心營養素調節干細胞增殖的用途的制作方法

專利名稱：心營養素調節干細胞增殖的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞治療劑領域，具體涉及調節干細胞增殖的方法。
背景技術：
干細胞是未分化的或未成熟的細胞，能產生多種特化細胞類型并最終產生終末分化的細胞。與任何其它細胞不同，它們能夠自我更新，使得當需要時可以產生基本上無限供應的成熟細胞類型。由于這種自我更新能力，干細胞可治療性的用于再生和修復組織。
干細胞具有向多種臨床狀況提供益處的潛力。很多潛在應用的限制是獲得足量靶細胞并刺激這些干細胞終末分化成成熟組織特異性細胞。
成年骨髓和很多其它身體組織被認為含有多能干細胞群體，它們可以分化成多種表型的細胞。例如，最近已報道成年小鼠心臟內的多能干細胞樣群體(SP)(Hierlihy，A.M.et al.，(2002)FEBS Letters，530239-243)。在減緩生長的條件下，這些細胞被激活并分化成心肌細胞。最近已描述(美國專利申請20030054973)通過施用來源于心臟或其它組織的成體干細胞和細胞因子來修復或再生損傷心肌的方法，這些細胞因子如干細胞因子(SCF)、粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質細胞來源因子-1(stromal cell-derived factor-1)、steel因子、血管內皮細胞生長因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞刺激因子或白介素-3。
已知細胞因子在機體內的細胞間通訊中起關鍵作用，并充當能夠調節生長和分化的細胞介質。已經描述了細胞因子促進干細胞分化的用途。例如美國專利申請20030027330描述了通過將干細胞和發育中或發育后異體或異種細胞、任選的和細胞因子、生長因子或趨化因子共培養，從干細胞產生分化的乳腺細胞或組織的方法；美國專利申請20030103951描述了通過施用間充質干細胞而再生心臟肌肉的方法，所述干細胞可以被遺傳修飾以產生對分化重要的蛋白質，如細胞因子、生長因子、生肌因子和轉錄因子；美國專利申請20020142457描述了使用多種細胞因子和轉錄因子使具有分化成心肌細胞潛力的細胞增殖并調節它們分化成心肌細胞的方法。
心營養素-1(cardiotrophin)(CT-1)是IL-6細胞因子家族的成員，并以相對心臟限制性方式表達。已克隆編碼人和小鼠CT-1的基因(Pennica，D.，et al.，(1996)Cytokine，8183-189；Pennica，D.，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921142-1146)。開始被稱為心臟肥大因子(cardiac hypertrophy factor，CHF)，CT-1已經表明可誘導心臟肥大，并且已經描述CT-1及其拮抗劑用于心衰、心律不齊或影響收縮的疾病或周圍神經病(見美國專利NO.5,534,615；5,571,675；5,571,893；5,624,806和5,679,545)，以及在診斷和治療癌癥中的用途(美國專利申請20020146707)。也已經報道在缺血前施用CT-1可保護成年大鼠心臟免受損傷(Liao，Z.，et al.，(2002)Cardiovasc.Res.，53902-910)。
提供這些背景信息的目的是準備本申請人認為與本發明可能相關的已知信息。不必然意味著、也不應解釋為任何前述信息構成針對本發明的現有技術。
本發明的一個目的是克服現有技術的缺點。
主權利要求的組合實現了上述目的，從屬權利要求進一步公開了本發明的有利

發明內容
本發明涉及干細胞治療劑領域，具體涉及調節干細胞增殖的方法。
根據本發明提供促進干細胞增殖的方法，包括將所述干細胞與含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸接觸。
在不以任何方式限制本發明的替代實施方案中，提供抑制干細胞增殖的方法，包括將所述干細胞與一種或更多種心營養素-1抑制劑接觸。
根據本發明的另一方面，提供促進干細胞增值和分化的方法，包括將所述干細胞與含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸與一種或多種干細胞調節劑接觸，其中所述一種或多種干細胞調節劑是多肽或編碼多肽的多核苷酸。
根據本發明的另一方面，提供分離的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸以及含所述多核苷酸的載體，所述多肽是心營養素-1的類似物、衍生物、變體或活性片段，其中所述多肽能促進干細胞增殖。
根據本發明的另一方面，提供促進哺乳動物中心臟干細胞增殖的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段，或編碼所述多肽的多核苷酸。
根據本發明的另一方面，提供抑制哺乳動物中心臟干細胞增殖的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的心營養素-1抑制劑。
根據本發明的另一方面，提供修復或再生哺乳動物中心臟組織的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽能促進心臟干細胞增殖。
該發明簡述不必一定要描述本發明的所有必要特征，但本發明也可以位于所描述特征的子組合中。


參考以下附圖，下面的描述將可以使本發明的這些和其它特征更明顯圖1表示本發明使用的腺病毒構建體ad-CT-1的示意圖。
圖2A和2B表示經注射鹽水或心營養素-1處理、隨后用Hoechst 33342染料染色的心臟細胞懸液的FACS分析。圖2C是證明在感染H9C2細胞中CT-1腺病毒表達的Western印跡。印跡中示出了約24.5kDa的CT-1蛋白。圖2D表示對照注射后24小時心臟細胞FACS分析獲得的對照結果。圖2E表示注射腺病毒后24小時心臟細胞FACS分析的對照結果。
圖3A和B表示在注射ad-CT-1后t＝24、48、72和96小時時ad-CT-1對小鼠心臟的作用的時程結果。
圖4的結果表示心臟內注射后4天恢復期間在AdCT-1處理心臟中發現的SP細胞相對數目。這些數據相對于每個時間點從對照注射心臟獲得的數據進行標準化。由相當Ad載體組成的對照注射不編碼CT-1。
圖5A、B和C表示心內施用ad-CT-1在時間點24小時、48小時、72小時和96小時對來自骨骼肌(圖5a)、骨髓(圖5b)和肝臟(圖5c)的SP細胞的結果。
圖6表示對照和CT-1注射小鼠心臟后3周、4個月和1年時間點的FACS分析結果，提示CT-1對所述小鼠心臟可能的年齡依賴作用。
圖7表示的結果提示CT-1加速成年心臟干細胞的分化。表達組成型表達的GFP轉基因的小鼠注射CT-1。24小時后收集心臟，將來自這些心臟的分離SP細胞與正常原代心肌細胞共培養。結果證實了標記GFP的SP細胞向連接蛋白-43陽性心肌細胞的明顯(robust)轉變。
圖8用圖解說明確認心內注射Ad-CT-1是否能影響受損骨骼肌修復所遵照的試驗程序。
圖9的結果表示對照注射、心臟毒素(ctx)注射或同時注射心臟毒素和Ad-CT-1之后約6天的損傷程度。在這些試驗中，向1月齡小鼠后肢的右脛骨前肌(TA)注射10微摩爾心臟毒素。對側腿用作對照。另一組小鼠中，心內注射心臟毒素之后施用CT-1。6天后，解剖TA肌并冷凍用于切片。用蘇木精/伊紅染色肌肉切片，以顯示膜和結構成分。
圖10表示用α-輔肌動蛋白抗體染色肌肉切片的結果。所述抗體染骨骼肌的肌節z-帶，并且是肌肉肌節完整性的公認指標。
具體實施例方式
以下描述只是以舉例方式對優選實施方案的說明，而不是對實施本發明的必要特征組合的限制。
本發明提供通過調節心營養素(CT-1)活性而調節干細胞增殖的方法。因而本發明提供促進干細胞增值、分化或同時促進其增值和分化的方法，包括將所述細胞與CT-1或其類似物、衍生物、變體或活性片段或激活內源性CT-1的化合物接觸。本發明也提供抑制干細胞增值、分化或同時抑制其增值和分化的方法，包括將所述細胞與CT-1抑制劑接觸。所述促進干細胞增殖的方法還可以包括將所述干細胞與一種或多種干細胞調節劑接觸以促進所述干細胞的增殖和/或分化。根據本發明的這個實施方案，所述細胞可以同時接觸CT-1(或其類似物、衍生物、變體或活性片段或CT-1激活劑)和一種或多種干細胞調節劑，或所述細胞可以依次與它們接觸。
可使用所述方法體外促進干細胞增殖、干細胞分化或同時促進增殖和分化。另外，可使用所述方法體內促進干細胞增殖、干細胞分化或同時促進增殖和分化。本發明也涉及可在體外和體內實施的方法。本發明的治療性應用不意味著被限制到需要促進干細胞增殖和/或分化的疾病和病癥，如替換受損或缺陷組織。此處提供的方法可用作治療方法或預防方法。本發明方法也可用于抑制干細胞增殖，因而可用于治療特征是不適當細胞增殖的疾病，例如但不限于心臟肥大。
定義除非另外定義，此處所用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域的普通技術人員的常規理解有相同含義。
如此處所用，術語“干細胞調節劑”表示能刺激或抑制干細胞增殖、分化、或增殖和分化的化合物。
如此處所用，術語“干細胞”表示能分化成一種或多種分化細胞類型的細胞。干細胞可以是全能或多能細胞。全能干細胞典型的具有發育成任何細胞類型的能力。全能干細胞通常起源于胚胎細胞。多能細胞典型的是能分化成幾種不同的、最終分化細胞類型的干細胞系。多能干細胞可以起源于多種組織或器官系統，包括但不限于血液、神經、心臟和骨骼肌、皮膚、腸、骨、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺等。
如此處所用，術語“祖細胞”表示定型為特定細胞譜系的細胞，它經一系列細胞分裂產生具體限定范圍的分化細胞類型。祖細胞的實例是成肌細胞，它能分化成僅一種類型細胞，但其自身不完全成熟或完全分化。
此處互換使用于細胞時，術語“增殖”和“擴增”表示通過細胞分裂相同類型細胞數目的增加。
如此處所用，術語“分化”表示細胞被特化成特定功能的發育過程，例如，細胞獲得不同于起始細胞類型的一種或多種形態特征和/或功能。術語“分化”包括譜系定型和終末分化過程。例如可以通過使用本領域技術人員已知的免疫組化或其它程序來監測是否存在譜系標志物，從而評價分化。來源于祖細胞的分化子代細胞可以但不必一定屬于與所述干細胞來源組織相同的胚層或組織。例如，神經祖細胞和肌肉祖細胞可以分化成造血細胞譜系。
如此處互換使用，術語“譜系定型”和“特化”表示干細胞經歷的過程，在此過程中所述干細胞產生祖細胞，所述祖細胞定向形成特定受限范圍的分化細胞類型。定型祖細胞經常能自我更新或細胞分裂。
