用于口服接種的凍干形式的具有改良的生物安全性特征的霍亂弧菌(Vibriocholerae)減毒株的制作方法

專利名稱：用于口服接種的凍干形式的具有改良的生物安全性特征的霍亂弧菌(Vibriocholerae)減毒株的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別地是獲得霍亂弧菌(Vibrio cholerae)活減毒疫苗株，更具體地說是引入確定的突變來防止或限制這些活疫苗株重新獲取CTXΦ噬菌體編碼的基因和/或隨后的傳播，以及將其保藏用作疫苗的方法。
背景技術：
術語定義描述本發明時所使用術語的含義如下所述CTXΦ病毒指一些霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株產生的蛋白質包被的DNA顆粒，其可以將包括霍亂毒素基因在內的其DNA轉導給其它弧菌。
霍亂毒素(CT)指由細菌引起霍亂時，負責產生臨床癥狀的蛋白質。
CTXΦ編碼的毒素基因指除了CT基因外，還包括分別編碼“緊密連接毒素(zonula occludens toxin)”及附屬霍亂腸毒素(accessory cholera enterotoxin)的zot和ace基因。ZOT活性負責將上皮細胞基側膜之間的緊密連接破壞掉，ACE蛋白具有附屬于霍亂毒素活性的活性。
術語耐受性良好的疫苗或耐受性良好的菌株指缺失殘余反應原性的菌株，這是大部分霍亂弧菌(Vibrio cholerae)非產毒株的特征。實際上該術語是指足夠安全地在社區中使用，不需要或僅僅有限地需要在保健機構中使用，而不會對受接種者構成生命危險的菌株。應該可以預測受接種者的腹瀉率是8％或以下，而且腹瀉的特征是不會超過600ml(grs)，只有1％或更少的受接種者會有頭痛，所述頭痛輕微而歷時較短(少于6小時)，最后它會使少于0.1％的受接種者發生嘔吐，嘔吐特征是單次嘔吐500ml或更少。
血凝素蛋白酶(HA/P)指霍亂弧菌(Vibrio eholerae)所分泌的蛋白，其具有雙重功能，功能之一是使某些種屬的紅細胞凝集，另一性質是降解或加工諸如粘蛋白和霍亂毒素之類的蛋白質。
celA指編碼內切葡聚糖酶A合成的核苷酸序列。該蛋白天然存在于熱解纖維梭菌(Clostridium thermocellum)菌株中，具有β(1-4)葡聚糖-葡聚糖水解酶活性，可以降解纖維素及其衍生物。
術語MSHA指霍亂弧菌(Vibrio cholerae)表面可以凝集不同種屬紅細胞的結構菌毛，其可以被甘露糖抑制。
VGJΦ介導的毒力逆轉指先前通過抑制CTXΦ基因獲得的減毒菌株通過完依賴于VGJΦ并由其介導的機制重新獲得該噬菌體的所有基因并與其受體MSHA相互作用這一事件。
在VGJΦ介導的過程中傳播CTXΦ噬菌體的可能性是絲狀噬菌體VGJΦ通過與CTXΦ的DNA發生基因重組形成穩定的雜交結構(HybPΦ)并將其帶活性基因的基因組傳播給霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的其它菌株，后者可以是環境中非致病菌株、疫苗菌株或其它來自不同種屬的菌株。
臨床霍亂是一種急性腹瀉疾病，由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)經口感染引起。經過100多年對霍亂的研究后，仍需要針對該疾病有效和安全的疫苗。從1817年來，人類已有七次霍亂大流行，前六次由古典生物型菌株引起，而目前第七次流行的特征是El Tor生物型菌株為主。最近，從1991年1月開始，這次流行曼延到了南美，在秘魯、厄瓜多爾和智利發生了25000多例霍亂并造成2000以上的患者死亡。到1992年11月，印度和孟加拉國出現了霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的新血清組O139，表明很有可能成為流行病并波及所有發展中國家。這些最近的經歷增加了抗血清組O1(生物型El Tor)和O139霍亂弧菌(Vibrio cholerae)所致疾病的有效霍亂疫苗的需要。
因為霍亂康復后是持續至少三年的免疫狀態，已在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)疫苗學中做了很多工作以產生活減毒霍亂疫苗，口服給藥后這種疫苗后，它近似地摸擬了在其免疫特性中的疾病，但不會導致服用者產生反應原性(腹瀉、嘔吐、發燒)。這類疫苗涉及CTXΦ所編碼全部毒性基因的缺失突變。例如，抑制原噬菌體CTXΦ中編碼霍亂毒素和其它毒素的基因是構造活疫苗侯選物期間的必需基因操作(參見分別于1991年和1995年公開的James B.Kaper的發明WO 91/18979及JohnMekalanos的發明WO 9518633)。
已提出將這類突變體用作單劑口服疫苗，盡管其已充分地減毒而且可以產生可靠的免疫反應(Kaper J.B.和Levine M.，專利US 06,472,276和581,406)。但是，這些突變體不能廣泛應用的主要障礙是其在受接種者中產生了高水平的副作用(Levine和cols.，Infect.and Immun.56卷，第1期，1988)。
因此，獲得足夠程度的減毒是獲得抗霍亂的活有效疫苗期間需要解決的主要問題。已經證明有至少三種活疫苗侯選物具有可接受水平的安全性，即足夠程度的減毒和足夠強的免疫原潛能。它們是霍亂弧菌(Vibrio cholerae)CVD103HgR(古典生物型，Inaba血清型)(Richie E.和cols，Vaccine 18，(2000)2399-2410.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)Perú-15(El Tor生物型，Inaba血清型)(Cohen M.，和cols.(2002)Infection and Immunity，70卷，Not.4，p 1965-1970)以及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)638(El tor生物型，Ogawa血清型)(Benitez J.A.和cols，(1999)，Infection andImmunity.Feb；67(2)539-45).
CVD103HgR菌株是已在全球數個國家注冊的抗霍亂口服活疫苗的活性抗原組分，Perú-15和638菌株是不久將來在現場試驗中評估的另兩種活疫苗侯選物。
但是，這些減毒活疫苗侯選物還有另外的重要問題需要解決；問題之一是環境安全性，尤其是與通過遺傳信息在細菌間水平轉移的現有機制可能重新獲得和傳播霍亂毒素基因相關的安全性。與此一致，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)減毒疫苗菌株可能在來自其它弧菌的CTXΦ噬菌體感染事件中不受實驗室條件控制而重新獲得毒力基因(Waldor M.K.和J.J.Mekalanos，Science 2721910-1914)并促進其傳播。當人們至少持續5天服用數千百萬減毒細菌并保持在其糞便中流出相當數量細菌時，這一過程就變得相當重要了。一旦處于環境中，細菌就有可能從生態系統中相同或不同種屬的其它細菌獲得遺傳物質。由于這些原因，目前需要獲得的疫苗侯選物具有特定的特征來防止或限制CTXΦ，尤其是編碼霍亂腸毒素的基因的獲得及傳播。這正是本發明的領域。
細菌病毒也稱為噬菌體，具有在相同或不同種屬的細菌之間轉移基因的超常潛能。霍亂弧菌(Vibrio cholerae)中的CTXΦ噬菌體正是如此(Waldor M.K.和J.J.Mekalanos，1996，Science 2721910-1914)。CTXΦ是攜帶編碼霍亂弧菌(Vibriocholerae)中霍亂毒素的基因并通過與來自于毒素共調節菌毛的IV型菌毛(稱為TCP)相互作用進入細菌。TCP暴露于弧菌的外表面。根據公開的結果，在最佳實驗室條件下CTXΦ噬菌體每毫升飽和相培養液的滴度可達含106顆粒或更少，這可以將其歸類為中度增殖的噬菌體。同樣，該噬菌體的TCP受體表達具有其產生的限制條件。盡管有這些限制，這一對噬菌體-受體的存從某種程度上限制了其被很好地接受為活霍亂疫苗，這是為什么使細菌失去進入該噬菌體的入口是理想的修飾。
理論上有兩種方法防止CTXΦ進入霍亂弧菌(Vibrio cholerae)1)抑制TCP表達或2)去除參與噬菌體受體相互作用的TCP位點。由于TCP對于適當的人類腸定居及保護性免疫反應來說是必需的，這兩種方法均不能實現。應該注意的是參與TCP-CTXΦ相互作用的位點對于定居過程也是必需的(Taylor R.2000.MolecularMicrobiology，(4)卷，896-910)。
已評估了數種抵抗病毒進入的策略，如防止噬菌體整合到細菌染色體及其穩定遺傳，是抑制整合位點及失活recA基因以避免重組和整合到染色體的其它位點(Kenner和cols.1995.J.Infect.Dis.1721126-1129)。
同樣，最近報道CTXΦ進入霍亂弧菌(Vibrio cholerae)依賴于TolQRA基因，但是此突變在霍亂疫苗侯選物中產生不想要的敏感表型，并且沒有得到實現(Heilpern和Waldor.2000.J.Bact.1821739)。
未見報道防止攜帶有霍亂疫苗菌株或其它疫苗菌株必要毒力決定簇的噬菌體進入的其它方法。
本發明的主要目的涉及噬菌體VGJΦ及利用甘露糖敏感血凝素(MSHA)菌毛為受體，其轉移編碼霍亂毒素的基因的能力。具體地，它包括通過引入阻止這種菌毛正確功能的抑制突變或修飾，從而保護減毒活疫苗菌株不受VGJΦ感染。
