專利名稱：利用免疫球蛋白片段的蛋白質復合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及含生理學活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段的蛋白質綴合物，其中各組分共價連接，并且與天然形式相比其生理學作用持續時間延長。
背景領域因為多肽由于其低穩定性而傾向于容易變性、在血液中被蛋白水解酶降解并容易通過腎臟或肝臟排除，所以蛋白質藥物，包括以多肽作為藥物有效成分的藥物需要頻繁的施用于患者以維持所需要的血液水平濃度和效價。不過，這樣頻繁施用蛋白質藥物，尤其是通過注射施用，會引起患者的痛苦。為了解決這些問題，已進行了許多努力來提高蛋白質藥物的血清穩定性以及長時期保持藥物在血液中的高水平，從而使藥物的藥效最大化。因此，具有持續活性的藥物組合物需要提高蛋白質藥物的穩定性并保持足夠高水平的效價而不會引起患者的免疫應答。
為了穩定蛋白質、預防酶促降解和被腎臟清除，傳統上使用了諸如聚乙二醇(下文中簡稱為“PEG”)等具有高溶解性的聚合物來化學修飾蛋白質藥物的表面。通過與靶蛋白質的特定區域或各種區域結合，PEG穩定了蛋白質并防止其水解，且不會造成嚴重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering 71137-139，1991)。不過，盡管它能增強蛋白質的穩定性，PEG偶聯也存在一些問題，諸如大大降低了生理學“活性”蛋白質的效價。此外，隨著PEG分子量的提高，其產率會有所降低，這是由于該蛋白質的反應性有所降低。
最近已設計了聚合物-蛋白質藥物綴合物。例如，如美國專利5,738,846中所述，可通過在PEG兩端連接同樣的蛋白質藥物來制備綴合物從而提高該蛋白質藥物的活性。此外，如國際專利WO 92/16221中所述，也可以將兩種不同的蛋白質藥物連接于PEG的兩端，得到具有兩種不同活性的綴合物。不過，以上方法在維持蛋白質藥物的活性方面不是非常成功。
另一方面，Kinstler等報道了一種通過偶聯粒細胞集落刺激因子(G-CSF)與人白蛋白而制備的融合蛋白顯示出改良的穩定性(Kinstler等，Pharmaceutical Research 12(12)1883-1888，1995)。不過，在這篇文章中，由于與單獨施用天然G-CSF相比，具有G-CSF-PEG-白蛋白結構的經修飾藥物只顯示出體內停留時間提高了大約4倍和血清半衰期的稍微延長，所以它尚未作為蛋白質藥物的有效的長效制劑而被工業化生產。
改進生理學活性蛋白質體內穩定性的一種備選方法是通過用遺傳重組技術將生理學活性蛋白質的基因與編碼具高血清穩定性的蛋白質的基因連接起來并培養用所述重組基因轉染的細胞以產生融合蛋白。例如，可通過用遺傳重組將白蛋白或其片段與感興趣的生理學活性蛋白質綴合來制備融合蛋白，所述白蛋白是已知在增強蛋白質穩定性方面最有效的一種蛋白質(國際專利申請WO 93/15199和WO 93/15200，歐洲專利申請413,622)。由人類基因組科技公司(HumanGenome Science Company)研發并以商品名‘A1buferonTM’被銷售的α干擾素和白蛋白的融合蛋白在猴子中的半衰期從5小時延長到了93小時，但已知成問題的是它的體內活性降低到未修飾的α干擾素的5％以下(Osborn等，J.Phar.Exp.Ther.303(2)540-548，2002)。
另一方面，免疫球蛋白(Ig)主要由兩個區域組成具有抗體結合位點的Fab和具有補體結合位點的Fc。進行了其他嘗試以通過遺傳重組將蛋白質藥物與免疫球蛋白Fc片段融合。例如，干擾素(韓國專利公開申請文件2003-9464)和白介素-4受體、白介素-7受體或促紅細胞生成素(EPO)受體(韓國專利注冊文件249572)先前已在哺乳動物中以與免疫球蛋白Fc片段融合的形式得到表達。國際專利申請WO01/03737描述了一種包含通過寡肽接頭與免疫球蛋白Fc片段連接的細胞因子或生長因子的融合蛋白。
此外，美國專利5,116,964公布了通過遺傳重組與免疫球蛋白Fc片段的氨基或羧基末端融合的LHR(淋巴細胞表面糖蛋白)或CD4蛋白質，美國專利5,349,053則描述了IL-2與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。通過遺傳重組制備的Fc融合蛋白的其它例子包括β干擾素或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(國際專利申請WO00/23472)，IL-5受體與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(美國專利5,712,121)、α干擾素和免疫球蛋白G4的Fc片段的融合蛋白(美國專利5,723,125)，以及CD4蛋白質和免疫球蛋白G2的Fc片段的融合蛋白(美國專利6,451,313)。此外，如美國專利NO.5,605,690中所述，具有氨基酸變化的Fc變體，尤其是在補體結合位點或受體結合位點具有氨基酸變化的Fc變體，可通過重組DNA技術與TNF受體融合，以得到TNFR-IgG1 Fc融合蛋白。用遺傳重組修飾的免疫球蛋白Fc片段制備Fc融合蛋白的方法可參閱美國專利6,277,375、6,410,008和6,444,792。
美國專利No.6,660,843公布了通過遺傳重組在大腸桿菌中生產包含借助接頭而與免疫球蛋白Fc片段融合之靶蛋白的綴合物的方法。此方法生產綴合物的成本比利用哺乳動物表達體系低，產生未糖基化(aglycosylated)形式的綴合物。不過，由于靶蛋白和免疫球蛋白Fc片段一起于大腸桿菌中產生，如果靶蛋白在天然狀態下是糖基化的，就難以用此方法生產這樣的靶蛋白。此方法還有另一個問題，即綴合物以包涵體表達，導致錯誤折疊率很高。
然而，通過遺傳重組產生的Fc融合蛋白具有以下優點蛋白質融合只發生在免疫球蛋白Fc片段的特定區域，即在氨基或羧基末端；只以均二聚體形式而不以單體形式產生；融合只可能發生在糖基化蛋白質之間或未糖基化(aglycosylated)蛋白質之間，而不可能形成由糖基化蛋1白質和未糖基化蛋白質組成的融合蛋白。此外，由這種融合所建立的新氨基酸序列可能引發免疫應答，而接頭區可能變得對蛋白水解降解作用敏感。
另一方面，就利用免疫球蛋白Fc片段研發融合蛋白而言，沒有關于含有利用交聯劑與人源的天然Fc相連接的靶蛋白的綴合物方面的報導。用接頭制備綴合物的優勢在于方便了選擇和調控連接在一起的兩個蛋白質的連接位點和方向，使得表達可以是單體、二聚體或多聚體，并可以制備同源或異源構建體。免疫球蛋白Fc片段可通過重組DNA技術利用哺乳動物細胞或大腸桿菌產生。不過，迄今為止，還沒有關于在大腸桿菌中單獨以高產量產生并用作長效制劑的天然免疫球蛋白Fc片段方面的報導。此外，迄今為止，還未嘗試通過重組DNA技術生產含有借助交聯劑而與這種大腸桿菌來源的免疫球蛋白Fc片段連接的靶蛋白的綴合物。