如此處所用，術語“終末分化”表示細胞最終分化成成熟的、完全分化的細胞。例如，神經祖細胞和肌肉祖細胞可以分化成造血細胞譜系，其終末分化導致特定細胞類型的成熟血細胞。通常終末分化與退出細胞周期和停止增殖相關。
如此處所用，術語“天然存在的”用于多肽或多核苷酸時，表示所述多肽或多核苷酸可以在自然界發現的這種事實。例如，可從天然來源分離的生物中存在、并且尚未在實驗室中人為修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
用心營養素-1(CT-1)調節干細胞增殖的方法本發明提供用CT-1促進干細胞增殖、分化或同時促進增殖和分化的方法。CT-1可單獨使用，或與一種或多種干細胞調節劑組合使用，以促進所述干細胞的增殖和/或分化。CT-1和任選的一種或多種干細胞調節劑可直接提供給所述干細胞，或可以間接提供它們，例如，但不限于，通過與能表達CT-1和/或一種或多種調節劑的細胞共培養。本發明方法也涉及可在干細胞或與干細胞共培養的細胞中激活內源性CT-1的化合物的用途。
本發明還提供用一種或多種CT-1抑制劑抑制干細胞增殖的方法。所述CT-1抑制劑可直接提供給所述干細胞，或可以間接提供它們，例如，但不限于，通過與能表達并優選分泌所述一種或多種抑制劑的其它細胞共培養。
胚胎和成體干細胞或其組合可用于本發明的方法中。所述干細胞可以是具有發育成任何細胞類型能力的全能干細胞，或可以是來源于特定組織或器官的多能干細胞，例如來源于血液、神經、骨骼肌、心肌、骨髓、皮膚、腸、骨、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺等。
在一個實施方案中，本發明方法應用于成體干細胞。在另一個實施方案中，本發明方法使用心肌干細胞、骨骼肌干細胞或二者。
1.CT-1根據本發明，CT-1表示哺乳動物CT-1(也稱心臟肥大因子或CHF)。本領域已知多種心營養素蛋白，例如但不限于小鼠CT-1(Pennica，D.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921142-1146)和人CT-1(Pennica，D.，et al.，(1996).Cytokine，8183-189)。
CT-1可以提供為多肽或編碼并能表達所述多肽的多核苷酸。多種CT-1蛋白的序列在本領域已知并可以用作制備CT-1多肽的基礎，例如，所述CT-1多肽是以上參考文獻和GenBank Accession No.AAC52173和NP 031821(小鼠)；AAD12173和AAA85229(人)提供的那些。
本發明也涉及天然存在(野生型)形式CT-1的多肽類似物、衍生物和變體，以及CT-1的活性肽片段和所述肽片段的類似物、變體和肽模擬形式。
活性片段是所述天然存在(或野生型)蛋白的片段，它基本保留與所述野生型蛋白相同的活性。片段典型是至少約20個氨基酸長。在本發明的一個實施方案中，所述片段是至少約50個氨基酸長。在另一個實施方案中，所述片段是至少約70個氨基酸長。在另一個實施方案中，所述片段是至少約100個氨基酸長。在另一個實施方案中，所述片段是至少約150個氨基酸長。術語“片段”也包括對應所述野生型蛋白的多肽，其中從所述野生型序列的N端、C端或從N端和C端缺失1到約50個氨基酸。候選片段可以選自從所述天然存在蛋白產生的隨機片段或者可以專門設計。測試所述片段的活性并與所述野生型蛋白比較，選擇具有與所述天然存在蛋白基本相同活性的片段。產生多肽片段的方法在本領域公知，包括酶促、化學或機械切割所述野生型蛋白或其重組形式，表達編碼這些片段的核酸等。
如本領域所知，多肽的類似物和衍生物、以及肽模擬化合物具有超過所述天然存在形式的顯著優點，例如包括更高化學穩定性、對蛋白裂解性降解的更高抗性、更強的藥理學特性(如半壽期、吸收、效力和療效)、改變的特異性(例如廣譜生物活性)和/或降低的抗原性。
“衍生物”是含有正常情況下不是天然存在序列的一部分的其它化學或生化結構的多肽或肽。衍生物包括氨基端和/或羧基端和/或一個或多個氨基酸側鏈已經用合適的化學取代基團衍生化的多肽和肽，以及環狀、雙和多聚多肽和肽，與其它蛋白質或載體融合的多肽和肽，糖基化或磷酸化多肽和肽，與親脂性結構(如己酰基、月桂基、硬脂酰基)偶聯的多肽和肽，和與抗體或其它生物配體偶聯的多肽和肽。
可用于衍生化多肽和肽的化學取代基團的實例包括但不限于烷基、環烷基和芳基基團；酰基基團，包括烷酰基和芳酰基；酯；酰胺；鹵素；羥基；氨甲酰基等。所述取代基團也可以是封閉基團，如Fmoc(芴甲基-O-CO-)、芐酯基(苯甲基-O-CO-)、單甲氧琥珀酰基、萘基-NH-CO-、乙酰氨基-己酰基和金剛烷基-NH-CO-。其它衍生物包括C端羥甲基衍生物、0-修飾衍生物(如C端羥甲基苯甲基醚)和N端修飾衍生物，包括取代酰胺如烷酰胺和酰肼。
術語“環狀”多肽或肽表示多肽或肽的環狀衍生物，例如兩個或更多附加的適于環化的氨基酸殘基已經被添加到多肽或肽上。這些附加氨基酸可以加在羧基端和氨基端，或可以加在內部位置。作為替代方案，環狀多肽/肽可利用氨基酸序列中天然存在的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，從而環化所述多肽/肽。環狀多肽/肽可含有分子內二硫鍵，即-S-S-；所述兩個添加殘基之間的分子內酰胺鍵，即-CONH-或-NHCO-；或分子內S-烷基鍵，即-S-(CH2)-CONH-或-NH-CO(CH2)nS-，其中n是1、2或更多。
含有分子內二硫鍵的環狀多肽/肽可以通過常規固相合成制備，常規固相合成的同時在選用于環化的位置摻入合適的S受保護的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基(例如見Sahm et al.，1996，J.Pharm.Pharmacol.48197)。完成鏈裝配后，可這樣進行環化選擇性去除所述S-保護基團，導致游離的對應SH官能團的載體上氧化，從而形成S--S鍵，然后從載體上常規去除所述產物并適當純化；或者從載體上去除所述多肽/肽，同時側鏈完全去保護，然后在高度稀釋的水溶液中氧化所述游離SH官能團。與之相似，含分子內酰胺鍵的環狀衍生物可以通過常規固相合成制備，常規固相合成的同時在選用于環化的位置摻入合適的氨基和羧基側鏈保護的氨基酸衍生物；含分子內-S-烷基鍵的環狀多肽/肽可通過常規固相合成制備，常規固相合成的同時在選用于環化的位置摻入具有合適的氨基保護側鏈的氨基酸殘基和合適的S受保護的半胱氨酸或高半胱氨酸。
雙重多肽/肽由互相共價連接的兩個相同或兩個不同多肽/肽組成，二者直接連接，或者通過間隔物連接，所述間隔物如丙氨酸殘基短鏈或假想的蛋白質水解位點(例如見美國專利5,126,249和歐洲專利495,049)。多聚體是由多個相同或不同多肽/肽或其衍生物形成的多聚分子。用合適的多聚化試劑如0.1％戊二醛進行所述多聚化(例如見Audibert et al.，1981，Nature 289593)。
“類似物”是含一個或多個非天然存在氨基酸的多肽/肽。例如，本發明多肽/肽類似物可以有用對應D-氨基酸殘基或另一個非天然存在氨基酸替換的一個或多個氨基酸殘基。非天然存在氨基酸的實例包括但不限于N-α-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-甲基氨基酸、(β-丙氨酸(β-Ala))、正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基異丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鳥氨酸(orn)、羥脯氨酸(Hyp)、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸(cysteic acid)、環己基丙氨酸、α-氨基異丁酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)、苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亞砜(MSO)和高精氨酸(Har)。
如本領域已知，全部用D-氨基酸替換肽內的全部L-氨基酸可得到“反轉(inverso)”肽或“逆反轉(retro-inverso)”肽(見Goodman et al.″Perspectives in PeptideChemistry″pp.283-294(1981)；美國專利No.4,522,752)，在本發明中兩者都被認為是類似物。“反轉”肽是序列中所有L-氨基酸替換成D-氨基酸的肽，“逆反轉”肽是氨基酸序列被顛倒(“逆”)并且所有L-氨基酸已被替換成D-氨基酸的肽。例如，如果母肽是Thr-Ala-Tyr，逆形式是Tyr-Ala-Thr，反轉形式是thr-ala-tyr，而逆反轉形式是tyr-ala-thr(小寫字母表示D-氨基酸)。與母肽比較，逆反轉肽具有逆向骨架而基本保留側鏈的原始空間構像，得到拓撲結構與母肽緊密相似的異構體。
肽模擬物是結構與多肽/肽相似、含有模擬本發明多肽或肽功能的化學結構的化合物。例如，如果多肽含有兩個有功能活性的帶電化學結構，模擬物將兩個帶電化學結構放置在空間定向和限制結構中，使得所述帶電化學功能維持在三維空間中。因此術語肽模擬物的意思包括等排體(isostere)。如此處所用，術語“等排體”表示能替換多肽或肽的化學結構，因為所述化學結構的立體構象與所述肽或多肽相似。例如，所述結構匹配對所述多肽或肽特異的結合位點。肽模擬物的實例包括含一個或多個骨架修飾的肽(即酰胺鍵模擬物)，這在本領域公知。酰胺鍵模擬物的實例包括但不限于-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-(例如見，Spatola，Vega Data Vol.1，Issue 3，(1983)；Spatola，in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins，Weinstein，ed.，Marcel Dekker，NewYork，p.267(1983)；Morley，J.S.，Trends Pharm.Sci.pp.463-468(1980)，Hudson et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.14177-185(1979)；Spatola et al.，Life Sci.381243-1249(1986)；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I307-314(1982)；Almquist et al.，J.Med.Chem.231392-1398(1980)；Jennings-White et al.，Tetrahedron Lett.232533(1982)；Szelke etal.，EP 45665(1982)；Holladay et al.，Tetrahedron Lett.244401-4404(1983)；和Hruby，Life Sci.31189-199(1982))。肽模擬物的其它實例包括由一個或多個苯并二氮(benzodiazepine)分子取代的肽(例如見，James，G.L.et al.(1993)Science2601937-1942)和含交聯形成內酰胺或其它環狀結構的骨架的肽。
