指導目的多肽在鱗翅目昆蟲后產絲腺中表達的核酸及其應用的制作方法

專利名稱：指導目的多肽在鱗翅目昆蟲后產絲腺中表達的核酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及工業目的蛋白質的合成和分泌，如用于紡織品中的纖維狀蛋白質，具體而言是具有生物醫學用途的新的絲或蛋白質。涉及目的多核苷酸和/或多肽在某些動物組織并且更確切地在家蠶(Bombyx mori)的產絲腺中的特異靶向表達。根據本發明，蠶的產絲腺可以用作能夠產生大量蛋白質并將其輸出到絲繭的“生物反應器”，可以從絲繭中純化這些蛋白質。
現有技術已經存在多種產生用于紡織品的纖維狀蛋白質的方法，例如通過轉基因山羊的乳腺產生蜘蛛絲纖維蛋白質的方法(Nexis Biotechnologies，Inc.1000 St-Charles Avenue，Bloc B，Vaudreuil-Dorion，QC，J7V 8PV，加拿大)。然而這些方法不能夠使纖維狀蛋白質組織成線的形式。至于有生物醫學用途的可溶性蛋白質的生產，一些已知的蛋白質的生產意味著進行細菌培養、細胞系培養或者脊椎動物如奶牛、山羊或者甚至轉基因兔的養殖。重組蛋白質的該種類型生產是十分昂貴的。另一方面，當使用脊椎動物系統合成重組蛋白質時，它們的工業用途特別是在食品或醫藥上的用途必然要涉及到預先證實這些蛋白質或包含它們的組合物是不含能夠傳遞給人類的致病污染物的。
考慮到重組蛋白質生產的重要經濟作用，在技術領域內存在對新方法的需求，所述方法即用于大量低成本并且使用與人類物種足夠遙遠的生物體生產重組蛋白質的方法，所述生物體能夠避免污染問題，主要是當蛋白質是用于生物醫學目的時。還存在對生產重組蛋白質的新方法的需求，當所述重組蛋白質是纖維狀時，所述新方法使得可以以線的形式組織所述蛋白質。為了得到高產量，蛋白質必須在組織中特異合成并且輸出到動物，優選無脊椎動物的外部。
然而，據申請人所知，還沒有無脊椎動物能夠對上述需求做出反應。例如，轉基因家蠶是眾所周知的(Tamara等，Germline transformation ofthe silkworm Bombyx mori L.using a piggyBac transposon derived vector.Nature Biotechnology 18卷，2000)，然而利用該方法還不能使重組蛋白質大量生產成為可能。
因此，申請人致力于研發具體而言能夠克服先前已知系統安全但是高成本缺點的表達系統。
發明概述現在本發明提供了該類型的重組蛋白質表達系統。
本發明涉及指導目的蛋白質在家蠶后產絲腺細胞中特異表達的核酸，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸與序列SEQ ID № 1中核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸在核苷酸上存在至少90％的同一性并且其中序列SEQ ID № 1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
本發明還涉及包含處于上文定義的核酸控制之下的目的多核苷酸的表達盒，目的多核苷酸是編碼多肽的有義多核苷酸。
本發明還涉及包含上文定義的核酸或表達盒的重組整合載體以及通過在其基因組中整合所述核酸或所述表達盒而受到修飾的宿主細胞。此外，本發明的目的是上文定義的核酸、表達盒、重組載體或者重組宿主細胞在得到轉基因非人動物中的用途。
本發明還涉及得到通過在其基因組中整合上文定義的核酸、表達盒、重組載體或者重組宿主細胞而受到修飾的轉基因非人動物的方法。
本發明還涉及指導能夠降低絲心蛋白H合成的目的RNA在家蠶的后產絲腺細胞中特異表達的核酸，所述核酸包含含有用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區，所述核酸與序列SEQ ID № 1的核苷酸1150至核苷酸1452的多核苷酸具有至少90％的核苷酸同一性。
在標題為“本發明的補充核酸”的部分更加詳細地描述諸如上述的核酸的核酸。
發明詳述根據本發明，已知核酸包含(i)包含SGF1“叉頭(forkhead)”型轉錄因子的靶核苷酸基序的至少一個拷貝，和適當的轉錄啟動子位點的調節區和(ii)編碼經修飾的信號肽的區域，所述區域被置于所述調節區的控制之下，當編碼目的蛋白質的核苷酸序列與編碼所述經修飾的信號肽的核苷酸序列在“同相”融合時，所述核酸能夠指導目的蛋白質在鱗翅目昆蟲家蠶的后產絲細胞內特異合成。
根據本發明，當位于編碼經修飾信號肽的序列的最后一個密碼子的3′末端的核苷酸在位于編碼目的蛋白質的序列的第一個密碼子的5′末端的核苷酸之前時，編碼目的蛋白質的核苷酸序列與編碼所述經修飾信號肽的核苷酸序列是“同相”融合的。
令人驚奇地是，申請人已經指出將存在于絲線纖維的前蛋白質原fibrohexamerin信號肽中的半胱氨酸的密碼子用疏水氨基酸例如丙氨酸、異亮氨酸或甚至亮氨酸替換能夠使與所述經修飾信號肽融合的蛋白質作為絲線的組成性蛋白質輸出到家蠶產絲腺之外。
本發明的目的涉及指導目的蛋白質在家蠶后產絲腺細胞特異表達的核酸，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸與序列SEQ ID № 1中的核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸在核苷酸上具有至少90％的同一性并且其中序列SEQ ID № 1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。優選地，本發明的任何核酸和任何多肽以分離的或純化的形式存在的。
在本發明的含義中術語“分離的”定義為從其最初環境(其天然發現的環境)中提取出來的生物材料。例如，以天然狀態存在于生物體的多核苷酸不是分離的。從天然插入到生物體基因組中的臨近核酸分開的相同多核苷酸是分離的。該種類型多核苷酸可以包含在載體中和/或此種多核苷酸可以包含在組合物中并且仍然保持分離狀態，這是因為載體或組合物不構成其天然環境。相同的推理還適用于從其天然環境提取的多肽。
術語“純化的”不要求材料以沒有其它化合物存在的絕對純的形式存在。它是個相對的定義。在原材料或者天然材料純化至少一個數量級，優選2個或3個并且優選4個或5個數量級后，多核苷酸或者多肽處于純化狀態。
對于本發明來說，詞語“核苷酸序列”可以不加區別地指多核苷酸或者核酸。詞語“核苷酸序列”包含遺傳物質本身并且因此不限于其序列相關的信息。術語“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”或者甚至“核苷酸序列”包括DNA、RNA、cDNA序列或者甚至不止一個核苷酸的雜合RNA/DNA序列，不論它們是單鏈形式或者雙鏈體形式。
術語“核苷酸”指天然核苷酸(A、T、G、C和U)。
對于本發明來說，當第一條核苷酸的每個堿基與方向相反的第二條多核苷酸的互補堿基配對時，認為第一條核苷酸與第二條核苷酸是“互補”的。互補的“堿基”是A和T(或者A和U)以及C和G。
根據本發明，與第二條參照核酸具有至少90％同一性的第一條核酸與所述第二條參照核酸在氨基酸水平上具有至少90％，優選地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.3％、98.6％、99％、99.6％的同一性。本發明含義中的兩條核酸序列之間的“同一性百分數”是通過對在最適比對下兩條序列進行比較確定的并且可以通過比較窗口觀察。
為了得到兩條序列之間的最適比對，在比較窗口中的核苷酸序列的部分相對于參考序列(它不包含插入或缺失)可以包含插入或缺失(例如“缺口”)。為了得到兩條序列之間的核苷酸的同一性百分數，通過確定在所比較的兩條序列中觀察到相同核堿基的位置數目，然后將兩個核堿基相同的位置的數目除以比較窗口中位置的總數，然后將結果乘以100來計算同一性百分數。
使用計算機方法通過眾所周知的算法可以對所比較的序列進行最適比對。
以更加優選的方式，使用CLUSTAL W軟件(版本1.82)采用下面的設置來確定序列的同一性百分數(1)CPU模式＝ClustalW mp；(2)比對＝《全》；(3)輸出格式＝《aln w/數目》；(4)輸出次序＝《對齊的》；(5)彩色比對＝《不》；(6)KTUP(字大小)＝《缺省》；(7)窗口長度＝《缺省》；(8)分值類型＝《百分數》；(9)TOPDIAG＝《缺省》；(10)配對缺口＝《缺省》；(11)系統發生樹/樹類型＝《無》；(12)矩陣＝《缺省》；(13)缺口打開＝《缺省》；(14)結束缺口＝《缺省》；(15)缺口延伸《缺省》；(16)缺口距離＝《缺省》；(17)樹類型＝《進化樹》和(18)樹RAP距離＝《隱藏》。
與本發明核酸具有至少90％核苷酸同一性的核酸包含本發明核酸的“變體”。
本發明核酸的“變體”定義為相對于參考核酸有一個或多個核苷酸替代、加入或缺失而與參考核酸不同的核酸。本發明核酸的變體可以是天然來源的例如天然存在的等位基因變體。此種核酸變體也可以是例如通過誘變方法得到的非天然的核酸。
通常，通過參考核酸和變體核酸具有十分相似的核苷酸序列和許多相同的區域這種方式使得參考核酸和變體核酸之間的差別降低了。
本發明的調節子核酸變體包含與序列SEQ ID № 1中核苷酸1379到核苷酸1390的區域具有100％核苷酸同一性的全部核苷酸序列。此外，本發明的調節核酸變體的三核苷酸對應著序列SEQ ID № 1中核苷酸1486到核苷酸1488的三核苷酸并且編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