從該菌毛的現有認知可以總結出下列方面。mshA的基因產物最初被描述為霍亂弧菌(Vibrio cholerae)表面中菌毛附器的主要亞單位，具有凝集不同種屬的紅細胞能力，甘露糖抑制這種能力(Jonson G和cols(1991).Microbial Pathogenesis11433-441)。同樣，認為MSHA是細菌的毒力因子(Jonson G.和cols(1994).Molecular Microbiology 13109-118)。根據其性質的重要性，獲取MSHA表達缺陷的突變體來研究其在毒力中可能的作用。已證明MSHA與TCP相反，并不是El Tor和O139霍亂弧菌(Vibrio cholerae)定居于人類小腸所必需(Thelin KH和Taylor RK(1996).Infection and Immunity 642853-2856)。MSHA也被描述為噬菌體493的受體(Jouravleva E.和cols(1998).Infection and Immunity，66卷，Not 6，2535-2539頁)，表明該噬菌體可以參與O139弧菌的出現(Jouravleva E.和cols，(1998).Microbiology144315-324)。后來已經報道菌毛MSHA在生物表面和非生物表面上生物膜形成中起作用，從而有助于細菌在實驗室及宿主外的存活(Chiavelli D.A.和cols，(2001).Appl.Environ Microbiol.Jul；67(7)3220-25；和Watnick P.I.和Kolter R.(1999).Mol.Microbiol.Nov，34(3)586-95)。從已有數據可以得知，已完成了數項與MSHA菌毛相關的研究，但這些研究沒有一項研究確定此菌毛為可高效轉導霍亂毒素基因的噬菌體受體，而且不僅僅是這些基因而是CTXΦ的整個基因組可顯著地促進其傳播。另外，盡管已做了大量研究，仍未發現與此菌毛作為毒力因子或介導CTXΦ傳播的噬菌體受體相關的發明。
另一方面，在研制活霍亂疫苗的人們中提供凍干形式的該疫苗是普通應用。因此，服用調節胃內pH的抗酸溶液后才服用這些活細菌制品，然后細菌懸液繼續向腸部推進而不會在胃內被破壞并在腸內定居。
凍干疫苗的精心制作改善了菌株的保藏，方便了劑量制備，允許長期貯藏，限制了污染的風險，并且更容易商業化和分發，不需要在發展中國家通常不具備的冷凍運輸線。
盡管霍亂弧菌(Vibrio cholerae)被認為是對凍干過程非常敏感的微生物，已知一些添加劑可以增強菌株的存活力。因此，為了保藏疫苗菌株古典Inaba型CVD103HgR，美國馬里蘭大學的疫苗研發中心、來自伯爾尼的瑞士血清和疫苗研究院(ISSVB)研發了一種制劑，參見(Vaccine，8，577-580，1990，S.J.Cryz Jr，M.M.Levine，J.B.Kaper，E.Fürer和B)，其主要含有糖類和氨基酸。該制劑包含蔗糖、氨基酸和抗壞血酸，經過冷凍干燥處理后加入乳糖和天冬苯丙二肽酯。
在一項有關野生型古典Inaba 569B菌株冷凍干燥保藏的研究中，比較了不同添加劑對該霍亂弧菌(Vibrio cholerae)生存力以及冷凍干燥時及在不同溫度下貯藏后最終外觀的作用，該結果發表于Cryo-Letters，16，91-101(1995)，作者為Thin H.，T.Moreira，L.Luis，H.Garcia，T.K.Martino和A.Moreno。結果表明45℃時貯藏3天后生存力喪失少于1個對數級。
發明CU 22 847要求保護一種凍干方法，其中該制劑中除了含有細菌蛋白胨或酪蛋白水解物及山梨糖醇外，還含有純化蛋白質或添加有聚合物及/或甘氨酸的脫脂乳的組合，其對不同血清組、生物型及血清型的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株有著良好的生存力結果。冷凍干燥的細菌溶解于調節胃內pH的1.33％碳酸氫鈉緩沖溶液后仍保有持其生存力。
任何欲在發展中國家使用的霍亂疫苗制品應滿足一定的要求，如具有簡單的組成，易于制備和操作，易于溶解而且溶解后具有良好的外觀。此外，也期望不需低貯藏溫度，并且至少在短期內耐受高的貯藏溫度以及在容器偶爾存在氧和濕氣。另外，也需要充分選擇制劑的組成，使得可以保存不同血清組、生物型和血清型的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。最后值得注意的是不含牛衍生成分的制劑可以使之符合因牛海綿狀腦病綜合征而使用牛組分的國際管理當局相關要求。

發明內容
本發明提出了免疫抗霍亂的新一代減毒活疫苗，所述疫苗改變了其性質，具體地是改善了其在人類定居期間及隨后在室驗室外環境中的生物學安全性。
本發明源自保護霍亂活疫苗不受含霍亂毒素基因的CTXΦ噬菌體感染以及損害從霍亂活疫苗侯選物開始的該噬菌體潛在傳播的需要。具體地，本發明源自于本實驗室中VGJΦ噬菌體的發現和鑒定。
VGJΦ是從霍亂弧菌(Vibrio cholerae)O139分離的絲狀噬菌體，但是其具有感染O1霍亂弧菌(Vibrio cholerae)所有血清型及生物型以及霍亂弧菌(Vibriocholerae)O139其它菌株的能力。在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)完整基因組序列中沒有描述該噬菌體的序列，說明N16961菌株(O1，El Tor Inaba)中不存在該噬菌體。本實驗室中大量霍亂弧菌(Vibrio cholerae)O1菌株清單中沒有一株具有與VGJΦ同源的序列，而霍亂弧菌(Vibrio cholerae)O139的MO45、SG25-1和MDO12C菌株則具有同源序列。
VGJΦ噬菌體通過MSHA菌毛感染霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。當該噬菌體進入細菌內時，其可進行復制或整合入特定的染色體區域。它是非常活躍的噬菌體，培養上清中可達1011顆粒/ml。
正如本發明下列應用所提出的，此噬菌體最重要的特征是其實施特異性轉導CTXΦ噬菌體從而轉導霍亂毒素基因的能力。這一過程通過CTXΦ和VGJΦ基因組之間的位點特異性重組，隨后包裝并將兩個基因組均輸出到VGJΦ衣殼中而發生。此雜交病毒顆粒命名為HybPΦ。同時受CTXΦ和VGJΦ感染的細菌培養產生了1011顆粒/ml VGJΦ和107-108顆粒/ml HybPΦ，至少比只用CTXΦ所得效價高100倍。
重要的是也應該理解，就本申請目的來說CTXΦ噬菌體的受體是表達需要特別條件的TCP，而VGJΦ的受體是MSHA菌毛，它是在所有研究表達條件下大量表達同時也在環境中產生的抗原。而且，其它弧菌產生的MSHA可增加傳播風險甚至傳播至其它細菌種屬。
重要的是應當知道一旦新宿主受到HybPΦ感染，在飽和相可穩定產生107-108顆粒/ml的顆粒，因此該雜交噬菌體具有很強的傳遞和傳播霍亂毒素基因的潛能。
就本申請目的來說，另一非常有趣的方面是HybPΦ中霍亂毒素基因足夠活躍，以至于在體外培養期間產生50ng/ml毒素，用新生小鼠霍亂模型評估時受HybPΦ感染后減毒菌株返轉成具有毒力的。
依據這些數據，本發明的主要目的是描述對活霍亂疫苗所作的另外突變以防止其受到VGJΦ或HybPΦ感染，以及在重新獲得CTXΦ的情況下，使用缺失VGJΦ基因組的活霍亂疫苗以避免VGJΦ介導的CTXΦ傳播的必要性。
這種突變的實例之一是導致MSHA菌毛在細胞表面表達缺失的穩定自發突變。這樣VGJΦ或其衍生噬菌體HybPΦ不能感染這種疫苗。
這種突變的另一實例是該菌毛(MshA)主要蛋白質亞單位結構基因中的抑制突變。
盡管可使用其它公知的方法學將VGJΦ從受感染菌株去除，但是可簡單地通過查找不同菌株間的DNA雜交來鑒定哪個不含與本發明所述VGJΦ片段同源的片段，從而實現缺失VGJΦ基因組的活霍亂疫苗侯選物的利用。
實施上述特定突變的活霍亂疫苗實例是不能與VGJΦ特異性探針反應，以及現有技術中已證明在志愿者研究中具有可接受水平反應原性的疫苗株。這些菌株的基因型包括留下殘余RS1的CTXΦ噬菌體抑制突變和celA基因對hap基因的插入失活。可以通過抑制霍亂弧菌(Vibrio cholerae)流行病菌株中CTXΦ原噬菌體，然后在它們序列中插入標記基因celA來失活血凝素蛋白酶基因(hap)構建這些菌株。參見Robert的科學論文和cols.，Vaccine，14卷，16期，1517-22，1996；Benitez J.A.和cols的科學論文，(1999)，Infection and Immunity.Feb；67(2)539-45以及Campos和cols 1997年的發明申請WO9935271A3。具有這些特征及還具有營養缺陷型突變的的其它菌株也可用于獲得具有本發明目標特征的菌株。
依據上文所述，本發明的主要目的是保護導致弧菌表面中MSHA菌毛缺失的抑制突變或自發突變的應用，并以此方式阻止活霍亂疫苗以雜交噬菌體NybPΦ感染的方式重新獲得和傳播霍亂毒素基因。
本發明優選包括現有生物型和血清型的任何活霍亂疫苗菌株或具有基因操作的另外出現血清型的任何不產毒菌株，所述基因操作抑制CTXΦ噬菌體的基因組、失活hap基因，可與任何其它突變組合，例如引入一些營養缺陷型(賴氨酸或甲硫氨酸)，同時也具有本發明所提出的特征。
本發明也優選包括使用可良好耐受的活霍亂疫苗作為遞送系統將異源抗原呈遞給粘膜免疫系統，通過在VGJΦ介導的事件中獲得CTXΦ的不可能性和缺失VGJΦ而降低了散播CTXΦ的風險而改良了所述疫苗。
為獲得MSHA菌毛表達中的這些突變體，我們使用了數種不屬于本發明保護目標的分子生物學技術。
本發明也公開了保存和凍干這些菌株的方法，目的是制備活疫苗，該活疫苗凍干后能快速而充分重構，并且在1.33％碳酸氫鈉溶液中重構時不影響其生存力。
本發明的目的還包括以充分篩選組分的方式使得凍干制品可以保證經過貯藏后活霍亂疫苗的生存力下降少于一個對數級，而不依賴于其具有何種血清組、血清型或生物型或是具有什么樣的突變，即使是分開凍干它們或作為相同制品的組分混合它們。
加入的制劑組分包括乳糖(L)、蛋白胨(P)、酵母提取物(E)和山梨糖醇(S)。總濃度應不超過10％。


圖1.VGJΦ噬菌體的顯微照像。放大倍數×32000。從受感染霍亂弧菌(Vibriocholerae)569B上清純化的VGJΦ噬菌體。