本領域技術人員將知道并非肽或多肽中的所有氨基酸需要被修飾。與之相似，并非所有氨基酸需要以相同方式修飾。本發明的多肽/肽衍生物、類似物和肽模擬物因此包括嵌合型分子，其中含有兩個或更多化學上不同的區域，每個區域包含至少一個氨基酸或其修飾形式。
多肽或肽變體是，對于出現在所述天然存在蛋白氨基酸序列中的氨基酸，其中一個或多個氨基酸殘基已經被缺失、添加或替換的多肽或肽。在本發明中，變體也基本保留與所述天然存在蛋白相同的活性。典型的，當變體包含一個或多個氨基酸替換時，它們是“保守性”替換。保守性替換涉及一個氨基酸殘基被替換成具有相似側鏈特性的另一個殘基。如本領域所知，20個天然存在氨基酸可根據側鏈的理化特性分類。合適的類別包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水側鏈)；甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(極性、不帶電側鏈)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性側鏈)與賴氨酸、精氨酸和組氨酸(堿性側鏈)。氨基酸的另一類別是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香側鏈)。保守性替換涉及一個氨基酸替換為同類的另一個氨基酸。
根據本發明，與天然存在的CT-1蛋白比較，類似物、衍生物、變體或活性片段具有基本相同或更高活性。術語“基本相同的活性”表示天然存在CT-1蛋白活性的約50％活性。在一個實施方案中，基本相同的活性表示天然存在CT-1蛋白活性的約60％活性。在另一個實施方案中，它表示天然存在CT-1蛋白活性的約75％活性。在另一個實施方案中，與天然存在的CT-1蛋白優選人CT-1蛋白比較，類似物、衍生物、變體或活性片段表現增強的(更高)活性。例如可以通過測定CT-1促進干細胞增殖的能力來測定其活性。在本發明的一個實施方案中，CT-1活性表示其促進心臟干細胞增殖的能力。測定干細胞增殖增加的方法在本領域已知，包括此處提供的那些。
本發明的多肽可通過本領域已知方法制備，如從細胞提取物中純化或使用重組技術。較短序列也可以用本領域已知方法化學合成，所述方法包括但不限于完全固相合成、部分固相合成、片段縮合或經典溶液合成(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.852149；Merrifield(1986)Science 232341)。本發明的多肽可用標準技術純化，如層析(如離子交換、親合或大小分離柱層析或高效液相層析)、離心、差異溶解度，或用本領域技術人員熟悉的其它技術純化。
所述多肽也可用重組技術制備。典型的，這涉及用含編碼所述蛋白或多肽的多核苷酸的表達載體轉化(包括轉染、轉導或感染)合適的宿主細胞。多種CT-1基因的核酸序列在本領域已知(例如見，Pennica et al.Ibid.，美國專利No.5,723,585；5,679,545；5,627,073(小鼠)和GenBank Accession No.Q16619和NM001330(人))，可以用作本發明多核苷酸的基礎。
所述多核苷酸可以通過標準技術來源于合適來源或從中純化。所述多核苷酸可以是基因組DNA或RNA，或它們可以是從分離mRNA制備的cDNA。另外，已知序列可用于制備探針，以使用標準技術從多種來源中獲得編碼CT-1多肽的其它核酸序列。獲得所述核酸的合適來源是已知表達本發明蛋白的細胞，如心肌細胞，以及骨骼肌組織和有可測定CT-1轉錄本的其它組織。
通過用標準技術如定點突變技術刪除、添加和/或替換編碼序列內的一個或多個核苷酸，可以構建編碼所述天然存在CT-1蛋白片段或變體的多核苷酸。
本發明的多肽和肽也可以制備成融合蛋白。這些融合蛋白的一種用途是改進所述多肽或肽的純化或檢測。例如，多肽或肽可以融合到免疫球蛋白Fc結構域，所得融合蛋白可容易的用蛋白A柱純化。融合蛋白的其它實例包括與組氨酸標簽(允許用Nie+樹脂柱純化)、谷胱甘肽-S-轉移酶(允許用谷胱甘肽柱純化)或生物素(允許用鏈親合素柱或鏈親合素標記的磁珠純化)融合的多肽或肽。所述融合蛋白純化后，可以用本領域已知的化學或酶促方法經位點特異性切割去除標簽。
有效翻譯克隆的多核苷酸可能需要特異性起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和臨近序列。在包括其自身起始密碼子和臨近序列的完整野生型基因或cDNA被插入適當表達載體的情況下，可能不需要另外的翻譯調控信號。在其它情況下，必須提供外源翻譯調控信號，可能必須提供ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須與預期編碼序列的讀碼框適應，以確保翻譯完整的插入物。所述外源翻譯調控信號和起始密碼子可以是天然或合成的。通過包括適當的轉錄增強元件和/或轉錄終止子可以增強表達效率(Bittner et al.，(1987)Methods in Enzymol.153，516)。
用于本發明核酸序列的合適表達載體包括但不限于質粒、噬粒、病毒顆粒和載體、噬菌體等。對昆蟲細胞來說，桿狀病毒表達載體是合適的。對于植物細胞來說，病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒和煙草花葉病毒)和質粒表達載體(如Ti質粒)是合適的。完整表達載體或其部分可以整合到宿主細胞基因組中。在有些情況下，希望使用本領域已知的誘導型表達載體。
分子生物學領域的技術人員將明白，廣泛的表達系統可用于提供所述重組多肽或肽。所用的具體宿主細胞對本發明不重要。所述多肽或肽可以在原核宿主(如大腸桿菌或枯草桿菌)或真核宿主(如釀酒酵母或畢赤酵母)中制備。轉化或轉染方法以及表達載體選擇取決于所選宿主系統，可以由本領域技術人員容易的確定。例如，轉化和轉染方法已經描述于Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York中；多種表達載體例如可以從Cloning VectorsALaboratory Manual(Pouwels et al.，1985，Supp.1987)和很多商業供應商提供的那些中選擇。
此外，可以選擇以特異性、希望的方式調節插入序列表達或修飾并加工所述基因產物的宿主細胞。蛋白質產物的這些修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對所述蛋白質的活性很重要。對于蛋白質和基因產物的所述翻譯后加工和修飾，不同宿主細胞具有特征性和特異性機制。本領域技術人員可以選擇適當細胞系或宿主系統以確保所表達異源蛋白的正確修飾和加工。
攜帶所述表達載體的宿主細胞可以培養于常規營養基中，并根據需要調整培養基，以便根據已知程序激活選定基因、阻遏選定基因、選擇15個轉化體或擴增選定基因。
II.激活CT-1的化合物本發明也涉及用激活CT-1并導致內源性CT-1增加或內源性CT-1活性增加的化合物而促進干細胞增殖的方法。CT-1激活劑可以是多肽或編碼多肽的基因，所述多肽在體內作用于CT-1上游從而上調CT-1表達或活性，或者它們可以是小分子激活劑。CT-1激活劑可以作用于基因水平，例如上調編碼CT-1的基因的表達，或者它們可以作用于蛋白質水平而增加CT-1多肽的活性或降低CT-1抑制劑的活性。CT-1激活劑例如可以是多肽和肽(或上述對應多肽的類似物、衍生物、變體或肽模擬化合物)、多核苷酸、寡核苷酸、抗體或抗體片段，或有機或無機小分子。
可以使用本領域已知的多種篩選方法來鑒定候選激活劑。例如，可以通過監測用所述候選激活劑處理的細胞中靶基因表達的增加或降低，鑒定上調或下調靶基因的激活劑。可用于此目的的方法如Northern印跡分析、定量RT-PCR或微陣列分析。另外，例如可以通過Western印跡分析來監測相應蛋白質水平的增加或降低，。
對于結合特定蛋白質的多肽或肽激活劑(或與所述多肽對應的類似物、衍生物、變體或肽模擬化合物)，可用本領域已知的多種結合測試之一來確定結合能力(例如見Coligan et al.，(eds.)Current Protocols in Protein Science，J.Wiley&Sons，New York，NY)。
對于抗體或抗體片段激活劑，可使用多種免疫測試。本領域公知很多競爭性結合或放射性測定免疫測試的方案，其中使用具有明確特異性的多克隆或單克隆抗體。這些免疫測試典型的涉及測定靶蛋白和其特異性抗體之間的復合體形成。這些技術的實例包括ELISA、放射免疫測試(RIA)和熒光激活細胞分選(FACS)。作為替代方案，用對兩個非干擾表位有活性的單克隆抗體的兩位點、單克隆基免疫測試或競爭性免疫測試可以使用(見Maddox，D.E.et al.(1983)J.Exp.Med.1581211-1216)。這些測試在本領域公知(例如見Hampton，R.et al.(1990)Serological Methods.A LaboratoryManual，APS Press，St Paul，Minn.，Section IV；Coligan，J.E.et al.(1997，and periodicsupplements)Current Protocols in Immunology，Wiley&Sons，New York，N.Y.；Maddox，D.E.et al.(1983)J.Exp.Med.1581211-1216)。
III.CT-1抑制劑本發明也涉及用抑制CT-1并導致內源性CT-1降低或內源性CT-1活性降低的化合物而抑制干細胞增殖的方法。CT-1抑制劑可以是多肽或編碼多肽的基因，所述多肽在體內作用于CT-1上游從而下調CT-1表達或活性，或者它們可以是小分子抑制劑。CT-1抑制劑可以作用于基因水平，例如下調編碼CT-1的基因的表達，或者它們可以作用于蛋白質水平而降低CT-1多肽的活性。CT-1抑制劑例如可以是多肽和肽，包括干擾野生型蛋白活性的CT-1無活性片段(或上述對應多肽的類似物、衍生物、變體或肽模擬化合物)、多核苷酸、寡核苷酸、抗體或抗體片段，或有機或無機小分子。
本領域已知的上述鑒定CT-1激活劑的各種方法也可以用來鑒定候選抑制劑。
IV干細胞調節劑除了CT-1(或CT-1激活劑)以外，本發明方法也涉及一種或多種干細胞調節劑的用途。干細胞調節劑可以促進干細胞增殖和/或分化。因此，調節劑可用于提高CT-1活性并增加干細胞群體的增殖，或它可以用于促進預先用CT-1處理而擴增的干細胞群體的分化。促進干細胞分化的調節劑可以刺激所述細胞的譜系定型，或它們可以刺激定型祖細胞的終末分化。