因此，在本發明調節子核酸中，序列SEQ ID № l的從核苷酸1486到核苷酸1488的三核苷酸可以選自下面的三核苷酸(i)下面的編碼氨基酸丙氨酸的三核苷酸GCU、GCT、GCC、GCA和GCG；(i)下面的編碼氨基酸異亮氨酸的三核苷酸AUU、ATT、AUC、ATC、AUA和ATA；和(iii)下面的編碼氨基酸亮氨酸的三核苷酸CUU、CTT、CUC、CTC、CUA、CTA、CUG、和CTG。
本發明的調節核酸的變體保存了指導特定目的多核苷酸在鱗翅昆蟲后產絲腺細胞內表達的能力。為了證實本發明核酸“變體”，包括與序列SEQ ID № 1具有90％核苷酸同一性的核酸的功能特征，本領域技術人員能夠實現在實例中描述的報告子或標記基因的特異表達測試。
在本發明含義中的“目的多核苷酸”定義為能夠指導經修飾的信號肽和目的多肽之間多肽融合合成的多核苷酸。
本發明的核酸包含具有啟動子功能的序列，所述啟動子構成了能夠指導目的多核苷酸在鱗翅昆蟲后產絲腺細胞內特異表達的調節信號。
對于本說明書，具有“啟動子”功能的核酸也叫做“啟動子”或甚至“啟動子序列”，包含具有RNA聚合酶識別基序和更加特別地是“TATA”盒和“CAAT”盒的核酸，它們的結構對于本領域專家是眾所周知的。
本發明已經顯示核酸序列SEQ ID № 1包含對于目的多核苷酸在家蠶后產絲腺細胞內特異表達所必需的調節序列。此種特異性在Tamura(Tamura等，Germline transformation of the silkworm Bombyxmori L.using a piggyBac transposon derived vector.Nature Biotechnology18卷，2000)描述的調節序列中沒有觀察到，其表達不限于家蠶后產絲腺細胞。本發明還顯示從5’末端到3’末端包含序列SEQ ID № 1的核苷酸1150到核苷酸2026的多核苷酸的核酸能夠指導目的多核苷酸在家蠶后產絲腺細胞內特異表達。
序列SEQ ID № 1包含，從5’末端到3’末端，從核苷酸1到核苷酸1451的fibrohexamerin基因的啟動子。該啟動子包含位于序列SEQ ID №1中第1420位核苷酸到第1423位核苷酸的“TATA”盒。該啟動子還包含位于序列SEQ ID № 1中第1252位核苷酸遠到第1365位核苷酸的“CAAT”盒。因此該啟動子序列包含位于序列SEQ ID № 1中第1397位核苷酸到第1390位核苷酸的序列《TATTTATTTAA》。TATA盒組成了啟動子元件本身，它通常位于距轉錄起始位點大約30個堿基的地方。CAAT盒是一個通常在啟動子和激活子區域(“增強子”)中發現的順式作用元件。序列SEQID № 1包含第1452位核苷酸到1525位核苷酸的編碼經修改的信號肽的fibrohexamerin外顯子1。
序列SEQ ID № 1包含第1526位核苷酸到2026位核苷酸的fibrohexamerin內含子1。序列SEQ ID № 1包含第2027位核苷酸到2040位核苷酸的多核苷酸。后一多核苷酸對于本發明是不必需的并且僅僅是有利于包含在第2041位核苷酸和第2721位核苷酸的額外的編碼報告子蛋白質“Ds-Red”核苷酸的序列SEQ ID № 1的構建。
本發明的另一個目的是包含(i)序列SEQ ID № 1第1位核苷酸遠到第1451位核苷酸的調節區域或者含有如上文所定義的TATA、CAAT盒和至少一個《CTATTTATTTAA》序列的該核酸的生物活性片段和(ii)編碼置于此種核酸控制之下的經修飾的信號肽的區域的核酸。
本發明已經顯示如上文所定義fibrohexamerin的外顯子1具有序列SEQ ID № 1中第1486位到1488位的三核苷酸是修飾的，以致于由目的多核苷酸編碼的多肽的選擇是正確的；并且以致于由目的多核苷酸編碼的多肽能夠與絲線一起分泌。序列SEQ ID № 1編碼半胱氨酸的第1486至1488位三核苷酸必須修飾成編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸的三核苷酸。由于對包含序列SEQ ID № 1中全體或大多數限制性部分的DNA構建的完成，本發明已經表明本發明的核酸使得特異地指導目的多核苷酸在家蠶后產絲腺細胞內表達成為可能。Ds-Red報告子基因的存在使得可以證明fibrohexamerin外顯子1的修飾使得可以得到由目的多核苷酸編碼的多肽的正確分泌。
表達盒包含編碼報告子基因即Ds-Red蛋白質基因的目的多核苷酸，該表達盒被置于如上文所定義的包含特異組織調節信號、經修飾的fibrohexamerin的外顯子1、fibrohexamerin內含子1的全部和具有啟動子功能的調節核酸的控制之下。
這些表達盒被用于轉化家蠶的細胞，更加精確地是使用轉基因動物的配子前體，之后報告基因在動物的不同組織進行了表達。結果表明對于在家蠶后產絲腺細胞的特異組織轉錄和強表達活性所必需的調節信號包含在特別是序列SEQ ID № 1核苷酸1150到核苷酸2026的區域內。
更加精確地說，本發明已經表明該區域包含位于序列SEQ ID № 1的第1379位核苷酸至第1390位核苷酸的基序《CTATTTATTTAA》(序列SEQ ID № 2)。該基序組成了SGF1叉頭類型轉錄因子的結合位點(Julien，E-，Bordeaux，M.C.，Garel，A.和Couble，P.(2002)Fork head alternativebinding drives stage specific expression in the silk gland of Bombyx mori.Insect Biochem Molecul.Biol.32，377-387.)。
不愿受任何理論所束縛，發明人相信基序《CTATTTATTTAA》組成了本發明核酸的重要結構特征，其具有轉錄序列激活子功能(“增強子”)和特異組織表達調節子功能。
根據本發明，在fibrohexamerin啟動子內天然包含的基序上游的新的基序“CTATTTATTTAA”使得在不改變特異性的情況下增加由目的多核苷酸編碼的多肽的表達率是可能的。通過微注射進入動物的卵中使得piggyBac整合載體攜帶的DNA引入到家蠶基因組中，這使得以出乎意料的方式表明fibrohexamerin基因的外顯子1的修飾使得可以得到的目的蛋白質的尋址(addressing)與該目的蛋白質以絲纖維分泌相容。換句話說，當目的多核苷酸與fibrohexamerin基因外顯子1的3’末端在同相位融合時，編碼經修飾的信號肽的該基因外顯子1的修飾使得目的蛋白質可能同fibrohexamerin一樣保留著分泌性。
根據本發明，序列SEQ ID № 10或者SEQ ID № 11的基序可以整合到fibrohexamerin的啟動子上以致于二聚體化《CTATTTATTTAA》基序并且因此在不改變特異性的條件下提高目的多核苷酸編碼的多肽的表達率。序列SEQ ID № 10和SEQ ID № 11每一個都包含上文已經敘述的處于天然核苷酸環境中的《CTATTTATTTAA》基序。
其它表達激活子序列，不論同源還是異源，都可以整合到fibrohexamerin啟動子中。作為實例，人們可以引用本領域技術人員已知的相應于酵母Gal4/UAS系統的序列并且不進行詳細描述。人們還提及對應于蠶胞質肌動蛋白基因的擴增子(Mange A.Julien E.Prudhomme JC.和Couble P.A strong inhibitory element down-regulates BRE-stimulatedtranscription of the A3 cytoplasmic actin genes f Bombyx mori.J Mol Biol.1997 1月24；265(3)266-74.Fatyol K.，Illes K.和Szalay A.A.Analternative intronic promoter of the Bombyx A3 cytoplasmic actin geneexhibits a high level of transcriptional activity in mammalian cells；MolGen Genet.19993月.261(2)337-45)。最后，人們可以提及對應于桿狀病毒IE1/Hr5或者Hr3的擴增子系統(Lu M.，Farrell P.J.，Johnson R.和latrou K.J Biol Chem.1997 12月5；272(49)30724-8)。
本發明的調節核酸本發明的目的涉及指導目的蛋白質在家蠶后產絲腺細胞特異表達的核酸，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸與序列SEQ ID № 1中的核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸在核苷酸上存在至少90％的同一性并且其中序列SEQ ID № 1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸可以編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
根據第一個實施方案，具體而言是根據上面提到的核酸，所述核酸的特征在于它從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID № 1的核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸并且其中序列SEQ ID № 1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸可以編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