另一方面，免疫球蛋白具有抗體功能，諸如抗體依賴型細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴型細胞毒性(CDC)，且免疫球蛋白Fc片段中存在的糖基部分在ADCC和CDC效應中起著重要作用(Burton D.，Molec.Immun.22，161-206，1985)。缺乏糖基部分的免疫球蛋白具有與糖基化免疫球蛋白類似的血清半壽期，但補體和受體結合親和力下降了10-1000倍(Waldmann H.，Eur.J.Immunol.23，403-411，1993；Morrison S.，J.Immunol.143，2595-2601，1989)。
如上所述，已嘗試了各種方法用于將聚合物與生理學活性蛋白質連接。傳統方法增強了多肽的穩定性但顯著降低了其活性，或者提高了多肽的活性而忽略了穩定性。因此，需要有能達到使蛋白質藥物的活性降低最少且穩定性增強的目的的方法。
這樣，由有關研發能實現活性降低最小化且穩定性增強的長效蛋白質藥物制劑(這通常被認為難以完成)的深入徹底的研究得到了本發明，從而發現了通過共價鍵合免疫球蛋白Fc片段、非肽聚合物和生理學活性多肽制備的蛋白質綴合物顯著延長了該生理學活性多肽的血清半壽期并保持了高于已知蛋白質藥物的效價。
發明內容
因此本發明的一個目的是提供使生理學活性多肽的活性降低最小同時延長該多肽的血清半壽期、并降低誘發免疫應答的風險的蛋白質綴合物，以及制備所述蛋白質綴合物的方法。
本發明的另一目的是提供長效蛋白質藥物制劑，其中含有血清半壽期延長的蛋白質綴合物作為有效組分。
本發明的另一目的是提供通過使生理學活性多肽的活性降低最小化且同時增加該多肽的血清半壽期而改進了穩定性和生理學作用持續時間的方法。
附圖簡述本發明的以上及其它目的、特性和其它優勢可通過以下詳述并結合附圖來更清楚的理解，其中
圖1顯示了用木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白獲得的免疫球蛋白Fc片段的層析結果；圖2顯示了純化的免疫球蛋白Fc片段的SDS-PAGE結果(M分子量標準，泳道1IgG，泳道2Fc)；圖3顯示了IFNα-PEG-Fc(A)，17Ser-G-CSF-PEG-Fc(B)與EPO-PEG-Fc(C)綴合物的SDS-PAGE結果，它們是通過偶聯反應產生的(M分子量標準，泳道1Fc，泳道2生理學活性蛋白質，泳道3生理學活性蛋白質-PEG-Fc綴合物)；圖4顯示了偶聯反應后純化的IFNα-PEG-Fc綴合物的大小排阻層析的結果；圖5顯示了EPO-PEG-Fc綴合物的MALDI-TOF質譜的結果；圖6a和6b分別顯示了天然免疫球蛋白Fc和去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)的MALDI-TOF質譜和SDS-PAGE分析結果；圖7顯示了IFNα-PEG-Fc綴合物和IFNα-PEG-DG Fc綴合物的MALDI-TOF質譜結果；
圖8a至8c顯示了IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物的反相HPLC結果；圖9是顯示天然IFNα、IFNα-40K PEG復合物、IFNα-PEG-白蛋白綴合物和IFNα-PEG-Fc綴合物藥物代謝動力學分析結果的曲線圖；圖10是顯示天然EPO、高度糖基化的EPO、EPO-PEG-Fc綴合物和EPO-PEG-AG Fc綴合物的藥物代謝動力學分析結果的曲線圖；圖11是顯示IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物的藥物代謝動力學分析結果的曲線圖；圖12是顯示Fab′、Fab′-S-40K PEG復合物、Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物和Fab′-S-PEG-N-Fc綴合物的藥物代謝動力學曲線圖；圖13是顯示Fab′、Fab′-S-40K PEG復合物和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物和Fab′-S-PEG-N-Fc綴合物體內活性的曲線圖；圖14是顯示人IgG各亞型與C1q補體結合親和力的比較結果的曲線圖；以及圖15是顯示糖基化Fc、酶促去糖基化DG Fc和其中載體為大腸桿菌所產生的AG Fc的干擾素-PEG-載體綴合物與C1q補體結合親和力的比較結果的示意圖。
實施本發明的最佳方式一方面，為了達到上述目的，本發明提供了含有共價連接的生理學活性多肽、兩端都有反應性基團的非肽聚合物以及免疫球蛋白Fc片段的蛋白質綴合物。
術語“蛋白質綴合物”或“綴合物”用于此處時指含有一個或多個生理學活性多肽、一個或多個兩端都有反應性基團的非肽聚合物和一個或多個免疫球蛋白Fc片段，其中這三種組分共價連接。此外，為了與“綴合物”相區分，只包含選自生理學活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段中的兩種不同分子的構建體(其中這兩種分子共價連接在一起)則被稱為“復合物”。
本發明的蛋白質綴合物是被制成減少蛋白質藥物的生理學活性的降低并延長其體內持續時間的蛋白質藥物變體，其特征在于將免疫球蛋白Fc片段與蛋白質藥物相連接。
免疫球蛋白Fc片段就用作藥物載體而言是安全的，因為它是可生物降解的多肽，能夠在體內被新陳代謝掉。此外，免疫球蛋白Fc片段與整個免疫球蛋白分子相比具有相對較低的分子量，因此有利于目的綴合物的制備、純化和生產。另外，由于免疫球蛋白Fc片段不包含Fab片段(它的氨基酸序列在抗體亞型中有所不同，因此具有高度的非均一性)，它能極大的提高物質的均一性并且具有較低的抗原性。
術語“免疫球蛋白Fc片段”用于此處時是指含有免疫球蛋白重鏈恒定區2(CH2)和重鏈恒定區3(CH3)且不含免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區、重鏈恒定區1(CH1)和輕鏈恒定區1(CL1)的蛋白質。它可能進一步包含位于重鏈恒定區的鉸鏈區域。此外，除了重鏈和輕鏈可變區之外，本發明的免疫球蛋白Fc片段可能包含重鏈恒定區1(CH1)和/或輕鏈恒定區1(CL1)的一部分或全部。同樣，只要它具有與天然蛋白質基本上相似或優于天然蛋白質的生理學作用，則IgG Fc片段可以是在CH2和/或CH3氨基酸序列的相對較長部分中有缺失的片段。即，本發明的免疫球蛋白Fc片段可包含1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域，2)CH1結構域和CH2結構域，3)CH1結構域和CH3結構域，4)CH2結構域和CH3結構域，5)一個或多個結構域和免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區的一部分)的組合，和6)重鏈恒定區和輕鏈恒定區各個結構域的二聚體。