可以用于本發明方法的調節劑實例包括但不限于Wnt多肽家族成員(包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt7b，和小鼠Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt3b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt12)和Pax7。也可以單獨一種或多種轉錄因子，或與Wnt、Pax7或兩者一起組合使用，以促進終末分化，所述轉錄因子例如但不限于Pax7、NKX2.5、GATA4、5或6、MEF2C、Hand1和Hand2(對于心肌干細胞)和MyoD、成肌蛋白、MRF4和Myf5(對于骨骼肌干細胞)。
所述調節劑可以作為全長多肽或作為其活性片段或變體(如上述)提供，或它們可以作為編碼并能表達所述全長多肽、活性片段或變體的多核苷酸提供。多種Wnt蛋白、Pax7和很多轉錄因子的氨基酸和核酸序列在本領域已知(例如GenBankAccession No.NM 002584和NP 002575(Pax7))。
在本發明一個實施方案中，所述調節劑促進干細胞分化。在另一個實施方案中，所述干細胞調節劑是Wnt多肽或編碼Wnt多肽的多核苷酸。在另一個實施方案中，所述干細胞調節劑是Wnt11多肽或編碼Wnt11多肽的多核苷酸。在另一個實施方案中，所述干細胞調節劑是Pax7多肽或編碼Pax7多肽的多核苷酸。
測試干細胞增殖CT-1、其類似物、衍生物、變體和活性片段、或CT-1激活劑單獨使用或與干細胞調節劑組合時促進干細胞增殖的能力可以用標準技術進行體外和體內測試，所述標準技術包括但不限于此處描述的那些。也可以進行體外或體內測定一種或多種CT-1抑制劑對干細胞增殖的抑制。
I.體外測試典型的，在存在和缺乏所述測試化合物條件下培養干細胞，隨后監測細胞中至少一種增殖指標，以確定暴露于所述測試化合物的那些細胞中增殖是否已經被刺激或抑制。作為替代方案，干細胞群體可以與“教育(educator)”細胞共培養，所述教育細胞暴露于所述測試化合物并隨后監測所述干細胞中的至少一種增殖指標。可以在共培養之前或期間將教育細胞暴露于所述測試化合物。可以使用來源于多種組織的成體干細胞或祖細胞。實例包括但不限于來源于心肌或骨骼肌、胰腺組織、神經組織、肝組織或骨髓、造血細胞、成肌細胞、肝細胞、胸腺細胞、心肌細胞等的干細胞。也可以使用胚胎干細胞。
維持干細胞培養的方法在本領域已知(例如見，Madlambayan，G.J.，et al.，(2001)J.Hematother.Stem Cell Res.10，481-492；Hierlihy，A.M.，et al.，(2002)FEBS Lett.530，239-243；Asakura，A.，et al.，(2002)J Cell Biol.159，123-134)。所述干細胞可以作為單培養物而單獨培養，或者可以與教育細胞共培養。另外的步驟可以包括在所述篩選方法中所述培養期間之前、之中或之后，如鑒定或分離細胞群體或有助于成功測試的步驟。例如，可使用生長因子或其它化合物來分離和擴增所述干細胞群體。EGF和FGF已被用于神經干細胞的此目的，如Gritti等人所述(J.Neurosci.(1999)193287-3297)，Bcl-2已被用于分離“肌肉干細胞”群體(見美國專利No.6,337,184)。
一般來說，在典型約1000倍范圍的一定濃度范圍測試化合物，合適的暴露方案可以容易的由本領域技術人員確定。使用共培養物時，干細胞暴露于化合物可以發生在所述干細胞初次暴露于所述教育細胞之前、之中或之后。作為替代方案，當所述測試化合物是多核苷酸或由多核苷酸編碼的化合物如多肽或肽時，可以用此處和其它地方描述的標準方法用所述核酸或含所述多核苷酸的表達載體轉染所述干細胞，使得所述測試化合物被內源性產生。作為替代方案，可通過共培養所述干細胞和轉染了所述多核苷酸或含所述多核苷酸的表達載體、表達所述測試化合物的另一種細胞系，使所述干細胞暴露于測試化合物。
如上所指，還涉及所述干細胞可以不直接暴露于所述化合物。例如可以首先用所述化合物處理教育細胞或第三種細胞類型，然后與所述干細胞共培養。作為替代方案，可以通過加入已經用這種細胞群體調節的培養基使所述干細胞間接暴露，所述細胞群體并不包括在所述共培養物中。此外，還涉及所述干細胞可以暴露于已經摻入到非液體培養基的化合物，所述非液體培養基例如固體、凝膠或半固體生長支持物，如瓊脂、聚合物骨架、基質或其它構造。
可以定性或定量監測的干細胞增殖指標例如包括整體形態變化、總細胞數、組織學、組織化學或免疫組織化學、或特異性細胞標志物的存在、缺失或相對水平(如作為增殖標志物的細胞周期蛋白D1、磷酸化組蛋白H1和H3、E2F和PCNA)。
例如可以通過用適當染料(如所述Hoescht染料之一)、BrdU摻入的FACS分析或通過氚化胸腺嘧啶摻入，監測形態變化和/或總細胞數。例如可以通過組織化學技術、免疫學技術、電泳、Western印跡分析、FACS分析、流式細胞術等，分析細胞標志物的存在、缺失或相對水平。作為替代方案，例如可以用PCR技術、Northern印跡分析、使用合適的寡核苷酸探針等，檢測編碼所述細胞標志物蛋白的基因所表達mRNA的存在。
對于同時用CT-1(或CT-1激活劑)和干細胞調節劑處理的細胞，也可以在用所述調節劑處理后監測所述干細胞群體中的一種或多種分化指標。典型的，如上述通過整體形態變化監測分化，或通過譜系特異性細胞標志物的存在，它們可以用如上述多種標準技術分析。
可以監測的合適譜系特異性細胞標志物在本領域中已知。例如，可通過監測心肌細胞特異性標志物如連接蛋白-43、MEF2C和肌球蛋白重鏈的出現來確定心肌干細胞的分化誘導；可通過檢測細胞表達一種或多種心肌細胞標志蛋白如肌球蛋白重鏈、低磷酸化MyoD、成肌蛋白、Myf5和肌鈣蛋白T(troponin T)來測定肌肉來源干細胞的分化誘導；可通過監測GFAP、MAP2和β-III微管蛋白表達確定作為神經球或作為SP細胞組分來源的神經干細胞的分化誘導(例如見，Hitoshi，S.，et al.，(2002)Genes&Dev.16，846-858)。
II.體內測試作為替代方案，可以在適當實驗動物中駐留的干細胞群體上體內測試CT-1、其類似物、衍生物、變體和活性片段、或CT-1激活劑促進干細胞增殖和/或分化的能力，例如但不限于當與一種或多種干細胞調節劑組合使用時。與之相似，可以體內測試CT-1抑制劑抑制干細胞增殖的能力。典型的，例如通過注射直接將所述測試化合物施用被研究組織。合適時間后，從所述動物收獲細胞并如上述分析所述干細胞群體。如果必要，可通過使駐留的干細胞群體與刺激增殖的化合物以及所述CT-1抑制劑接觸來測試抑制劑，從而確定所述抑制劑防止或降低增殖的能力。可同時提供所述化合物和所述抑制劑給所述干細胞，或者可以在所述抑制劑之前或之后提供所述化合物。
在本發明一個實施方案中，所述化合物促進干細胞增殖的能力可以在小鼠心臟組織中體內測試。監測從處理小鼠中分離的心臟干細胞樣群體(SP)的增加，并與未處理或用安慰劑如緩沖液或鹽水溶液處理的對照小鼠中的進行比較。根據本發明的這個實施方案，當所述SP增加至少約2倍時認為化合物促進干細胞增殖。在至少24小時期間、更典型在至少96小時期間測定SP增加。
可以在合適動物模型中測試CT-1、其類似物、衍生物、變體和活性片段、或CT-1激活劑修復損傷組織的能力。例如，可以通過將所述化合物施用于具有冠狀動脈結扎誘導心臟損傷的小鼠并監測損傷心肌修復，從而測試所述化合物修復損傷心肌組織的能力(見Guo et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611507)。與之相似，可以在經冷凍破碎(freeze crush)或施用心臟毒素誘導產生肌肉損傷的動物中確定所述化合物修復骨骼肌損傷的能力(見Megeney et al.，(1996)Genes Dev.，101173-1183；Asakura etal.，(2000)J.Cell Biol.，159123-134)。
應用本發明提供通過將所述細胞直接或間接與CT-1、其類似物、衍生物、變體和活性片段、或CT-1激活劑接觸從而促進干細胞增殖的方法。本發明還提供通過將所述細胞直接或間接與CT-1(或其類似物、衍生物、變體和活性片段或CT-1激活劑)以及一種或多種干細胞調節劑接觸從而促進干細胞增殖和分化的方法。抑制干細胞增殖的方法包括將所述細胞直接或間接與一種或多種CT-1抑制劑接觸。本發明提供的所述方法有多種應用。例如，所述方法可用于體外促進干細胞增殖，其中所述細胞已決定用于進一步體外應用，例如用于研究目的。所述方法可用于維持體外干細胞培養物，還有在開發新的藥物測試體外模型的潛在應用。
另外，所述促進增殖和/或分化的方法可用于刺激干細胞的離體(ex vivo)擴增和/或分化，從而提供適于移植或施用于對其需要的患者的細胞群體。干細胞的離體擴增具有治療很多疾病狀況的治療指證。
所述促進增殖和/或分化的方法也可用于體內促進駐留于組織中的干細胞的增殖和/或分化，從而有助于替換或修復被破壞的組織，這種破壞是所述疾病或病癥、或手術或損傷后的結果。
與之相似，所述使用一種或多種CT-1抑制劑抑制增殖的方法可用于抑制體內干細胞增殖，從而防止組織中的不適當細胞增殖或使之降至最低。
也涉及促進干細胞增殖和之后分化的序貫法。例如，通過將所述細胞直接或間接與CT-1或CT-1激活劑接觸，可以離體擴增干細胞群體。所擴增的細胞群體隨后施用于患者，并用促進干細胞原位分化的一種或多種干細胞調節劑體內處理。作為替代方案，可以在將所述細胞施用患者之前離體進行以上兩個步驟。
對于體內和離體方法，所述干細胞可以是自體、異體或異種的。
所述促進干細胞增殖(和任選的分化)方法的治療應用典型的涉及需要替換損失或破壞組織的情況，例如化療或放療之后、肌肉損傷之后、或治療或護理疾病和病癥過程中。例如，所述方法可與骨骼肌干細胞一起用于治療、護理或預防退行性肌肉障礙、肌營養不良、神經肌肉退行性疾病、HIV感染等；可與神經干細胞一起用于治療、護理或預防神經退行性疾病，如帕金森病和阿爾茨海默病，以及與心肌細胞一起用于治療、護理或預防退行性或缺血性心臟病、動脈硬化癥、高血壓、再狹窄、心絞痛、風濕性心臟病、先天性心血管缺陷、動脈炎癥和動脈、小動脈和毛細血管的其它疾病，用于再生瓣膜、傳導組織或血管平滑肌，和用于預防接受冠狀動脈搭橋移植物患者的進一步疾病。可用本發明所述方法治療或預防的其它疾病或病癥可以包括但不限于退行性肝病，包括硬化和肝炎和糖尿病。
所述抑制干細胞增殖方法的治療應用典型的但不總是涉及需要預防或最小化不適當細胞增殖的情況，例如治療或預防心臟肥大。