根據上述核酸的第二個實施方案，所述核酸的特征在于它從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID № 1的核苷酸1至核苷酸2026的多核苷酸并且其中序列SEQ ID № 1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸可以編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
根據第三個特定的實施方案，本發明的核酸包含如上文所描述的核酸，其中所述核酸通過在序列SEQ ID № 1核苷酸1和1379之間導入至少一個并少于4個拷貝的序列SEQ ID № 2多核苷酸進行修飾。為了引入序列SEQ ID № 2多核苷酸的一個拷貝，人們可以將序列SEQ ID № 10或者SEQ ID № 11插入到序列SEQ ID № 1的核苷酸1和1379并且特別是核苷酸1378和1379之間。本發明還涉及其序列與上文所定義的任何一條核酸互補的核酸。
如已陳述，本發明的目的之一是得到由目的多核苷酸所編碼的多肽在家蠶后產絲細胞內的高速表達。
此外，本發明的目的是包含編碼目的多肽的目的多核苷酸的核酸，其與本說明書所定義的指導目的多肽特異地在家蠶后產絲細胞表達的調節子核酸相融合。對于本發明，將此種包含編碼目的多肽的多核苷酸的核酸命名為“表達盒”。
此外，本發明的目的是包含處于如上文所定義的調節子核酸控制之下的目的多核苷酸的表達盒。
本發明的表達盒根據第一個實施方案，本發明的表達盒的特征在于其所包含的目的多核苷酸編碼多肽。
備選地，目的多核苷酸可以編碼融合多肽，所述融合多肽從N-末端至C-末端包含-絲心蛋白L多肽序列的至少172個N-末端氨基酸(Tanaka K.，Kajiyama N.，Ishikura K.，Waga 5.，I ikuchi A，Ohtomo K.，TakagiT.和Mizuno S，Determination of the site of disulfide linkagebetween heavy and light chains of silk fibroin produced byBombyx mori.Biochimica et Biophysica Anta 1432(1999)92-103))，和-目的多肽。
優選地，目的多肽選自例如蜘蛛的蛛絲蛋白(蜘蛛屬(Nephila))、Galleria絲心蛋白或者更加一般地能夠絲纖維的任何其他多肽，例如，所述絲纖維的延展性強度或者彈性特性受到修飾。
目的多核苷酸還可以編碼具有生物醫學目的的可溶性多肽，例如激素、抗原、酶、生長因子甚至受體。
具體而言，目的多核苷酸可以編碼人白細胞介素2。
本發明的表達盒可以在一端或者每一端由絕緣子包圍著，所述絕緣子旨在使得目的多核苷酸不論整合在何位置均能表達。作為絕緣子的適宜，可以提及果蠅(Drosophila)的gypsy絕緣子(Gerasimova T.I.和Corces V.G.Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of achromatin Insulator.Cell 1998，92511-521)、scs/scs’(Kellum R.和SchedlP.1991 A position effect assay for boundaries of higher orderchromosomal domains.Cell 64941-950)或者甚至雞β珠蛋白基因的5’HS4絕緣子(Chung J.H.，Bell A.c.和Felsenfeld G.(1997)Characterization ofthe chicken beta-globin insulator.Proc.Nat.Acad.Sci，USA 94575-580)。
本發明的重組載體本發明涉及含有如上文定義的調節子核酸或者表達盒的重組整合載體。因此本發明包含重組載體，其中已經插入包含調節信號的本發明的調節子核酸，該調節子核酸使得當將該多核苷酸置于其控制之下時目的多核苷酸特異地在家蠶后產絲腺細胞中表達成為可能。
本發明的部分還包括重組整合載體，其包含a)如本發明說明書所定義的調節子核酸，和b)置于a)中定義的調節子核酸控制之下的目的多核苷酸。
目的多核苷酸包含編碼可檢測多肽或者標記多肽，例如編碼Ds-Red蛋白質的多肽的多核苷酸。
與上面定義相對應的本發明的重組整合載體是2003年2月20日保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur)的國立微生物保藏中心(CNCM)的保藏號為CNCM I-2975的Pig fhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)。
本發明還涉及包含如上所述重組整合載體的核苷酸序列的重組克隆載體。
為了得到本發明的任意一種調節序列，可以利用實例中所描述的技術和引物。
本領域專家還可以利用2003年2月20日保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)的保藏號為CNCM I-2975的Pig fhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)本發明重組載體的一般特征在本發明的意思中“載體”定義為任選地為單鏈或雙鏈形式的環狀DNA或RNA分子。根據本發明的載體可以是克隆載體或者整合載體。
根據本發明的一個優選的實施方案，本發明的重組載體是能夠將該載體中的DNA序列的拷貝插入到家蠶物種的動物基因組中的整合載體。
有利地，重組載體或者，在其它情況下，載體中包含的表達盒也可以包含已知作為“終止子”的非翻譯3’序列。能夠用于本發明構建中的終止子當中，可以提及SV40多腺苷酸化序列。本發明優選的整合載體是從粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)得到的在該物種中以天然狀態存在的piggyBac轉座子(Cary，L，C，等，Transposon mutagenesis of baculovirusesanalysis ofTrichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FF-locus of nuclearpolyhedrosis viruses，Virology 172，156-69(1989))。
piggyBac轉座子包含能夠基于轉座從基因組的一個基因座移動到另一個部分的DNA片段。piggyBac轉座子包含右和左“足”，所述右和左“足”包含兩個短的反向重復序列，其與編碼其移動功能的基因在同一讀框內。
本發明描述的整合載體是經過修飾的piggyBac轉座子，其中目的核酸取代了編碼已經被去除的轉座子移動功能的基因的一部分。
整合載體可以與輔助載體聯合使用，所述輔助載體能夠使在整合載體中受到抑制的移動基因表達。整合載體與輔助載體結合可以基于轉座將本發明的核酸或者表達盒整合到宿主細胞的基因組中。
本發明的整合載體還可以來自果蠅的Hobo元件或者果蠅的minos轉座子。
根據另一個實施方案，使用了重組克隆載體以便擴增如上文所描述的整合載體的核苷酸序列。根據另一個實施方案，上述的重組整合載體在線性化后插入接受載體的克隆位點或所述接受載體的多位點被線性化。所使用的克隆載體是細菌或病毒來源的。這些載體為例如PUC、pBR或pSK型質粒，它們是本領域專家公知的但不用進行詳細描述。
本發明的重組宿主細胞為了使處于本發明調節子核酸控制之下的目的多核苷酸能夠表達，在本說明書中定義的調節子核酸、表達盒或者甚至重組載體必須導入到宿主細胞中。使用本領域專家眾所周知的方法，可以在體外(in vitro)將本發明的多核苷酸導入到宿主細胞。“包含核酸的宿主細胞”定義為具有整合到其基因組中核酸的一個或多個拷貝的細胞。
此外，本發明的另一目的是包含上文所定義的調節子核酸、表達盒或者甚至重組載體的宿主細胞。該宿主細胞優選地是屬于蠶蛾屬(Bombyx)，更加優選地是家蠶種的動物細胞，而不考慮株系。宿主細胞還可以是屬于其它鱗翅目昆蟲物物種，例如樗蠶(Philosamia cynthia)或者更一般為蠶蛾屬、柞蠶屬(Antheraea)、蠟螟屬(Galleria)、樗蠶屬(Philosamia)、灰翅夜蛾屬(Spodoptera)或者果蠅屬的動物細胞。
更加優選地，本發明的宿主細胞包括家蠶后產絲腺細胞。
本發明的轉基因動物此外，本發明的目的是如上文所定義的核酸、表達盒、載體或者重組宿主細胞在得到產絲的蠶蛾屬轉基因非人動物中的用途。
優選地，所述轉基因動物屬于家蠶種并且以絲纖維形式分泌目的蛋白質。本發明還涉及包含上文所定義的一種或多種宿主細胞、表達盒或者甚至重組載體的多細胞轉基因生物體。本發明的進一步的目的是轉基因非人動物，其包含其基因組中整合形式的本說明書所定義的核酸或者表達盒。
通常，本發明還涉及上文所定義的調節子核酸、表達盒、重組載體或者甚至宿主細胞在得到轉基因動物中的用途。
本發明還涉及絲心蛋白L分泌缺陷的轉基因非人動物，其包含整合入其基因組形式的表達盒，所述表達盒包含編碼融合多肽的目的多核苷酸，其中所述融合多肽從N-末端至C-末端包含-絲心蛋白L多肽序列的至少172個N-末端氨基酸，和-目的多肽。
