從慢性淋巴細胞性白血病細胞衍生的多肽和抗體及其應用的制作方法

專利名稱：從慢性淋巴細胞性白血病細胞衍生的多肽和抗體及其應用的制作方法
技術領域：
公開了從慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞衍生的細胞系及其 在CLL和其它疾病的研究和治療中的應用。具體來說，本公開涉及了 一株被命名為"CLL-AAT"的CLL細胞系，該細胞系按照布達佩斯 公約的條款于2001年11月28日保藏于美國典型培養保藏中心 (Manassas, Virginia, USA) ， ATCC登記號為PTA-3920。
背景技術：
慢性淋巴細胞性白血病(CLL)是一種白細胞疾病，在西半球是 最常見的白血病形式。CLL代表了一組不同形式的與惡性淋巴細胞的 生長相關的疾病，這些淋巴細胞生長緩慢，但是生命期跨度延長。CLL 被分成不同的類型，包括例如典型的和混合型的B細胞慢性淋巴細胞 性白血病(B-CLL) 、 B細胞和T細胞前淋巴細胞性白血病、毛細胞 白血病和大的粒狀淋巴細胞性白血病。
在所有的不同類型的CLL中，B-CLL占了所有白血病的大約 30%。盡管它在年齡在50歲以上的個體中發生得更頻繁，但在較年輕 的人群中也越來越多地看見。B-CLL的特征表現為形態學上正常但生
物學上不成熟從而失去功能的B淋巴細胞的積累。淋巴細胞的正常功 能是與感染斗爭。但是，在B-CLL中，淋巴細胞在血液和骨髓中積累， 導致淋巴結腫脹。正常骨髓和血細胞的生產減少，病人通常經歷嚴重 的貧血以及低血小板計數。這可能引起危及生命的出血，以及由于白 細胞數量的減少而發展成嚴重的感染。
為了進一步了解象白血病這樣的疾病，重要的是要具有能夠用做 工具研究它們的病因學、發病機理和生物學的適當的細胞系。惡性人 B淋巴細胞類的細胞系的例子包括前B急性成淋巴細胞性白血病 (Reh)、擴散性大細胞白血病(WUS-DLCL2)和Waldenstrom巨球 蛋白血癥(WUS-WM)。不幸的是，大多數現有的細胞系不能代表臨 床上最常見的白血病和淋巴瘤的類型。
使用Epstein Barr病毒(EBV)在體外感染獲得了一些CLL衍生 細胞系、特別是B-CLL細胞系，它們是具有代表性的惡性細胞。這些 細胞系的表現型與體內腫瘤的表現型不同，B-CLL株的特征反而傾向 于與成淋巴細胞類的細胞系的特征相似。通過EBV感染的幫助使B-CLL細胞永生的嘗試很少獲得成功。其原因尚不清楚，但是已知這不 是由于缺少EBV受體的表達、結合或攝取。Wells等發現B-CLL細胞 停止在細胞周期的Gl/S期，并且與轉化相關的EBV DNA沒有表達。 這表明EBV與B-CLL細胞的相互作用與它和正常B細胞的相互作用 不同。EBV轉化的CLL細胞系更多表現為分化，具有與用EBV永生 的成淋巴細胞類的細胞系(LCL)更相似的形態。
以前已經建立了一株EBV陰性的CLL細胞系WSU-CLL (Mohammad等，(1996) Leukemia 10(1): 130-7)。但是還不知道有 其它這樣的細胞系存在。
在身體對疾病狀態包括癌癥和CLL的反應中有多種不同的機制 發揮作用。例如，CD4+輔助性T細胞通過為效應細胞提供刺激因子，
在針對各種惡性腫瘤的有效的免疫反應中發揮重要作用。細胞毒性T
細胞據信是消除癌細胞最有效的細胞，輔助性T細胞通過分泌Thl細 胞因子例如IL-2和IFN-Y來引發細胞毒性T細胞。在各種惡性腫瘤中， 已經顯示出輔助性T細胞的表現型與正常個體中發現的細胞相比有變 化。 一個顯著改變的特征是Thl細胞因子的產生減少，轉變成產生Th2 細胞因子。(參見例如Kiani等，Haematologica 88:754-761 (2003); Maggio等，Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56 (2002); Ito等，Cancer 85:2359-2367 (1999); Podhorecka等，Leuk Res 26:657-660 (2002); Tatsumi等，J Exp Med 196:619-628 (2002); Agarwal等，Immunol Invest 32:17-30 (2003); Smyth等，Ann Surg Oncol 10:455-462 (2003); Contasta 等，Cancer Biother Radiopharm 18:549-557 (2003); Lauerova等， Neoplasma 49:159-166 (2002)。)已經證實將這種細胞因子的轉變逆轉 向Thl的情況增加了 T細胞的抗腫瘤效應(參見Winter等，Immunology 108:409-419 (2003); Inagawa等，Anticancer Res 18:3957-3964 (1998))。
腫瘤細胞驅使輔助性T細胞的細胞因子的表達從Thl變為Th2 的能力之下的機制包括細胞因子例如IL-10或TGF-(3的分泌以及與免 疫系統的細胞相互作用的表面分子的表達。OX-2/CD200為一種在樹 突狀細胞表面表達的與免疫球蛋白基因家族的分子具有高度同源性的 分子，已經牽涉于免疫抑制中(Gorczynski等，Transplantation 65:1106-1114 (1998))，表明表達OX-2/CD200的細胞能夠抑制對Thl 細胞因子生產的刺激的證據已經提供。Gorczynski等在小鼠模型中證 實了在使用白血病腫瘤細胞的動物模型中OX-2/CD200 Fc的灌注抑制 了腫瘤細胞的排斥(Clin Exp Immunol 126:220-229 (2001))。
對治療患有癌癥或CLL的病人的方法進行改進是合乎需要的， 特別是改進它們增強T細胞活性的程度。
發明簡述
在一個實施方案中，提供了不是通過用EBV永生化而建立的惡
性來源的CLL細胞系。該細胞系從初級CLL細胞衍生而來，保藏于 ATCC，登記號PTA-3920。在優選實施方案中，細胞系是CLL-AAT。 CLL-AAT是從B-CLL初級細胞衍生的B-CLL細胞系。
另一方面，CLL-AAT細胞系被用來產生單克隆抗體，用于CLL 的診斷和/或治療。抗體的產生可以通過使用本發明的細胞作為免疫 原，在動物中引發免疫反應，再從中分離單克隆抗體。這些抗體的序 列可以被測定，抗體及其變異體可以通過重組技術生產。在這一方面 來說，"變異體"包括基于單克隆抗體序列的嵌合的、CDR-移植的、 人源化的和完全的人類抗體。
此外，可以使用本發明的細胞或從中衍生的多肽作為餌在靶特異 性的基礎上分離抗體，從而篩選從重組文庫衍生的抗體("噬菌體抗 體")。
另一方面，抗體的產生可以通過使用初級CLL細胞或從其衍生 的抗原來淘洗抗體文庫，然后使用一株CLL細胞系例如本發明描述的 CLL細胞系進一步篩選和/或表征。因此，提供了用于表征特異于CLL 的抗體的方法，其中包括評估抗體與CLL細胞系的結合。
另一方面，提供了鑒定在CLL細胞中獨特表達的蛋白的方法， 這利用了 CLL-AAT細胞系，使用本領域的專業技術人員熟知的方法， 例如免疫沉淀然后質譜分析。這些蛋白可以獨特表達在CLL-AAT細 胞系中，或獨特表達在來自CLL病人的初級細胞中。
可以使用CLL-AAT細胞系在基于細胞的分析中篩選小分子文庫 (許多可以購買到)，以鑒定能夠調節細胞的生長特性的試劑。例如， 調節CLL-AAT細胞系中的細胞凋亡、或抑制其生長和/或增殖的試劑 可以被鑒定。這樣的試劑是開發治療性化合物的侯選物。
從CLL-AAT細胞系分離的核酸可以被用于扣除雜交實驗以鑒定 CLL特異性的基因，或用于微陣列分析(例如基因芯片實驗)。其轉 錄在CLL細胞中被調節的基因可以被鑒定。以這種方式鑒定的多肽或 核酸基因產物被用做開發CLL的抗體或小分子療法的先驅。
在優選情況下，CLL-AAT細胞系可以被用來鑒定內生的抗體， 這些抗體與被細胞內化的細胞表面成分結合。這樣的抗體是治療應用
的侯選物。特別是在細胞質中保持穩定并保留細胞內結合活性的單鏈 抗體可以通過這種方式進行篩選。
另一方面，描述了一種治療方法，該方法中在病人中篩選被惡性 癌細胞上調的多肽的存在，并給病人施用與被上調的多肽的代謝途徑 相互作用的抗體。
本發明還涉及了一些方法，其中根據在患者中OX-2/CD200是否 被上調而作出決定，如果是的話，給患者施用與OX-2/CD200結合的 多肽。在另一個實施方案中，多肽與OX-2/CD200受體結合。