圖2.雜交噬菌體HybPΦ-kn的基因組圖，其具有很強的霍亂毒素傳遞潛能。
圖3.用于抑制霍亂弧菌(Vibrio cholerae)疫苗侯選物的mshA基因的基因操作示意圖及處理過程中所用自殺載體。
圖4.用感染HybPΦ-Kn的減毒菌株及其衍生物接種的乳鼠生存圖，其中所述減毒菌株已經恢復毒力。
具體實施例方式
實施例1VGJφ噬菌體的發現和特征VGJφ是在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)SG25-1總DNA制品中發現的染色體外可遺傳元件，SG25-1是于1993年在印度加爾各答分離的O139菌株并由Richard A.Finkelstein教授友情惠贈。簡單的實驗顯示該元件具有可遺傳性。攜帶該元件的供體菌株無細胞培養上清液在標準條件下如LB培養基(NaCl 10g/l、triptone 10g/l和酵母提取物5g/l)中生長，并且將與供體菌株中存在的遺傳元件具有相同大小和限制性酶切圖譜的遺傳元件轉移到不含任何染色體外元件的受體菌株。供體-受體之間無直接接觸的傳遞這一性質在噬菌體中非常典型。
感染測定供體菌株長到600nm光密度為0.2，然后從培養液取一等份，用孔大小為0.22μm濾器過濾以去除細菌。取一等份濾液在LB板上培養并于37℃孵育過夜以確定濾液無菌。確認沒有菌落形成單位后，用100μl無細胞上清液或系列稀釋度感染20μl受體菌株新鮮培養物。混合物室溫孵育20分鐘并在固體或液體LB培養基中于37℃平鋪過夜。受感染弧菌中VGJφ復制形式(FR)和單鏈DNA(ssDNA)的出現進一步證實了感染的發生。
VGJφ噬菌體的純化從VGJφ感染的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)569B菌株(古典型，Inaba)培養物進行噬菌體顆粒的純化。使用該菌株是因為其含有CTXφ缺陷的原噬菌體。細胞于8000×g離心10分鐘。上清液用0.22μm的膜過濾。加入終濃度分別為3％和5％的NaCl和聚乙二醇6000使濾液中的噬菌體顆粒沉淀。混合物置冰中孵育30分鐘，12000×g離心20分鐘。棄上清，含噬菌體的沉淀懸浮于1ml磷酸緩沖鹽溶液中。
VGJφ的鑒定沉淀的VGJφ顆粒保持了其感染569B菌株的能力而且4℃時，在PBS溶液中穩定至少6個月。
噬菌體顆粒純化后，用酚-氯仿溶液將基因組DNA提取出來。對DNA進行分析發現其可耐受核糖核酸酶H的消化，表明基因組為DNA而不是RNA(數據未列出)；它也可以耐受不同限制性內切酶的處理但對綠豆和S1核酸酶處理敏感(數據未列出)，表明該噬菌體基因組含有ssDNA。吖啶橙(acrydine orange)存在下電泳分析顯示的結果與前而結果類似。吖啶橙嵌入雙鏈DNA(dsDNA)中是發綠色熒光，而嵌入ssDNA中時發橙色熒光。與預期的一致，基因組DNA發出橙色熒光說明其單鏈性質(數據未列出)，而受感染細胞中所觀察的質粒DNA發出綠色熒光說明其含有dsDNA。
VGJφ基因組和細胞內復制形式之間的同一性以VGJφ基因組為探針進行Southern印跡分析，表明供體菌株SG25-1和受咸染菌株569B的染色體外元件之間的遺傳同一性。這一結果證實了病毒基因組的ssDNA由胞質RF產生，同時也表明VGJφ是絲狀噬菌休，其利用滾環復制機制產生基因組ssDNA，裝配和在噬菌體顆粒中輸出。
用限制性分析對從受感染菌株569B分離的RF作圖。所得圖譜顯示噬菌體基因組大小(約7500b)及電泳限制性模式與以前報道的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)特異性絲狀噬菌體不同。這些結果表明從SG25-1分離的噬菌體以前沒有報道，將其命名為VGJφ。
VGJφ的效價滴定噬菌體懸液的操作與感染測定相同。但指示劑菌株細胞涂平板到固體LB板的軟瓊脂(0.4％)涂層上。將板于37℃孵育過夜，對觀測到的不透明噬菌斑(感染集中點)計數。
該測定發現VGJφ感染的569B培養物每毫升培養物能產生高達3×1011個的噬菌體顆粒，與其它已報道的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)絲狀噬菌體如CTXφ相比是非同尋常的高，通常這些噬菌體每毫升最多能產生106個顆粒。
電子顯微鏡檢查用4％熒光素醋酸鈉(uranile acetate)溶液(m/v)負染不同量的VGJφ顆粒，然后在透射電子顯微鏡JEM 200EX(JEOL，日本)中觀察新制備的聚醋酸甲基乙烯酯(Formvar)柵格。觀察結果證實噬菌體顆粒為絲狀(圖1)。
VGJ-Knφ的構建和滴定通過VGJφRF的唯一XbaI位點線性化它。將含R6K復制起點和來自pUC4K質粒的卡那霉素抗性盒的一個DNA片段插入VGJφ的XbaI位點。將此重組RF引入霍亂弧菌(Vibrio cholerae)569B中，并且噬菌體顆粒命名為VGJ-Knφ。
VGJ-Knφ感染的供體菌株569B培養到OD600＝2.0。通過0.2μm孔大小的濾器過濾等份培養液以去除細菌。取50ul等份濾液涂固體LB平板上并于37℃孵育過夜以證實無細胞的懸浮液無菌。用等份100μl無細胞噬菌體懸液或其稀釋液感染20μl新制備的受體菌株培養液(約108個細胞)。混合物室溫孵育20分鐘以進行感染。隨后將混合物涂平板到添加了卡那霉素(50ug/ml)的固體LB上，該平板于37℃孵育過夜。抗生素存在時可生長的菌落由于受標記噬菌體VGJ-Knφ感染而獲得了Kn-抗性。通過純化質粒DNA并進行限制性內切酶分析檢查這些菌落中數個菌落的VGJ-knφ的RF存在。
此方法所完成的滴定測定與通過VGJφ對不透明噬菌斑測定所獲得結果一致，表明VGJ-knφ感染的569B培養物每毫升培養物產生了約2×1011個VGJ-knφ噬菌體顆粒。
核苷酸序列VGJφ的核苷酸序列含7542個核苷酸，G+C含量為43.39％。鑒別了其編碼的ORFs并與蛋白質數據庫堿基比較。
VGJΦ的基因組構造與以前鑒定的絲狀噬菌體類似，如大腸桿菌(E.coli)的Ff組噬菌體(M13、fd和f1)及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的其它絲狀噬菌體(CTXΦ、fs1、fs2和VSK)和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)的其它絲狀噬菌體(Vf12、Vf33和VfO3k6)。VGJΦ沒有與Ff組噬菌體基因IV同源的基因，表明VGJΦ與CTXΦ噬菌體類似，可以利用宿主的孔蛋白(porine)來裝配和輸出其噬菌體顆粒。
VGJΦ的核苷酸序列說明VGJΦ是fs1和VSK噬菌體的近親，共有高度同源的幾個ORF，與VSK和fs1具有82.8％和77.8％的DNA同源性。但是，它們之間也存在高度不同的基因組區域和不共有的ORFs。此外，基因組大小不同，以前也沒有報道fs1或VSK能轉導霍亂毒素基因。
VGJΦ的核苷酸序列也表明存在與att序列同源的兩個位點，已知att序列在整合絲狀噬菌體中起作用。VGJΦ的這些位點有部分重疊并處于相反的方向。野油菜黃單胞菌(X.campestris)的噬菌體Cf1c、Cf16-v1和ΦLF，副溶血弧菌(V.parahemolyticus)的Vf33和VfO3k6，以及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的VSK中也發現了這種排列。這些噬菌體中除Vf33和VSK外均通過這些噬菌體復制形式負鏈中的att位點整合入其宿主的染色體中。
實施例2.VGJΦ受體的鑒定絲狀噬菌體通常使用IV型菌毛做為受體來感染其宿主。以前報道的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)特異性絲狀噬菌體使用TCP或MSHA菌毛做為受體。因此，使用這些菌毛的兩種El Tor菌株C6706突變體KHT52(ΔtcpA10)和KHT46(ΔmshA)來鑒別它們它們中任何一種是VGJΦ的受體。親本菌株C6706及其TCP突變體KHT52對VGJΦ感染敏感，而MSHA突變體KHT46完全抗該噬菌體，這說明MSHA是VGJΦ的受體。菌株KHT46與質粒pJM132上攜帶的(來自親本C6706的)野生型mshA結構基因互補回復了噬菌體敏感性，證實了MSHA是VGJΦ的受體。通過感染測定后分析受體菌株培養物中復制形式的存在與否來評估對VGJΦ的抗性或敏感性。
為了給出每種情況下轉導的顆粒的滴度數值，使用前面所述的VGJΦ-kn感染測定，結果如下親本菌株C6706及其衍生的TCP突變體KHT52對VGJΦ-Kn感染敏感，指示菌株顯示了1011噬菌斑形成單位(PFU)的滴度，而MSHA突變體KHT46完全抗該噬菌體，用同樣制備的VGJΦ-Kn感染后滴度小于5PFU/mL。菌株KHT46與野生型mhsA結構基因互補恢復了噬菌體敏感性。這些結果證實了阻止MSHA菌毛表達的突變賦予了對VJGΦ感染的抗性。
使用它們的卡那霉素抗體變異體進一步做了測定以比較HybPΦ和CTXΦ感染古典和El Tor菌株的能力。結果見表1。
如前所述，通過在CTXΦ復制形式唯一的限制性位點NotI中插入來自質粒pUC4K(Amersham Biosciences)的卡那霉素抗性盒獲得CTXΦ-Kn噬菌體。
在用CTXΦ-Kn和VGJΦ-Kn共感染569b菌株無細胞培養上清液的感染測定期間獲得HypPΦ噬菌體用于感染受體菌株KHT52。將攜帶卡那霉素抗性的該菌株細胞純化，它們繼續向上清液中繼續產生出HybPΦ病毒顆粒，所述抗性最初由CTXΦ-Kn攜帶然后提供給HybPΦ。
用相同滴度(1～5×1011顆粒/mL)的CTXΦ-Kn及VGJΦ-Kn懸液感染受體菌株569B(古典)和C7258(El Tor)來檢查在古典和El Tor弧菌中雜交噬菌體的感染效率。兩種情況下，受體菌株均在CTXΦ受體TCP表達最佳條件下培養。按如下方法進行測定，將200μL純噬菌體制備物與20μL受體菌株新鮮培養物(約108個細胞)于室溫下，在20分鐘期間混合，涂平板到添加有卡那霉素的固體LB培養基上并于室溫孵育過夜。