在本發明一個實施方案中，所述方法應用于心臟干細胞。在另一個實施方案中，所述方法應用于成體心臟干細胞。在另一個實施方案中，并非有以任何方式限制的含義，所述方法應用于骨骼肌干細胞。
本發明還提供藥物組合物，其包含CT-1、其類似物、衍生物、變體或活性片段、CT-1激活劑或CT-1抑制劑、以及制藥接受的稀釋劑或賦形劑。所述藥物組合物任選的還可以包含一種或多種干細胞調節劑、一種或多種干細胞，或其組合。藥物組合物和制備藥物組合物的方法在本領域已知，例如描述于“RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy”(前稱“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(2000)。
施用所述藥物組合物可經過多種途徑，取決于是希望局部還是系統性治療，還取決于待治療區域。典型的，局部施用所述組合物到待治療區域。給藥可以是外用(包括眼部和包括陰道和直腸的粘膜遞送)、經肺部(如經吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括經噴霧器)、氣管內、鼻內、表皮和透皮、口服或胃腸道外。胃腸道外給藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射，例如但不限于心臟內注射或灌輸、或顱內如鞘內或心室內給藥。
本發明組合物與制藥接受的載體組合遞送。優選的是，這種載體將增強穩定性和/或遞送特性。實例包括脂質體、微顆粒或微膠囊。在本發明的多種實施方案中，這些載體的應用可能對實現所述活性成分的持續釋放有益。
當配制成胃腸道外注射劑時，所述藥物組合物優選使用無菌溶液形式，其中含有其它溶劑，例如，足以使溶液等滲的鹽水或葡萄糖。
對于經吸入或吹入給藥，所述藥物組合物可以配制成水性或部分水性溶液，然后可以使用氣溶膠形式。對于外用，所述調節劑或含所述調節劑的藥物組合物可以配制成制藥接受載體中的散粉(dusting powder)、乳膏或洗液，它們涂覆于皮膚的受影響部分。
所述藥物組合物的劑量要求隨所用具體組合物、給藥途徑和待治療的具體患者而變化。劑量要求可通過本領域技術人員已知的標準臨床技術來確定。治療一般從小于每種化合物最佳劑量的小劑量開始。然后增加劑量直到達到所述情況下的最佳效果。一般來說，施用所述藥物組合物的濃度一般將提供有效結果而不引起任何有害或有毒的副作用。可以單個單位劑量給藥，或者如果希望，所述劑量可分成適于在全天的合適時間給藥的方便亞單位。
當使用處理所述干細胞的離外方法時，可通過多種程序將所述干細胞施用于患者。典型的，局部施用所述干細胞。可以作為制藥接受液體介質中的細胞懸液經注射施用所述干細胞。作為替代方案，可以在生物相容性介質中施用所述干細胞，所述介質原位變成半固體，或固體基質。例如，所述基質可以是在組織破壞部位形成半固體凝膠的注射液，如含膠原和/或其衍生物、聚乳酸或聚乙醇酸，或者它可以含一層或多層柔性、固體基質，并以其最終形式如浸漬纖維基質植入。這些基質在本領域已知(例如，由Upjohn，Kalamazoo，Mich.可得的Gelform)，具有在損傷部位支持細胞的功能，從而增強所施用細胞增殖和分化的概率。
基因治療本發明也涉及通過本領域已知的多種“基因治療”方法施用編碼CT-1(或其變體或活性片段，或CT-1激活劑)和任選的干細胞調節劑的多核苷酸，所述多核苷酸在體內表達所編碼產物。施用CT-1的方法在本領域已知。例如，CT-1已經用在腺病毒中來治療運動神經元退化(Lesbordes et al.，(2003)，Hum.Molec.Gen.12，1223-1229)。基因治療包括體外和體內技術。因此，宿主細胞可以離體用多核苷酸遺傳工程化，然后將工程化細胞提供給上述待治療患者。
作為替代實施方案，可用本領域已知技術施用多核苷酸在體內工程化細胞。例如，直接注射“裸”多核苷酸(Feigner and Rhodes，(1991)Nature 349351-352；U.S.Patent No.5,679,647)，或與輔助細胞吸收多核苷酸的一種或多種其它物質配成組合物的多核苷酸，所述其它物質如皂素(例如見美國專利No.5,739,118)或陽離子聚胺(例如見美國專利No.5,837,533)；微顆粒轟擊(例如通過使用“基因槍”；Biolistic，Dupont)；使用脂質、細胞表面受體或轉染劑包被所述多核苷酸；將所述多核苷酸包封在脂質體、微顆粒或微膠囊中；施用與已知進入核的肽連接的多核苷酸；或施用與配體連接的所述多核苷酸，所述配體參與受體介導的細胞內吞(例如見Wu and Wu，(1987)J.Biol.Chem.2624429-4432)，這可用于靶向特異性表達所述受體的細胞類型。
作為替代方案，可以形成多核苷酸-配體復合體，其中所述配體包含可破壞內體的促融合病毒肽，使所述多核苷酸免受溶酶體降解；或者通過靶向特異性受體而靶向所述多核苷酸，以便細胞特異性攝入和體內表達(例如見國際專利申請WO92/06180，WO 92/22635，W092/20316，W093/14188和WO 93/20221)。本發明也涉及細胞內引入所述多核苷酸，并隨后經同源重組摻入宿主細胞DNA中以供表達(例如見Koller and Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。
所述多核苷酸也可引入合適表達載體中。本領域已知適于基因治療應用的多種載體(例如見Viral VectorsBasic Science and Gene Therapy，Eaton Publishing Co.(2000))。
所述表達載體可以是質粒載體。產生和純化質粒DNA的方法是快速而簡單的。此外，質粒DNA通常不整合入宿主細胞基因組中，而是作為分離的實體維持在附加體位置，從而消除染色體整合可能帶來的基因毒性問題。
如今容易從商業途徑獲得多種質粒，包括來源于大腸桿菌和枯草桿菌的質粒，其中很多專門設計用于哺乳動物系統。可用于本發明的質粒的實例包括但不限于真核表達載體pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV和pAd/TR5/GFPq(Massie et al.，(1998)Cytotechnology 2853-64)。在一個示例性實施方案中，所述質粒是pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)或pVAX(Invitrogen)。
作為替代方案，所述表達載體可以是基于病毒的表達載體。基于病毒的表達載體的實例包括但不限于來源于復制缺陷型逆病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關病毒的載體。逆病毒載體和腺相關病毒載體是當前選用于體內轉移外源基因尤其是進入人體的重組基因遞送系統。這些載體提供基因向細胞的有效遞送，并且轉移的多核苷酸穩定整合入宿主染色體DNA。使用逆病毒的主要條件是確保使用的安全性，尤其是有關野生型病毒傳播到細胞群體中的可能性。用于衍生逆病毒載體的逆病毒包括但不限于莫洛尼小鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆病毒如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓組織增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。具體的逆病毒包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它們是本領域技術人員公知的。
所述多核苷酸通常引入所述載體中合適啟動子的控制下，從而允許體內表達所編碼多肽。可用的合適啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，如腺病毒主要晚期啟動子、E1A啟動子、主要晚期啟動子(MLP)和相關前導序列或E3啟動子；巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動子；誘導型啟動子，如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，如單純皰疹胸苷激酶啟動子；逆病毒LTR；組蛋白、pol III和(β-肌動蛋白啟動子；B19細小病毒啟動子；SV40啟動子；和人生長激素啟動子。所述啟動子也可以是感興趣基因的天然啟動子。合適啟動子的選擇將取決于載體、宿主細胞和所編碼蛋白，并且在本領域技術人員的普通技術范圍內。
開發只產生復制缺陷型逆病毒的專門細胞系(稱為“包裝細胞”)增加了逆病毒用于基因治療的效用，并且缺陷型逆病毒已被很好表征用于基因治療目的的基因轉移(綜述見Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。因此，可以構建重組逆病毒，其中部分逆病毒編碼序列(gag、pol、env)已經被待用多核苷酸替換，使逆病毒具有復制缺陷性。然后使用輔助病毒經標準技術將所述復制缺陷型逆病毒包裝成能用于感染靶細胞的毒粒。制備重組逆病毒和用這些病毒體外或體內感染細胞的操作方案可在CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)，J.Wiley & Sons，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它標準實驗手冊中查到。用于制備親嗜性和兼嗜性逆病毒系統的合適包裝病毒株實例包括Crip、Cre、2和Am。包裝細胞的其它實例包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN細胞系，如下文描述Miller，Human Gene Therapy，Vol.1，pgs.5-14(1990)。
另外，已經表明可以通過修飾病毒顆粒表面上的病毒包裝蛋白來限制逆病毒及隨后逆病毒基載體的感染譜(例如見PCT公開WO93/25234和WO94/06920)。例如，修飾逆病毒載體感染譜的策略包括將細胞表面抗原特異性抗體與病毒env蛋白偶聯(Roux et al.(1989)PNAS 869079-9083；Julan et al.(1992)J.Gen Virol 733251-3255；和Goud et al.(1983)Virology 163251-254)；或將細胞表面受體的配體與病毒env蛋白偶聯(Neda et al.(1991)J Biol Chem 26614143-14146)。偶聯可以是與蛋白或其它多種物質(例如將env蛋白轉變成脫唾液酸糖蛋白的乳糖)的化學交聯形式，以及通過產生融合蛋白(例如單鏈抗體/env融合蛋白)。這種技術當用于限制或指導感染某種組織類型時，也可用于將親嗜性載體轉變成兼嗜性載體。
此外，通過使用組織或細胞特異性轉錄調節序列可進一步增強逆病毒基因遞送的用途，所述轉錄調節序列控制載體中所含多核苷酸的表達。