另一方面，本發明的方法被用來治療OX-2/CD200被上調的患者 中的疾病狀態，這是通過給患病的病人施用能夠結合OX-2/CD200或 OX-2/CD200受體的多肽來進行的。在一個實施方案中，用這些方法 治療的疾病狀態包括癌癥，在其它實施方案中具體指CLL。
附圖簡述


圖1簡要圖示了通過磁活化細胞分類方法(MACS)進行抗體文 庫的細胞表面淘洗中包括的典型步驟。
圖2顯示了全細胞ELISA的結果，證實了選定的scFv克隆與初 級B-CLL細胞的結合以及與正常的人類PBMC的不結合。在本圖和 其它圖中的符號2°+3°是指只用小鼠抗HA染色和只檢測抗小鼠抗體的 陰性對照孔。在本圖和其它圖中的符號RSC-S文庫是指從原始的兔
scFv未淘洗文庫中制備的可溶性抗體。在本圖和其它圖中的符號 R3/RSC-S庫是指從第三輪淘洗獲得的完整的scFv抗體庫中制備的可 溶性抗體。抗CD5抗體被用做陽性對照以證實在每個孔中放置了相等 數量的B-CLL和PBMC細胞。
圖3a和3b顯示了全細胞ELISA的結果，比較了選定的scFv抗 體與初級B-CLL細胞及正常的初級人B細胞的結合。抗CD19抗體被 用做陽性對照以證實在每個孔中放置了相等數量的B-CLL和正常B 細胞。其它的對照與圖2的圖例中描述的相同。
圖4a和4b顯示了全細胞ELISA的結果，用于確定scFv克隆是 與病人特異性(即獨特型)抗原結合還是與血液特異性(即HLA)抗 原結合。每個克隆被測試與從3個不同的B-CLL病人分離的PBMC 的結合。與1個病人樣品結合的克隆被認為是病人或血液特異性類型 的。
圖5a和5b顯示了全細胞ELISA的結果，比較了 scFv克隆與初 級B-CLL細胞和三個人類白血病細胞系的結合。Ramos是從Burkitt 氏淋巴瘤衍生的成熟B細胞系。RL是從非Hodgkin氏淋巴瘤衍生的 成熟的B細胞系。TF-1是從紅白血病衍生的類成紅細胞細胞系。
圖6a、 6b和6c顯示了全細胞ELISA的結果，比較了 scFv克隆 與初級B-CLL細胞和從B-CLL病人衍生的細胞系CLL-AAT的結合。 包含了 TF-1細胞作為陰性對照。
圖7顯示了本發明的scFv抗體的結合特異性，用3色流式細胞 計量術進行分析。在正常的外周血單核細胞中，被scFv-9識別的抗原 在B淋巴細胞上中度表達，在T淋巴細胞亞群中表達較弱。使用抗 CD5-FITC、抗CD19-PerCP和scFv-9/抗HA-生物素/鏈親和素-PE通 過3色流式細胞計量術對來自正常供體的PBMC進行了分析。
圖8a、 8b和8c顯示了被本發明的scFv抗體所識別的抗原的表 達水平。被scFv-3和scFv-9識別的抗原在衍生出CLL-AAT細胞系的 初級CLL腫瘤上過量表達。來自CLL病人用于建立CLL-AAT細胞 系的初級PBMC或來自正常供體的PBMC用scFv抗體染色并通過流 式細胞計量術進行分析。當用中等的熒光強度進行測量時，scFv-3和
scFv-9對CLL細胞的染色比對正常細胞的染色更亮。
圖9a和9b提供了選定的scFv抗體的CDR序列和結合特異性的 概要。
圖10是顯示了流式細胞計量術分析結果概要的表，比較了圖8a-8c中描述的初級CLL細胞與正常PBMC上scFv抗原的表達水平。
圖11是顯示了流式細胞計量術分析結果概要的表，比較了 scFv-9抗原的表達水平與從10個CLL病人分離的外周血單核細胞中CD38+ 細胞的百分數。
圖12顯示了通過免疫沉淀和質譜對scFv抗原的鑒定。CLL-AAT 細胞用溶于pH8.0的PBS的0.5mg/ml sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce) 溶液標記30分鐘。在用過量的PBS清洗除去未反應的生物素后，細 胞用氮氣空化作用破碎，通過差速離心分離微粒體級份。微粒體級份 重新懸浮于NP40裂解緩沖液中，用正常的兔血清和蛋白A Sepharose 進行過量的預先澄清。抗原用HA標記的scFv抗體偶聯大鼠抗HA瓊 脂糖珠(Roche)進行免疫沉淀。免疫沉淀后，抗原用SDS-PAGE分 離，通過Western雜交使用鏈親和素-堿性磷酸酶(AP)或使用考馬 斯亮蘭G-250染色來檢測。不與CLL-AAT細胞結合的抗體scFv-7被 用做陰性對照。抗原條帶從考馬斯亮蘭染色的凝膠中切下，通過質譜 (MS)進行鑒定。MALDI-MS在Scripps研究所的蛋白質組學核心實 驗室(La Jolla， CA)進行。LC/MS/MS在哈弗微化學實驗室(Cambridge, MA)進行。
圖13顯示了三個scFv抗體與用人OX-2/CD200 cDNA克隆瞬間 轉染的293-EBNA細胞的特異性結合。OX-2/CD200 cDNA從CLL細 胞通過RT-PCR克隆，插入到哺乳動物表達載體pCEP4 (Invitrogen) 中。使用Polyfect試齊U (QIAGEN)將pCEP4-CD200質粒或相應的空 載體pCEP4轉染到293-EBNA細胞中。轉染2天后，通過細胞計量術 分析細胞與scFv抗體的結合。
圖14顯示了 OX-2/CD200轉染細胞的存在導致了對Thl細胞因 子例如IL-2和IFN-Y的負調控。加入30貼/ml的抗OX-2/CD200抗體 完全恢復了 Thl反應。
圖15顯示了在混合的淋巴細胞反應中CLL細胞的存在導致了對 IL-2的Thl反應的負調控。
圖16顯示了在混合的淋巴細胞反應中CLL細胞的存在導致了對 IFN-y的Thl反應的負調控。
圖17A和B顯示了所有NOD/SCID小鼠組中腫瘤體積的平均值 +/-SD,這些小鼠在存在或不存在人的情況下用4X106 RAJI細胞進行 了皮下注射。
圖18顯示了使用兩個參數檢驗(Student's t-test和Welch's test) 和一個無參數檢驗Wilcox test進行的統計學分析結果。
發明詳述
根據本發明，提供了方法以確定患者中的OX-2/CD200是否被上 調，如果是的話，給患者施用與OX-2/CD200結合的多肽。 一般來說， 本發明中使用的多肽可以使用本領域的專業技術人員所熟知的各種不 同技術來構建。在一個實施方案中，多肽通過化學合成獲得。在其它 實施方案中，多肽是抗體，或從一種或多種抗體的一個片段或幾個片 段構建而成。
在優選情況下，在本發明的方法中使用的多肽從CLL細胞系獲 得。此處使用的"CLL"是指涉及任何淋巴細胞的慢性淋巴細胞性白 血病，這些淋巴細胞包括但不限于各種發育階段的B細胞和T細胞， 包括但不限于B細胞CLL ( "B-CLL")。此處使用的B-CLL是指 一種白血病，其B細胞具有成熟B細胞的表現型CD5+、CD23+、CD20dim+ 和sIgdim+，但終止于細胞周期的G0/G1期。另一方面，CLL細胞系被 用于產生多肽、包括抗體，以用于其中OX-2/CD200被上調的疾病狀 態包括癌癥和CLL的診斷和/或治療。
本文使用的術語"抗體"是指能夠與選定的靶結合的完整抗體或 抗體片段。包括Fv、 scFv、 Fab'和F(ab')2、單克隆和多克隆抗體、工 程抗體(包括嵌合、CDR-移植和人源化及完全的人類抗體，以及人工
選擇的抗體)和使用噬菌體展示或其它技術生產的合成或半合成的抗
體。小的片段例如Fv和scFv，因為它們小的尺寸及較優越的組織分 布性，在診斷和治療應用中具有有利的性質。
本發明使用的多肽和/或抗體被特別指明用于診斷和治療應用。 因此它們可以用效應蛋白例如毒素或標記物來改建。特別優選的是允 許對多肽或抗體在體內的分布進行成像的標記物。這樣的標記物可以 是放射性標記物或射線不能透過的標記物例如金屬微粒，以便在病人 體內可以容易地被看見。此外，標記物可以是熒光標記物或其它在從 病人中取出的組織樣品中可以被看見的標記物。
抗體的產生可以使用本發明的細胞作為免疫原，在動物中引發免 疫反應，再從中分離單克隆抗體。這些抗體的序列可以被測定，抗體 及其變異體可以通過重組技術生產。在這一方面來說，"變異體"包 括基于單克隆抗體以及能夠結合OX-2/CD200的多肽的序列的嵌合 的、CDR-移植的、人源化的和完全的人類抗體。
此外，可以使用本文描述的細胞或從中衍生的多肽作為餌在靶特 異性的基礎上分離抗體或多肽，從而篩選從重組文庫衍生的抗體("噬 菌體抗體")。
另一方面，抗體和多肽的產生可以通過使用初級CLL細胞或從 其衍生的抗原來淘洗抗體文庫，然后使用一株CLL細胞系例如本發明 描述的CLL細胞系進一步篩選和/或表征。因此，提供了用于表征特 異于CLL的抗體或多肽的方法，其中包括評估抗體或多肽與CLL細 胞系的結合。
細胞系的制備