基因組中攜帶Kn-抗性基因的菌落數是噬菌體感染的結果，表明每個噬菌體在常規實驗室條件下感染不同菌株的能力。結果如表1所示。
表1.CTXφ-Kn和雜交噬菌體(HybPΦ-Kn)在569B和C7258中的滴定

如表1所示，雜交噬菌體比CTXΦ更有效的轉導CT基因，所述CTXΦ是這些基因的常規載體。
這些結果指出了在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株中VGJΦ介導的CTXΦ傳遞的重要性，并且考慮到功能性受體MSHA在這些細菌菌株中的普遍性，所述結果強調了其關聯性。
實施例3.CTXΦ的運動，其機制和毒力逆轉用VGJΦ感染攜帶活性CTXΦ噬菌體的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)O1或O139菌株產生感染性顆粒，該顆粒的CTXΦ噬菌體基因組插入到VGJΦ的基因組中。這些雜交噬菌體顆粒命名為HybPΦ。用測定攜帶卡那霉素標記(HybPΦ-Kn)的雜交噬菌體的方法測定HybPΦ的滴度，測定時使用不同的菌株做指示菌株。所得滴度如表1所示。
從來源于569B(HybPΦ-Kn)菌株的制備物純化HybPΦ-Kn，對單鏈測序以測定CTXΦ和VGJΦ之間的連接。
如圖2表示共整合結構及兩個序列中連接的核苷酸序列，這闡明了VGJΦ向其它霍亂弧菌(Vibrio cholerae)轉導CTXΦ的機制。HybPΦ-Kn使用與VGJΦ相同的受體即MSHA進入霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)1333菌株是現有技術報道過的減毒克隆，與用于獲得本發明衍生物的菌株類似。該菌株是致病C6706菌株的衍生物。如圖4所示，乳鼠接種105個菌落形成單位的菌株1333沒有致死效應，即使菌株在隨后的15天中一直定居也沒有致死效應。進行幾個試驗來測定其毒力，證實了HybPΦ-Kn感染對毒力逆轉的作用。105個菌落形成單位劑量的菌株1333沒有致死效應，而C6706和1333(HybPΦ-Kn)菌株具有非常類似的致死模式，接種的小鼠存活時間不超過第5天(圖4)。
實施例4.VGJΦ受體，MSHA菌毛在不同培養條件下的組成型表達將霍亂弧菌(Vibrio cholerae)C7258、C6706和CA401菌株的MSHA菌毛主要亞單位在不同培養基中培養來研究MshA的表達。所用培養基為LB pH 6.5(NaCl，10g/l；細菌triptone(bacteriological triptone)，10g/l；酵母提取物，5g/l)、AKI(細菌蛋白胨，15g/l；酵母提取物，4g/l；NaCl，0.5g/l；NaHCO3，3g/l)、TSB(酷蛋白胰消化物，17g/l；大豆種子木瓜蛋白酶消化物，3.0g/l；NaCl，5g/l；二堿式磷酸鉀，2.5g/l；葡萄糖，2.5g/l)、Dulbecco′s(葡萄糖，4.5g/l；HEPES，25mm；吡哆醇，HCl，NaHCO3)，無蛋白雜交瘤培養基(不含血清和蛋白的合成制劑，添加有NaHCO3，2.2g/l；谷氨酰胺，5mg/l；酚紅，20g/l)和Syncase(NaH2PO4，5g/l；KH2PO4，5g/l；酪蛋白氨基酸，10g/l；蔗糖，5g/l和NH4Cl，1.18g/l)。所有情況下，將一個菌落接種于50ml培養肉湯中，并于37℃在旋轉振蕩器中培養16小時，但AKI的條件不同，使用AKI時菌株先于30℃靜止培養4個小時，然后于37℃在旋轉振蕩器中培養16小時。在每種情況下，均通過離心來收獲細菌生物量并用于制備細胞裂解液。采用單克隆抗體2F12F1對mshA進行免疫檢測，通過Western印跡分析等量細胞裂解液。使用MSHA突變菌株KHT46為試驗的陰性對照。除了陰性對照菌株KHT46外，所有研究的菌株均在所有測試培養條件下都顯示了產生MshA的能力。同樣，在前述條件下培養的所述菌株在相同滴度或者等于或高于1∶16滴度，能凝集雞紅細胞(甘露糖敏感)，并可被VGJΦ-Kn有效地感染，顯示了高于1010顆粒/ml培養物的滴度。
實施例5.獲得MSHA表達缺陷的自發突變體及評估其對感染的抗性來源于于霍亂弧菌(Vibrio cholerae)C6706(O1，The Tor，Inaba)的KHT46菌株，MSHA抑制突變體顯示了對VGJΦ、VGJΦ-Kn和雜交噬菌體HybPΦ感染的耐受狀態。但是，它是致病菌株，這不是本發明申請作者的財產，也不是提供它的法人古巴哈瓦那市國家科學研究中心的財產。
使用霍亂毒素基因的抑制突變體來獲得本發明表面MSHA表達缺陷的自發突變體，其中在獲得所述自發突變體的期間，所述抑制突變體影響了它們裝配細胞表面中MSHA的能力。這些突變體雖然可以產生MSHA的結構亞基，但不在其表面進行裝配，所以不具有甘露糖敏感性血細胞凝集的可檢測滴度，在競爭性ELISA中也不會吸附抗MSHA的特異性單克隆抗體的活性。由于該表型特別穩定，按Campos等的專利WO 99/35271“V.cholerae v accine candidates and the methods of theirconstructing”及Robert′s的論文(Vaccine，14卷，16期，1517-22，1996)所述方法對這些突變體進行基因操作以在血凝素蛋白本酶基因中引入插入突變。所得突變體命名為JCG01和JCG02，均屬于O1血清組、El Tor生物型和Ogawa血清型。
JCG01和JCG02對VGJΦ噬菌體變體VGJΦ-Kn噬菌體的感染顯示了耐受性，VGJΦ-Kn噬菌體攜帶有卡那霉素抗性標記。具有證明的滴度1011單位/ml的VGJΦ-Kn懸液不能感染所述菌株(檢測不到滴度，低于5單位/ml)。除了在依賴于MSHA的血細胞凝集中總的損害外，這種對VGJΦ-Kn感染的耐受性狀態對應于相對于它們親本(1∶32)的JCG01和JCG02菌株中非常低的滴度(1∶2)。同樣，這些突變體的整個細胞在競爭性ELISA中不能抑制抗MSHA單克隆抗體(2F12F1)與固定于固相上的MshA的相互作用。但是，依據免疫印跡試驗看，兩個菌株均產生了主要結構亞基MshA，表明該蛋白雖然已產生了但并沒有在細胞表面正確地裝配。這些突變體可以證明本發明的理念并可以通過它們獲取抑制突變體。
從其它霍亂疫苗侯選物開始獲得mshA基因的抑制突變體用聚合酶鏈反應，利用下面的寡核苷酸CNC-8125，ATG ATC GTG AAG TCGACT ATG(21mer)；CNC-8126 CAG CAA CCG AGA ATT HERE ATC ACC ACG(27mer)；CNC-8127，ATT CTC GGT TGC TGG AAC TGC TTG TG(26mer)；和CNC-8128，GCT CTA GAG TAT TCA CGG TAT TCG(24mer)擴增mshA結構基因每個側翼約1200bp堿基對的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)N16961基因組兩個片段獲得mshA結構基因抑制突變體。獨立地克隆擴增的片段并在體外裝配以產生pΔmshA克隆。該克隆含有片段的順序和方向與細菌染色體中的片段相同，只是mshA基因的編碼區已經從序列內部被抑制了。攜帶抑制的片段從前面的質粒以Sal I/Xba I片段在自殺載體pCVD442中進行亞克隆以獲得質粒pSΔmshA。
pSΔmshA質粒用于以傳統的等位基因置換方法來抑制霍亂弧菌(Vibriocholerae)疫苗菌株中染色體mshA基因。為此，將pSΔmshA導入大腸桿菌(E.coli)SM10λpir菌株中并以細菌接合的方式向霍亂弧菌(Vibrio cholerae)遷移。所得克隆在添加有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基板上進行氨芐青霉素抗生素抗性篩選。由于通過染色體mshA基因的一個側翼片段與質粒pSΔmshA的一個側翼片段之間進行同源重組，起始了兩者之間的共整合的方法，質粒整合在受體弧菌的染色體中，這些克隆大部分都生長出來了。Sothern印跡試驗驗證了這一事件，其中用限制性酶Sma I消化10個克隆的總DNA并與從質粒pSΔmshA獲得的探針(Sal I/Xba插入片段)進行雜交。我們感興趣的克隆是那些產生21000堿基對條帶的克隆。本試驗中親本菌株的類似對照產生了13000堿基對條帶。立即將足量的克隆保藏于-70℃LB甘油中。然后取其中3個克隆在不含抗生素選擇壓力的條件下培養，以便使消除基因復制的同源重組事件得以發生。可以通過抑制原始基因結構(完整mshA基因)并用質粒中存在的突變拷貝(抑制mshA基因)置換來完成，如圖3所示。用Southern印跡分析突變基因置換了完整基因的克隆，并以12000堿基對條帶的出現來進行鑒別。最后，篩選mshA基因被抑制的克隆并作為疫苗侯選物適當地保藏(冷凍于-80℃添加有20％甘油的LB中)。對構建了mshA抑制突變體的各克隆進行此操作。
血清學鑒定在此文獻所述的疫苗菌株中導入各個突變后，檢查每種衍生物對應于原始血清型的脂多糖的正確表達。為此，從新鮮培養板收集細胞，重懸于鹽水(NaCl，0.9％)中并立即用Ogawa、Inaba或O139弧菌特異性的合適凝集反應血清進行檢驗。
抗霍亂疫苗產生的主要免疫應答抗LPS，因此用與特異性抗血清的凝集反應證實對應于本發明中各個菌株的抗原表達。
乳鼠中定居測定用乳鼠中定居測定(Herrington等，J.Exper.Med.1681487-1492，1988)來測定各菌株的定居能力。通過口胃途徑將105-106接種量弧菌以50ul的體積施用給至少5只乳鼠的各組動物。18-24小時后于30℃將小鼠處死，取出腸并進行勻漿，將稀釋液涂平板于突變體生長的適合培養基中。