本發明的Fc片段包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突變體)。氨基酸序列衍生物是由于一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或它們的組合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgG Fc中，已知對于結合重要且位于位點214至238、297至299、318至322或327至331處的氨基酸殘基可用作修飾的適當靶目標。此外，其它各種衍生物也是有可能的，包括其中能形成二硫鍵的區域被缺失，或者天然Fc形式N末端的某些氨基酸殘基被除去或在此添加了甲硫氨酸殘基的衍生物。此外，為了去除效應器功能，缺失可以發生在補體結合位點，諸如C1q結合位點和ADCC位點。制備所述的免疫球蛋白Fc片段序列衍生物的技術參閱國際專利申請WO 97/34631和WO 96/32478。
蛋白質和肽中通常不改變其活性的氨基酸變換是本領域所已知的(H.Neurath，R.L.Hill，蛋白質The Proteins，AcademicPress，New York，1979)。最通常發生的變換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，可以是其中任一種替換另一種。
此外，如果需要，Fc片段可以通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等等作用而被修飾。
上述Fc衍生物是具有與本發明Fc片段同樣的生物學活性或提高了結構穩定性(例如，抗熱、pH等等)的衍生物。
此外，這些Fc片段可獲自從人或包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠在內的其它動物中分離的天然形式，或可以是重組體或它們的衍生物，獲自被轉化的動物細胞或微生物。在此，它們可通過從人或動物體中分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶加以處理而從天然的免疫球蛋白獲得。木瓜蛋白酶將天然的免疫球蛋白消化成Fab和Fc片段，而胃蛋白酶處理則導致了pF′c和F(ab′)2片段的產生。可對這些片段進行例如大小排阻層析以分離Fc或pF′c。
優選的，人源Fc片段是獲自微生物的重組免疫球蛋白Fc片段。
此外，本發明的免疫球蛋白Fc片段可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比糖鏈增加或與天然形式相比糖鏈減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖鏈的增加、減少或去除可以通過本領域的通用方法完成，諸如化學法、酶促法和利用微生物的遺傳工程方法。將糖鏈從Fc片段中去除導致了它與第一補體成分C1的C1q部分的結合親和力明顯降低和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)的降低或喪失，從而不會在體內引起不必要的免疫應答。在這點上，去糖基化或未糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更適于本發明作為藥物載體的目的。
用于此處時，術語“去糖基化”指從Fc片段中酶促除去了糖基部分，而術語“未糖基化”指Fc片段是以非糖基化的形式由原核生物，優選大腸桿菌產生。
另一方面，免疫球蛋白Fc片段可來自人類或其它動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和豚鼠，優選人類。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者通過它們的組合或雜合制備而來的Fc片段。優選Fc片段來自IgG或IgM(它們是人類血液中最豐富的蛋白質之一)，最優選來自IgG(已知它能延長配體結合蛋白質的半壽期)。
另一方面，術語“組合”用于此處時是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不同來源的單鏈多肽連接形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由選自IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc和IgG4 Fc片段中的兩種或多種片段所形成。
術語“雜合體”用于此處時指編碼兩種或多種不同來源的免疫球蛋白Fc片段的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fc片段中。在本發明中，各種類型的雜合體都是有可能的。即，結構域雜合體可以由選自IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc和IgG4 Fc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一種至四種結構域組成，且可能包含鉸鏈區。
另一方面，IgG被劃分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型，本發明包括它們的組合和雜合體。優選IgG2和IgG4亞型，最優選IgG4的Fc片段，它幾乎不具有諸如CDC(補體依賴型細胞毒性)等效應器功能(參閱圖14和15)。
也就是說，作為本發明的藥物載體，最優選的免疫球蛋白Fc片段是人IgG4來源的未糖基化Fc片段。人源Fc片段比非人源Fc片段更優越，因為后者可能在人體內作為抗原并引起不期望有的免疫應答，諸如產生抗該抗原的新抗體。
本發明的特征在于免疫球蛋白Fc片段和蛋白質綴合物是通過非肽聚合物連接在一起的。
術語“非肽聚合物”用于此處指生物相容性聚合物，其中包括兩個或多個通過除肽鍵之外的共價鍵彼此相連的重復單元。
能用于本發明的非肽聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、諸如PLA(聚乳酸)和PLGA(poly lactic-glycolicacid)等可生物降解聚合物、脂類聚合物、幾丁質、透明質酸及它們的組合物。最優選的是聚乙二醇(PEG)。此外，本領域眾所周知且在本領域技術范圍內易于制備的它們的衍生物也包含在本發明的范圍內。非肽聚合物優選分子量為1-100kDa，更優選1-20kDa。此外，本發明中與免疫球蛋白Fc片段連接的非肽聚合物可以是一種聚合物或不同類型聚合物的組合。
可用于本發明的非肽聚合物具有能與免疫球蛋白Fc片段和蛋白質藥物結合的反應性基團。
非肽聚合物在兩端都具有反應性基團，優選所述基團選自反應性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物。所述琥珀酰亞胺衍生物可以是丙酸琥珀酰亞胺酯、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基或碳酸琥珀酰亞胺酯。尤其是，當非肽聚合物在其兩端都具有反應性醛基時，在其兩端與生理學活性多肽和具有最小非特異反應的免疫球蛋白Fc片段相連接是有效的。通過醛鍵由還原性烷基化產生的終產物比通過酰胺鍵連接的要穩定得多。