細胞系可以按照本領域專業人員所熟知的現有的方法來產生。一 般來說，細胞系的產生是通過對來自病人的初級細胞進行培養直到在
培養物中自發產生了永生的細胞。然后分離這些細胞并進一步培養以 產生對細胞凋亡顯示出抗性的克隆細胞群或細胞。
例如，可以從患有CLL的病人抽取的外周血中分離CLL細胞。 可以清洗這些細胞并進行適當的免疫分型以確定存在的細胞類型。然 后可以將細胞在培養基例如含有IL-4的培養基中進行培養。在優選情 況下，在培養過程中將全部或部分培養基替換一次或多次。然后可以 分離細胞系，并通過在培養中生長增加來鑒定。
在一個實施方案中，提供了一個不是通過EBV永生來建立的惡 性來源的CLL細胞系。"惡性來源"是指細胞系是從惡性的CLL初 級細胞衍生的，而不是從例如用EBV轉化的非增殖性細胞衍生的。 本發明中使用的細胞系在表現型上可以是它們原來的惡性，也可以不 是。CLL細胞具有的"惡性"表現型包括在重復的細胞生長周期中細 胞生長不依賴于底物培養基，并對細胞凋亡表現出抗性。該從初級CLL 細胞衍生的細胞系被保藏于ATCC，登記號為PTA-3920。在優選實施 方案中，細胞系是CLL-AAT。 CLL-AAT是從B-CLL初級細胞衍生的 B-CLL細胞系。
在一個實施方案中，利用CLL-AAT細胞系，使用本領域的專業 技術人員熟知的方法、例如免疫沉淀然后質譜分析的方法，鑒定了在 CLL細胞中獨特表達的蛋白。這些蛋白可以獨特表達在CLL-AAT細 胞系中，或獨特表達在來自CLL病人的初級細胞中。
可以使用CLL-AAT細胞系在基于細胞的分析中篩選小分子文庫 (許多可以購買到)，以鑒定能夠調節細胞的生長特性的試劑。例如， 調節CLL-AAT細胞系中的細胞凋亡、或抑制其生長和/或增殖的試劑 可以被鑒定。這樣的試劑是開發治療性化合物的侯選物。
從CLL-AAT細胞系分離的核酸可以被用于扣除雜交實驗以鑒定CLL特異性的基因，或用于微陣列分析(例如基因芯片實驗)。其轉 錄在CLL細胞中被調節的基因可以被鑒定。以這種方式鑒定的多肽或 核酸基因產物被用做開發CLL的抗體或小分子療法的先驅。
在一個實施方案中，CLL-AAT細胞系可以被用來鑒定內生的抗 體，這些抗體與被細胞內化的細胞表面成分結合。這樣的抗體是治療 應用的侯選物。特別是在細胞質中保持穩定并保留細胞內結合活性的 單鏈抗體可以通過這種方式進行篩選。
單克隆抗體的制備
重組DNA技術可以被用來改進本發明產生的抗體。因此，可以 構建嵌合抗體以減少其在診斷或治療應用中的免疫原性。此外，還可 以通過CDR移植和任選框架修飾使抗體人源化以最小化免疫原性。 參見美國專利No.5225539，其內容在此引為參考。
抗體可以可以從動物血清中獲得，或對單克隆抗體或其片段來說 在細胞培養中產生。重組DNA技術可以被用來按照現有的步驟，在 細菌或優選的哺乳動物細胞培養中生產抗體。優選情況下選定的細胞 培養系統可以分泌抗體產物。
在另一個實施方案中，生產本發明的抗體的過程包括對已經用雜 合載體轉化的宿主、例如大腸桿菌或哺乳動物細胞、進行培養。載體 包含了一個或多個表達元件。其中包括一個啟動子，它與編碼信號肽 的第一個DNA序列可操作地連接，該信號肽以適當的閱讀框架與編 碼抗體蛋白的第二個DNA序列連接。然后收集抗體蛋白并進行分離。 或者，表達元件可以包括與多順反子例如雙順反子可操作地連接的啟 動子，該多順反子中編碼抗體蛋白的DNA序列各自以適當的閱讀框 架分別與信號肽可操作地連接。
雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外增殖在適當的培養基中進
行，其中包括常規的標準培養基(例如Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)或RPMI 1640培養基)，可以添補哺乳動物血清 (例如胎牛血清)或微量元素和生長維持補充物(例如詞養細胞如正 常的小鼠腹膜滲出液細胞、脾細胞、骨髓巨嗜細胞、2-氨基乙醇、胰 島素、轉鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)。宿主細胞為細菌或酵母 細胞的增殖同樣也是在本領域所熟知的適當的培養基中進行的。例如 對細菌來說適當的培養基包括LE、 NZCYM、 NZM、 Terrific Broth、 SOB、 SOC、 2x YT或M9基本培養基。對于酵母來說適當的培養基 包括YPD、 YEPD、基本培養基或完全基本缺陷培養基(Dropout Medium)。
體外生產提供了相對純的抗體制備物，并允許放大以產生大量所 需抗體。細菌細胞、酵母、植物或哺乳動物細胞培養技術在本技術領 域是熟知的，包括均質懸浮培養(例如在氣升式反應器或在連續攪拌 反應器中)和固定化或捕捉細胞培養(例如在中空纖維、微囊中、在 瓊脂糖微珠或陶瓷筒上)。
大量的所需抗體也可以通過在體內增殖哺乳動物細胞而獲得。為 了這個目的，產生所需抗體的雜交瘤細胞被注射到組織相容的哺乳動 物中，引起能產生抗體的腫瘤的生長。另外，在注射前，動物也可以 用碳氫化合物特別是礦物油例如鯊肝油垸(四甲基十五烷)引發。在 1到3周后，從那些動物的體液中分離抗體。例如，通過將適當的骨 髓瘤細胞與來自Balb/c小鼠的產生抗體的脾細胞或從雜交瘤細胞系 Sp2/0衍生的產生所需抗體的被轉染的細胞進行融合獲得的雜交瘤細 胞，通過腹膜內注射到任選用鯊肝油垸進行預處理后的Balb/c小鼠中。 在1到2周后，從動物中取得腹水。
上述的和其它的技術在例如Kohler和Milstein ( 1975) Nature 256:495-497;美國專利No. 4376110; Harlow禾卩Lane，抗體實驗指南 (1988)冷泉港出版社，中有討論，它們在此都引為參考。制備重組
抗體分子的技術在上述的參考文獻以及例如WO97/08320;美國專利 No.5427908;美國專利No.5508717; Smith, 1985, Science, Vol. 225， pp 1315-1317; Parmley和Smith 1988， Gene 73， pp305-318; De La Cruz 等，1988， Journal of Biological Chemistry, 263 pp4318-4322;美國專利 No.5，403,484，美國專利No.5223409; WO88/06630; W092/15679; 美國專利No.5780279;美國專利No.5571698;美國專利No.6040136; Davis等，Cancer Metastasis Rev.， 1999， 18(4):421-5; Taylor等，Nucleic Acids Research 20(1992):6287-6295; Tomizuka等，Proc. Nat. Academy of Science USA 97(2) (2000):722-727中有描述。所有這些參考文獻的內 容在此引為參考。
在細胞培養上清液中篩選所需抗體，在優選情況下通過CLL細 胞的免疫熒光染色、通過免疫雜交、通過酶聯免疫分析例如夾心分析 或斑點分析、或通過放射免疫分析來進行。
為了分離抗體，培養上清液或腹水液中的免疫球蛋白可以通過例 如用硫酸銨沉淀、對吸濕材料如聚乙二醇透析、用選擇性膜進行過濾 等方法來濃縮。如果必需和/或需要，抗體可以通過常規的層析方法來 純化，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE纖維素層析和/或(免疫) 親和層析，例如用從本發明的CLL細胞系衍生的一個或多個表面多肽 或用蛋白A或G進行親和層析。
另一個實施方案提供了制備細菌細胞系的方法，該細菌細胞系分 泌直接針對細胞系的抗體，該方法的特點在于用收集的CLL病人樣品 免疫適當的哺乳動物，例如兔。從被免疫的兔產生的噬菌體展示文庫 被構建并使用本領域所熟知的方法(例如本文引為參考的各種參考文 獻中公布的方法)從中淘洗所需的抗體。
分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞也被考慮到了。優選的雜交瘤細胞 應該在遺傳上穩定、分泌具有所需的特異性的本發明的單克隆抗體、
并且可以從深凍的培養物中通過融化和再克隆得到活化。
在另一個實施方案中，提供了制備雜交瘤細胞系的方法，該雜交