表2.本發明疫苗菌株的定居能力


所有菌株均顯示有充分的定居能力以用作活疫苗侯選物。需要定居以產生強免疫學應答，因為細菌的繁殖增加了與粘膜免疫系統相互作用的持續時間。這種情況下，盡管沒有霍亂的完美模型，乳鼠給出了隨后各菌株在人類中定居的充足的途徑。
運動性測定良好分離菌落的細胞加載在接種環的頂端，該接種環起始于主培養板并朝向活力檢測的培養板(LB，0.4％瓊脂)，將環的尖端插入瓊脂深2～3mm。孵育24小時后測定30℃時各菌落的擴散直徑。距接種點的直徑達3mm或更小的細菌菌株可認為是非運動型的。細菌生長的直徑超過3mm時可認為是有自動力的。結果表明本發明包括的菌株均是運動型的。
實施例6.篩選和構建疫苗侯選物的方法，該疫苗侯選物用作本發明所公開的方法修飾的起始菌株篩選我們庫中的五株致病菌作為起始微生物，因為其不能與VGJΦ序列雜交。這些菌株是霍亂弧菌(Vibrio cholerae)C7258(O1，El Tor，Ogawa，Perú，1991)、C6706(O1，El Tor，Inaba，Perú，1991)、CRC266(O139，La India，1999)、CA385(Clásico，Ogaw)和CA401(Clásico，Inaba)。
本實施例中公開的方法不是本發明的目的。它們更構成了用于獲得減毒菌株的方法的詳細描述，所述減毒菌株構成了本發明中所要求保護的突變體。這些突變體的特征是它們耐受VGJΦ和雜交VGJΦ∷CTXΦ的感染，所述雜交VGJΦ∷CTXΦ從實施例4和5所述方法獲得。
下面我們描述在所述突變適于用本發明的方法修飾前，用于以等位基因置換的方法向霍亂弧菌(Vibrio cholerae)中引入不同組突變的自殺質粒。讀者應注意到本發明要求保護的菌株除了損害MSHA菌毛正確表達的突變外，還有(a)霍亂腸毒素基因或整個CTXΦ噬菌體的缺失突變及(b)被熱解纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)內切葡聚糖酶A基因中斷的血凝素蛋白酶基因。它們還可以有可選地基因(c)lysA、(d)metF、(e)VC0934(編碼糖基轉移酶)和(f)thyA中的突變。
(a)為了通過滅活霍亂腸毒素基因或使CTXΦ原噬菌體缺失來構建不產毒的菌株，使用了自殺質粒pJAF(Benitez y cols，1996，Archives ofMedical Research，27卷，3期，275-283頁)。該質粒從pBB6質粒獲得(Baudry y cols，1991，Infection and Immunity60428)，pBB6含有來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)569B的插入片段，其編碼ace、zot、ctxA和ctxB。由于缺失古典弧菌中ctxAB操縱子的3’端RS1序列，該質粒中ctxAB拷貝下游的EcoR I位點位于未確定功能的側翼DNA。通過缺失ScaI內部片段對pBB6質粒進行修飾從而產生pBSCT5質粒，其含有失去zot和ctxA功能基因的重組區域。然后插入EcoRI接頭使pBSCT5的PstI突變成EcoRI，得到pBSCT64，將所得EcoRI片段亞克隆入pGP704的EcoRI位點從而得到pAJF。
(b)為了構建HA/P表達受影響的菌株，使用了自殺質粒pGPH6。該質粒通過不同的步驟構建。首先將含hap基因的質粒pCH2(Hase y Finkelstein，1991，J.Bacteriology 1733311-3317)在位于hap編碼序列中的StuI位點線性化，所述hap基因位于來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)3083的3.2kb HindIII片段中。將含celA基因的3.2kb HindIII片段從pCT104質粒(Cornet y cols，1983，Biotechnology 1589-594)切除并亞克隆入pCH2的StuI位點，得到pAHC3。將含pAHC3的插入片段以HindIII片段亞克隆到pUC19衍生物從而得到pIJHCI，該pUC19衍生物具有位于BglII位點側翼的多克隆位點，其中所述pAHC3含有被celA基因插入失活的hap基因。將該質粒的BglII片段亞克隆入pGP704從而產生pGPH6，其含有帶遺傳性hap∷celA結構的6.4kb片段，hap基因沒有功能。
(c)和(d)構建lysA或metF基因突變體時，使用自殺質粒pCVlysAΔ1或pCVMΔClaI。為了構建這些質粒，從霍亂弧菌(Vibrio cholerae)C7258 PCR擴增lysA和metF基因，各基因使用一對寡核苷酸。寡核苷酸購自Centro de IngenieríaGenética和Biotecnología，Ciudad de La Habana，古巴。引物的核苷酸序列為(lysA)(P6488)5′-GTA AAT CAC GCT ACT AAG-3′和(P 6487)5′-AGA AAA ATG GAAATGC-3′和(metF)(P 5872)5′-AGA GCA TGC GGC ATG GC-3′和(P 5873)5′-ATACTG CAG CTC GTC GAA ATG GCG-3′。將擴增子克隆入質粒pGEMT(Promega)和pIJ2925(Janssen和cols，1993，Gene 124133-134)，從而獲得重組質粒pGlysA3和pMF29，其分別含有lysA和metF基因的活性拷貝。用核苷酸測序來鑒定各基因。
體外將克隆的metF和lysA基因中ClaI(246堿基對)和PstI/AccI(106堿基對)內部片段缺失，使之突變。最后的情況下，設計的策略是保留產生失活基因產物的開放閱讀框以避免在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)lysA突變體的構建時或構建后產生極性效應。將各失活的基因以BglII片段克隆入自殺載體pCVD442中，隨后導入目標霍亂疫苗侯選物中。含lysA等位基因的自殺質粒命名為pCVlysAΔ1，含metF等位基因的自殺質粒則命名為pCVMΔClaI。
(e)構建VC0934基因突變體時，我們構建并使用自殺質粒pCVDΔ34。此時，以來自菌株N16961的總DNA為模板進行PCR擴增VC0934基因，所用引物為5′-GCA TGC GTC TAG TGA TGA AGG-3′和5′-TCT AGA CTG TCT TAA TAC GC-3′。將擴增子克隆入質粒pGEM5Zf T載體中，得到質粒pGEM34；用限制性內切酶NarI/BglII在VC0934編碼序列中缺失270個堿基對。用klenow酶補平末端后，質粒重新成環，從而得到pG34。所得失活的基因亞克隆入用SalI和SphI消化的自殺載體pCVD442中，得到質粒pCVΔ34。該質粒用于制備野生型基因的等位基因置換。
(f)構建thyA表達缺陷的突變體時，構建并使用pEST自殺質粒。構建該質粒步驟包括將來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)C7258的thyA基因以EcoRI-HindIII染色體DNA片段克隆入pBR322中，得到pVT1(Valle和cols，2000，Infection andImmunity 68，11期，6411-6418頁)。從該質粒位于BglII和MluI位點間的thyA基因缺失300堿基對的內部片段，得到pVMT1。該缺失去除了編碼蛋白Thimidilate合酶中第7～105個氨基酸的DNA片段。將所突變的thyA基因以EcoRI-HindIII切割出來，將末端平端化然后以和β-半乳糖苷酶基因相同的方向克隆入pUC19的SmaI位點，得到pVT9。所得基因以SacI片段從pVT9亞克隆入pCVD442，所得質粒命名為pEST。該最終構建體用于制備目標菌株中野生型基因的等位基因置換。
所述的自殺載體是模式系統，可用于將長期(secuencial)突變導入霍亂弧菌(Vibrio cholerae)疫苗侯選物中。
這些載體所編碼基因的等位基因置換按下述步驟操作第一步，含上述所選等位基因的自殺載體通過接合從大腸桿菌(E.coli)供體SM10λpir轉移到霍亂弧菌(Vibrio cholerae)受體，后者是所計劃修飾的個體。此步驟完成后產生了抗氨芐青霉素的共整合體。因此該接合事件所得克隆在添加氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板中篩選。
此第一階段的操作方法如下用目的自殺載體轉化的供體菌株SM10λpir在添加氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板(NaCl，10g/l；細菌triptone，10g/l，及酵母提取物，5g/l)中培養，而受體菌株，即需要修飾的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株則在LB平板中培養。培養條件為37℃過夜。將一個供體菌落和一個受體菌落以劃線方式接種到新的LB平板中。先將供體菌株以一個方向劃線，然后受體菌株(霍亂弧菌(Vibrio cholerae))以相對的方向劃線。這種垂直而重疊的劃線可以保證培養時兩菌株緊密接觸。接下來將平板于37℃孵育12小時，用5ml NaCl(0.9％)收集并取200μl的102、103、104和105稀釋液分散到LB-氨芐青霉素-多粘菌素B平板中，篩選自殺質粒轉化了的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)克隆和反篩選供體菌株大腸桿菌SM10λpir。每次處理所得的克隆取10個凍存于-80℃的LB-甘油(20％)中，用于第二步分析。
