是以適合陰道插入的劑型制備的，包括陰道栓劑，凝膠和片劑。所述制劑可選擇性地包括一種或多種下列合適的和可藥用的賦形劑，包括但不局限于十四酸異丙酯NF，礦物油USP，十八烷醇NF，苯甲酸USP，pegoxyl 7硬脂酸酯，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，丙二醇，丁羥基茴香醚，椰子或棕櫚仁油甘油三酯，聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯8，peglicol 5，PEG-100硬脂酸酯和脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，乳酸鈣，羥丙基甲基纖維素，多糖角叉菜膠玉米淀粉，乳糖，乳酸鈣，二氧化硅和凈化水USP等。上述賦形劑具有多種功能，作為載體，媒介物，稀釋劑，粘合劑，防腐劑，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑，和其他配制助劑。
為了靜脈內(nèi)施用，本發(fā)明免疫球蛋白組合物的劑量和施用方法將根據(jù)所治療特定病癥的嚴(yán)重程度和性質(zhì)，治療持續(xù)時(shí)間，采用的輔助治療，治療對(duì)象的年齡和身體狀況等而改變。不過(guò)，用于靜脈內(nèi)施用的單一劑量可通常從每千克體重大約50mg-大約10g，或每千克體重大約100mg-大約5g(除非另有說(shuō)明，在本文中，表示為″mg/kg″或″g/kg″的單位表示毫克或克/千克體重)。
實(shí)施例實(shí)施例1 HSV的生長(zhǎng)和病毒母液的制備單純皰疹病毒(HSV-1 Walki)是按常規(guī)方法在非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞；ATCC CCL-81)上繁殖的；不過(guò)，很多組織培養(yǎng)系可用于HSV的生長(zhǎng)和定量(Herpes Simplex Virus Protocols，1998，Ed.S.M.Brown & A.R.MacLean，Humana Press，Totowa，New Jersey)。Vero細(xì)胞在補(bǔ)充了5％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100 IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的M199培養(yǎng)基中在細(xì)胞培養(yǎng)瓶(例如175cm2/25-50ml)中在37℃下在存在5％CO2的條件下生長(zhǎng)。細(xì)胞按1∶4傳代，每周兩次(細(xì)胞活力＞95％)。為了進(jìn)行病毒感染，取出培養(yǎng)基，并且用Hank′s溶液洗滌細(xì)胞，用0.05％的胰蛋白酶，0.02％EDTA(Seromed，L2143)進(jìn)行胰蛋白酶消化，以每毫升4×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并且在37℃下在存在5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。取出培養(yǎng)基，并且以＜0.05的感染復(fù)數(shù)(m.o.i)添加病毒懸液，以每175cm2表面積2ml的體積。讓所述培養(yǎng)瓶在37℃下在存在5％CO2的條件下放置1小時(shí)，偶爾進(jìn)行攪拌，以便使病毒均勻分布在細(xì)胞上。然后將培養(yǎng)基添加至每175cm2組織培養(yǎng)瓶50ml的終體積。培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，直到所有細(xì)胞表現(xiàn)出感染征象(大約2-3天)。為了收獲病毒，將培養(yǎng)瓶在-80℃下冷凍并且在37℃下解凍(放在水浴中)兩次。通過(guò)離心(300g，10min，4℃)除去細(xì)胞碎片，并且將上清液以等份樣品的形式在-80℃下保存。
通過(guò)噬斑分析確定病毒母液的效價(jià)。簡(jiǎn)單地講，以每孔4×105細(xì)胞的密度將Vero細(xì)胞接種在24孔組織培養(yǎng)平板上。在培養(yǎng)24小時(shí)(37℃，5％CO2)之后，用10-2-10-8的病毒母液稀釋液感染細(xì)胞。感染體積為每孔100μl。在感染之后，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)1小時(shí)之后，輕輕取出細(xì)胞，用1ml覆蓋培養(yǎng)基(0.5％甲基纖維素，0.225％碳酸氫鈉，2mM谷氨酰胺，100 IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，5％FCS在MEME(MEM-Eagle，含有Earle′s鹽)中)覆蓋，并且在37℃下，在存在5％CO2的條件下放置3天。用4％福爾馬林固定細(xì)胞至少30分鐘，用水洗滌，并且用Giemsa溶液(Merck，Darmstadt)染色30分鐘，并且再次洗滌。在干燥所述平板之后，計(jì)數(shù)噬菌斑，并且計(jì)算病毒母液的效價(jià)實(shí)施例2致死攻擊模型購(gòu)買Balb/cABom雌性小鼠(體重19 g，7周大)(M & B A/S，Denmark)，并且在1周后接種。將50μl在冰冷PBS中稀釋的病毒懸液(HSV-1 Walki)(～5×104pfu)應(yīng)用于用乙醚輕度麻醉的小鼠鼻孔中，在7-10天之后導(dǎo)致90-100％的死亡率。每天檢查受感染動(dòng)物的疾病征象(腦炎，麻痹，呼吸癥狀)并且對(duì)垂死動(dòng)物實(shí)施安樂死。