瘤細胞系分泌針對本發明的CLL細胞系的單克隆抗體。在該方法中， 使用從本發明描述的細胞衍生的一個或多個多肽或其抗原性片段、細 胞系本身、或含有純化的多肽的抗原性載體來免疫適當的哺乳動物， 例如Balb/c小鼠。被免疫的哺乳動物中產生抗體的細胞被簡單地培養 或與適當的骨髓瘤細胞系的細胞進行融合。在融合中獲得的雜交細胞 被克隆，并篩選分泌所需抗體的細胞克隆。例如用本發明細胞系免疫 的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Agl4的細胞進行融合，獲得的雜交細胞被篩選對所需抗體的分泌， 陽性的雜交瘤細胞被克隆。
優選的制備雜交瘤細胞系的方法，其特點為通過皮下和/或腹膜 內的方式，將106到107之間的本發明的細胞系的細胞，在幾個月的 時間例如2至lj 4個月內，通過幾次例如4到6次注射到Balb/c小鼠中。 在最后一次注射后2到4天從被免疫的小鼠取得脾細胞，在存在融合 促進劑優選為聚乙二醇的情況下與骨髓瘤細胞系PAI的細胞進行融 合。優選情況下，骨髓瘤細胞與3到20倍過量的被免疫小鼠的脾細 胞在含有大約30%到大約50%分子量為大約4000的聚乙二醇的溶液 中進行融合。融合后，細胞被平鋪在前面描述的適當的培養基上，以 規定的時間間隔添加選擇培養基例如HAT培養基，以便防止正常的 骨髓瘤細胞的生長超過所需的雜交瘤細胞。
在另一個實施方案中，生產了重組的DNA，它含有插入片段， 為針對前述的細胞系的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區編碼。術語 DNA包括編碼的單鏈DNAs、含有該編碼DNAs和與其互補的DNAs 的雙鏈DNAs、或這些互補的(單鏈)DNAs本身。
此外，為針對本發明的細胞系的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可
變區編碼的DNA，可以是酶法或化學合成的具有為重鏈可變區和/或 輕鏈可變區編碼的真實的DNA序列的DNA，也可以是其突變體。真 實的DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的 DNA，其中的一個或多個氨基酸被刪除了或被一個或多個其它的氨基 酸所替代。優選情況下在人源化和表達最適化應用中，該修飾位于抗 體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的CDRs之外。術語突變體DNA也 包括沉默突變，其中一個或多個核苷酸被其它的核苷酸所代替，產生 的新密碼子編碼同樣的氨基酸。術語突變序列也包括簡并的序列。簡 并序列是指遺傳密碼意義上的簡并，其中不限數量的核苷酸被其它核 苷酸所替代，而不導致最初編碼的氨基酸序列的改變。這樣的簡并序 列可能是有用的，因為它們具有不同的限制性位點以及/或被特定的宿 主特別是大腸桿菌所優選的特定的密碼子頻率，以便獲得重鏈鼠可變 區和/或輕鏈鼠可變區的最適的表達。
術語突變體包括按照本技術領域所熟知的方法對真實的DNA進 行體外突變而獲得的DNA突變體。
為了裝配完整的四聚體免疫球蛋白分子以及表達嵌合的抗體，為 重鏈和輕鏈可變區編碼的重組DNA插入片段與相應的編碼重鏈和輕 鏈恒定區的DNA融合，然后在例如并入雜交載體中后，轉移到適當 的宿主細胞中。
此外還提供了重組DNA，包含了為針對本發明的細胞系的抗體 的重鏈鼠可變區編碼的插入片段與人類的恒定區g、例如yl、 y2、 y3 和l4、優選為yl或y4的融合。也提供了重組DNA，包含了為針對本 發明的細胞系的抗體的輕鏈鼠可變區編碼的插入片段與人類的恒定區
K或入、優選為K的融合。
另一個實施方案涉及為重組多肽編碼的重組DNAs，其中的重鏈 可變區和輕鏈可變區通過間隔物連接，也可以包含信號序列以便于抗
體在宿主細胞中的加工，和/或包含編碼肽的DNA以便于抗體的純化， 和/或水解位點和/或肽間隔物和/或效應分子。
為效應分子編碼的DNA是指為可用于診斷或治療應用的效應分 子編碼的DNA。因此特別指出效應分子可以是毒素或酶、特別是能夠 催化藥物前體的活化的酶。為這樣的效應分子編碼的DNA具有為天 然存在的酶或毒素的序列編碼的DNA或其突變體，可以通過本技術 領域所熟知的方法來制備。
本發明的抗體和抗體片段在診斷和治療中是有用的。因此，提供 了包含本發明的抗體的治療或診斷組合物。
在診斷組合物中，優選情況下抗體與檢測抗體的方法一起被提 供，這可以是酶學的、熒光的、放射性同位素的或其它的方法。在用 于診斷目的的診斷試劑盒中，抗體和檢測方法可以提供成同時，分開 或順序的使用。
雖然上面公開的內容針對抗體，但是在某些實施方案中從這些抗 體衍生的多肽也可以用于本發明。
CLL細胞系的使用
發展CLL細胞系有許多優點，因為它為CLL、癌癥和其它以 OX-2/CD200的水平被上調為特征的疾病狀態例如黑素瘤的診斷和治 療的發展提供了重要的工具。
本發明的細胞系可以用于CLL和其它以OX-2/CD200的水平被 上調為特征的疾病狀態的病因學、發病機理和生物學體外研究。這幫 助鑒定了在這些疾病的治療中有用的適當的試劑。
如上所述，細胞系也可以用于產生多肽和/或單克隆抗體，用于
CLL、癌癥和其它以OX-2/CD200的水平被上調為特征的疾病狀態例 如黑素瘤的體外和體內診斷，以及用于通過其它方法產生的抗體的篩 選和/或定性，例如通過用來自CLL病人的初級細胞和/或抗原淘洗抗 體文庫的方法。
細胞系可以這樣使用，或者可以從其衍生出抗原。有利的是這樣 的抗原是對CLL特異的細胞表面抗原。它們可以直接從本發明的細胞 系中分離。此外，從本發明描述的細胞系制成的cDNA表達文庫也可 以用于表達CLL特異性抗原，用于抗CLL抗體的篩選和定性以及新 的CLL特異性抗原的鑒定。
在本技術領域中已經提出了用單克隆抗體療法來治療CLL。最 近，Hainsworth (Oncologist 5(5) (2000) 376-384)已經描述了目前從 單克隆抗體衍生的治療方法。特別是淋巴細胞性白血病被認為是這種 療法的理想候選者，這是因為在淋巴細胞腫瘤上存在多淋巴細胞特異 性的抗原。
現有的抗體療法(例如Rituximab TM，它針對B淋巴細胞表面 表達的CD20抗原)已經被成功地用于治療某些淋巴細胞疾病。但是， 在CLL中在B淋巴細胞表面表達的是較低密度的CD20抗原(Almasri 等，Am. J.Hematol.， 40(4) (1992) 259-263)。
因此本發明的CLL細胞系允許發展新的抗CLL抗體和多肽，它 們對本CLL細胞系的一個或多個抗原決定簇具有特異性，它們可以用 于CLL、癌癥和其它以OX-2/CD200的水平被上調為特征的疾病狀態 的治療和診斷。
抗體或多肽可以結合到正常情況下與OX-2/CD200相互作用的受 體上，從而阻止或抑制了 OX-2/CD200與受體的結合。另一種可選擇 的方案是，抗體可以與調節OX-2/CD200表達的抗原結合，從而阻止
或抑制了 OX-2/CD200的正常或增加的表達。由于OX-2/CD200的存 在與減少的免疫反應相關，因此值得考慮對OX-2/CD200的代謝途徑 進行干擾以便病人的免疫系統能夠更有效地抵御疾病狀態，例如癌癥 或CIX。
在一個特別有用的實施方案中，多肽與OX-2/CD200結合。在一 個實施方案中，多肽可以是與OX-2/CD200結合的抗體，并阻止或抑 制OX-2/CD200與其它的分子或受體相互作用。因為CLL細胞和其它 過量表達OX-2/CD200的細胞極大地減少了 Thl細胞因子的生產，給 OX-2/CD200的水平被上調的病人使用抗CD200抗體或與OX-2/CD200 結合的多肽恢復了 Thl細胞因子譜。因此，這些多肽和/或抗體在CLL 和其它癌癥或過量表達OX-2/CD200的疾病的治療中可能是有用的治 療試劑。
因此，在另一個實施方案中，本發明的方法包括篩選存在OX-2/CD200的患者以及使用與OX-2/CD200結合的多肽的步驟。在一個 特別有用的實施方案中，篩選OX-2/CD200過量表達的CLL病人，并 且給病人使用與OX-2/CD200結合的抗體。正如下面將詳細描述的那 樣， 一個這樣的抗體是與OX-2/CD200結合的scFv-9 (參見圖9B)。
為了本領域的專業技術人員能夠更好地實踐本文描述的組合物和 方法，為說明的目的給出了下面的實施例。
實施例1
CLL-AAT細胞系的分離 細胞系的建立
從被診斷為CLL的病人獲得外周血。白細胞數量是1.6xlOVml。 通過Histopaque-1077密度梯度離心(Sigma Diagnostics, St. Louis， MO)分離單核細胞。用添加了 10。/。熱失活的胎牛血清(FBS)的Iscove，s Modified Dulbecco，s培養基(IMDM)將細胞清洗兩次，重懸浮在5ml