第二步，用對進行突變過程目的基因特異性的探針進行Southern印跡雜交，目的是檢測前一步所保存克隆中正確共整合體的結構。自殺質粒以同源重組方式整合入正確靶點的克隆用特殊染色體結構的存在來鑒別。該結構含有一拷貝野生型基因和一拷貝突變等位基因，兩者只被質粒載體序列分開。這一特別結構在具有鑒定其的特異性探針的Southern印跡中產生了特異性雜交模式。將合適的克隆凍存于-80℃的LB甘油中。
第二步包括下列步驟首先，按照常規方法(Ausubel和cols，Short protocols inMolecular Biology，第三版，1992，2.4單元，2-11頁，basic protocol)將第一步所得各個克隆的總DNA分離出來。從祖菌株分離出來的總DNA作為對照。然后用合適的限制性酶消化10個克隆的總DNA，這一點會在下文述及。取各個克隆、母菌株的1μgDNA進行消化，然后在瓊脂糖凝膠的平行泳道中電泳。在堿性條件下將凝膠的DNA內含物印跡到膜內(Ausubel和cols，Short protocols in Molecular Biology，第三版，1992，2.9A單元，2-30頁，alternate protocol 1)。
將印跡于80℃孵育15分鐘進行固定。然后通過預雜交將膜內的游離位點封閉，隨后用各個突變的特異性探針進行探測。
下面是依據靶基因，鑒別各個克隆共整合體期望結構的限制性酶、探針(通過隨機引物方法用地高辛配基標記)及雜交片段大小的詳細情況a)對于CTXΦ噬菌體基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶HindIII消化，置于膜中后立即與得自pBB6質粒PstI-EcoRI片段的探針雜交。，目的克隆是那些具有在Southern印跡中產生兩個條帶的基因結構的克隆，所述條帶一條為10000堿基對，另一條為7000堿基對。作為對照的親本菌株在相同Southern印跡試驗中產生17000堿基對的單一條帶。
b)對于hap基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶Xho I消化，置于膜中后立即與獲自pCH2質粒中3200堿基對Hind III片段的探針雜交。目的克隆是那些具有在Southern印跡中產生單個16000堿基對條帶的基因結構的克隆。作為對照的親本菌株在相同的Southern印跡試驗中產生6000堿基對的單一條帶。
c)對于lysA基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶Xho I消化，置于膜中后立即與獲自pCVΔlysA1質粒中Sph I/Sma I片段的探針雜交，該質粒含突變lysA基因。目的克隆是那些具有在Southern印跡中產生單個12 500堿基對條帶的基因結構的克隆。作為對照的親本菌株在相同的Southern印跡試驗中產生5 200堿基對的單一條帶。
d)對于metF基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶Nco I消化，置于膜中后立即與獲自pCVMΔlaI質粒中BglII片段探針雜交，該質粒含突變metF基因。目標克隆是那些具有在Southern印跡中產生單個12000堿基對條帶的基因結構的克隆。作為對照的親本菌株在相同的Southern印跡試驗中產生5000堿基對的單一條帶。
e)對于VC0934基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶Ava I消化，置于膜中后立即與獲自pCVDΔ34質粒中Sal I/Sph I片段的探針雜交，該質粒含突變VC0934基因。目的克隆是那些具有在Southern印跡中產生兩個條帶的基因結構的克隆，所述條帶一條為1600或1900堿基對，另一條為8200或7900堿基對。作為對照的親本菌株在相同的Southern印跡試驗中產生3500堿基對的單一條帶。
f)對于thyA基因的抑制突變體來說，各克隆的總DNA用限制性酶Bstx I消化，置于膜中后立即與獲自pEST1質粒中Sac I片段的探針雜交，該質粒含突變thyA基因。目的克隆是那些具有在Southern印跡中產生單個9 600堿基對條帶的基因結構的克隆。作為對照的親本菌株在相同的Southern印跡試驗中產生2400堿基對的單一條帶。
第三步，取3個攜帶了前面結構之一共整合體的目的克隆在沒有抗生素選擇壓力的條件下培養，以便通過同源重組及所得克隆擴增的方式讓自殺性載體丟失。在所述克隆中，自殺性載體的丟失伴隨著該細菌遺傳天賦中突變型或野生型的兩個拷貝基因中的一個拷貝丟失。
第四步，將前述培養物的稀釋度在平板中擴大以獲取分開的菌落，將其復制到添加了氨芐青霉素的平板中評估哪些克隆對氨芐青霉素敏感。將所述對氨芐青霉素敏感的克隆如前所述凍存。
第五步，通過用對目的基因(a、b、c、d和f中所述)中各個基因特異的探針進行Southern印跡研究來驗證目的等位基因突變拷貝保留在染色體中的克隆。這些目的克隆擴大產生一個工作庫并實施其后來的鑒定，和引入本發明申請中保護目的的修飾。
下面我們按修飾目的的各個基因，詳細描述鑒別各個突變體中期望結構所用到的限制性酶、探針和雜交片段的大小a)分析CTXΦ原噬菌體中的突變體時，總DNA用限制性內切核酸酶Hind III消化。當置于膜中后立即與來源于pBB6質粒Pst I-EcoR I片段的探針雜交。Southern印跡中不出現雜交條帶的那些克隆就是目的克隆。
b)分析失活的hap等位基因突變體時，總DNA用限制性酶Xho I消化，當置于膜中后立即與來源于pCH2質粒中編碼hap基因的3200堿基對Hind III片段的探針雜交。Southern印跡中出現單個約9000核苷酸堿基對條帶的那些克隆就是目的克隆。
c)分析lysA基因突變體時，總DNA用限制性酶Xho I消化，當置于膜中后立即與來源于pCVΔlysA質粒中分離的Sph I/Sma I片段的探針雜交，所述pCVΔlysA質粒含lysA突變基因。Southern印跡中基因結構可產生單個約5000堿基對條帶的那些克隆就是目的克隆。
d)分析metF基因突變體時，總DNA用限制性酶Nco I消化，當置于膜中后立即與來源于pCVMΔClaI質粒中所包含的BglII片段的探針雜交，所述pCVMΔClaI質粒含metF突變基因。Southern印跡中基因結構可產生單個約4 700堿基對條帶的那些克隆就是目的克隆。
e)分析VC0934基因突變體時，總DNA用限制性酶Ava I消化，當置于膜中后立即與獲自pCVDΔ34質粒中Sal I/Sph I片段的探針雜交，所述pCVDΔ34質粒含體外獲得的VC0934突變基因。Southern印跡中基因結構可產生單個約3 200堿基對條帶的那些克隆就是目的克隆。
f)分析thyA基因突變體時，總DNA用限制性酶Bstx I消化；印跡與獲自pEST1質粒Sac I片段的探針雜交，所述pEST1質粒含thyA基因。Southern印跡中基因結構可產生單個約2 100堿基對條帶的那些克隆就是目的克隆。
實施例7.用凍干方法保藏疫苗菌株的方法下面的實施例中，微生物于37℃在LB肉湯中培養，同時以150rpm和250rpm進行軌道式振搖，直到對數生長期。于4℃以5000和8000rpm轉速離心10-20分鐘收獲細胞，然后與具有良好保護微生物性質的成分混合，使細胞濃度為108～109細胞/ml。每個10R型培養瓶分配2ml。凍干循環包括將材料深度冷凍，于-30℃和-39℃之間保持每種產物進行8-12小時進行初級干燥，以及于18℃和25℃溫度之間進行不超過12小時的次級干燥。生存力喪失定義為凍干前后或凍干材料貯藏前后的CFU/mL的對數差異，其中所述凍干物質通常溶于1.33％碳酸氫鈉溶液。
制劑L+E+SBLR01、JCG03和ESP05菌株通過前述凍干方法，在制劑類型L(5.0％)、E(2.0％)和S(2.0％)中加工。冷凍的溫度為-60℃。初級干燥時產品溫度在-32℃保持10小時，次級干燥時溫度在22℃保持12小時。凍干物質在1.33％碳酸氫鈉溶液是速溶的。溶解后立即計算生存力損失，相對于凍干前活細胞的濃度來說，BLR01、JCG03和ESP05的損失分別為0.30、0.43和0.60個對數數量級。
L+P+S及L+E+S制劑與脫脂乳+蛋白胨+山梨糖醇制劑的對比菌株JCG03用兩種制劑凍干一種類型為L(6.0％)、P(2.0％)和S(2.0％)，另一種類型為L(5.5％)、E(1.8％)和S(1.6％)。該菌株也在6.0％脫脂乳、2.0％蛋白胨和2.0％山梨糖醇制劑中作為對照制劑進行凍干。冷凍于-60℃完成。初級干燥時產品溫度在-33℃保持12小時，次級干燥時溫度在20℃保持14小時。制劑L+P+S或L+E+S的凍干物質在1.33％碳酸氫鈉溶液是速溶的，而對照制劑的凍干物質稍微慢一點。溶解后立即計算生存力損失，相對于凍干前活細胞的濃度，L+P+S、L+E+S和對照制劑的損失非常類似，分別為0.48、0.52和0.55對數級。
濕度和氧氣的影響菌株JCG03用前面一段所述三種制劑凍干，凍干后立即暴露于同時作用的濕度和氧氣中。這一點這樣實現在相對濕度為11％(由氯化鋰飽和溶液產生)的條件下，樣品在無菌玻璃干燥器空氣中于25℃保持3天。L+P+S、L+E+S和對照制劑的生存力損失分別為1.61、1.10和3.43對數級，說明本發明的目的制劑能比對照制劑保證更大地濕度和氧氣保護。
貯藏溫度的影響菌株TLP01、JCG01和ESP05用L(5.5％)、E(2.0％)、S(2.0％)型制劑凍干。冷凍于-58℃完成。初級干燥時產品溫度在-30℃保持12小時，次級干燥時溫度在20℃保持14小時。凍干物質在1.33％碳酸氫鈉溶液是速溶的。溶解后立即計算生存力損失，相對于凍干前活細胞的濃度，TLP01、JCG01和ESP05的損失分別為0.43、0.55和0.44個對數級。凍干物質于8℃或-20℃貯藏1年。表3為所獲得的生存力喪失結果。