絲心蛋白L缺陷蠶是已知的。作為實例可以提及Nd-s或者Nd-sD突變體(Kazuyuki Mori，Kazunori Tanaka，Yoshimi Kikuchi，Miho Waga，Shou Wage和Shigeki Mizunoproduction of a chimeric fibroin light-chainpolypeptide in a fibroin secretion-deficient naked pupa mutant of thesilkworm Bombyx mori.J.Mol.Biol.(1995)251，217-228.)。
雖然如此，本領域技術人員可以借助于基因工程的常規技術來提供絲心蛋白L缺陷的動物。
作為實例，希望實現絲心蛋白L缺陷的動物的本領域技術人員可以在蠶絲中產生誘變，接著篩選絲心蛋白L缺陷的動物。誘變可以是使用UV的經典誘變或者化學誘變或者甚至絲心蛋白L基因的定點誘變。
通過對繭進行RNA印跡或者蛋白質印跡實現對絲心蛋白L缺陷的動物的篩選。
備選地，本領域技術人員應該認識到還可以用RNA干擾技術來產生絲心蛋白L缺陷的動物。通常，由產絲腺(分泌腺)后室產生的絲心蛋白是三種不同多肽重鏈(絲心蛋白H)、輕鏈(絲心蛋白L)和fibrohexamerin的復合物。
通過二硫鍵連接絲心蛋白H和絲心蛋白L對于將絲心蛋白分泌至腺腔是必需的。通過突變體純合子Nd-s或者Nd-sD產生的絲心蛋白L的C-區域與野生型產生的不同并且該突變絲心蛋白L不能夠與絲心蛋白H形成二硫鍵(由于包含參與二硫鍵的半胱氨酸的外顯子的內含子重組而消除二硫鍵這一事實)。該分泌缺陷不改變動物的生存力但是導致突變體蠶分泌腺的發育延緩和產生非常細的基本上由絲膠蛋白組成的繭(與正常繭相比絲心蛋白少于0.3％)。
因此，本發明涉及絲心蛋白L分泌缺陷的轉基因非人動物，其包含整合入其基因組形式的表達盒，所述表達盒包含編碼融合多肽的目的多核苷酸，其中所述融合多肽從N-末端至C-末端包含-絲心蛋白L多肽序列的至少172個N-末端氨基酸，和-目的多肽。
本發明的特定實施方案使得可得到轉基因動物，在所述轉基因動物中，所產生的目的蛋白質的量是受融合多肽中絲心蛋白L的部分的存在和動物天然產生的絲心蛋白L的缺少的控制。
本發明的轉基因動物優選地屬于上面已經列出的關于本發明動物宿主細胞起源的種和屬。此外，本發明的目的是包含目的蛋白質的繭，其中目的蛋白質的表達是由上述核酸、表達盒或者載體指導的并且其中目的蛋白質以超過5ng/mg繭并且優選地大于70ng/mg繭的濃度存在。
按照實施例7所描述的方法通過本發明的轉基因動物已經產生包含1-10μg白細胞介素-2的141mg繭。
另一目的是得到家蠶種的轉基因動物的方法，其特征在于包含下述步驟
a)在產卵后1-5小時后囊胚層形成之前對卵注射上文所述核酸、表達盒或者載體；b)選擇基因組中整合如本描述所定義的核酸或者表達盒的轉基因動物。
本發明的另一目的是得到家蠶種的轉基因動物的方法，其特征在于包含下述附加步驟c)將在步驟b)中得到的兩個轉基因動物雜交；d)選擇轉基因的純合子動物。
本發明的另一目的是得到絲纖維的方法，其特征在于包含下面的步驟a)飼養如本說明書所定義的轉基因動物；b)回收轉基因動物產生的絲。
本發明的另一目的是得到目的蛋白質的方法，其特征在于包含下面的步驟a)飼養如本說明書所定義的轉基因動物；b)回收轉基因動物產生的絲；c)從絲纖維中回收目的蛋白質。
本發明的補充核酸本發明還涉及指導降低絲心蛋白H合成的目的RNA在家蠶后產絲腺細胞內特異表達的核酸，其中所述核酸包含含有用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區，所述核酸與序列SEQ ID № 1的核苷酸1150至核苷酸1451的多核苷酸具有至少90％的同一性。
該類型核酸相應于在說明書的第一部分給出的一組一般定義并且具體而言相應于兩條序列之間同一性百分數的定義。
產絲腺細胞產生外源性蛋白質的成功尤其與該蛋白質動員用于其合成的蛋白質合成作用相關。
優化外來蛋白質表達速率的一種方式是降低一種絲蛋白質的表達。其中，僅絲心蛋白H就占產絲腺產生的蛋白質的80％并且是絲的主要蛋白質。由于其結構，它負責絲纖維的理化和機械特性強度、彈性、不溶解性。
該蛋白質的除去和用目的蛋白質例如蛛絲蛋白、絲心蛋白H Galleria或者已經提到的其他目的蛋白質進行替換使得特別是能夠對絲纖維的特性進行改良并且因此產生新的生物材料。
為了穩定抑制(因此可傳遞給后代)在產絲腺后部分的絲心蛋白H基因，優選使用RNA干擾(iRNA)方法。在原核生物和真核生物中均證實的該似乎普遍的現象在于通過對外源雙鏈RNA做出反應而降解基因的mRNA而特異和有效抑制該基因。
所使用的目的RNA可以是能夠與絲心蛋白H的mRNA配對以形成雙鏈RNA的siRNA類型(小干擾RNA)的RNA或者是能夠不與絲心蛋白H的信使RNA配對而形成雙鏈RNA的shRNA(小發夾RNA)。
優選地，編碼目的RNA的核苷酸序列是序列SEQ ID № 12。
序列SEQ ID № 12是由來源于絲心蛋白H基因的倒置和重復的核苷酸序列組成并且將在實施例9中更加詳細的討論。
如實施例9和

圖13所示，發明人發現用上文描述的核酸轉化家蠶能夠明顯降低絲心蛋白H的產生。該種蛋白質合成的降低是基于干擾RNA的原理的，通過將雙鏈RNA導入細胞觸發的轉錄后加工，其以序列特異方式導致基因失活或者“無效”。
依靠此種核酸能夠特異地降低絲心蛋白H的產生，而不影響進入絲纖維成份的其他蛋白質的產生。
無意于受特定理論的束縛，發明人相信目的RNA形成發夾結構，能夠穩定RNA聚合酶并因此降低絲心蛋白H的合成。
家蠶絲心蛋白H合成速率的降低在本發明上下文中產生了相當大的興趣。依靠上文剛剛描述的核酸，與指導目的多肽表達的那些核酸一起提供這樣的動物，其中細胞資源重定向于目的蛋白質合成。本發明的該實施方案完全滿足用于大量生產重組蛋白質的工業工具可用性的需要。轉基因動物包含幾種類型的核酸，例如上文所述那些核酸和在下文中更加詳細描述的核酸。優選地，本發明核酸包含含有用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區，所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID № 1的核苷酸1150至核苷酸1451的多核苷酸。
優選地，本發明核酸包含含有用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區，所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID№ 1的核苷酸1至核苷酸1451的多核苷酸。
本發明的另一目的是由諸如上文定義的核酸組成的核酸，所述核酸通過在序列SEQ ID № 1的核苷酸1和1379之間導入具有序列SEQ ID № 2的多核苷酸的至少一個并且不多于四個拷貝而受到修飾。
本發明還涉及具有與諸如上文描述的核酸互補的序列的核酸。
本發明的補充表達盒本發明還涉及包含編碼目的RNA并且置于如上文所描述的核酸控制之下的核酸的表達盒。
優選地，目的RNA是由具有序列SEQ ID № 12的核酸編碼的。
本發明的表達盒一端的或者每一端由絕緣子包圍著，該絕緣子旨在不論該表達盒整合在何位置都能使目的多核苷酸表達。作為絕緣子的實例，可以提及果蠅的gypsy絕緣子(Gerasimova T.I.和Corces V.G.Polycomband trithorax group proteins mediate the function of a chromatininsulator，Cell 1998，92511-521)、scs/scs′(Kellum R.和Schedl P.1991 Aposition effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains.Cell 64941-960)或者甚至雞β珠蛋白基因5′H S4絕緣子(Chung J.H.，BellA.c.和Felsenfeld G.(1997)Characterisation of the chicken beta-globininsulator.Proc.Nat.Acad.Sci，USA 94575-580)。
本發明的補充載體本發明的另一個目的是包含上文所述核酸或表達盒的重組整合載體。
因此本發明包括重組載體，其中已經插入本發明的包含調節信號的調節子核酸，當編碼目的RNA的核酸處于所述調節子核酸控制之下時，能夠降低絲心蛋白H合成的目的RNA在家蠶后產絲腺細胞內特異表達。本發明還包括包含以下部分的重組整合載體a)如上文所定義的調節子核酸，和
b)處于a)定義的調節子核酸控制之下的編碼目的RNA的核酸。
本發明的重組整合載體對應于在標題為“本發明重組載體的一般特征”的部分中描述的載體的一般定義。
本發明還涉及包含如上所述重組整合載體核苷酸序列的重組克隆載體。
為了得到任意一種本發明的調節序列，可以使用實例中描述的技術和引物。本領域專家只是用指導能夠降低絲心蛋白H合成的目的RNA合成的序列替換指導DS-red蛋白質合成的核酸序列。
本發明重組宿主細胞為了使上述定義的處于調節子核酸控制之下的能夠降低絲心蛋白H合成的RNA進行表達，必須將上文定義的調節子核酸、表達盒或者甚至重組載體導入宿主細胞。
使用本領域技術人員眾所周知的方法能夠在體外將本發明的多核苷酸導入宿主細胞。“包含核酸的宿主細胞”定義為在其基因組中整合核酸的一個或者多個拷貝的細胞。