在非肽聚合物兩端的反應性基團可以是相同的或不同的。例如，非肽聚合物可以在一端具有馬來酰亞胺基團，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當用兩端具有反應性羥基的聚乙二醇(PEG)作為非肽聚合物時，所述羥基可通過已知的化學反應被激活成多種反應性基團，或者可利用具有商品化修飾反應性基團的PEG以制備本發明的蛋白質綴合物。
另一方面，在本發明中，免疫球蛋白Fc片段和非肽聚合物的復合物與生理學活性多肽連接以產生蛋白質綴合物。
術語“生理學活性多肽”、“生理學活性蛋白質”、“活性多肽”、“多肽藥物”和“蛋白質藥物”用于此處時其意義是可互換的，其特征是它們都處于呈現各種體內生理學功能的生理學活性形式。
蛋白質藥物的劣勢是由于其易被體內存在的蛋白水解酶變性或降解的特性造成了它不能長期保持生理學作用。不過，當多肽藥物與本發明的免疫球蛋白Fc片段相綴合而形成綴合物時，該藥物的結構穩定性得以提高，降解半壽期也延長了。同樣，與Fc片段綴合的多肽與其它已知的多肽藥物制劑相比，其生理學活性的降低要小得多。因此，與常規多肽藥物的體內生物利用率相比，依照本發明的多肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物的特征是具有顯著提高的體內生物利用率。這一點也通過本發明的實施方案進行了清楚的闡述。即，與它們單獨綴合PEG或綴合PEG和白蛋白二者的常規形式相比，當與本發明的免疫球蛋白Fc片段連接時，IFNα、G-CSF、hGH和其它蛋白質藥物呈現出體內生物利用率提高了大約2至6倍(表8、9和10)。
另一方面，蛋白質和本發明免疫球蛋白Fc片段之間的連接的特征在于，它不是通過常規的重組方法融合的。通過重組方法獲得的并用作藥物的免疫球蛋白Fc片段與活性多肽的融合形式是以如下方式得到的，即將多肽與Fc片段的N末端或C末端連接，并從編碼融合形式的核苷酸序列表達和折疊成單一多肽。
這導致了所產生的融合蛋白的活性顯著降低，因為蛋白質作為生理學功能性物質的活性是由蛋白質的構象決定的。因此，當多肽藥物通過重組方法與Fc融合時，即使融合蛋白的結構穩定性提高了，它對其體內生物利用率也沒有影響。同樣，由于這樣的融合蛋白常常錯誤折疊并因此以包涵體形式表達，這樣的融合方法在蛋白質產生和分離純化中是不經濟的。此外，當多肽的活性形式是糖基化形式時，多肽應于真核細胞中表達。這種情況下，Fc也被糖基化，而此糖基化可能引起體內不適當的免疫應答。
也就是說，只有本發明有可能產生糖基化活性多肽和非糖基化免疫球蛋白Fc片段的綴合物，并克服所有上述問題，包括提高蛋白質產量，因為復合物的兩種組分是通過最佳體系單獨制備和分離的。
另一方面，可應用于本發明蛋白質綴合物的生理學活性多肽舉例說來有激素、細胞因子、白介素、白介素結合蛋白、酶、抗體、生長因子、轉錄調控因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白質、配體蛋白質或受體、細胞表面抗原、受體拮抗劑及它們的衍生物。
具體而言，生理學活性多肽的非局限性例子包括人生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素和干擾素受體(例如干擾素-α、-β和-γ，水溶性I型干擾素受體，等)、集落刺激因子、白介素(例如白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20-、21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白介素受體(例如IL-1受體、IL-4受體等)、酶(例如葡糖腦苷脂酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶-A、α-L-iduronidase、丁酰膽堿酯酶、幾丁質酶、谷氨酸脫羧酶、imiglucerase、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性內肽酶、髓過氧化物酶、等)、白介素和細胞因子結合蛋白(例如IL-18bp、TNF結合蛋白，等)、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態反應抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調節蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質、降鈣素、胰島素、心房肽激素(atriopeptin)、軟骨誘發因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經生長因子(如神經生長因子、睫狀神經營養因子、axogenesis factor-1、胰高血糖素樣肽(如GLP-1)、腦促尿鈉排泄肽、神經膠質來源的神經營養因子、netrin、neurophil抑制因子、神經營養因子、neuturin等)、甲狀旁腺激素、松弛素、促胰液素(secretin)、生長調節素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子(autotaxin)、乳鐵蛋白、筒箭毒堿(myostatin)、受體(如TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、B細胞活化因子受體，等)、受體拮抗劑(如IL1-Ra等)、細胞表面抗原(如CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(如scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd)和病毒來源的疫苗抗原。
具體而言，優選作為生理學活性多肽的是那些在施用于個體以治療或預防疾病時需頻繁給藥的多肽，包括人生長激素、干擾素(干擾素-α、-β、-γ等)、粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素(EPO)和抗體片段。最優選的多肽藥物是干擾素-α。此外，某些衍生物也包括在本發明的生理學活性多肽的范圍內，只要與天然形式的生理學活性多肽相比，它們具有基本上相同的或更優越的功能、結構、活性或穩定性。
在本發明中，抗體片段可以是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd或scFv，它能結合特異的抗原，優選Fab′。Fab片段包含輕鏈的可變區(VL)和恒定區(CL)以及重鏈的可變區(VH)和第一恒定區(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段在于它在CH1結構域的羧基末端添加了數個氨基酸殘基，包括來自鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸殘基。Fd片段只包含VH和CH1結構域，而F(ab′)2片段則作為一對Fab′片段通過二硫鍵或化學反應產生。scFv(單鏈Fv)片段包含通過肽鍵相互連接并因此以單一多肽鏈存在的VL和VH結構域。