表3.生存力損失(貯藏1年)

實施例8.本發明的菌株及其特征本發明的菌株已保藏于比利時微生物協調保藏中心(BCCM)/根茨大學微生物實驗室(Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling(LMG))霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG01(LMG P-22149)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG02(LMG P-22150)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG03(LMG P-22151)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)KMD01(LMG P-22153)
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)KMD02(LMG P-22154)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)KMD03(LMG P-22155)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG04(LMG P-22152)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP01(LMG P-22156)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP02(LMG P-22157)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP03(LMG P-22158)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)RAF01(LMG P-22159)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP01(LMG P-22160)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP02(LMG P-22161)以及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP03(LMG P-22162)它們如表4所述。
表4.本發明的菌株


本發明優點本發明提供了一種使活霍亂疫苗侯選物不能通過VGJΦ噬菌體介導從CTXΦ噬菌體重新獲得霍亂毒素基因和它毒素，因此不能通過該機制發生毒力逆轉的方法。
同時還提供了確保活霍亂疫苗侯選物萬一因VGJΦ噬菌體的特殊轉導后重新獲得CTXΦ而不會傳播CTXΦ所所需的信息。
本發明提供了MSHA突變體作為活霍亂疫苗侯選物的用途，由于抗VGJΦ介導的CTXΦ感染，其顯示了增加的環境安全性。
本發明在活霍疫苗侯選物的設計和構建時提供了一種新的特性來改善其環境安全性，也就是說這些疫苗萬一重新獲得CTXΦ也不能傳播通過VGJΦ介導的CTXΦ基因。
上述特性可以應用于已經制備的活霍亂疫苗侯選物以減少其對環境潛在的影響，其中在志愿者研究中所述疫苗已表現出可接受的反應原性。
本發明也提供了保藏所有上述提及的活霍亂疫苗侯選物凍干的制劑，并改善其耐受容器中殘余氧氣和濕度的能力。
這些制劑也可確保凍干的活霍亂疫苗侯選物粉末在碳酸氫鈉緩沖液中快速重構，使操作更容易，在此過程中保護疫苗并改善感官特征，特別是與凍干片及重構物的視覺效果有關的感觀特征。
本文所提供用于活霍亂疫苗保藏及凍干的制劑之一不含通常會添加到許多制劑中以凍干人類疫苗的牛源組分。
序列表<110>Centro Nacional de Investigaciones Cientificas(CNIC)(森特拉·耐科奧諾·德·因威斯迪蓋什斯·西恩蒂菲科斯(CNIC))<120>用于口服接種的凍干形式的具有改良的生物安全性特征的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)減毒株<130>CUA1V050005943<141>2004-02-19<150>CU 2003-0039<151>2003-02-20<150>CU 2003-0084<151>2003-04-17<160>1<210>1<211>7542<212>DNA<213>霍亂弧菌(Vibrio cholerae)絲狀噬菌體<220>
<221>ORF359 CDS<222>(1)..(1077)<223>與來自于其它絲狀噬菌體的復制蛋白pII相似<220>
<221>ORF112 CDS<222>(1085)..(1420)<223>假設的蛋白質<220>
<221>ORF81 CDS<222>(1433)..(1675)<223>假設的蛋白質<220>
<221>ORF44 CDS<222>(1690)..(1821)<223>與來自于其它絲狀噬菌體衣殼的主要蛋白質pVIII相似<220>
<221>ORF29 CDS<222>(1839)..(1925)<223>假設的蛋白質<220>
<221>ORF493 CDS<222>(1954)..(3432)<223>與來自于其它絲狀噬菌體衣殼的微量蛋白質pIII相似<220>
<221>ORF80 CDS<222>(3510)..(3749)<223>假設的蛋白質<220>
<221>ORF384 CDS<222>(3755)..(4906)<223>與來自于其它絲狀噬菌體的裝配蛋白質pI相似<220>
<221>ORF104 CDS<222>(5232)..(5543)<223>與來自于其它絲狀噬菌體的裝配蛋白質pI相似<220>
<221>ORF67 CDS<222>(7328)..(7528)<223>假設的蛋白質<220>
<221>ORF136 CDS<222>(6105)..(6112)<223>互補鏈推定的轉錄調節物I<220>
<221>ORF154 CDS<222>(6439)..(6900)<223>互補鏈推定的轉錄調節物I
<220>
<221>ORF58 CDS<222>(6439)..(6900)<223>互補鏈假設的蛋白質<400>1atgatacggt tcgccctgtc aaagttgacc acttggcttt tactttcgcc tatgcggact60tgcgccactt ggacaaaagc aacgaccaag actttatcaa tctacagatg cccgtttatc120acgagccaaa gacccgaacc aaggaacaag gcgcggtgtg ctctaccttg gaacaaatcg180agcatcatat ggaagcgcac cgaaacaaag tgtccaagat gctctttcat cgctttgatt240tgttcatgtc caaaatcatg gctttcgtta tcgcctatgc gtggtcgtgg ccttcatggt300tacaacgatt ctatggtcat tctcgatatg accggacaag ttgagtgtgg ccttgtcgga360attggcggaa acaacgatac cgtttttgtc caaatcaacg gcacggggtg caccaaactt420ttcgaccgta tcgactctaa gaagcttcat tggtggctcg ctcaggttct tggcattact480cgcttagttc gtctcgactt ggccgtggac gattacaccg gaaacttcga cgccaagtat540gcagagaaat gtttttatga gggagcattt cgcactgctc cacgggggca aggtccctca600atggttcctc ataaacgcat tacagaaaac ggcgctttga tggaagaagc aacgattgtc660ggctctcgtt cctcggcgat ttactggcgt atctacaaca aaaagcttga gcaaaaaatt720actgaccctg acctgatttg gtatcgaaac gaggttgagc tgaaaaagtg cgacatcgag780cttttagcca atcctgccgc ctcttttgcg ggtatctgcc ctttcgcggc ctctatcgag840tgtacgcctc cggttaagtt ctctcgcaac aaaaaggctc aaggtcttga atttatggct900cgcatcgcat gggttcgccg tcaatgtggc gtggcgttag cggaagttat cgccatgacg960caaggcgatt taggcgaagc attcgggatg cttatccctc acaaacatag acgccctgac1020tttgaattgc tcggcgttcc tgattcatac acacaactga aaaacacact atggagttaa1080ggtaatggct aacatcactg gcatcgtcat caaaacattt cctaaatcgg gtaccacgat1140