此外，本發明另一目的是包含上文所定義的調節子核酸、表達盒或者甚至重組載體的宿主細胞。
該宿主細胞優選地是蠶蛾屬，更加具體地是家蠶種而不考慮其株系的動物細胞。宿主細胞還可以是屬于另一鱗翅目昆蟲物種，例如樗蠶或者更加一般地為蠶蛾屬、柞蠶屬、蠟螟屬、樗蠶屬、灰翅夜蛾屬或者果蠅屬動物的細胞。
更加優選地，本發明的宿主細胞包括家蠶后產絲腺細胞。
本發明的補充轉基因動物進一步，本發明的目的是如上文定義的核酸、表達盒、載體在得到蠶蛾屬轉基因動物中的用途。
優選地，所述轉基因動物屬于家蠶種并且以絲纖維分泌目的蛋白質。
本發明還涉及包含如上文所定義的一個和多個宿主細胞、表達盒或者甚至重組載體的多細胞非人轉基因生物。
進一步，本發明的目的是非人轉基因動物，其含有以整合入其基因組的形式的下面部分(i.)在說明書的第一部分描述的能夠指導目的蛋白質表達和分泌的核酸、表達盒或者載體和(ii.)在說明書的第二部分定義的指導能夠降低絲心蛋白H合成的RNA合成的核酸、表達盒或者載體。
如上所述轉基因動物的可得性具有重要的工業利益。實際上，在此種動物中，絲心蛋白H合成的降低能夠使細胞內的資源重定向于目的蛋白質的合成而沒有因此影響絲纖維的分泌。本發明的實施方案完全滿足用于大量生產重組蛋白質的工業工具可得性的需要。
本發明還涉及非人轉基因動物(i.)絲心蛋白L的分泌缺陷，(ii.)包含整合到其基因組的形式的能夠指導絲心蛋白L多肽序列至少172個N-末端氨基酸與目的肽的融合蛋白質表達的表達盒，和(iii.)在說明書的第二部分定義的指導能夠降低絲心蛋白H合成的RNA合成的核酸、表達盒或者載體。
本發明的該具體實施方案提供了具有與本發明相關的一組優勢的轉基因動物；換句話說就是其中所生產的目的蛋白質的量是受控制的并且其中細胞資源轉向目的蛋白質合成的動物。因此，本發明提供了用于以降低的成本大規模生產重組蛋白質的直接可利用的工業工具。
通常，本發明還涉及如上文所定義的調節子核酸、表達盒、重組載體或者甚至宿主細胞在得到非人轉基因動物中的用途。
關于本發明動物宿主細胞的來源，上文描述的轉基因動物優選地屬于上面已經列出的種和屬。
根據與在說明書第一部分描述的那些方法相同的方法，可以得到上文描述的轉基因動物。
為了能夠容易地區分包含至少一種如本申請描述的核酸的動物，發明人還開發出下面描述的一組引物。
有義引物包含5’末端相當于編碼丙氨酸、異亮氨酸或者亮氨酸核苷酸的三個核苷酸。
通過任意方法選擇反義引物，因為它在3’互補鏈上與有義引物雜交。
在聚合酶鏈式反應(PCR)中借助于引物在嚴格的可控制條件下進行，這能夠使只擴增包含半胱氨酸突變成丙氨酸、異亮氨酸或者亮氨酸的DNA序列。
相應地，轉基因動物可以通過在DNA印跡中出現在野生型動物中不出現的條帶來進行表征。
還可以使用序列SEQ ID № 13和SEQ ID № 14來擴增核苷酸序列，然后使用上文所定義的探針檢測所擴增的產物中存在或缺乏突變的半胱氨酸殘基。
此外，本發明通過附圖和下面的實施例闡明本發明，這些附圖和下面的實施例絕不限制本發明，其中圖1表示構建本發明載體的方案；圖2表示在編碼firbrohexamerin的基因信號肽中用異亮氨酸密碼子替換半胱氨酸密碼子的方案；圖3表示通過加入序列SEQ ID № 2的多核苷酸的3個拷貝修飾firbrohexamerin的啟動子的方案；圖4圖示序列SEQ ID № 3；圖5表示處于本發明核酸控制之下的Ds-Red蛋白質的特異組織積累；圖6表示在蠶的產絲腺中檢測到處于本發明核酸控制之下的Ds-Red蛋白質；圖7表示處于本發明核酸控制之下的Ds-Red蛋白質在絲纖維中的特異積累；圖8表示在蠶繭中檢測到處于本發明核酸控制之下的Ds-Red蛋白質；圖9表示使用掃描電子顯微鏡觀察纖維可見在纖維表面有Ds-Red蛋白質存在；所述蛋白質表現為包被著纖維的大小可變(取決于聚集物的數目)的球狀顆粒；圖10表示檢測轉基因雜合蠶的繭中處于本發明核酸控制之下的IL-2蛋白質；圖11表示檢測雜合轉基因蠶產絲腺(A)和繭(B)中處于本發明核酸控制之下的大蠟螟(Galleria mellonella)絲心蛋白H蛋白質；圖12表示構建包含指導能夠降低絲心蛋白H合成的RNA表達的核酸載體的方法；圖13表示使用圖12所表示的載體轉化的動物中絲心蛋白H合成的降低。
實施例在實施例中通常使用的一般材料和方法A)材料所使用的動物屬于來自UnitéNationale Séricole(25 quaiJean-Jacques Rousseau，69350，La Mulatière，法國)的家蠶種Nistari株。它是發育中沒有胚胎滯育的多化性株。
用于克隆的細菌是來自INVITROGEN公司(參考號440097)的大腸桿菌(E.coli)DH5αTi Max.Efficiency。
B)方法*動物的飼養條件在“Animalerie A1”動物圈中，在根據幼蟲年齡設定的可變溫度下(22-25℃之間)和75％濕度的可控條件下飼養蠶。用在桑樹葉顆粒的基礎上制備的人工培養基飼養蠶。
*核酸的提取使用來源于Qiagen的Qiaprep Spin Miniprep(參考號27 106)從細菌中提取質粒構建體的DNA。使用苯酚-氯仿-異戊醇將蠶基因組DNA提取出來。
*轉基因動物的產生產卵后2-5小時后，囊胚層形成之前，向動物卵中注射整合載體。在含有5mM KCl的0.5mM磷酸緩沖液(pH7.0)中制備包含整合載體和等量“輔助”載體的溶液。使用Eppendorf微量注射器(Transjector 5246)，將1-5nL的該種溶液進行注射。然后通過注射形成的孔用膠(LoctiteSuperglue 3，Henkel France S.A.)封閉并且將卵置于25℃以便使卵繼續發育。
*轉基因動物的選擇借助于3xP3-GFP基因在動物的眼中早期表達篩選出具有Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)載體的轉基因動物。
*用于檢測Ds-Red蛋白質在轉基因動物中存在的檢測試驗在裝備有激發光(558nm)發射系統和在582nm處的發射光濾光器以及數字捕獲裝置的Leica熒光放大器(MZFL2)下原位(在產絲腺細胞)和在繭中顯現Ds-Red蛋白質。對于繭熒光的分析在干燥情況下進行。將經干燥的產絲腺置于少許PBS中在放大器下觀察。在發育的不同階段并且特別是在絲蛋白質大量合成時期的第5幼蟲期檢測Ds-Red蛋白質。
通過蛋白質印跡使用兩種抗體兔抗Ds-Red抗體(Clonetech，參考號8370-1)和偶聯過氧化物酶的山羊抗兔抗體(Biorad，參考號170-6515)對從產絲腺或者絲繭中提取的蛋白質進行檢測。
*通過蛋白質印跡用來源于產絲腺、繭和蠶繭衣的樣品實現對Ds-Red蛋白質的檢測試驗通過蛋白質印跡對Ds-Red蛋白質的檢測試驗包括幾步-蛋白質樣品的提取將第三個繭或者或者一對產絲腺(分泌器與儲存器分離)取出并轉移至微型管中。然后將繭破碎成小片或者將腺體在1mL 10M LiSCN中擠碎；然后將蛋白質提取物室溫孵育至少1小時同時用渦旋器定時攪拌。然后將蛋白質樣品用Tris緩沖液10mM-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/5稀釋。
將繭或者繭衣的外殼轉移至微型管中，向微型管中加入150μL H2O以清洗繭衣。通過將樣品超聲處理10分鐘回收可溶性的Ds-Red蛋白質。
在上樣之前，將蛋白質提取物在100℃下Laemmli 5x緩沖液中變性5分鐘制備樣品。
-電泳將蛋白質提取物上樣于預制凝膠上(INVITROGEN Novex Tris甘氨酸，10孔，1.0mm)。使用遷移緩沖液(INVITROGEN Novex SDS電泳緩沖液(10X))在120V，40mA電泳2小時30分鐘實現蛋白質的遷移。
-蛋白質轉移將蛋白質轉移至9cm×6cm的硝酸纖維素膜上(Hybond ECLAmersham Pharmacia)。所使用的whatman濾紙的大小為10cm×7.5cm。使用轉移緩沖液(InVitrogen Novex Tris甘氨酸轉移緩沖液(25X))在120V，250mA下進行1小時15分鐘將蛋白質轉移。
-用麗春紅對蛋白質染色為了使已轉移的蛋白質可見，用麗春紅(Sigma)孵育硝酸纖維素膜1分鐘。如有必要，用筆將大小標記條帶標記。
-膜的封閉在4℃下將膜在PLT(PBS-0.2％Tween-2％奶)中孵育過夜。
-用一級抗體孵育用PLT稀釋一級抗Ds-Red抗體(Living Color Dspeptide Clontech)至1/500并且在室溫下孵育2小時。孵育后用PBS-0.02％ tween洗滌2次5分鐘。
-用二級抗體孵育用PLT稀釋二級抗體(山羊抗兔IgG(H+L)，辣根過氧化物酶綴合物，Biorad)至1/3000并且在室溫下孵育1小時。孵育后用PBS-0.02％tween洗滌4次10分鐘。
-膜顯影溶液A(5mL Tris 100mM，pH8.5，22μL香豆酸和在黑暗中加入的50μl魯米諾)和溶液B(5mL Tris 100mM，pH8.5，3μL H2O2)。在黑暗中臨時制備溶液A和溶液B的混合物，然后將膜在A和B溶液中孵育顯影1分鐘。將膜在放射自顯影膠片上曝光約3分鐘并且在曝光后將膠片顯影。
實施例1包含置于本發明調節子核酸控制之下的含有編碼Ds-Red多肽的多核苷酸表達盒的整合載體的構建，尤其包含序列SEQ ID № 1一部分的表達盒的構建。
構建的第一步表示為圖1A。在該第一步中需要兩種質粒。
第一種質粒是Clonetech提供的pDsRed1-N1(參考號6921-1)，其從5’末端至3’末端包含-CMV IE啟動子；-Ds-Red基因；-SV40多腺苷酸化信號；-卡那霉素抗性基因；-pUC質粒復制起點。