冰冷的IMDM/10%FBS中。活細胞通過錐蟲藍染色進行計數。細胞與 等體積的85%FBS/15%DMSO混合，分成1ml的等份試樣冷凍，儲存 在液氮中。
免疫表現型分析顯示90%以上的CD45+淋巴細胞群表達IgD、 k 輕鏈、CD5、 CD19和CD23。該群也表達低水平的IgM和CD20。大 約50%的細胞表達高水平的CD38。細胞是入輕鏈、CD10和CD138陰性。
細胞的一個等份試樣被融化，清洗，以107/mL的密度重新懸浮 在添加了 20。/。熱失活的FBS、 2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、 100pg/ml鏈霉素、50pM 2-巰基乙醇和5ng/ml重組人IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN)的IMDM中。細胞在增濕的含5% C02的 氣氛中于37°C培養。每4天更換部分培養基直到觀察到穩定的生長。 5周后，培養液中的細胞的數量開始大約每4天翻番。該細胞系被命 名為CLL-AAT。
細胞系的性質
通過流式細胞計量術對細胞系的免疫表現型分析顯示，IgM、 k 輕鏈、CD23、 CD38和CD138高表達，CD19和CD20中度表達，IgD 和CD5弱表達。細胞系是人輕鏈、CD4、 CD8和CD10陰性。
細胞系的免疫表現型分析也通過全細胞ELISA進行，使用了一 組已經被篩選為與初級B-CLL細胞特異性結合的兔scFv抗體。所有 這些CLL特異性scFv抗體也識別CLL-AAT細胞系。相反，大部分 的scFvs不與從B細胞淋巴瘤衍生的兩個細胞系結合，它們是Ramos、 Burkitt氏淋巴瘤細胞系和RL、非Hodgkin氏淋巴瘤細胞系。
實施例2
使用抗體噬菌體展示和細胞表面淘洗篩選針對B-CLL特異性細胞表面 抗原的scFv抗體
免疫和scFv抗體文庫的構建
從Scripps臨床醫院(La Jolla, CA)的CLL病人抽取的血液中分 離外周血單核細胞(PBMC)。用從10個不同的患有CLL的供體收 集的2xl07個PBMC免疫2只兔子。以3周的時間間隔進行3次免疫， 兩次通過皮下注射然后一次通過靜脈內注射。使用流式細胞計量術通 過測量血清IgG與初級CLL細胞的結合來檢查血清的滴度。在最后一 次免疫后5天，從動物收集脾臟、骨髓和PBMC。從這些組織中使用 Tri-Reagent (Molecular Research Center, Inc)分離總RNA。如以前所 描述的那樣構建單鏈Fv(scFv)抗體噬菌體展示文庫(Barbas等(2001) 噬菌體顯示實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。為了 進行細胞淘洗，從再次擴增的文庫產生的噬粒顆粒用聚乙二醇(PEG) 沉淀，重新懸浮在含有1。/。牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中，對PBS透析過夜。
通過細胞表面淘洗篩選抗體
象Siegel等描述的那樣(1997， J. Immunol. Methods 206:73-85) 使用磁激活的細胞分類器(MACS)通過陽性-陰性篩選富集了 CLL 細胞表面特異性抗體的文庫。簡單來說，來自scFv抗體文庫的噬粒顆 粒在MPBS (2%脫脂奶粉和0.02%疊氮化鈉溶于pH7.4的PBS)中于 25。C預先保溫1小時以封閉非特異性的結合位點。大約1(^個初級CLL 細胞用與順磁微珠(Miltenyi Biotec， Sunnyvale, CA)連接的小鼠抗CD5 IgG和小鼠抗CD19 IgG標記。通過清洗將未結合的微珠除去。標記 的CLL細胞("靶細胞")與過量的"抗原陰性吸附細胞"混合，沉 淀，重新懸浮在50nl (10^-10"cfu)噬菌體顆粒中。吸附細胞用于吸 收非特異性黏附在細胞表面的噬菌體和對出現在靶細胞和吸附細胞上 的"常見"抗原具有特異性的噬菌體。使用的吸附細胞是從外周血通 過免疫磁性陰性篩選(StemSep System, StemCell Technologies, Vancouver, Canada)分離的TF-1細胞(人紅白血病細胞系)或正常的 人B細胞。吸附細胞與耙細胞的比率按體積來說大約是10倍。在25。C
保溫30分鐘后，細胞/噬菌體混合物被轉移到MiniMACS MS+分離柱 中。柱用0.5ml MPBS洗兩次，用0.5ml PBS洗一次，以除去未結合 的噬菌體和吸附細胞。靶細胞用lml PBS從柱上洗脫下來，在微量離 心機中以最大速度離心15秒沉淀下來。被捕獲的噬菌體顆粒通過將 靶細胞重新懸浮在20(Hxl酸性洗脫緩沖液(0.1N HC1，用甘氨酸將pH 調整到2.2，加入lpg/ml BSA)中而洗脫下來。在25°C保溫10分鐘 后，緩沖液用12^1 pH10.5的2M的Tris堿中和，洗脫下來的噬菌體 在大腸桿菌中擴增以進行下一輪淘洗。對于每一輪淘洗，測定進入和 輸出的噬菌體的滴度。進入的滴度是加到靶細胞/吸附細胞混合物中的 再次擴增的噬菌體顆粒的數量，輸出的滴度是從靶細胞上被洗脫的捕 獲的噬菌體的數量。富集因子(E)使用公式E= (Rn輸出/Rn輸入)/ (R,輸出/R,輸入)來計算。在大多數情況下，到第三或第四輪富集 因子應該達到102國103倍。
淘洗后富集的抗體庫的分析
在3-5輪淘洗后，通過流式細胞計量術和/或全細胞ELISA分析 被捕獲的噬菌體庫與CLL細胞的結合
1、 為了產生HA標記的可溶性抗體的完整的庫，用1^1 (109-101()cfu)噬粒顆粒感染2ml無抑制基因的大腸桿菌菌株(例如 TOP10F')。原始的未淘洗的文庫作為陰性對照。加入羧芐青霉素到 終濃度為10pM，將培養液在37°C保溫1小時，以250rpm振蕩。加 入含有50ng/ml羧芐青霉素的SB培養基8ml，將培養物生長到OD600 大約為0.8。加入IPTG至終濃度為lmM以誘導scFv從Lac啟動子的 表達，在37°C繼續振蕩4小時。培養物在3000xg離心15分鐘。含 有可溶性抗體的上清液被過濾，分為lml的等份試樣儲存在-20。C。
2、 scFv抗體庫與靶細胞和吸附細胞的結合通過流式細胞計量術 測定，使用高親和性的大鼠抗HA (克隆3F10， Roche Molecular Biochemicals)作為第二抗體，PE-結合的驢抗大鼠抗體作為第三抗體。
3、 抗體庫與靶細胞和吸附細胞的結合也通過下述的全細胞 ELISA來測定。 在淘洗后對單個scFv克隆進行篩選
為了在淘洗后篩選單個的scFv克隆，如上所述用噬菌體庫感染 TOP10F，，鋪在含有羧芐青霉素和四環素的LB平板上，在37。C保溫 過夜。單個克隆被接種到深的96孔板中，每個孔含有0.6-1.0ml SB-羧節青霉素培養基。培養物在HiGro搖床(GeneMachines, San Carlos, CA)上于37。C和520rpm生長6-8小時。此時，從每個孔中取出9(Hd 試樣轉移到含有10nl DMSO的深的96孔板中。該復制的板被儲存在-80°C。在原始平板上加入IPTG到終濃度為lmM，繼續振蕩3小時。 板在3000xg離心15分鐘。含有可溶性scFv抗體的上清液被轉移到另 一個深的96孔板中，于-20。C儲存。
開發了一種篩選HA標記的scFv抗體的靈敏的全細胞ELISA方
法
1、 ELISA板用伴刀豆球蛋白A包被(10mg/ml，溶于0.1M NaHC03， pH8.6， 0.1MCaCl2)。
2、 用PBS洗板后，在每個孔中加入0.5-1^05個靶細胞或吸附 細胞的50plPBS，板在250xg離心10分鐘。
3、 加入5(^1溶于PBS的0.02%的戊二醛，細胞在4°C固定過夜。
4、 用PBS洗后，非特異性結合的位點用含有4%脫脂奶粉的PBS 在室溫封閉3小時。
5、 細胞與50pl可溶的HA標記的scFv或Fab抗體(TOPIOF' 上清液)在室溫保溫2小時，然后用PBS洗6次。
6、 使用小鼠抗HA第二抗體(克隆12CA5)和堿性磷酸酶(AP) 連接的抗小鼠IgG第三抗體檢測結合的抗體。使用AMDEX AP連接 的綿羊抗小鼠IgG作為第三抗體(Amersham Pharmacia Biotech)可以 獲得大約擴大10倍的信號。AMDEX抗體通過葡聚糖骨架與多個AP 分子連接。使用堿性磷酸酶的底物PNPP產生顏色，使用讀板器在 405nm湖lj量。