用于基因治療技術的另一種病毒載體是腺病毒來源的載體。可以操作腺病毒基因組使得它編碼并表達感興趣基因產物，但其在正常溶胞病毒生活史中復制的能力被滅活。例如見Berkner et al.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld et al.(1991)Science252431-434；和Rosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155。來源于腺病毒株Ad 5型d1324(Ad type 5d1324)或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Adz等)的合適腺病毒載體對本領域技術人員公知。重組腺病毒在某些情況下可具有優勢，因為它們能用于感染包括周圍神經細胞的各種細胞類型。另外，所述病毒顆粒相對穩定并可以純化和濃縮，并且如上所述，可以被修飾以影響感染譜。另外，導入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不整合入宿主細胞基因組，而保持附加體形式，從而避免當所導入的DNA整合入宿主基因組中時(如逆病毒DNA)作為插入突變結果可能發生的潛在問題。另外，相對于其它基因遞送載體，腺病毒基因組攜帶外源DNA的能力較大(最高為8kb)(Berkner et al.同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。當前使用且本發明涉及的多數復制缺陷型腺病毒載體中刪除了全部或部分的病毒E2和E3基因，但保留約80％腺病毒遺傳物質(例如見Jones et al.(1979)Cell 16683；Berkner et al.，同上；和Graham et al.in Methods in Molecular Biology，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，N.J.，1991)vol.7.pp.109-127)。
產生和擴增復制缺陷型人腺病毒載體要求獨特的輔助細胞系。輔助細胞系可以來源于人細胞，如人胚腎細胞、肌肉細胞、造血細胞或其它人胚胎間充質細胞或上皮細胞。作為替代方案，所述輔助細胞可以來源于對人腺病毒允許的其它哺乳動物物種細胞，即提供允許復制缺陷型病毒復制的必要序列。這些細胞例如包括293細胞、Vero細胞或其它猴胚間充質或上皮細胞。也涉及使用非人腺病毒載體如豬或牛腺病毒載體。適當病毒載體和輔助細胞系的選擇在本領域技術人員的普通技術范圍內。
在本發明一個實施方案中，所述基因治療載體是腺病毒來源的載體。
試劑盒本發明還提供治療試劑盒，其含有位于藥物組合物中的CT-1、其類似物、衍生物、變體或活性片段、或CT-1激活劑和任選的一種或多種干細胞調節劑。還提供了在藥物組合物中含一種或多種CT-1抑制劑的試劑盒。所述試劑盒的單個成分分別包裝在獨立容器中，并且與這些容器相關的可以是規范藥物或生物制品的生產、使用和銷售的政府機構批準形式的公告，該公告反映經生產、使用或銷售的機構批準用于人類。
當所述試劑盒的成分以一種或多種液體溶液提供時，所述液體溶液可以是水性溶液，例如無菌水性溶液。在此情況下所述容器本身可以是吸入器、注射器、移液器、滴眼器或其它類似裝置，所述組合物可以從中施用于患者。
所述試劑盒中的成分也可以干燥或凍干形式提供，并且所述試劑盒還可以含有合適溶劑，以便重構凍干成分。與容器的數目或類型無關，本發明試劑盒也可包含輔助將所述組合物施用于患者的裝置。這種裝置可以是吸入器、注射器、移液器、鑷子、量匙、滴眼器或任何類似的醫學上允許的遞送載體。
結果從轉化了合適核苷酸構建體的細胞中產生并分泌的CT-1促進干細胞增殖和/或分化。現在參考圖3和4，其中的時間曲線結果表明心臟內注射24、48、72和96小時后CT-1對小鼠心臟細胞的影響。數據提示SP細胞響應CT-1處理而增殖。因此，本發明提供了促進患者中干細胞增殖的方法，包括將含CT-1的組合物或能產生CT-1的組合物施用于患者。
在上述方法的實施方案中，所述干細胞包含心臟細胞，更優選心臟SP細胞。然而，所述干細胞也可以包含來源于其它體液、組織和/或器官的干細胞，例如但不限于骨骼肌干細胞、骨髓干細胞或肝干細胞等。在本發明另一個實施方案中，并非具有以任何方式限制的含義，所述干細胞可以包含骨骼肌干細胞。優選所述干細胞是人干細胞。
包含或編碼CT-1的組合物可通過本領域已知的任何途徑施用于患者，例如但不限于經注射或灌輸。不希望以任何方式限制，這些注射途徑包括但不限于肌肉注射、皮下注射、腹膜內注射、靜脈注射或動脈內注射等。在本發明一個實施方案中，所述組合物經肌肉注射施用。在本發明另一個實施方案中，經心臟內注射或灌輸施用所述組合物。
如上所述，圖3和4表示的結果表明CT-1促進受治療患者中的細胞增殖，例如但不限于干細胞的增殖。盡管表達并分泌CT-1的細胞使得大致連續地將CT-1施用于患者，此處所得結果表明連續施用CT-1后SP細胞群體有短暫增加。另外，結果表明，與對照比較，CT-1處理后經約24小時到約96小時的時間，SP細胞總數增加。這些結果提示應該以多劑量施用CT-1從而避免干細胞不對CT-1處理作應答的時間段。另外，與單劑量或連續劑量CT-1比較，多劑量CT-1可以促進干細胞更大增殖和/或分化。另外，與多劑量遞送比較，此處所述的間隔一定時間、例如間隔約24小時的多劑量可以促進干細胞更大程度的增殖和/或分化。
本發明提供促進患者中干細胞增殖的方法，包括將兩個或多個含CT-1的組合物施用于所述患者。優選的，施用于所述患者的第一和第二個劑量間的時間段、任選的任意兩個CT-1劑量之間的時間段大于約24小時，更優選至少約48小時，更優選至少約72小時，更優選至少約96小時，或更長。本發明也包括將兩個或多個劑量的CT-1施用于患者，其中任意兩個劑量間的時間段是約2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、28天、1月、2月、3月、6月、1年，或之間的任意時間。所述兩個或多個劑量例如在CT-1量、配方、組合物中成分或其任意組合方面可以相同或不同。本發明也包括將三個、四個、五個、六個、七個或更多含CT-1的組合物施用于患者。
本發明也提供篩選增加被試者中細胞增殖的化合物的方法，包括a)將化合物施用于屬于測試組的一個或多個被試者；b)從所述一個或多個被試者的至少一種體液、組織或器官中分離多個細胞；c)將所述多個細胞進行FACS分析并定量含有一種或多種明確特征的細胞數目；d)將具有所述一種或多種明確特征的細胞數目與從一個或多個對照被試者中獲得的結果作比較。
所述細胞可以包含單種類型細胞或很多類型細胞的組合。在一個實施方案中，所述細胞包含干細胞。在一個替代實施方案中，所述細胞包含心臟細胞或骨骼肌細胞。在另一個替代實施方案中，所述細胞包含心臟干細胞。在另一個替代實施方案中，所述細胞包含心臟SP細胞。
也涉及分析步驟(步驟c)進一步包括分離所述細胞。
在一個替代實施方案中，施用步驟(步驟a)可以包括施用一種或多種化合物，其中至少一種化合物是CT-1多肽或基本表現與CT-1多肽相同生物活性的化合物，并且其中所述一種或多種化合物還包含至少一種干細胞調節劑，例如但不限于一種或多種信號傳遞分子，如但不限于一種或多種Wnt多肽、Pax7，或同時包含二者。
在一個替代實施方案中，提供了篩選增加被試者中細胞增殖的化合物的方法，包括a)從一個或多個被試者的至少一種體液、組織或器官中分離多個細胞，和任選的純化所述多個細胞，以富集一種或多種特定細胞群體；b)用化合物處理所述多個細胞或所述一種或多種富集的細胞群體；c)培養所述細胞或細胞群體一段時間，使之足以允許所述細胞或細胞群體增殖和/或分化；和d)將從培養步驟得到的集落細胞數目與從一個或多個對照中獲得的結果作比較。
比較步驟(步驟d)還可以包括將所述細胞進行FACS分析以鑒定一種或多種特定細胞群體，例如但不限于SP細胞。
以上描述并非要以任何方式限制要求保護的本發明，而且，所討論的特征組合并非對本發明解決方案絕對必要。
本發明將在以下實施例中進一步說明。然而應該理解這些實施例只是用于說明目的，而不應用來以任何方式限制本發明范圍。
實施例實施例1心營養素-1增加心臟干細胞樣群體(SP)構建含由通用RSV啟動子驅動的全長CT-1的腺病毒構建體(ad-CT-1)(圖1)。將CT-1與所述神經生長信號融合，以促進CT-1從所述細胞分泌。將7.5×107PFU的ad-CT-1注射進2月齡小鼠心臟。同時使用50μL無菌PBS進行平行對照試驗。注射后72小時分離細胞并進行FACS分析。圖2是用Hoechst 33342染料染色并根據theHoechst 33342HSC Staining and Stem Cell Purification Protocol(見Goodell，M.，et al.(1996)J Exp Med 183，1797-806，引入此處作為參考)分析的所述心臟細胞懸液的FACS分析。從三個心臟收集細胞。注射鹽水的心臟表現約0.93％的SP群體(圖2A)而注射心營養素的心臟表現約3.61％的群體(圖2B)。
圖2C提供CT-1腺病毒在受感染H9C2細胞中表達的證據。細胞用腺病毒處理，72小時后收集這些細胞的培養基以及未處理對照H9C2細胞培養基，用抗CT-1抗體進行Western印跡分析。印跡膜上顯示約24.5kDa的CT-1蛋白。
圖2D是對照注射24小時后心臟細胞FACS分析獲得的結果。圖2E是對照腺病毒注射24小時后心臟細胞FACS分析獲得的結果。維拉帕米是可用于限定所述SP群體的藥物(通道阻斷劑)。例如，用維拉帕米處理的細胞排斥Hoechst染料并且不再能通過FACS分析檢測到SP群體。用對照腺病毒處理后維拉帕米敏感的SP群體沒有變化。
顯示t＝24、48、72和96小時的時候ad-CT-1對小鼠心臟影響的時間曲線在圖3A中給出。顯示t＝24小時、48小時、72小時和96小時的時候CT-1對心臟細胞影響的第二個時間曲線在圖3B中給出。用Hoechst 33342染料染色心臟細胞懸液并進行FACS分析。以前使用多種組織來源的研究已經確定Hoechst染料染色的細胞懸液顯示出Hoechst流出的亞群體細胞(副群體或SP細胞)。這些細胞具有干細胞樣活性，分化標志物減少或缺乏，并且也具有對維拉帕米存在敏感的特征，維拉帕米是多藥抗性樣蛋白的抑制劑[Goodell et al.(1997)，Nat.Med.3，1337-1343；Jackson et al.(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，14482-14486.]。因此，為評價駐留心肌干細胞群體的存在，成熟小鼠(約2月)的心臟被酶促解離成單細胞懸液，并進行FACS分析。使用裝備雙激光器的DakoCytomation MoFlo流式細胞儀進行FACS分析。在兩個波長處測量熒光。在488nm(Spectraphysic氬激光器)處測量前向和側向散射。Hoechst染料在350nm被激發(I90C UV激光器，來自Coherent)。在424nm(424/44帶通濾光器)測量藍色發光，在675nm(675AGLP寬帶濾光器)以上測量紅色發光。使用510DLP分色鏡分開這兩個波長。心肌細胞懸液的FACS分析顯示來自小鼠心臟組織的排斥Hoechst染料的明顯(robust)SP群體。所有細胞從2月齡小鼠心臟中分離，這些小鼠經直接心內注射接受7.5×107PFU ad-CT-1或lacZ腺病毒。