另一方面，當免疫球蛋白Fc片段和蛋白質藥物通過非肽聚合物被連接在一起時，免疫球蛋白Fc片段的連接位點包括存在于鉸鏈區或恒定區的氨基酸殘基的一個或多個游離反應性基團。優選的，免疫球蛋白Fc恒定區和蛋白質藥物在氨基末端、賴氨酸殘基的氨基、組氨酸殘基的氨基或游離的半胱氨酸殘基處與非肽聚合物相應末端的反應性基團共價連接。
本發明的蛋白質綴合物可包含一個或多個“生理學活性多肽-非肽聚合物-免疫球蛋白Fc片段”單元結構，其中所有的組分都通過共價鍵線性連接。由于非肽聚合物在自身的兩端都具有反應性基團，它可以與生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段通過共價鍵連接。也就是說，非肽聚合物與生理學活性多肽的一個或多個復合物可通過共價鍵與單個免疫球蛋白Fc片段連接，以產生以免疫球蛋白Fc片段為載體的生理學活性多肽單體、二聚體或多聚體，從而更有效的提高體內活性和穩定性。
在本發明的蛋白質綴合物中，生理學活性多肽可與免疫球蛋白Fc片段以各種摩爾比例連接。
此外，正如通常所已知的，兩種不同的蛋白質通過寡肽連接在一起，在接頭位點處形成的氨基酸序列有引起免疫反應的風險，而蛋白質的連接位點局限于N末端和C末端。相反，由于本發明的蛋白質綴合物通過生物相容性非肽聚合物介導，它的有利之處在于沒有諸如毒性或免疫應答產生等副作用，并且由于其連接位點的多樣性而可以制備多種蛋白質綴合物。
此外，通過遺傳重組將免疫球蛋白Fc片段直接與活性蛋白質相融合的常規方法是有問題的，因為這使融合只發生在用作融合配偶體的免疫球蛋白Fc片段末端序列中，而且由于其依賴于動物細胞培養的生產模式而限制了融合蛋白的產量。傳統方法具有另外的問題，即其中活性蛋白質的活性可能由于非天然的糖基化作用而降低，蛋白質折疊必須準確發生，且融合蛋白可能會以均二聚體的形式產生。尤其是，當綴合物于大腸桿菌中產生時，不溶性的錯誤折疊的綴合物非常難以除去。相反，本發明的蛋白質綴合物可能具有長得多的作用持續時間和高得多的穩定性，同時還不會引起這些問題，它在保持多肽的活性方面而尤其優選，使得可能制備含有與非糖基化Fc連接的糖基化治療蛋白質的綴合物。
另一方面，低分子量化學結合劑，諸如碳二亞胺或戊二醛，存在以下問題它們可以同時結合蛋白質上的幾個位點，導致蛋白質的變性，且結合是非特異性的，從而使得難以控制連接位點或純化所連接的蛋白質。相反，由于本發明的蛋白質綴合物利用了非肽聚合物，所以它便于控制連接位點，使非特異性反應最小化，并且便于蛋白質的純化。
本發明的用處在以下實施方案中有更詳細的描述。含有與PEG各端連接的生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段的本發明蛋白質綴合物(多肽-PEG-Fc)，比多肽-PEG復合物或多肽-PEG-白蛋白綴合物具有高得多的穩定性。藥物代謝動力學分析顯示，與天然IFNα相比，當與40-kDa PEG連接時(IFNα-40K PEG復合物)，IFNα的血清半壽期提高了大約20倍，而在IFNα-PEG-白蛋白綴合物中則提高了大約10倍。相反，依照本發明的IFNα-PEG-Fc綴合物顯示出半壽期顯著增加大約50倍(見表3)。此外，在其它靶蛋白、人生長激素(hGH)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和其衍生物(17S-G-CSF)以及促紅細胞生成素(EPO)中觀察到了同樣的結果。與蛋白質的天然形式以及綴合PEG或PEG-白蛋白的形式相比，依照本發明的蛋白質綴合物(其中各包含與PEG-Fc連接的靶蛋白)顯示出平均停留時間(mean residencetime，MRT)和血清半壽期延長了大約10倍(見表4至7)。
此外，當PEG-Fc復合物與接近Fab′C末端或Fab′N末端的-SH基團連接時，產生的Fab’-PEG-Fc綴合物呈現出比40K PEG-Fab’復合物長2到3倍的血清半壽期(見圖12)。
此外，當蛋白質綴合物是用去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)(其中糖基部分被去除)和重組的非糖基化免疫球蛋白Fc(AG Fc)衍生物制備的時候，它們的血漿半壽期和體外活性維持在與利用天然Fc制備的蛋白質綴合物相似的水平上(見表3，圖8和11)。
因此，由于本發明的蛋白質綴合物具有延長的血清半壽期和平均停留時間(MRT)，當它們被應用于包括人生長激素、干擾素、促紅細胞生成素、集落刺激因子或其衍生物和抗體衍生物在內的多種生理學活性多肽時，它們可用于開發不同生理學活性多肽的長效制劑。
在另一方面，本發明提供了制備體內持續時間和穩定性有所改進的蛋白質綴合物的方法，包括(a)促進兩端都具有反應性基團的非肽聚合物、生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段之間共價連接的反應；并(b)分離所產生的含有與非肽聚合物各端共價連接的生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物。
在步驟(a)中，所述三種組分之間的共價連接依次或同時發生。例如，當生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段與非肽聚合物的各端連接時，生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段中的任一個與非肽聚合物的一端連接，然后另一組分與非肽聚合物的另一端連接。為了使除了預期蛋白質綴合物之外的副產物的生成最小化，優選這樣的順序連接方法。
因此，步驟(a)可能包括(a1)將免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽與非肽聚合物的一端共價連接；(a2)從反應混合物中分離含有與非肽聚合物連接的免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽的復合物；并(a3)將生理學活性多肽或免疫球蛋白Fc片段與所分離的復合物中非肽聚合物的另一端共價連接，得到含有與非肽聚合物各端連接的免疫球蛋白Fc片段和生理學活性多肽的蛋白質綴合物。
在步驟(a1)中，生理學活性多肽和非肽聚合物的最佳反應摩爾比例是1∶2.5至1∶5之間，而免疫球蛋白Fc片段和非肽聚合物的最佳反應摩爾比例是1∶5至1∶10之間。
另一方面，在步驟(a3)中，步驟(a2)中獲得的復合物與免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽之間的反應摩爾比例可以在1∶0.5至1∶20之間，而優選1∶1至1∶3之間。