scFv克隆的初篩通過對初級CLL細胞和正常人類PBMC的ELISA 來進行。對CLL細胞陽性并對正常PBMC陰性的克隆通過ELISA對 正常人B細胞、人B細胞系TF-1細胞和CLL-AAT細胞系進行再次 篩選。克隆再次通過ELISA對從三個不同的病人分離的CLL細胞進 行篩選，以消除識別病人特異性或血型特異性抗原的克隆。從代表性 的ELISA獲得的結果顯示在圖2-6中，并在圖9中進行了概括。
獲得的獨特scFv抗體克隆的數目通過DNA指紋圖譜和測序確 定。scFv DNA插入片段從質粒上通過PCR擴增，用限制性酶BstNI 消化。得到的片段在4%瓊脂糖凝膠上分離，用溴化乙錠染色。具有 不同限制性片段類型的克隆一定具有不同的氨基酸序列。具有同樣的 類型的克隆可能具有相似的或相同的序列。具有獨特的BstNI指紋圖 譜的克隆進一步通過DNA測序進行分析。發現了 25個不同的序列， 可以被分成16組具有密切關系的互補決定區的抗體(圖9)。
通過流式細胞計量術對scFv抗體進行表征
通過三色流式細胞計量術對幾個scFv抗體的結合特異性進行了 分析(圖7)。從正常供體分離的PBMC用FITC連接的抗CD5和PerCP 連接的抗CD19抗體染色。scFv抗體的染色使用生物素連接的抗HA 作為第二抗體的PE連接的鏈親和素進行染色。三個抗體scFv-2、scFv-3 和scFv-6被發現特異性地識別CD19+B淋巴細胞群(數據未顯示)。 第四抗體scFv-9識別兩個不同的細胞群CD19+B淋巴細胞和CD5+T 淋巴細胞的一個亞類(圖7)。對T細胞亞類的進一步定性表明它是 CD4+CD8-Th細胞的一個亞群(數據未顯示)。
為了確定scFv抗體識別的抗原是否在初級CLL細胞上過量表 達，來自5個CLL病人和5個正常供體的PBMC用scFv染色并通過 流式細胞計量術進行比較(圖8和表2)。通過比較陽性細胞群的平 均熒光強度，可以測定CLL細胞與正常細胞上抗原的相對表達水平。
一個抗體scFv-2總是對CLL細胞的染色強度弱于對正常PBMC的染 色，而scFv-3和scFv-6則總是對CLL細胞的染色亮于對正常PBMC 的染色。第四個抗體scFV-9，對5個CLL樣品中的兩個的染色強于 對正常PBMC的染色，但是對其它3個CLL樣品的染色僅僅稍微亮 一些(圖8和表2)。這表明scFv-3和scFv-6的抗原在如果不是全部 也是大多數CLL腫瘤上過量表達了大約2倍，而scFv-9在CLL腫瘤 的一個亞類中過量表達了 3-6倍。
CLL病人可以被分成大約相等的兩組預后不良的病人(平均存 活時間8年)和預后良好的病人(平均存活時間26年)。對CLL已 經鑒定了幾個預后不良的信號，最顯著的是存在缺少體細胞突變的VH 基因和高百分率CD38+ B細胞。因為scFv-9識別僅僅在CLL病人的 一個亞類中過量表達的抗原，我們試圖確定是否scFV-9抗原的過量 表達與來自10個CLL病人的血液樣品中的CD38+細胞百分率具有相 關性(圖11)。結果表明scFv-9抗原的過量表達和CD38+細胞百分 率彼此之間完全獨立。
通過免疫沉淀(IP)和質譜(MS)鑒定被scFv抗體識別的抗原
為了鑒定這些抗體的抗原，使用scFvs對從細胞表面生物素化的 CLL-AAT細胞的微粒體級分制備的裂解液中的抗原進行免疫沉淀(圖 12)。被免疫沉淀的抗原通過SDS-PAGE純化，并通過基質輔助激光 解析電離質譜(MALDI-MS)或毛細管反向HPLC納噴串聯質譜 ((iLC/MS/MS)進行鑒定(數據未顯示)。scFv-2從RL和CLL-AAT 細胞都免疫沉淀了 110kd的抗原(圖12)。該抗原被MALDI-MS鑒 定為B細胞特異性的標記CD19。 ScFv-3和scFv-6都從CLL-AAT細 胞免疫沉淀了 45kd的抗原(數據未顯示)。該抗原被MALDI-MS鑒 定為CD23，這是已知的CLL和活化的B細胞的標記。ScFv-9從 CLL-AAT細胞免疫沉淀了 50kd的抗原(圖12)。該抗原通過 (iLC/MS/MS鑒定為OX-2/CD200，是已知的B細胞、活化的CD4+細 胞和胸腺細胞的標記。OX-2/CD200也在一些非淋巴類細胞例如神經
元和內皮細胞上表達。
實施例3
過量表達OX-2/CD200的細胞將細胞因子反應從Thl反應(IL-2， IFN-y)轉移到Th2反應(IL-4， IL-10)的能力被評估，評估在混合 的淋巴細胞反應中進行，使用來自一個供體的單核細胞衍生的巨嗜細 胞/樹突狀細胞和來自不同供體的血液來源的T細胞。下述的用OX-2/CD200轉染的EBNA細胞或CLL病人的樣品被用作OX-2/CD200表 達細胞的來源。
293-EBNA細胞的轉染
在每個100mm的碟子中接種2.5x106個293-EBNA細胞 (Invitrogen)。 24小時后細胞用Polyfect試劑(QIAGEN)按照制造商 的說明進行瞬間轉染。細胞用7.2pg連接在pCEP4載體(Invitrogen) 中的OX-2/CD200 cDNA禾卩0.8pg pAdVAntage載體(Promega)共轉 染。用空的pCEP4載體加上pAdVAntage載體共轉染的細胞作為陰性 對照。轉染48小時后，通過流式細胞計量術使用scFv-9抗體測定的 結果表明大約90%的細胞在它們的表面表達了 OX-2/CD200。
來自血液單核細胞的樹突狀細胞/巨嗜細胞的成熟
白細胞層從San Diego血庫獲得，初級血液淋巴細胞(PBL)使 用Ficoll分離。細胞在含有2%人類血清的Eagles最小基本培養基 (EMEM)中吸附1小時，然后用PBS充分沖洗。細胞在存在GM-CSF、 IL-4和IFN-y或M-CSF的情況下培養5天，在3天后添加或不添加脂 多糖(LPS)。成熟的細胞被收集，使用y-放射源(Shepherd Mark I Model 30 irradiator (Cs137))在2000RAD下輻射。
混合淋巴細胞反應
混合淋巴細胞反應在24孔板中建立，使用500000個樹突狀細胞 /巨嗜細胞和lxl(^個反應細胞。反應細胞是從外周血中使用Ficoll純
化的富集了 T細胞的淋巴細胞。T細胞的富集是通過將細胞在組織培 養瓶中保溫1小時，然后取出不吸附的細胞級份。在加入淋巴細胞之 前2-4小時，500000個OX-2/CD200轉染的EBNA細胞或CLL細胞 在存在或不存在30pg/ml抗CD200抗體(被轉變為完整IgG的scFv-9) 的情況下被加入到巨嗜細胞/樹突狀細胞中。在48小時和68小時后收 集上清液，并分析細胞因子的存在。
ScFv-9向完整IgG的轉變
scFv-9的輕鏈和重鏈可變區通過重疊PCR擴增，使用分別連接 每個基因的可變區和人 i輕鏈恒定區基因和人IgGl重鏈恒定區CH1 基因的引物。ScFv-9的輕鏈基因和重鏈基因的可變區使用特異的引物 擴增，人人輕鏈恒定區基因和人IgGl重鏈恒定區CH1基因使用特異 的引物分別擴增，使用的引物如下
R9VL-F1 QP: 5， GGC CTC TAG ACA GCC TGT GCT GAC TCA GTC GCC CTC 3 ， (SEQ ID NO 26);
R9VL/hCL2-rev: 5' CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TGT GAC GGT CAG CTG GGT C 3' (SEQ ID NO 27);
R9VL/hCL2-F: 5， GAC CCA GCT GAC CGT CAC AGG TCA GCC CAAGGCTGCCCCCTCG3， (SEQ ID N028);
R9VH-F1: 5， TCT AAT CTC GAG CAG CAG CAG CTG ATG GAG TCCG3， (SEQIDN0 29);
R9VH/hCG國rev: 5' GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GC 3' (SEQ ID
NO 30);
R9VH/hCG-F: 5， GCA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TC 3' (SEQ ID NO
31);
hCL2陽rev: 5， CCA CTG TCA GAG CTC CCG GGT AGA AGT C 3， (SEQ ID NO 32);
hCG-rev: 5， GTC ACC GGT TCG GGG AAG TAG TC 3' (SEQ
ID NO 33).