通過AgeI和NotI限制性酶的核苷酸序列將Ds-Red蛋白質在其末端定界。
所使用的第二種質粒叫做pfhx(sp*)GFP，其從5’末端至3’末端包含-經修飾的fibrohexamerin啟動子；-編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因；-SV40多腺苷酸化信號；-卡那霉素抗性基因；-pUC質粒的復制起點。
如圖1A所表示，pfhx(sp*)GFP質粒也包含通過兩種限制性酶AgeI和NotI定界的、置于fibrohexamerin基因啟動子下游的核苷酸序列。將從pDSred1-N1得到的并且包含編碼Ds-Red蛋白質的序列的AgeI-NotI片段在AgeI-NotI序列位點克隆到pfhx(sp*)GFP質粒中。
從該克隆得到的質粒稱作pfhx(sp*)DsRed，示于圖1B并且其從5’末端至3’末端包含-經修飾的fibrohexamerin的啟動子；
-Ds-Red基因；-SV40多腺苷酸化信號；-卡那霉素抗性基因；-pUC質粒的復制起點。
如圖1B所示，經修飾的fibrohexamerin啟動子和Ds-Red基因包含于通過BglII和NaeI序列定界的片段中。使用與上文所述相同的方法，將該片段克隆入源于piggyBac轉座子的pPigA3cyp6a2-(3xP3-GFP)2載體中BglII-StuI片段中，pPigA3cyp6a2-(3xP3-GFP)2載體的結構示于圖1B。pPigA3cyp6a2(3xP3-GFP)2載體包含示于圖1B的左足(L)和右足(R)。
在該第二次克隆結束時得到的載體示于圖1C，其稱作Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)，相應于本發明載體的定義。
實施例2用異亮氨酸密碼子替換編碼fibrohexamerin信號肽的基因中半胱氨酸密碼子的方法。所使用的方法示于圖2并且包含幾個步驟。首先，通過使用HindIII和PstI限制性酶消化分離fibrohexamerin啟動子片段。第二步——圖2A中稱作PCR1——使用圖2A所示的序列SEQ ID № 4和SEQ ID № 5的引物進行聚合酶鏈式反應。第三步——圖2A中稱作PCR2——使用序列SEQ ID № 6和SEQ ID № 7的引物進行聚合酶鏈式反應。序列SEQ ID № 5和SEQ ID № 6的引物包含用于替代fibrohexameri的天然信號肽中半胱氨酸密碼子的異亮氨酸密碼子。然后將擴增的核酸連接并且得到圖2B所示的通過SacII和PstI限制性酶定界的核酸。該核酸包含在圖1B中以粗體類型表示的代替天然半胱氨酸密碼子的異亮氨酸密碼子。然后將該片段進行克隆以代替pfhx(sp*)GFP質粒中的相應天然序列。
實施例3通過在序列SEQ ID № 1的核苷酸1-1279之間加入結合SGF-1/叉頭轉錄因子的序列SEQ ID № 2多核苷酸的三個拷貝修飾fibrohexamerin啟動子的方案；該方案示于圖3。
在第一步，進行了fibrohexamerin啟動子序列的聚合酶鏈式反應。使用示于圖3中的A、B、C和D引物實現了該擴增，B引物用于序列SEQID № 3，C引物用于序列SEQ ID № 9。
在第二步，將所得到的核酸進行連接以便得到核酸，其編碼鏈示于圖3。
所得到的核酸包含通過加入序列SEQ ID № 2多核苷酸的3個拷貝修飾的fibrohexamerin的啟動子序列的一部分。然后將該核酸克隆到pfhx(sp*)GFP質粒中通過HindIII和PstI限制性位點界定的fibrohexamerin啟動子天然序列的位置中。
序列SEQ ID № 3的圖示于圖4。
序列SEQ ID № 3從5’末端至3’末端包含-fibrohexamerin基因的啟動子(1)；-除了天然序列外的SGF1/叉頭元件(3)的三個附著序列(2)；-fibrohexamerin外顯子1(4)，其半胱氨酸密碼子經過修飾；-fibrohexamerin內含子1(5)；-幫助序列SEQ ID № 1構建的多核苷酸(6)；-編碼Ds-Red報告子蛋白質的多核苷酸(7)。
實施例4使用源于piggyBac轉座子的包含序列SEQ ID № 1的pPigFbx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)載體轉基因的蠶的產絲腺中Ds-Red蛋白質的積累。示于圖5中的照片a、b、c、d、e和f代表在用來源于piggyBac轉座子的包含序列SEQ ID № 3的載體轉基因的蠶中Ds-Red蛋白質的組織特異性表達。照片a、b和c是在目光下的三次放大。使用上文中描述的方案進行檢測Ds-Red蛋白質存在的試驗。照片d、e和f對應于照片a、b和c但是在Ds-Red蛋白質的熒光光譜下得到。
這些照片可以證實Ds-Red蛋白質的熒光并且其表達局限于家蠶后產絲腺細胞(PSG，2)。
在中部產絲腺細胞(SSG，1)沒有觀察到對應于Ds-Red蛋白質的熒光。可以推斷出本發明的核酸驅動目的多肽在鱗翅目昆蟲后產絲細胞中特異表達。
該結果通過圖6所示的蛋白質印跡證實。在上文描述的條件下所進行的蛋白質印跡幫助在蠶的產絲腺細胞檢測Ds-Red蛋白質的存在。將SDS-PAGE凝膠(14％；Tris-甘氨酸；0.1％SDS)轉移至硝酸纖維素濾膜上并且用考馬斯藍進行染色。硝酸纖維素濾膜示于圖6A。然后將同一濾膜用一級多克隆抗Ds-Red抗體孵育，然后用綴合辣根過氧化物酶的二級山羊抗兔抗體孵育。結果示于圖6B。通過化學發光檢測的條帶對應于Ds-Red蛋白質的存在。
在圖6A和6B所示濾膜上可見到來源于蠶產絲腺的蛋白質的4種沉積物。使用上文描述的方法從產絲腺提取蛋白質。四種沉積物如下泳道1來源于非轉基因蠶中間產絲腺的蛋白質；泳道2來源對于包含在序列SEQ ID № 1中轉基因雜合的蠶的中間產絲腺的蛋白質；泳道3來源于非轉基因蠶后產絲腺的蛋白質；泳道4來源對于包含在序列SEQ ID № 1中轉基因雜合的蠶的后產絲腺的蛋白質。
圖6A中所示的濾膜顯示的條帶的強度在泳道之間是相當的。可以得出結論在SDS-PAGE凝膠上沉積的蛋白質是等量的。還可在濾膜的左邊部分包含可見的大小標志物。將同一張濾膜用上文所述抗體處理后示于圖6B。可以觀察到在后產絲腺存在相當大量的Ds-Red蛋白質。Ds-Red蛋白質也存在于中間產絲腺但程度較小。發明人認為這種存在是由于后產絲細胞所分泌的Ds-Red蛋白質遷移至中間產絲腺所致并且不是中間產絲腺合成Ds-Red蛋白質所致。
實施例5用來源于PiggyBac轉座子的包含序列SEQ ID № 1的Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3 GFP)的載體轉基因的蠶中Ds-Red蛋白質的積累根據上文中所描述的方案進行檢測Ds-Red蛋白質存在的試驗。如圖7中所見，絲纖維具有相應于Ds-Red蛋白質存在的熒光。從這可以推導出本發明的核酸驅動目的多肽在鱗翅目昆蟲絲中的分泌。
該結果通過圖8所示的蛋白質印跡證實。將SDS-PAGE凝膠(14％；Tris-甘氨酸；0.1％SDS)轉移至硝酸纖維素膜上并且用麗春紅染色。
硝酸纖維素膜示于圖8A。然后用該同一張膜與一級多克隆抗Ds-Red抗體孵育，然后用綴合辣根過氧化物酶的二級山羊抗兔抗體孵育。結果示于圖6B。可見到通過化學發光檢測的條帶，其對應于Ds-Red蛋白質的存在。來源于蠶繭的蛋白質的9個沉積物在圖8A和8B所示濾膜上可觀察到。使用上文所述方法提取蛋白質。它們是泳道C1和C2來源于非轉基因蠶繭的蛋白質；泳道T1和T2來源于對序列SEQ ID № 1中所述轉基因雜合的蠶繭的蛋白質。
從示于濾膜左邊的大小標志物開始的前6個沉積物對應來源于除去外殼(稱作繭衣)的蠶繭蛋白質。后三個沉積物對應從用水漂洗的蠶繭繭衣得到的蛋白質。從圖8A所示的濾膜上可觀察到起初在SDS-PAGE凝膠上所沉積的蛋白質是等量的。將同一張濾膜如上文所述處理后示于圖8B。可見對轉基因蠶繭繭衣漂洗得到的部分存在相當大量的Ds-Red蛋白質。從這可以推論本發明的核酸驅動目的多肽在鱗翅目昆蟲絲中的分泌。
實施例6用實施例1中描述的構建轉基因的蠶絲纖維表面上Ds-Red蛋白質的積累圖9表示用掃描電子顯微鏡觀察發現Ds-Red蛋白質存在于纖維的表面；蛋白質以包被纖維的大小可變(依賴于聚集物的數目)的球狀顆粒的形式出現。
在將轉基因繭用水溶液濕潤后，來自相應上清液的蛋白質的濃度測量(使用常規Bradford方法)表明每個繭存在大約100微克Ds-Red。
在圖9中可見在分泌過程中非纖維的Ds-red蛋白質被送到絲纖維的外部。這種現象有利于提取目的非纖維蛋白質。對于例如實施例7將描述的人白細胞介素-2的產生，可以得到相同的結論。
實施例7人IL-2的產生分泌人白細胞介素2(IL-2)的轉基因蠶的產生將編碼IL-2的基因替換在實施例1中所描述的整合載體中編碼Ds-Red蛋白質的基因。
轉基因動物的選擇借助于在動物的眼中早期表達3xP3-GFP基因選擇轉基因動物。圖10表示在轉基因雜合蠶繭中置于本發明核酸控制下的IL-2蛋白質的檢測。
在轉基因動物產絲腺或者蠶繭中檢測IL-2的試驗通過蛋白質印跡使用雙抗體多克隆人抗IL2抗體和綴合過氧化物酶的山羊抗兔抗體(Biorad，參考號170-6515)檢測從產絲腺或者蠶繭得到的蛋白質提取物。通過蛋白質印跡檢測外源蛋白質的試驗包括與相對于Ds-Red蛋白質的材料和方法部分中描述的步驟相同的電泳、轉移和蛋白質染色、膜顯影步驟。