參考圖4，其中的結果表示心內注射后4天恢復期間在AdCT-1處理的心臟中發現的SP細胞相對數目。對每個時間點而言，所述數據用對照注射心臟獲得的數據進行標準化。數據表明心臟SP細胞隨時間推移有約3倍增加，在較短時間內，例如在約48h到約72h的時候看到大的增加。
參考表2，其中表示，與對照比較，用CT-1處理的被試者的心臟質量與身體質量的比值。
表2用CT-1處理的被試者的心臟質量/身體質量比值的比較

統計分析指出對照組和CT-1處理組所得比值之間沒有顯著差異存在(p＞0.05)。這些結果提示CT-1可施用于患者預防或治療多種病癥或疾病，例如但不限于心臟病或疾病，而不促進所述患者的心臟肥大。
心臟內施用ad-CT-1對骨骼肌、骨髓和肝臟在24小時、48小時、72小時和96小時時間點的影響表示于圖5A-C。結果表明心臟內注射ad-CT-1提供選擇性促進患者中心臟干細胞增殖的合適方式。與之相似但不希望以任何方式限制，在患者的特定肌肉中肌肉注射CT-1或能產生CT-1的組合物可以導致干細胞在那塊肌肉中的選擇性增殖，而不是在另外區域，例如但不限于心臟和其它肌肉或組織。作為比較，但不希望限制，通過使得CT-1接觸多種組織或器官系統的一種或多種途徑向患者施用CT-1或能產生CT-1的組合物，可以導致干細胞在一種或多種組織或器官系統中的非選擇性增殖，例如但不限于心臟和骨骼肌組織。這些結論由Methocult測試的結果支持，所述測試使用含促進集落形成所必需的因子的甲基纖維素或凝膠樣介質。該測試可用于確認干細胞群體是否在其生活周期中經受某種程度的激活。簡單的說，通過在時間＝注射后24、48、72或96小時以約10,000細胞/板將注射adCT-1或adLacZ的小鼠細胞鋪板，根據制造商說明進行所述實驗(StemCell Technologies，Catalog#28405，Version 3，February 2004)。來自心臟、骨骼肌和骨髓的副群體(SP)和主群體(MP)組分都被檢測。培養細胞兩周，隨后計數集落數并對包括造血標志物的多種細胞標志物染色。體內施用Ad-CT-1載體導致一種或多種骨骼肌干細胞群體的增殖增加。例如，盡管暴露于Ad-CT-1的骨骼肌中SP增加小，與對照處理的培養物比較，來源于骨骼肌并生長于允許條件(即methocult培養基)下的原代細胞培養物導致造血集落數目約10倍增加。
參考圖6，其中結果提示施用CT-1促進大于約3周齡的小鼠被試者中細胞增殖。因此本發明涉及此處及全文中定義的方法，其中所述被試者大于約3周齡，優選2月齡。在一個實施方案中，其中所述被試者是人，本發明涉及此處和全文中定義的方法，其中所述被試者大于約1月，優選大于約2月，更優選大于約6月，更優選大于約1年。在另一個實施方案中，所述被試者是成年人被試者。
參考圖7，其中結果提示CT-1加速成體心臟干細胞的分化。表達組成型表達GFP轉基因的小鼠注射CT-1。24小時后收集心臟，并且將從這些心臟分離的SP細胞與正常原代心肌細胞共培養。結果表明GFP標記的SP細胞明顯轉變成連接蛋白-43陽性的心肌細胞。所述結果提供了CT-1可用于促進被試者中心臟干細胞的增殖和/或分化證據。進而，基于從所述試驗獲得的結果，本發明也提供篩選調節心臟干細胞增殖、分化或增殖和分化的化合物的方法，包括下列步驟a)從被試者分離含心臟干細胞的多個細胞；b)用一種或多種化合物處理所述細胞；c)將步驟b處理的細胞與一種或多種正常原代心肌細胞一起培養一段時間，使得足以允許所述細胞經歷增殖、分化或二者兼有，和；d)測頂增殖細胞、分化細胞、或增殖和分化細胞的數目。處理步驟可以包括將所述細胞與CT-1、或其片段或衍生物、CT-1活性調節劑、wnt多肽、或表現wnt活性的其片段或衍生物、Pax7、或以上的任意組合接觸。也可以使用其它信號轉導分子。也涉及在分離步驟之前用CT-1處理被試者以促進一種或多種干細胞群體的增殖。在另一個實施方案中，所述含心臟干細胞的多個細胞可以包含使它們與正常原代心肌細胞區分的標志物等。例如，含心臟干細胞的多個細胞可以被GFP標記，而所述正常原代心肌細胞不被GFP標記。區分含心臟干細胞的多個細胞和正常心肌細胞的任何方法都可以用于此處所述的方法。
參考圖8，其中大體說明了確定心臟內注射Ad-CT-1是否能影響受損骨骼肌修復所應遵照的實驗程序。進行所述實驗以確認methocult實驗的觀察結果。在那些試驗中，注意到心臟內注射CT-1導致在methocult培養基上形成的來自骨骼肌的“干細胞樣”集落的數目增加。這些結果提示CT-1激活骨骼肌中的干細胞樣群體，該群體可輔助或增強所述骨骼肌修復過程。為確認這些觀察結果，注射蛇毒心臟毒素誘導小鼠后肢破壞。心臟毒素在短時間(約1-2天)內誘導肌肉極度退化。然而已經公知破壞后幾天骨骼肌可以充分修復自身。此處，誘導心臟毒素破壞后立即注射CT-1。進而，進行類似試驗，其中在心臟毒素注射1-3天后施用CT-1。
參考圖9，其中結果表示對照注射、心臟毒素(ctx)注射、或心臟毒素和Ad-CT-1同時注射后約6天的破壞程度。在這些實驗中，向1月齡小鼠后肢的右脛骨前肌(TA)注射10微摩爾心臟毒素。對側腿用作對照。另一組小鼠中，注射心臟毒素后心內施用CT-1。6天后，解剖TA肌肉并冷凍切片。所述肌肉切片用蘇木精/伊紅染色顯示膜和結構組分。當在注射心臟毒素的大概同時施用CT-1時觀察到更多肌肉完整性。
參考圖10，其中表示如上所述處理并用抗α-輔肌動蛋白抗體染色的肌肉橫切片。α-輔肌動蛋白染骨骼肌的肌節z-帶，是肌肉肌節完整性的公認指標。結果提示用CT-1處理的肌肉表現出比單獨心臟毒素(ctx)處理肌肉更好的α-輔肌動蛋白染色。不希望受理論約束或以任何方式限制，這些結果提示CT-1可以用于增強損傷后骨骼肌恢復，和/或CT-1可以保護肌肉免于損傷后退化。
一般方案骨髓分離取小鼠腿。取小鼠前腿長骨(股骨)，也可以分離后腿以增加骨髓細胞數。
1)去除周圍肌肉和其它組織2)盡可能高的程度的切割骨3)去除膝蓋周圍組織并切斷長骨
4)骨游離出后用胰島素注射器沖洗骨髓到5cm組織培養皿中。
5)用5mL PBS沖洗一根骨，確保沖洗兩端。
6)如果需要重復操作。
7)收集骨髓后，用18號針頭在皿中磨碎(triturate)。
8)轉移細胞到15mL Falcon管。保持于冰上。
9)為進行FACS，從離心下細胞并用DMEM+洗滌的點繼續操作方案*不需要消化*用于FACS方案的抗體染色1)按照HOECHST操作方案直到最后洗滌，就在重懸于HBSS+中之前。
2)以1ml/心臟重懸于PBS+2％FBS中。
3)用血細胞計數儀計數細胞公式＝#細胞/mm3×稀釋度×10,000(#細胞/mL)4)制作飽和曲線＞用PBS+2％FBS稀釋細胞到終濃度3,000,000細胞/mL＞每管100μL加入8個管中(兩個對照和6個不同濃度抗體)＞接著稀釋抗體溶液(ex制備400μL的5μg/mL溶液，其中起始濃度是100μg/mL)5(400)＝100(x)x＝20μL將20μL抗體加入380μL dH2O中＞取100μL并加入細胞。稱此為對照#1，其中含NO 2°抗體。
＞另取100μL并加入細胞，并加NO 2°抗體。
＞將剩余抗體(200μL)加入200μL dH2O中。得到400μL的2.5μg/mL溶液。
＞繼續直至完成適當數目的稀釋。
＞對照#2將是沒有1°抗體的細胞。
5)將細胞與第一抗體在冰上孵育15分鐘。
6)離心細胞并去除上清液。
7)用PBS+2％FBS洗滌細胞。
8)重懸于200μLPBS+2％FBS中。
9)加入第二抗體并在冰上孵育15分鐘。
10)再次用PBS+2％FBS洗滌細胞。
11)重懸于500μLHBSS+。
12)轉移入小圓底Falcon管*用于FACS*13)用1cc胰島素注射器取出任何細胞團塊14)記得取含1mL培養基的15mL管，待用于收集細胞。
15)進行FACSFACS配方維拉帕米(100×)制備100×最終貯液用95％乙醇懸起終濃度50μMHOECHST 33342(200×)制備200×最終貯液用水懸起終濃度1mg/mLDMEM+388mLDMEM8mL FBS4mL 1M Hepes
HBSS+100mL HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)2mL FBS1mL 1M Hepes膠原酶-分散酶在通風櫥中制備用5mL 1×PBS溶解整個500mg膠原酶瓶每5mL等份膠原酶-分散酶溶液加入＞4.34mL分散酶2(t.c.冷凍)＞500μL懸起的膠原酶(+4℃冷藏)＞125μL 100mM CaCl2PBS+2％FBS*抗體染色時使用*500mLPBS10mL FBSHoechst 33342干細胞染色和純化方案1)打開通風櫥并在37℃水浴中解凍膠原酶/分散酶。
2)處死小鼠，噴乙醇并解剖出心臟。
3)將心臟放入冷PBS中(保存于4℃的合格PBS)4)用鑷子從心臟中擠壓出多余血液5)保存于冷PBS中直至準備消化6)在通風櫥中，用兩個刀片，將心臟切碎。(確保心臟濕潤～如果它們變成膏狀則加入100μL PBS)7)然后轉移切碎的心臟到小組織培養皿中
8)每1到4個心臟加4-5mL膠原酶/分散酶9)上下吹吸至完全混合，并分開細胞團塊10)在37℃孵箱中放置35-38分鐘11)通過75微米篩網濾器(從網孔板)12)用5mL PBS漂洗濾器并收集在50mL管中。
13)轉移50mL管的內容物到15mL管中。
14)在設置1.2離心10分鐘，去除上清液，并重懸于8mL冷DMEM+中，并再次在設置1.2離心10分鐘。
15)仔細去除上清液，將沉淀重懸于2mLDMEM/心臟(估計細胞數)16)用Hoechst和維拉帕米(都冷凍保存)染色加5μL/mL 200×Hoechst到所有細胞中取1mL Hoechst染色的細胞并放入新15mL管中加15μL/mL 100×維拉帕米17)在37℃孵箱中放置90分鐘。確保溫度恒定。
18)冰上放置5分鐘。
19)在設置1.2離心10分鐘，去除上清液，重懸于8mL冷DMEM+中，再次在設置1.2離心10分鐘。
20)去除上清液并重懸于HBSS+中(～200μL/心臟)。
21)轉移到帶蓋小管中用于FACS，用1cc胰島素注射器去除任何細胞團塊22)從該點開始保持于冰上(無生物活性的)23)記得取含1mL培養基的15mL管，待用于收集細胞。