實(shí)施例3眼皰疹模型購(gòu)買(M & B A/S，Denmark)Balb/cABom雌性小鼠(體重19g，7周大)，并且在1周后接種。通過(guò)乙醚麻醉小鼠，并且用無(wú)菌的30號(hào)針頭垂直劃右角膜三次，水平劃三次。將5μl病毒懸液(5×106pfuHSV-1 Walki)應(yīng)用在劃破的角膜上。每天檢查小鼠皰疹感染的征象(瞼炎，角膜炎，腦炎)。對(duì)垂死的動(dòng)物實(shí)施安樂死。
實(shí)施例4免疫球蛋白級(jí)分按以下方法制備人免疫球蛋白級(jí)分，IgG，單體IgA(mIgA)，和二聚IgA(dIgA)。
用于實(shí)施例中的IgG是商業(yè)級(jí)IgG(5％GAMIMMUNE N，BayerCorp.，Pittsburgh，PA)，是用Cohn級(jí)分II+III作原材料從混合人血漿中純化的。使用BIOLOGIC層析臺(tái)(Bio Rad，Richmond，CA)在SUPERDEX 200上通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的大小排阻層析步驟純化來(lái)自人血漿的單體IgA和dIgA。將Q-SEPHAROSE層析步驟的高鹽條帶-IGIV-C處理的廢物流(參見被以全文形式收作本文參考的美國(guó)專利號(hào)6,307,028)用作原材料，其含有純度為45％的13mg/ml的IgA。
簡(jiǎn)單地講，將20ml原材料添加到2-升200 XK50/100 SUPERDEX200柱(5cm×93cm，Pharmacia，Upsala，Sweden)上，并且以10ml/min的速度用Tris緩沖的鹽溶液(Sigma，St.Louis，MO)洗脫。通過(guò)濁度測(cè)定法，SDS-PAGE，和大小排阻-FPLC分析級(jí)分。合并單體IgA陽(yáng)性的級(jí)分，用AMICON濃縮室(YM10膜，RT)濃縮到最終體積為10ml，并且重新加樣到SUPERDEX 200柱上，使用與第一次運(yùn)行相同的洗脫條件。最終產(chǎn)品是在0.2M甘氨酸，pH4.25中配制的，并且用0.2μm的膜過(guò)濾除菌。第一次層析的洗脫曲線(280nm)具有五個(gè)蛋白峰，通過(guò)免疫濁度測(cè)定法鑒定這些峰為IgM，dIgA，mIgA，IgG和白蛋白(參見圖1A)。在SUPERDEX 200上再次層析mIgA和dIgA峰得到了一個(gè)主要的蛋白峰和兩個(gè)小的肩，它們分別含有mIgA，dIgA，和IgG(參見圖1B)。合并含有mIgA或dIgA的級(jí)分。通過(guò)SDS-PAGE和western印跡進(jìn)一步驗(yàn)證IgA的身份(參見圖2，3A，3B，4A，和4B)。在-70℃下保存等份樣品。
實(shí)施例5用于預(yù)防/治療眼HSV-疾病的人類IgG對(duì)于眼皰疹模型來(lái)說(shuō)，在處理受感染的動(dòng)物之前，用PBS將免疫球蛋白懸浮液稀釋到最終濃度為25mg/ml。通過(guò)每日三次將5μl稀釋過(guò)的免疫球蛋白懸浮液直接應(yīng)用在受感染的眼角膜上而對(duì)小鼠進(jìn)行局部治療。在感染當(dāng)天，在感染之前1小時(shí)，感染之后(p.i.)1小時(shí)和感染后5小時(shí)進(jìn)行治療。從感染后第一天到感染后第四天，每天治療動(dòng)物三次，分別在7a.m.，2p.m.和7p.m.。
用HSV感染小鼠一只眼的角膜，并且在感染當(dāng)天和在隨后4天用上述人IgG，mIgA和dIgA，或用安慰劑(磷酸鹽緩沖鹽水，PBS＝150mM NaCl，20mM磷酸鹽，pH7.0-7.4)每天處理三次。在感染之后第7天，在接受每一種治療的總共10只受感染的小鼠中，存活數(shù)目如下表1
在感染之后七天，所有僅用安慰劑處理的動(dòng)物都發(fā)生了眼HSV疾病以及致死性HSV腦炎，而在每天用局部IgG治療3次的10只動(dòng)物中有7只存活，并且沒有表現(xiàn)出眼HSV-疾病的征象。
實(shí)施例6預(yù)防/治療播散性HSV疾病的人dIgA在致死性攻擊模型中，通過(guò)將免疫球蛋白懸浮液注射到尾靜脈中處理動(dòng)物。處理是在感染之前1小時(shí)和感染之后24小時(shí)給予的。在感染當(dāng)天，應(yīng)用2mg的免疫球蛋白；在感染后第二天再應(yīng)用2mg免疫球蛋白。
用HSV通過(guò)鼻內(nèi)途徑感染小鼠，并且在感染當(dāng)天和感染之后第二天通過(guò)靜脈內(nèi)注射IgG，mIgA，dIgA或安慰劑(磷酸鹽緩沖鹽水，PBS)進(jìn)行處理。在感染之后第7天，在總共10只受感染的小鼠中的存活數(shù)目如下表2
感染之后七天，所有安慰劑-處理過(guò)的動(dòng)物都死于致死性播散性HSV-感染，而在用靜脈內(nèi)dIgA處理過(guò)的10只動(dòng)物中有7只存活，在用靜脈內(nèi)mIgA處理過(guò)的10只動(dòng)物中有5只存活。