唯一對應于蛋白質樣品提取的步驟與關于Ds-Red的描述不同并且因此將在下面更加明確地描述。
蛋白質樣品的提取以141mg繭開始-對46mg繭進行總的提取(樣品號1)-19mg組成繭衣(繭的外殼)(樣品號2)-將76mg繭進行脫膠(除去包被纖維的蛋白質絲膠蛋白)，得到兩種組分-一種是不溶的(樣品號3)-另一種是可溶的(樣品號4)。
樣品的處理-樣品號1將繭在破碎成小片并且在室溫溶解于10M LiSCN(250μL)1小時后，用Tris 10mM緩沖液-2％ SDS-5％β-巰基乙醇以4/5稀釋，在室溫孵育過夜并且在37℃孵育30分鐘。
-樣品號2將繭衣在室溫溶解于10M LiSCN(200μL)1小時并且在室溫孵育過夜并在37℃下孵育30分鐘然后將樣品用Tris 10mM緩沖液-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/5稀釋。
-樣品3和4將繭在2ml肥皂水(7g/L)中100℃下孵育1小時(除去絲膠蛋白)。將可溶組分(含有絲膠蛋白的上清液)在室溫孵育過夜(樣品號4)。將不溶的組分(包含絲心蛋白)在室溫過夜溶解于LiSCN 10M(500μL)中然后將樣品用Tris 10mM緩沖液-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/5進行稀釋。可溶的部分(包含絲膠蛋白的上清液)室溫孵育過夜(樣品號4)。不溶的部分(包含絲心蛋白)在室溫過夜溶解于LiSCN10(500μL)中然后將樣品用Tris 10mM緩沖液-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/1進行稀釋(樣品號3)。
在沉積前，將包含蛋白質提取物的樣品在Laemmli 5x緩沖液中于100℃下變性5分鐘。
下面的步驟與對Ds-Red所描述的步驟相同。
圖10所示的蛋白質印跡表明不管樣品是何種類型都存在IL-2蛋白質。
-泳道1從繭的總提取物得到的蛋白質(樣品號1)；-泳道3從繭衣的提取物中得到的蛋白質(樣品號2)；-泳道4從繭的不溶組分得到的蛋白質(絲心蛋白)(樣品號3)；-泳道5從繭的可溶組分得到的蛋白質(絲膠蛋白)(樣品號4)；-泳道2從與樣品號1相同條件處理的對照繭(陰性對照)的總提取物得到的蛋白質；-泳道S10ng人IL-2標準溶液的沉積。
關于泳道，可以對每個繭產生的IL-2的量進行半定量估計。根據所分析的轉基因系，每個繭產生的IL-2的量為1-10μg。該實施例清楚地證明在對于具有醫療利益的分子人白細胞介素的產生，本發明是有效的。此外，具有生物醫學利益的非纖維蛋白質可以容易地純化，因為在非纖維蛋白質合成時其被送到絲纖維的外部，這在實施例6中關于Ds-Red蛋白質已經證明。
實施例8大蠟螟的絲心蛋白H的產生分泌大蠟螟的絲心蛋白H的轉基因蠶的產生用編碼大蠟螟絲心蛋白H的基因代替實施例1中描述的整合載體中編碼Ds-Red蛋白質的基因。圖11表示對雜合子轉基因蠶的產絲腺(A)和繭(B)中置于本發明核酸控制之下的大蠟螟絲心蛋白H的檢測。
在轉基因動物的產絲腺或者繭中檢測大蠟螟絲心蛋白H的試驗通過蛋白質印跡方法使用雙抗體多克隆人抗FibHGm抗體和綴合過氧化物酶的山羊抗兔抗體(Biorad，參考號170-6515)對從產絲腺或者繭中得到的蛋白質提取物進行檢測。通過蛋白質印跡檢測外源蛋白質的試驗由與相對于Ds-Red蛋白質的材料和方法部分描述的那些步驟相同的電泳、轉移和蛋白質染色、膜顯影步驟組成。唯一對應于蛋白質樣品提取的步驟與關于Ds-Red的描述的不同并且因此將在下面更加明確地描述。
蛋白質樣品的提取和處理將從第五幼蟲期的轉基因動物中取出的一對產絲腺(分泌器與儲存器分離)轉移至微型管中，壓碎并在500μL LiSCN中于室溫下孵育20分鐘然后于60℃下孵育1小時。將樣品用Tris 10mM緩沖液-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/5進行稀釋。
將破碎成小片的繭(20mg)于65℃下溶解于LiSCN 10M(250μL)30分鐘然后用Tris 10mM緩沖液-2％SDS-5％β-巰基乙醇以4/5進行稀釋。
在沉積前，將含有蛋白質提取物的樣品在Laemmli 5x緩沖液中于100℃下變性5分鐘。下面的步驟與對Ds-Red所描述的步驟相同。
-圖11所示的蛋白質印跡表明在轉基因個體的產絲腺(儲存器和分泌器)和繭中存在FibHGm(大小115KDa)，而與上文所述條件相同的條件下處理的從非轉基因動物得到的對照樣品中缺乏該蛋白質。
泳道1從轉基因動物產絲腺的分泌器部分提取得到的蛋白質；泳道2從轉基因動物產絲腺的儲存器部分提取得到的蛋白質；
泳道3從轉基因動物繭總提取物所得到的蛋白質；泳道1*從對照動物產絲腺的分泌器部分提取得到的蛋白質；泳道2*從對照動物產絲腺的儲存器部分提取得到的蛋白質；泳道3*從對照動物繭總提取物得到的蛋白質。
該實施例清楚地證明本發明對于新生物材料例如具有強度和彈性的新機械特性的絲混合物的產生是有效的。
實施例9構建包含指導降低絲心蛋白H合成的RNA表達的核酸載體的方案為了抑制絲心蛋白H，產生了如實施例1中所描述的轉基因piggyBac載體，其包含處于反向重復的目的基因的兩個片段。將來源于絲心蛋白H基因的有義——反義序列通過中性穩定序列隔開并且處于fibrohexamerin啟動子控制之下(圖12)。該載體驅動產生由一條鏈組成的雙鏈sRNA，所述一條鏈折疊形成稱作“發夾結構”的二級結構，所述雙鏈sRNA靶定位于絲心蛋白H基因外顯子2的465bp重復序列的部分(圖12)。這些序列可以備選地從重復和無定形結構域形成。如圖12所示，絲心蛋白H基因的大小為17kbp。編碼序列由兩個外顯子組成一個為67bp并且另一個為15,750bp。該基因的特征是外顯子2中高度重復序列。每一個重復區域包含208bp的亞結構域，該亞結構域以重復的Ua和Ub基序組織。用于靶定mRNA的465bp片段的位置通過箭頭表示。轉錄后產生的mRNA的重復表述為圖中的灰色區域。(Zhou等，2000 Fine organization of Bombyxmori fibroin heavy chain gene.Nucleic Res 28，2413-2419)。
在“一般材料和方法部分”描述了與輔助載體(helper)的共注射，該構建允許建立轉基因蠶系，對于該系測定了繭中產生的絲心蛋白H的量。
如圖13所示(直方圖)，RNA機制對絲心蛋白H分泌產生了可測量的影響，該影響在轉基因系之間是可變的。
相對于對照繭，由轉基因蠶吐絲形成的繭包含少至20％的絲心蛋白H。
序列表<110>科學研究國家中心<120>指導目的多肽在鱗翅目昆蟲后產絲腺中表達的核酸及其應用<130>P443FR<160>13<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>2721<212>DNA<213>人工序列<400>1aagcttagat aattcggcat tgtgcgccac tgagtcgcat tatgctctgt aattggaaac 60taccaaacat tgtgtaccct ttaatgatat tctaatctat atatataaaa atgaattgct120gttcgttagt ctcgctaaaa ctcgagaacg gccggaccga tttggctaat tttggtcttg180aattatttgt ggaagtccag agaagattta gaaggtttaa ataaatatga aaatgctcgg240aattaaataa aaataacaat tttgtttttt ctttgatgtg ttcccgtcgg acggattcct300ttagtctttt atttatcgac tagcgacccg ccgcttcgct tcggaaacat taaaatacac360
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<213>家蠶(Bombyx mori)<400>2ctatttattt aa 12<210>3<211>2772<212>DNA<213>人工序列<400>3aagcttagat aattcggcat tgtgcgccac tgagtcgcat tatgctctgt aattggaaac 60taccaaacat tgtgtaccct ttaatgatat tctaatctat atatataaaa atgaattgct120gttcgttagt ctcgctaaaa ctcgagaacg gccggaccga tttggctaat tttggtcttg180aattatttgt ggaagtccag agaagattta gaaggtttaa ataaatatga aaatgctcgg240aattaaataa aaataacaat tttgtttttt ctttgatgtg ttcccgtcgg acggattcct300ttagtctttt atttatcgac tagcgacccg ccgcttcgct tcggaaacat taaaatacac360atgataccaa aaaaattaaa taattttttt ttaaaaaaag tagcctatgt tcatcaggta420caatgtcggc ttctaatgga aaaagaattt ttcaaatcgg tccagtagtt tcggagccta480ttcgaaacaa acaaacaaac aaatctttcc tctttataat attagtatag atagtataga540ttgaggcact acgaagtctg ccgggtcagc tagtatactc ataaataagg tcaactttaa600tacagtatta catttaatta ggcatatttg gtctttaggt tcacgcttta atcttttttg660gttgatttta atttctggct gatcgctatg gcggttattg agcaatgcct tcgtccaaca720gttgacatct gttgatgatg gtgatatctt caaaattacc ttagcgcaat gtagacttat780