擴增產物被純化并進行重疊PCR。
終產物用Xba I/Sac I (輕鏈)和Xho I/Pin AI (重鏈)消化，并 克隆在人Fab表達載體PAX243hGL中。DNA克隆通過DNA測序來 分析PCR的錯誤。hCMV IE啟動子基因被插到Not I/Xho I位點(在 重鏈之前)。載體用Xba I/Pin AI/EcoR I/Nhe I消化，含有輕鏈加hCMV IE啟動子和重鏈基因的3472bp的片段被轉移到IgGl表達載體的Xba I/Pin AI位點處。
細胞因子分析
scFv-9轉變為完整的IgG對混合淋巴細胞反應中細胞因子譜的影 響被確定。
使用ELISA對在組織培養上清液中發現的IL-2、IFN-y、IL-4、IL-10 和IL-6進行了定量。每種細胞因子的匹配的捕獲和檢測抗體對從R+D Systems公司(Minneapolis, MN)獲得，使用重組人細胞因子為每種 細胞因子制作了標準曲線。抗細胞因子捕獲抗體以最適的濃度在PBS 中包被在板上。保溫過夜后，洗板，并用含有P/。BSA和5%蔗糖的PBS 封閉1小時。在用含有0.05%Tween的PBS清洗3次后，加入用含有 1% BSA的PBS稀釋2倍或10倍的上清液。被捕獲的細胞因子用適 當的生物素化的抗細胞因子抗體然后加入堿性磷酸酶結合的鏈親和素 和SigmaS底物來檢測。顏色的產生用ELISA讀板器(Molecular Devices)來評估。
如圖14所示，OX-2/CD200轉染的細胞的存在導致Thl細胞因 子例如IL-2和的IFN-y的下調，但未轉染的細胞則不會。以30^g/ml 的濃度加入抗CD200抗體完全恢復了 Thl反應，表明抗體封閉了 OX-2/CD200與其受體的相互作用。
如圖15和16所示，在混合淋巴細胞反應中存在CLL細胞導致 了Thl細胞因子的下調。(圖15顯示了對IL-2的結果；圖16顯示了 對IFN-Y的結果。)這不僅是在過量表達OX-2/CD200的細胞(IB、 EM、 HS、 BH)的情況中，而且也在不過量表達OX-2/CD200的細胞(JR、 JG和GB)的情況中出現(這些細胞的表達水平顯示在圖11中)。 但是，抗CD200抗體只能恢復過量表達OX-2/CD200的細胞中的Thl 反應，表明對于過量表達OX-2/CD200的病人來說，廢止OX-2/CD200 與它在巨嗜細胞上的受體的相互作用就足夠恢復Thl反應。在不過量 表達OX-2/CD200的病人中，顯示出其它的機制參與了 Thl反應的下 調。
試驗抗CD200抗體對腫瘤排斥的效果的動物模型
建立了一個模型，其中RAJI淋巴瘤腫瘤的生長被同時注射的 PBL's所阻止。NOD/SCID小鼠在存在或不存在lx106、 5乂106或10x106 個來自不同供體的人PBL's的情況下，通過皮下注射了 4"06個RAJI 細胞。腫瘤的長度和寬度以及體重每周測定3次。所有的組中腫瘤體 積的平均+/- SD被顯示在圖17A和B中。使用兩個參數檢驗(Student's t陽test禾卩Welch's test)和一個非參數檢驗Wilcox test進行了統計學分 析。統計學分析的結果顯示在圖18中。PAJI細胞在皮下形成了腫瘤， 其偏差可以接受。排斥依賴于具體的供體和PBL細胞的數量。lxl06 個PBL's不足以阻止腫瘤的生長。5xlOS個供體2的PBL's從22到43 天和5xlOS個或lxl(^個供體3的PBL's從36天開始明顯地減緩了腫 瘤的生長。供體4在48天后非常近于顯著的結果。
為了試驗抗CD200抗體的效果，RAJI細胞用CD200穩定轉染。 象前一段描述的那樣注射動物。在CD200轉染的細胞存在的情況下， 腫瘤即使在存在人PBL's的情況下也可以生長。在該模型中使用抗 CD200抗體來評估腫瘤的排斥。
此外還建立了一個液體腫瘤模型。RAJI細胞通過腹膜內注射到NOD/SCID小鼠中。細胞散布到骨髓、脾臟、淋巴結和其它器官中導 致了癱瘓。同時注射人PBL's阻止或減緩了腫瘤的生長。通過評估小 鼠的運動損傷和癱瘓的情況來監測腫瘤的生長。 一旦發現這些情況， 將小鼠處死，不同器官包括骨髓、脾臟、淋巴結和血液中的腫瘤細胞 的數量通過FACS分析和PCR來評估。
與皮下注射的模型相同，CD200轉染的細胞通過腹膜內注射。它 們即使在存在人PBL's的情況下也能生長。用抗CD200抗體處理導致 腫瘤的排斥或腫瘤生長的減緩。
參考文獻
下面的參考文獻在此引為參考以便更全面地描述本發明所屬的技 術領域的狀態。下面的這些著作或前面引為參考的著作與本發明的內 容之間如果有任何不一致的地方，應該朝對本發明有利的方式予以解 決。
1) Agarwal等,(2003). Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma.(在患有口腔內 部鱗狀細胞腺癌的病人中Th2細胞因子基因不受調控的表達)Immuno1 Invest 32:17-30.
2) Almasri，畫等.(1992). Am J H,to 140 259-263.
3) Contasta等,(2003). Passage from normal mucosa to adenoma and colon cancer: alteration of normal sCD30 mechanisms regulating TH1/TH2 cell functions.(從正常粘膜到腺瘤和結腸癌的過程調節 TH1/TH2細胞功能的正常sCD30機制的變化)Cancer Biother Radiopharm 18:549-557.
4) Gorczynski 等,(1998). Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolongation of murine renal allograft survival.(新分子OX-2的增加的表達與鼠腎異源移植存活期的延長有 關)Transplantation 65:1106-1114.
5) Gorczynski 等,(2001). Evidence of a role for CD200 in
regulation of immune rejection of leukaemic tumor cells in C57BL/6 mice.
(在C57BL/6小鼠中CD200在白血病腫瘤細胞的免疫排斥調控中發 揮作用的證據)Clin Exp Immunol 126:220-229.
6) Hainsworth， JD(2000). Oncologist 2000;5(5):376-84.
7) Inagawa等,(1998). Mechanisms by which chemotherapeutic agents augment the antitumor effects of tumor necrosis factor: involvement of the pattern shift of cytokines from Th2 to Thl in tumor lesions.(化學 治療試劑增強腫瘤壞死因子的抗腫瘤效果的機理涉及了在腫瘤病灶 中細胞因子從Th2到Thl的類型轉移)Anticancer Res 18:3957-3964.
8) Ito等，(1999). Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry.(肺癌通過用流式細胞計量術檢測細胞內細胞 因子來分析1和2型輔助性T細胞和1型和2型細胞毒性T細胞)Cancer 85:2359-2367.
9) Kiani等，(2003). Normal intrinsic Thl/Th2 balance in patients with chronic phase chronic myeloid leukemia not treated with interferon-alpha or imatinib.(在未用a-干擾素或imatinib治療的患有慢性階段性 慢性骨髓白血病的病人中正常的固有的Thl/Th2平衡)Haematologica 88:754-761.
10) Lauerova 等，(2002). Malignant melanoma associates with Thl/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response.(惡性黑色素瘤與Thl/Th2失衡相關，這與疾 病進程和對免疫療法的反應一致)Neoplasma 49:159-166.
11) Maggio等，(2002). Chemokines， cytokines and their receptors in Hodgkin，s lymphoma cell lines and tissues.(趨化因子、細胞因子及其 在Hodgkin，s淋巴瘤細胞系和組織中的受體)Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56.
12) Nilsson, K(1992). Bum Cell. 5(1):25-41.
13) Podhorecka等，(2002). T type 1/type 2 subsets balance in B-cell chronic lymphocytic leukemia-the three —color flow cytometry analysis. (B
細胞慢性淋巴細胞性白血病中1型和2型T細胞因子亞類的平衡——
三色流式細胞計量分析)Leuk Res 26:657-660.
14) Pu, QQ和Bezwoda， W(2000). Anticancer Res. 20(4):2569-78.
15) Smyth等，(2003). Renal cell carcinoma induces prostaglandin E2 and T-helper type 2 cytokine production in peripheral blood mononuclear cells.(腎細胞癌在外周血單核細胞中誘導了前列腺素E2和輔助性T 細胞2型細胞因子的產生)Ann Surg Oncol 10:455-462.