tgcagagctg aacgttcttc gccctgttga aaccgtcaac gttgagaagt ttgctcaata1200cggtttgggg ctaaacacgg atattccttt caataagcag ccgctgcgta tcgaacctac1260ttacgccaag cgtttgattg aaacacgcgc ttttgttcct aaccgtgaat atgacattcg1320ctttggtagt aaccctgacg acccattgga agtcgttgct gttgagctca tccccaagga1380tgacgacctt aaaaaatact ttactgaaac acttaaaaag taaggaagtt ttatgcctgt1440gtgcgctctc ccaaatagtc agggattcct agcggttact gacaagccac tgaatgaatg1500tgacggcggt tatgttgctt tcactattca ggattacgac tacttgatga gctacacacg1560cataacccca accgatgccg gaacggcctt tagcttcggt tttatggctg tattcgctct1620cggttattta tatacctatg ccgtttatat cggtaaaaaa ctcatcaacc tcttataagg1680agatacatca tggctgatat ctttggcgca attgattttg caggtgtcgc tgctcttgtt1740actgctgctg gtgttgccat cattggcatt actatggctt tcaaaggcat ctcacttggc1800aaacgcgctg ttaacaaagc ctaatcggta actgaactat gcttattgcc ctgcatgata1860ttcagttaat tattttcgcg ttgctgggtg gcatgtcggg ttttatagct gctctcaact1920tccgataaca aaggggctaa cgcccctttt tttatggtta tgtttatgcg caaatttttt1980attatctctc ttgtcattag cttatatttc accgttcttc ctgcttttgc tgcttatcag2040ttaccttttg accaaacaaa gactttctca actgttcagg ccgccgctga gtattatgtc2100aatttacttg gtggtacttc atgcaaggct gacggtaaca ggtttaaaat ttacagagtt2160aaatctattg gcgacccctc ttttgttatt caacaagaaa cctatttaga caacaaatgt2220caggtctttt catcaaaggg tgatatcagc gttactctta ttgttgttga cgaccctacc2280acctgcgagg cttcaaaagg tcaaacagga aaagtcggtt ggaattctta cttctggggc2340tcggcaactc catcccgtta tatctgctct tctgcttatg gtggttgtgt tgccctcact2400ggtgaccatt tatgtattaa tattgaccct gaagcattga aaaatgaccc gtctctttat2460gattgcgatg ctctctatat cgttcaggat actccttgtt ccccttctgg tgattatcca2520ttttgtaccg atgagaattg ctcttctttt cttcctgagc cgaatcctaa ccctaaccct2580
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PCT/RO/134表PCT/RO/134表的中文譯文




僅受理局使用

僅國際局使用

權利要求
1.具有改良的環境安全性，用于口服接種抗霍亂的活霍亂弧菌(Vibriocholerae)減毒株，其特征在于·抗雜交重組噬菌體VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)感染及隨后的毒力轉化，·不能通過VGJФ∷CTXФ雜交重組體(SEQ IDNo 1)出現進一步傳播引入的CTXФ，以及·以冷凍干燥的制劑存在，其包含下列物質乳糖、蛋白胨、酵母提取物和山梨糖醇，總濃度不超過10％。
2.如權利要求1所述的活減毒株，其中所述菌株的特征在于·由于損害細菌表面上VGJФ受體，MSHA菌毛正確裝配的突變，抗雜交重組噬菌體VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)感染，·由于它們的基因組中缺失VGJФDNA序列，不能通過VGJФ∷CTXФ雜交重組體(SEQ IDNo 1)出現進一步傳播引入的CTXФ，以及·以冷凍干燥的制劑存在，其包含下列物質乳糖(濃度范圍為4.0～6.0％)、蛋白胨(濃度范圍為0.5～2.0％)、山梨糖醇(濃度范圍為0.5～2.0％)或包含酵母提取物(濃度范圍為0.5～2.0％)和山梨糖醇(濃度范圍為1.0～2.0％)。
3.如權利要求1或2所述的活減毒株，其中所述菌株的特征在于由于損害細菌表面上VGJФ受體，MSHA菌毛正確和功能性裝配的自發和穩定突變，抗雜交重組噬菌體VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)的感染。
4.如權利要求1、2或3所述的活減毒株，其中所述菌株的特征在于其屬于下列O1血清組、El Tor生物型、Ogawa血清型霍亂弧菌(Vibriocholerae)菌株中的一種或多種(由BCCM、LMG國際保藏當局保藏)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG01(LMG P-22149)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG02(LMG P-22150)
5.如權利要求1或2所述的活減毒株，其中所述菌株的特征在于由于mshA基因中引入了損害細菌表面上噬菌體受體，MSHA菌毛的結構亞單元合成和其隨后表達的缺失，抗雜交重組噬菌體VGJФ∷CTXФ(SEQIDNo 1)的感染。
6.如權利要求1、2或5所述的活減毒株，其中所述菌株的特征在于其屬于下列El Tor生物型中O139及O1血清組、Ogawa血清型霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株中的一種或多種(由BCCM、LMG國際保藏當局保藏)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG03(LMGP-2215])·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)MD01(LMGP-22153)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)KMD02(LMG P-22154)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)KMD03(LMG P-22155)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)JCG04(LMG P-22152)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP01(LMG P-22156)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP02(LMG P-22157)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)ESP03(LMG P-22158)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)RAF01(LMG P-22159)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP01(LMG P-22160)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP02(LMG P-22161)·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)TLP03(LMG P-22162)
7.如權利要求1、2或5所述的活減毒株，其中所述菌株屬于現有霍亂疫苗無效抵抗的新出現的血清型。
全文摘要
本發明公開了用于口服免疫抗霍亂的新減毒活菌株，提供了可長期保藏并施用于人類的凍干劑型。這些菌株綜合了霍亂疫苗侯選物兩個最重要的性質。所述性質之一是使用這些菌株的人可以很好地耐受。這一性質已經通過突變得以實現，本領域內也有說明。另一性質是由于基因組中缺失VGJΦDNA以及mshA基因中的無效突變或是其它自發性突變使細菌表面易于缺失MSHA IV型菌毛，從而具有增強的環境安全性。這是可以預計的，因為VGJΦ是絲狀噬菌體，可與CTXΦ發生重組并傳播霍亂毒素基因。VGJΦ噬菌體以及VGJΦ－CTXΦ重組體以MSHA菌毛為受體。由于缺失MSHA菌毛，這些疫苗侯選物不能從重組的雜交VGJΦ－CTXΦ獲得CTXΦ。由于缺失VGJΦ，這些疫苗侯選物通過VGJΦ傳播CTXΦ的能力受到削弱。
文檔編號C07K14/28GK1780640SQ200480010101
公開日2006年5月31日 申請日期2004年2月19日 優先權日2003年2月20日
發明者雅維爾·坎波斯·戈梅, 托馬斯·馬塞利諾·莫雷拉·赫爾南德斯, 鮑里斯·路易斯·羅德里格斯·岡薩雷, 凱琳·馬雷羅·多米蓋茲, 埃瑞爾·馬迪內茲·古蒂瑞茲, 泰蓮納·亞米爾·萊多佩雷茲, 赫米尼亞·德拉卡里戴德·德爾蓋多·羅德里蓋茲, 卡里戴德·烏拉·維拉維森希奧, 拉斐爾·阿爾弗雷多·范多·卡爾贊達 申請人:森特拉·耐科奧諾·德·因威斯迪蓋什斯·西恩蒂菲科斯(Cnic)