如果需要，可在還原劑存在的條件下進行步驟(a1)和(a3)，這取決于參與步驟(a1)和(a3)反應的非肽聚合物兩端的反應性基團類型。優選的還原劑可包括氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。
考慮到步驟(a2)和(b)所需的純度以及產物的分子量和電荷，可從本領域通常所用的蛋白質分離方法中選擇適當的蛋白質分離方法。例如，可應用多種已知方法，包括大小排阻層析和離子交換層析。如果需要，還可以使用數種不同方法的組合來達到高度純化。
在另一方面，本發明提供了藥物組合物以使生理學活性多肽在體內持續時間和穩定性上有所改進，其中包含本發明蛋白質綴合物作為有效組分以及藥用可接受載體。
術語“施用”用于此處時指通過某一合適方法將預定量的物質引入患者中。本發明的綴合物可通過任何常規路徑施用，只要它能到達預期組織即可。各種施用方式都在考慮范圍內，包括腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內施用，但本發明并不局限于這些例證性的施用方式。不過，由于在口服時肽會被消化，故口服組合物的活性成分應被包裹或配制成保護其在胃中免于降解的形式。優選的，本發明組合物可以可注射的形式施用。此外，本發明的藥物組合物可用能將活性成分轉運入靶細胞的某種設備施用。
含有依照本發明的綴合物的藥物組合物可包含藥物可接受載體。對口服而言，藥物可接受載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑和芳香劑。對可注射制劑而言，藥物可接受載體可包括緩沖劑、保存劑(preserving agent)、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑。對于局部施用的制劑而言，藥物可接受載體可包括堿、賦形劑、潤滑劑和保存劑。本發明的藥物組合物可與前述藥物可接受載體組合配制成各種劑型。例如，就口服給藥而言，藥物組合物可以被配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或干膠片(wafer)。就可注射制劑而言，藥物組合物可被配制成單位劑型，諸如多劑量容器或單劑量形式的安瓿。藥物組合物也可被配制成溶液、懸浮液、片劑、膠囊和長效制劑。
另一方面，適于藥物制劑的載體、賦形劑和稀釋液的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽(酯)、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸鹽(酯)、丙基羥基苯甲酸鹽(酯)、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，藥物組合物可進一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、芳香劑、乳化劑和防腐劑。
與作為載體的本發明免疫球蛋白Fc片段組合的藥物的實質劑量可能由數種相關因素決定，包括待治療疾病的類型、施用途徑、患者年齡、性別、體重和病情的嚴重程度以及作為活性組分的藥物的類型。由于本發明的藥物組合物在體內具有很長的作用持續時間，所以它具有極大地降低治療藥物施用頻率的優勢。
從以下實施例中可以更好的理解本發明，這些實施例的提出只是為了舉例說明，而不應被認為是對本發明的限制。
實施例1IFNα-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物的制備I<步驟1>用免疫球蛋白制備免疫球蛋白Fc片段免疫球蛋白Fc片段制備如下。將溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的200mg 150-kDa免疫球蛋白G(IgG)(Green Cross，Korea)用2mg蛋白水解酶—木瓜蛋白酶(Sigma)在37℃溫和攪拌處理2小時。酶反應后，對由此再生的免疫球蛋白Fc片段依次用Superdex柱、蛋白A柱和陽離子交換柱進行層析純化。具體的說，就是將反應液加到用10mM磷酸鈉緩沖液(PBS，pH7.3)平衡過的Superdex 200柱(Pharmacia)上，將柱 用同一緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫。與免疫球蛋白Fc片段相比具有相對較高分子量的未反應免疫球蛋白分子(IgG)和F(ab′)2由于其洗脫早于Ig Fc片段的特性而被除去。分子量近似于Ig Fc片段的Fab片段通過蛋白A柱層析除去(圖1)。將洗脫自Superdex 200柱的含Ig Fc片段的所得組分以5ml/分鐘的流速加到用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡的蛋白A柱(Pharmacia)上，用同一緩沖液洗滌柱，以去除未結合在柱上的蛋白質。然后，用100mM檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)洗脫蛋白A柱，以獲得高純度的免疫球蛋白Fc片段。最后用陽離子交換柱(polyCAT，PolyLC Company)純化從蛋白A柱收集的Fc組分，其中上樣了Fc組分的該柱子用10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的0.15-0.4M NaCl線性梯度洗脫，從而提供了高純度的Fc組分。用12％SDS-PAGE分析高純度的Fc組分(圖2中的泳道2)。
<步驟2>IFNα-PEG復合物的制備將兩端具有醛反應性基團的3.4-kDa聚乙二醇ALD-PEG-ALD(Shearwater)與以5mg/ml的量溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的人干擾素α-2b(hIFNα-2b，MW20kDa)以IFNα∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉(NaCNBH3，Sigma)，并在溫和攪拌下在4℃反應3小時，使PEG與干擾素α的氨基末端連接。為了得到PEG和干擾素α的1∶1復合物，將反應混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)作為洗脫液將IFNα-PEG復合物從柱上洗脫下來，而未與PEG連接的干擾素α、未反應的PEG以及PEG與兩個干擾素α分子連接的二聚體副產物則被去除。將純化的IFNα-PEG復合物濃縮至5mg/ml。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最小量諸如二聚體等副產物的IFNα∶PEG最佳反應摩爾比率是1∶2.5至1∶5。