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<212>DNA<213>家蠶<400>5tacgaccgcg cctaggatcg acatc25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6atgctggcgc ggatcctagc tgtag25<210>7<211>20<212>DNA<213>家蠶<400>7cgtcaaaacc gaagacgtcc 20<210>8<211>36<212>DNA
<213>家蠶<400>8ggtgctgcga taaataaatt ggaatagata aataaa36<210>9<211>36<212>DNA<213>家蠶<400>9ctatttattt ccacgacgct atttatttaa cgttat36<210>10<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>10ctatttattt actagt 16<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列
<400>11ctatttattt aacgttattc gttgtgagga acactag37<210>12<211>18<212>DNA<213>家蠶<400>12gtttccacga cgctattt 18<210>13<211>18<212>DNA<213>家蠶<400>13ctgcagaagc caaaactg 18
權利要求
1.核酸，其指導目的蛋白質在家蠶后產絲腺細胞中特異表達，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸與序列SEQ ID №1的核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸在核苷酸上具有至少90％同一性并且其中序列SEQ ID№1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
2.根據權利要求1的核酸，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID №1的核苷酸1150至核苷酸2026的多核苷酸并且其中序列SEQ ID №1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
3.根據權利要求1的核酸，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含(i)包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區和(ii)編碼處于所述調節區控制之下的經修飾信號肽的區域，其中所述核酸從5’末端至3’末端包含序列SEQ ID №1的核苷酸1至核苷酸2026的多核苷酸并且其中序列SEQ ID №1的核苷酸1486至核苷酸1488的三核苷酸編碼選自丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的一個氨基酸。
4.權利要求1-3任意一項的核酸，其中所述核酸通過在序列SEQ ID№1的核苷酸1和1379之間導入序列SEQ ID №2的多核苷酸的至少一個并且不多于四個的拷貝而受到修飾。
5.核酸，其具有與權利要求1-4任意一項所述核酸互補的序列。
6.表達盒，其包含置于權利要求1-5任意一項的核酸控制下的目的多核苷酸。
7.根據權利要求6的表達盒，其中目的多核苷酸編碼多肽。
8.根據權利要求6的表達盒，其中目的多核苷酸編碼融合多肽，其從N-末端至C-末端包含-絲心蛋白L多肽序列的至少172個N-末端氨基酸，和-目的多肽。
9.根據權利要求7或8的表達盒，其中目的多肽選自下面的蛋白質-蜘蛛蛛絲蛋白；-蠟螟屬動物的絲心蛋白，和-人白細胞介素-2。
10.重組整合載體，其包含根據權利要求1-5任意一項的核酸或者根據權利要求6-9任意一項的表達盒。
11.重組克隆載體，其包含權利要求10的重組整合載體的核苷酸序列。
12.根據權利要求10的重組整合載體，其中所述重組整合載體是2003年2月20日保存在巴斯德研究所的國立微生物保藏中心(CNCM)、保藏號為CNCM I-2975的Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP)。
13.重組宿主細胞，其包含權利要求1-5任意一項的核酸或者權利要求6-9任意一項所述表達盒或者權利要求10-12任意一項的載體。
14.根據權利要求13的重組宿主細胞，其特征在于所述重組宿主細胞是選自蠶蛾屬、柞蠶屬、蠟螟屬、樗蠶屬、灰翅夜蛾屬或者果蠅屬的產絲動物細胞。
15.根據權利要求13的重組宿主細胞，其中所述重組宿主細胞是家蠶細胞。
16.根據權利要求13的重組宿主細胞，其中所述重組宿主細胞是家蠶的后產絲細胞。
17.權利要求1-5任意一項的核酸、權利要求6-9任意一項的表達盒、權利要求10-12任意一項的載體或者權利要求13-16任意一項的重組宿主細胞的用途，用于得到蠶蛾屬轉基因動物。
18.根據權利要求17的用途，其中家蠶種轉基因動物將目的蛋白質分泌到絲纖維中。
19.轉基因非人動物，其包含整合到其基因組形式的權利要求1-5任意一項的核酸、權利要求6-9任意一項的表達盒或者權利要求10-12任意一項的載體。
20.轉基因非人動物，其缺乏絲心蛋白L的分泌，所述轉基因非人動物包含整合到其基因組形式的權利要求8或9的表達盒。
21.繭，其包含目的蛋白質，所述蛋白質的表達受權利要求1-5任意一項的核酸、權利要求6-9任意一項的表達盒或者權利要求10-12任意一項的載體的指導并且其中所述目的蛋白質以大于5ng/mg繭，優選地大于70ng/mg繭的濃度存在。
22.得到家蠶種轉基因動物的方法，其中該方法包括下面步驟a)向產卵后1到5小時、囊胚層形成之前的家蠶卵注射權利要求1-5任意一項的核酸、權利要求6-9任意一項的表達盒或者權利要求10-12任意一項的載體；b)選擇基因組中整合權利要求1-5任意一項的核酸或者權利要求6-9任意一項的表達盒的轉基因動物。
23.權利要求21的得到動物的方法，其中該方法包括額外的下列步驟c)將步驟b)得到的兩個轉基因動物雜交；d)選擇轉基因的純合子動物。
24.得到絲纖維的方法，其特征在于該方法包括下面的步驟a)飼養根據權利要求19的轉基因動物；b)回收所述轉基因動物產生的絲。
25.得到目的蛋白質的方法，其特征在于該方法包括下面的步驟a)飼養根據權利要求19的轉基因動物；b)回收所述轉基因動物產生的絲；c)從絲纖維回收目的蛋白質。
26.核酸，其指導降低絲心蛋白H合成的目的RNA在家蠶后產絲腺細胞中的特異表達，其中所述核酸含有包含用于目的多核苷酸在所述產絲腺細胞特異表達的調節信號的調節區，所述核酸與序列SEQ ID №1的核苷酸1150至核苷酸1451的多核苷酸具有至少90％核苷酸同一性。
27.核酸，其由權利要求26的核酸組成，其中所述核酸通過在序列SEQID №1核苷酸1和1379之間導入序列SEQ ID №2的多核苷酸的至少一個并且不多于4個拷貝而受到修飾。
28.表達盒，其包含編碼目的RNA的核酸，其中所述表達盒置于權利要求26或27的核酸的控制下。
29.重組整合載體，其包含權利要求26或27的核酸或者權利要求28的表達盒。
30.重組宿主細胞，其包含權利要求26或27的核酸或者權利要求28的表達盒或者權利要求29的載體。
31.權利要求26或27的核酸或者權利要求28的表達盒或者權利要求29的載體的用途，用于得到蠶蛾屬轉基因動物。
32.轉基因非人動物，其中所述動物包含整合到其基因組形式的i)權利要求1-5任意一項的核酸、權利要求6-8任意一項的表達盒或者權利要求9-11任意一項的載體，和ii)包含權利要求26或27的核酸或者權利要求28的表達盒或者權利要求29的載體。
33.根據權利要求20的轉基因非人動物，其特征在于所述動物包含整合到其基因組形式的權利要求26或27的核酸或者權利要求28的表達盒或者權利要求29的載體。
全文摘要
本發明涉及指導目的蛋白質在家蠶后產絲腺細胞內特異表達的核酸。本發明還涉及包含置于如上文所述核酸控制之下的目的多核苷酸的表達盒。本發明還涉及包含上文所定義的核酸或表達盒的重組整合載體以及通過在其基因組整合所述核酸或者所述表達盒而受到修飾的宿主細胞。
文檔編號C07K14/435GK1774507SQ200480010261
公開日2006年5月17日 申請日期2004年3月12日 優先權日2003年3月13日
發明者G·沙萬希, P·庫布爾, B·杜蘭德, A－M·格勒尼耶, B·奧拉爾, E·朱利安, B·莫尚, P·諾尼, J－C·普勞德霍曼, C·魯瓦耶 申請人:科學研究國家中心, 克洛德貝納爾里昂第一大學, 國家農藝研究院