本發(fā)明的上述實(shí)施例只是說(shuō)明性質(zhì)的，并且不希望以任何方式限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)上述實(shí)施方案的各種改進(jìn)都屬于本發(fā)明預(yù)期的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物單純皰疹病毒(HSV)感染的方法，該方法包括，給哺乳動(dòng)物靜脈內(nèi)施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的免疫球蛋白A(IgA)。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人類新生兒。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是免疫受損的。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物患有皰疹性疾病。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述疾病選自下列一組腦炎，肺炎，肝炎，眼皰疹，水痘，帶狀皰疹，耳帶狀皰疹，zostervaricellosus，角膜炎，指單純皰疹，面皰疹，生殖器皰疹，外傷性皰疹和皰疹性口炎。
6.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述疾病選自下列一組腦炎，肺炎，肝炎，帶狀皰疹，耳帶狀皰疹和zoster varicellosus。
7.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述疾病是腦炎。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述IgA占存在于所述組合物中的任何免疫球蛋白的至少大約35％-大約55％。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述IgA占存在于所述組合物中的任何免疫球蛋白的至少大約60％-大約80％。
10.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物單純皰疹病毒(HSV)感染的方法，該方法包括，給哺乳動(dòng)物靜脈內(nèi)施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的單體IgA，二聚IgA和IgG，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約35％-大約55％。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約60％-大約80％。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約70％-大約95％。
13.如權(quán)利要求10的方法，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約60％。
14.如權(quán)利要求10的方法，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約80％。
15.如權(quán)利要求10的方法，其中，單體和二聚IgA占存在于所述組合物中的總免疫球蛋白的至少大約90％。
16.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物皰疹性疾病的方法，該方法包括，給哺乳動(dòng)物局部施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的免疫球蛋白G(IgG)。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述皰疹性疾病選自下列一組水痘，帶狀皰疹，耳帶狀皰疹，zoster varicellosus，角膜炎，指單純皰疹，面皰疹，生殖器皰疹，外傷性皰疹和皰疹性口炎。
18.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物眼皰疹性疾病的方法，該方法包括，給哺乳動(dòng)物局部施用有效量的組合物，該組合物包含從混合人血漿制備的免疫球蛋白G(IgG)。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中，所述皰疹性疾病是角膜炎。
20.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物眼皰疹性疾病的方法，該方法包括，直接對(duì)哺乳動(dòng)物受感染的眼施用包含有效量從混合人血漿制備的免疫球蛋白G(IgG)的懸浮液。
全文摘要
通過(guò)施用包含免疫球蛋白的組合物治療或預(yù)防皰疹感染和相關(guān)疾病狀態(tài)的方法，所述免疫球蛋白是從混合人血漿制備的。提供了包括靜脈內(nèi)和局部施用免疫球蛋白的方法。
文檔編號(hào)C07K16/06GK1845756SQ200480025305
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日
發(fā)明者U·貝茨, K－P·拉特克 申請(qǐng)人:拜爾保健有限公司