<步驟3>IFNα-PEG-Fc綴合物的制備為了將上述步驟2中純化的IFNα-PEG復合物與免疫球蛋白Fc片段的N末端連接，將以上步驟1中制備的免疫球蛋白Fc片段(約53kDa)溶于10mM磷酸鹽緩沖液中，并以IFNα-PEG復合物∶Fc的摩爾比率1∶1、1∶2、1∶4和1∶8與IFNα-PEG復合物混合。在將反應溶液的磷酸鹽緩沖液濃度調節到100mM之后，將還原劑NaCNBH3加入反應液中，終濃度20mM，在溫和攪拌下于4℃反應20小時。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最少量的諸如二聚體等副產物的IFNα-PEG復合物∶Fc的最佳反應摩爾比率是1∶2。
<步驟4>IFNα-PEG-Fc綴合物的分離和純化在以上步驟3的反應之后，對反應混合物進行Superdex大小排阻層析以去除未反應的物質和副產物，并純化所產生的IFNα-PEG-Fc蛋白綴合物。將反應混合物濃縮并加到Superdex柱上之后，使10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.3)以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結合的Fc和未反應的物質，隨后進行柱子洗脫，收集IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物部分。由于所收集到的IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物級分包含小量的雜質、未反應的Fc和干擾素α二聚體，進行陽離子交換層析以去除雜質。將IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物級分加到用10mM乙酸鈉(pH4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的0-0.5M NaCl線性梯度洗脫柱子。最后，用陰離子交換柱純化IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物。將IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物部分加到用10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的PolyWAX LP柱(PolyLC)上，然后用1M NaCl在10mM Tris-HCl(pH7.5)中的0-0.3M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物。
實施例2IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物的制備II
<步驟1>Fc-PEG復合物的制備將兩端具有醛反應性基團的3.4-kDa聚乙二醇ALD-PEG-ALD(Shearwater)與以15mg/ml的量溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的實施例1步驟1中所制備的免疫球蛋白Fc片段按Fc∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。在此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉(NaCNBH3，Sigma)，并在溫和攪拌下使之于4℃反應3小時。為了得到PEG和Fc的1∶1復合物，將反應混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)作為洗脫液將Fc-PEG復合物從柱上洗脫下來，而未與PEG連接的免疫球蛋白Fc片段、未反應的PEG以及PEG與兩個免疫球蛋白Fc片段分子連接的二聚體副產物則被去除。將純化的Fc-PEG復合物濃縮至大約15mg/ml。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最小量諸如二聚體等副產物的Fc∶PEG最佳反應摩爾比率是1∶3至1∶10。
<步驟2>Fc-PEG復合體和干擾素α的綴合物的形成和純化為了將上述步驟1中純化的Fc-PEG復合物與IFNα的N末端連接，將Fc-PEG復合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液的IFNα以Fc-PEG復合物∶IFNα的摩爾比率1∶1、1∶1.5、1∶3和1∶6混合。在將反應溶液中的磷酸鹽緩沖液濃度調節到100mM之后，將還原劑NaCNBH3加入反應液中，終濃度20mM，使之在溫和攪拌下于4℃反應20小時。反應完成后，依照實施例1步驟4中同樣的純化方法將未反應的物質和副產物去除，從而分離高純度形式的Fc-PEG-IFNα蛋白質綴合物。
實施例3hGH-PEG-Fc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化hGH-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用除干擾素α之外的藥物-人生長激素(hGH，MW22kDa)，并且hGH∶PEG的摩爾比率是1∶5。
實施例4(G-CSF)-PEG-Pc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化G-CSF-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用干擾素α之外的藥物-人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)，并且hG-CSF∶PEG的摩爾比率是1∶5。
另一方面，利用在天然hG-CSF的第17位氨基酸殘基處具有絲氨酸取代的G-CSF衍生物17S-G-CSF，依照上述相同的方法制備和純化17S-G-CSF-PEG-Fc蛋白質綴合物。
實施例5EPO-PEG-Fc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化EPO-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用了干擾素α之外的藥物-人促紅細胞生成素(EPO)，并且EPO∶PEG的摩爾比率是1∶5。
實施例6用具有不同反應性基團的PEG制備蛋白質綴合物用兩端具有丙酸琥珀酰亞胺酯(SPA)反應性基團的PEG制備IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物，步驟如下。將3.4-kDa聚乙二醇SPA-PEG-SPA(Shearwater)與溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的10mg干擾素α以IFNα∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。然后使混合物在溫和攪拌下于室溫反應2小時。為了獲得PEG和干擾素α的1∶1復合物(IFNα-PEG復合物)(其中PEG選擇性的與干擾素α的賴氨酸殘基的氨基連接)，對反應混合物進行Superdex大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)作為洗脫緩沖液從柱上洗脫IFNα-PEG復合物，未連接PEG的干擾素α、未反應的PEG以及其中兩個干擾素α分子與PEG兩端連接的二聚體副產物被去除。為了將IFNα-PEG復合物與免疫球蛋白Fc的賴氨酸殘基的氨基連接，將純化的IFNα-PEG復合物濃縮至約5mg/ml，并依照實施例1步驟3和4中相同的方法制備和純化IFNα-PEG-Fc綴合物。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最少量諸如二聚體等副產物的最佳IFNα∶PEG反應摩爾比例是1∶2.5至1∶5。