24)進行FACS分析ASAP以最小化可能在此期間發生的任何變化。
原代心肌細胞培養基培養基應該臨用前新鮮制備，但也可以在冷藏箱中保存約1周。
向50mL DMEM-F12中加入以下成分d-葡萄糖 0.3g
1-谷氨酰胺500μL200mM貯液pen-strep 500μL 5000單位貯液胰島素250μL 5mg/mL貯液去鐵轉鐵蛋白 100μL50mg/mL貯液孕酮 1μL 1mM貯液腐胺 60μL 8mg/mL貯液硒15μL 100μM貯液兩性霉素B 50μL 12.5μg/mL貯液肝素 10μL 10mg/mL貯液用0.2μm濾器過濾培養基。過濾后加入40μL 25μg/mL bFGF貯液。EGF任選。如果使用，以10μL100μg/mL貯液在過濾前加入50mL DMEM-F12培養基中。
分離心肌細胞的配方MEM-JM(500mL)400mLdH2O5.65g MEM-JM1.0g碳酸氫鈉用NaOH調節溶液pH到7.3，用H2O補充到終體積500mL，過濾除菌。
2×膠原酶(新鮮制備)30mg膠原酶15mLMEM-JM過濾除菌(注射器)DMEM-10％FBS400mLDMEM45mL FBS
4.5mL pen/strepDMEM-F12+ITS (500mL)半包DMEM-F12(約7.8g)2.5mL pen/strep500μLITS0.6gNaHCO3分離原代心肌細胞準備制備培養基，加30mg膠原酶到15mL JMEM中，過濾除菌并放置于37℃水浴(約20只小于6日齡小鼠)。
解剖心臟1)從小鼠切下心臟，盡量避免心房，放置于含冷DMEM-JM的50mL管中。
2)在JMEM培養基中上下吹吸洗滌心臟。
3)轉移心臟到petri培養皿，如果需要用PBS保持濕潤。
4)用兩個解剖刀片切碎心臟。
膠原酶消化1)用25mL寬口吸管用20mL JMEM輕柔洗滌petri培養皿中的心室組織。幾次后用吸管吸打組織和培養基。讓組織沉降并只“吸出”組織到潔凈50mL管中。丟棄培養基，其中含多數紅細胞。
2)用同樣的25mL吸管，從50mL管中組織去除任何殘余液體，并加入適當體積的JMEM和2×膠原酶。(見表，并考慮所用組織量)

3)以20-30轉/分在37℃孵育輕柔旋轉15分鐘。同時準備2個含10％FBS+DMEM的50mL管。
4)第一次孵育后，用25mL吸管緩慢吹打(triturate)組織和培養基大約3次。等1分鐘讓組織沉降，緩慢吸出上清液并丟棄(多數BBC和第一次的碎片)。更換成10mL新鮮JMEM。重復洗滌步驟1次。使組織沉降1分鐘并丟棄上清液。測量組織量并加入JMEM以調整到適當體積(見表)。加入膠原酶并孵育。
5)隨后孵育結束時，用10mL吸管緩慢吸打組織和培養基并吹打2次。等1分鐘然后，緩慢吸起上清液并轉移到含10mL FBS的50mL管中而終止膠原酶消化。用10mL新鮮JMEM更換宿主組織。重復洗滌步驟1次。使組織沉降1分鐘，然后轉移上清液到含FBS的同一個50mL管中。測量出組織體積并加入JMEM調整到適當體積，然后加入膠原酶。
6)向所述含FBS和來自兩次洗滌上清液的50mL管中，加入足量DMEM以充滿管子。在水平轉頭離心機(airplane)中50g離心5分鐘。真空吸出上清液，將沉淀重懸于10mL DMEM-20％FBS。在通風櫥中室溫保存。
7)再重復步驟4和5兩次(或多次)。
8)最后孵育后，用10mL吸管緩慢吹打兩次。用10mL新鮮DMEM+10％FBS更換宿主組織，重復洗滌步驟1次。使組織沉降1分鐘，轉移上清液到同一個含FBS的50mL管中。
9)向含FBS和來自兩次洗滌上清液的50mL管中加入足量DMEM+10％FBS以充滿管子，并在500g離心5分鐘。
預鋪板操作程序
1)去除上清液2)重懸于20mL DMEM+10％FBS。
3)放置nytex尼龍濾器在無菌的50mL管上準備過濾。將過濾的懸液均勻分配到一個無菌的150mm petri培養皿中，并在37℃孵育15分鐘。(這是第一次鋪板)4)孵育后，緩慢吹打并轉移上清液(～20mL)到第二個皿中。
5)用10mL新鮮DMEM+10％FBS洗滌舊培養皿，并轉移到第二個培養皿中(這是第二次鋪板)。在37℃孵育15分鐘。
6)用10mL或更少DMEM+10％FBS重懸沉淀。一定記得，較少量的重懸體積意味著越多的細胞用于細胞計數程序并且濃度也比鋪板程序使用的最終濃度更高。
7)細胞鋪板到含～5mLDMEM+10％FBS的2mm×6mm培養皿中。蓋上培養皿孵育20小時。預鋪板細胞的第二個板保持于DMEM+10％FBS中。
8)20小時培養后，更換平板培養基為DMEM F12+ITS。
9)生長第一天后，輕柔漂洗平板并轉移含漂浮細胞的生長培養基到15mL管中。離心下細胞并重新鋪到帶蓋平板中的新鮮DMEM+10％FBS培養基中。第二次預鋪板在DMEM+10％FBS中生長3天。
細胞計數1)在1.5mL eppendorf管中，加200μL細胞懸液到400μL 0.4％臺盼藍溶液和400μL DMEM+10％FBS中。孵育2分鐘，然后在血細胞計數儀中計數。分別計數活的心肌細胞和不活的心肌細胞。活肌細胞應該相當大并成核化或多核化。不活的細胞將染藍色。忽略紅細胞和其它小碎片。
2)計數和鋪板以后，在37℃預熱的DMEM+10％FBS中培養細胞過夜或至少16小時。在含血清培養基中培養24小時是最大值。
本發明如此描述，很明顯可以很多方式作相同改變。這些改變不認為偏離本發明的實質和范圍，對本領域技術人員而言顯而易見的所有這些修改都包括在以下權利要求的范圍內。
所有引用內容引入此處作為參考。
已使用優選實施方案描述本發明。然而，對本領域技術人員顯而易見的是，可以在不偏離本文所述的本發明范圍條件下對本發明進行很多改變和修改。
權利要求
1.促進干細胞群體增殖的方法，包括將所述干細胞與含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸接觸。
2.抑制干細胞增殖的方法，包括將所述干細胞與一種或多種心營養素-1抑制劑接觸。
3.促進干細胞增殖和分化的方法，包括將所述干細胞與含心營養素-1氨基酸序列的第一種多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述第一種多肽的多核苷酸以及一種或多種干細胞調節劑接觸，其中所述一種或多種干細胞調節劑是多肽或編碼多肽的多核苷酸。
4.根據權利要求3的方法，其中所述干細胞調節劑是Wnt多肽。
5.根據權利要求3的方法，其中所述干細胞調節劑是Pax7。
6.根據權利要求3的方法，其中所述一種或多種干細胞調節劑包含至少一種Wnt多肽和Pax7。
7.根據權利要求1的方法，其中所述方法在體外實施。
8.根據權利要求1的方法，其中所述方法在體內實施。
9.根據權利要求1的方法，其中所述干細胞是心臟干細胞。
10.促進哺乳動物中心臟干細胞增殖的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸。
11.根據權利要求10的方法，還包括施用誘導所述心臟干細胞增殖和/或分化的一種或多種干細胞調節劑。
12.抑制哺乳動物中心臟干細胞增殖的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的心營養素-1抑制劑。
13.修復或再生哺乳動物中心臟組織的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的含心營養素-1氨基酸序列的多肽或其類似物、衍生物、變體或活性片段或編碼所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽能促進心臟干細胞的增殖。
14.促進患者中干細胞群體增殖、分化、或增殖和分化的方法，包括，向所述患者施用至少一種組合物，所述組合物含具有心營養素-1活性的至少一種肽，或能表達具有心營養素-1活性的肽的核苷酸序列。
15.權利要求14的方法，其中所述干細胞包含心臟干細胞或骨骼肌干細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述干細胞包含心臟干細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述干細胞包含骨骼肌干細胞。
18.權利要求14的方法，其中所述施用步驟包括皮下注射、肌肉注射、腹膜內注射或靜脈注射。
19.權利要求18的方法，其中所述肌肉注射包括心臟內注射。
20.權利要求14的方法，其中所述核苷酸序列包含病毒核苷酸序列。
21.權利要求20的方法，其中所述病毒核苷酸序列是腺病毒或逆病毒核苷酸序列。
22.權利要求20的方法，其中所述核苷酸序列包含分泌核苷酸序列，所述分泌核苷酸序列促進具有心營養素-1活性的肽從所述患者細胞中分泌。
23.權利要求22的方法，其中所述分泌核苷酸序列包含神經生長信號序列。
24.權利要求14的方法，其中所述施用步驟包括注射兩次或多次組合物，每次所述組合物具有心營養素活性，并且其中所述兩次或多次注射以至少約96小時的時間間隔分開。
25.組合物，包含a)心營養素-1或編碼心營養素-1的核苷酸序列，和；b)至少一種干細胞增殖、分化、或增殖和分化的調節劑，選自i)一種或多種Wnt多肽；ii)編碼一種或多種Wnt多肽的一種或多種核苷酸序列；iii)Pax7多肽；iv)編碼Pax7多肽的核苷酸序列；或其組合。
26.篩選增加被試者中細胞增殖的化合物的方法，包括；a)向屬于測試組的一個或多個被試者施用化合物；b)從所述一個或多個被試者的至少一種體液、組織或器官中分離多個細胞；c)將所述多個細胞進行FACS分析并定量具有一種或多種明確特征的細胞數目；和d)將具有一種或多種明確特征的細胞數目與從一個或多個對照被試者獲得的結果作比較。
27.篩選增加被試者中細胞增殖的化合物的方法，包括，a)從一個或多個被試者的至少一種體液、組織或器官中分離多個細胞，和任選的純化所述多個細胞，以富集一種或多種特定細胞群體；b)用化合物處理所述多個細胞或所述一種或多種富集的細胞群體；c)培養所述細胞或細胞群體一段時間，使得足以允許所述細胞或細胞群體增殖和/或分化；和d)將來自所述培養步驟的集落細胞數目與從一個或多個對照中獲得的結果作比較。
全文摘要
提供促進干細胞增殖的方法，包括將所述細胞與心營養素－1(CT－1)接觸。所述方法還可以包括將所述干細胞與一種或更多種促進所述干細胞分化的干細胞調節劑接觸。也提供抑制干細胞增殖的方法，包括將所述細胞與一種或更多種CT－1抑制劑接觸。所述方法可用于體外和體內促進或抑制干細胞增殖。也提供所述方法在替代損傷或缺陷組織或在抑制不適當細胞增殖的治療性應用。
文檔編號C07K14/54GK1812996SQ200480017889
公開日2006年8月2日 申請日期2004年6月25日 優先權日2003年6月25日
發明者林恩·梅吉尼 申請人:渥太華健康研究所