16) Tatsumi等,(2002). Disease-associated bias in T helper type 1 (Thl)/Th2 CD4(+) T cell responses against MAGE-6 in HLA-DRB1040(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma. (在患有腎細胞癌或黑 素瘤的HLA-DRB1040(+)病人中輔助性T細胞1型(Thl)與Th2 CD4(+) T細胞對MAGE-6的反應的比例的偏移與疾病相關)J Exp Med 196:619-628.
17) Walls A V等(1998)' Int. J Cancer 44846-853.
18) Winter 等，(2003). Tumour-induced polarization of tumor vaccine-draining lymph node T cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumor and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies.(排出腫瘤疫苗的淋巴 結T細胞受腫瘤誘導的向1型細胞因子譜的偏移預測腫瘤內在的強烈 的免疫原性并與過繼性轉移研究中的治療效力相關)Immunology 108:409-419.
應該理解，對于本文描述的實施方案可以進行各種不同的修飾。 例如，本領域的專業技術人員將會認識到，本文描述的具體的序列可 以被輕微地改變而不一定嚴重地影響被用來結合OX-2/CD200的多 肽、抗體或抗體片段的功能性。例如，通常可以對抗體序列中一個或 多個氨基酸進行取代而不破壞抗體或片段的功能性。因此，應該理解， 與本發明的具體的抗體具有70%以上程度同源性的多肽或抗體都被包 含在本發明的范圍之內。在特別有用的實施方案中，與本發明的具體 的抗體具有80%以上同源性的抗體是在本發明的設想之中。在其它有 用的實施方案中，與本發明的具體的抗體具有90%以上同源性的抗體 是在本發明的設想之中。因此，上面的描述將不構成一種限制，而僅 僅是優選實施方案的示例。本領域的專業技術人員將可以在本發明的 范圍和精神之內想象出其它的修改方案。
權利要求
1. 一種方法，包括確定在患者中OX-2/CD200是否被上調；以及給患者施用能夠與OX-2/CD200或OX-2/CD200受體結合的多肽。
2. 權利要求1中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200結合的抗體。
3. 權利要求1中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200結合的單克隆抗體。
4. 權利要求1中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200受體結合的抗體。
5. 權利要求1中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200受體結合的單克隆抗體。
6. 權利要求1中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 包含一種或多種選自下列氨基酸序列的多肽SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID.NO:7、 SEQ. ID.NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID.NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID, NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
7. —種治療其中OX-2/CD200被上調的疾病狀態的方法，包括給 患有該其中OX-2/CD200被上調的疾病的患者施用能夠與OX-2/CD200 或OX-2/CD200受體結合的多肽。
8. 權利要求7中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200結合的抗體。
9. 權利要求7中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200結合的單克隆抗體。
10. 權利要求7中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200受體結合的抗體。
11. 權利要求7中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 與OX-2/CD200受體結合的單克隆抗體。
12. 權利要求7中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施用 包含一種或多種選自下列氨基酸序列的多肽SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID.NO:15、 SEQ. ID.NO:16、 SEQ, ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
13. —種治療癌癥的方法，包括確定在患有癌癥的患者中OX-2/CD200是否被上調；以及 給患者施用能夠與OX-2/CD200或OX-2/CD200受體結合的多肽。
14. 權利要求13中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200結合的抗體。
15. 權利要求13中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200結合的單克隆抗體。
16. 權利要求13中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200受體結合的抗體。
17. 權利要求13中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200受體結合的單克隆抗體。
18. 權利要求13中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用包含一種或多種選自下列氨基酸序列的多肽SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ.ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ.ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ.ID. NO: 17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
19. 一種治療CLL的方法，包括確定在患有CLL的患者中OX-2/CD200是否被上調；以及 給患者施用能夠與OX-2/CD200或OX-2/CD200受體結合的多肽。
20. 權利要求19中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200結合的抗體。
21. 權利要求19中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200結合的單克隆抗體。
22. 權利要求19中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200受體結合的抗體。
23. 權利要求19中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用與OX-2/CD200受體結合的單克隆抗體。
24. 權利要求19中的方法，其中施用多肽的步驟包括給患者施 用包含一種或多種選自下列氨基酸序列的多肽SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID.NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID, NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO: 13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
25. —種鑒定抗體所結合的抗原的方法，包括 使用從CLL病人收集的組織制備衍生的抗體的文庫； 將文庫的一個或多個成員與保藏在ATCC登記號為PTA-3920的細胞系CLL-AAT的裂解液相接觸；以及對與文庫的至少一個成員結合的抗原進行表征。
26. 權利要求25中的方法， 其中制備文庫的步驟包括用CLL細胞或其部分免疫一個生物體。
27. 權利要求25中的方法， 其中制備文庫的步驟包括用CLL細胞或細胞系淘洗合成的抗體文庫。
28. 權利要求27中的方法， 其中的文庫通過噬菌體展示進行篩選以分離文庫的成員。
29. 權利要求27中的方法，其中的文庫用從一個或多個患有CLL 的病人分離的的初級CLL細胞進行淘洗。
30. 權利要求25中的方法，還包括鑒定抗體文庫中與CLL細胞 中被上調的抗原結合的成員的步驟。
31. 權利要求30中的方法，其中抗體文庫的成員與OX-2/CD200
32. —種與CLL細胞所上調的抗原結合的抗體。
33. 權利要求32中的抗體，其中的抗原是OX-2/CD200。
34. 權利要求32中的抗體，含有的氨基酸序列與選自下列的序 列具有至少70%的同源性SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ, ID. NO:15、 SEQ. ID.NO:16、 SEQ.ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID.NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
35. —種鑒定與抗體結合的抗原的方法，包括 使用從保藏在ATCC登記號為PTA-3920的細胞系中的細胞制備衍生的抗體文庫；將文庫的一個或多個成員與從CLL病人收集的組織中的細胞的 裂解液相接觸；以及對與文庫的至少一個成員結合的抗原進行表征。
36. —種鑒定與抗體結合的抗原的方法，包括 用從CLL病人收集的組織中的CLL細胞的至少一部分免疫生物體；基于被免疫的動物的免疫反應產生抗體文庫； 將文庫的一個或多個成員與CLL細胞相接觸；以及 對與文庫的至少一個成員結合的抗原進行表征。
37. 權利要求36中的方法，其中將文庫的一個或多個成員與CLL 細胞相接觸的步驟包括將文庫的一個或多個成員與從CLL病人收集的 組織中的細胞的裂解液相接觸。
38. —種鑒定抗體所結合的抗原的方法，包括 用CLL細胞的至少一部分免疫生物體； 基于被免疫的動物的免疫反應產生抗體文庫； 將文庫的一個或多個成員與保藏在ATCC登記號為PTA-3920的細胞系CLL-AAT的裂解液相接觸；以及對與文庫的至少一個成員結合的抗原進行表征。
39. —種治療癌癥的方法，包括施用能夠干擾被惡性癌細胞上調 的多肽的代謝途徑的抗體。
40. 權利要求39中的方法，其中的抗體與被上調的多肽結合。
41. 權利要求39中的方法，其中的抗體與同被上調的多肽相互 作用的受體結合。
42. 權利要求39中的方法，其中的抗體與調節多肽表達的抗原
43. 權利要求39中的方法，其中的多肽是OX-2/CD200。
44. 權利要求39中的方法，其中的抗體含有的氨基酸序列與選 自下列序列具有至少70%的同源性SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ.ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID.NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
45. —種方法，包括篩選癌癥病人以鑒定出那些其中多肽的表達被惡性癌細胞上調的病人；以及給那些被發現有上調的病人施用能夠干擾被上調的多肽的代謝途 徑的抗體。
46. 權利要求45中的方法，其中篩選病人的步驟包括篩選CLL 病人。
47. 權利要求45中的方法，其中篩選病人的步驟檢測OX-2/CD200的上調。
48. 權利要求45中的方法，其中施用抗體的步驟包括施用與 OX-2/CD200結合的抗體。
49. 權利要求45中的方法，其中施用抗體的步驟包括施用與同 OX-2/CD200相互作用的受體結合的抗體。
50. 權利要求45中的方法，其中施用抗體的步驟包括施用與調 節OX-2/CD200的表達的抗原結合的抗體。
51.權利要求45中的方法，其中施用抗體的步驟包括施用的抗 體含有的氨基酸序列與選自下列序列具有至少70%的同源性SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID.NO:IO、 SEQ. ID.NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
全文摘要
本文公開了能夠與OX-2/CD200和/或OX-2/CD200受體結合的多肽、包括抗體的使用方法。這些多肽被用于治療其特征表現為OX-2/CD200水平升高的疾病，包括癌癥和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
文檔編號C07K16/00GK101384280SQ200480005993
公開日2009年3月11日 申請日期2004年3月4日 優先權日2003年3月4日
發明者凱瑟琳·S·鮑迪什, 安克·克雷茨羅梅爾, 約翰·麥克沃特 申請人:阿萊克森制藥公司