另一方面，依照上述相同方法，利用在兩端都具有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應性基團的PEG即NHS-PEG-NHS(Shearwater)或兩端都具有丁醛反應性基團的PEG即BUA-PEG-BUA(Shearwater)制備另一種IFNα-PEG-Fc綴合物。
實施例7用具有不同分子量的PEG制備蛋白質綴合物用兩端具有醛反應性基團的10-kDa聚乙二醇即ALD-PEG-ALD(Shearwater)制備IFNα-10K PEG復合物。依照實施例1步驟2中相同的方法制備和純化此復合物。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最少量諸如二聚體等副產物的最佳IFNα∶10-kDa PEG反應摩爾比率是1∶2.5至1∶5。將純化的IFNα-10K PEG復合物濃縮至大約5mg/ml，并用此濃度依照實施例1步驟3和4中相同的方法制備和純化IFNα-10K PEG-Fc綴合物。
實施例8Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物(-SH基團)的制備<步驟1>Fab’的表達和純化將表達抗腫瘤壞死因子αFab’的大腸桿菌轉化株BL21/poDLHF(保藏號KCCM-10511)在100ml LB培養基中振蕩培養過夜，接種于5-L的發酵罐(Marubishi)中，并在30℃以500rpm轉數和20vvm空氣流速進行培養。為了補充發酵期間細菌生長所需的不足營養物，根據細菌的發酵狀態在培養物中補充葡萄糖和酵母提取物。當培養物達到OD600值為80-100時，在培養物中加入誘導劑IPTG以誘導蛋白質的表達。將培養物進一步培養40到45小時，直至600nm的0D值提高到120至140。將由此獲得的發酵液以20,000×g離心30分鐘。收集上清，棄沉淀。
對上清液進行以下三步柱層析以純化抗腫瘤壞死因子αFab’。將上清液加到用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡的HiTrap蛋白G柱(5ml，Pharmacia)上，并用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脫柱子。然后將收集到的Fab’級分加到用10mM磷酸鈉緩沖液(PBS，pH7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，并用相同的緩沖液洗脫此柱子。最后，將第二步的Fab’級分加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的0.15-0.4M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而提供高純度的抗腫瘤壞死因子αFab’級分。
<步驟2>Fc-PEG復合物的制備和純化為了將PEG接頭連接到免疫球蛋白Fc的N-末端，將依照實施例1步驟1中同一種方法制備的免疫球蛋白Fc溶于100mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中，終濃度5mg/ml，并以Fc∶PEG摩爾比率1∶10與NHS-PEG-MAL(3.4kDa，Shearwater)混合，隨后在溫和攪拌下于4℃保溫12小時。
反應完成后，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)置換反應緩沖液，以去除未結合的NHS-PEG-MAL。然后，將反應混合物加到polyCAT柱(PolyLC)上。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子。在洗脫過程中，免疫球蛋白Fc-PEG復合物早于未反應的免疫球蛋白Fc而洗脫下來，而未反應的Ig Fc稍后被洗脫，從而除去了未反應的Ig Fc分子。
<步驟3>Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物(-SH基團)的制備和純化為了將免疫球蛋白Fc-PEG復合物連接至Fab’的半胱氨酸基團處，將上述步驟1中純化的Fab’以2mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)中，并與上述步驟2中制備的免疫球蛋白Fc-PEG復合物以Fab’∶復合物摩爾比例1∶5混合。將反應混合物濃縮至終濃度50mg/ml，并在溫和攪拌下于4℃保溫24小時。
反應完成后，將反應混合物加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，并用同樣的緩沖液以1ml/分鐘的流速洗脫柱子。被偶聯的Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物由于其高分子量而相對較早地洗脫下來，而未反應的免疫球蛋白Fc-PEG復合物和Fab’則在稍后被洗脫下來，從而除去了未反應的分子。為了完全除去未反應的免疫球蛋白Fc-PEG，將收集的Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物級分再加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子，由此得到含有與接近Fab’C末端的-SH基團連接的Fc-PEG復合物的純Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物。
實施例9Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物(N-末端)的制備<步驟1>Fab’-PEG復合物(N-末端)的制備和純化將實施例8步驟1中純化的40mg Fab’以5mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，以Fab’∶PEG摩爾比率1∶5與丁基ALD-PEG-丁基ALD(3.4kDa，Nektar)混合。將還原劑NaCNBH3加到反應混合物中，終濃度20mM，然后在溫和攪拌下使反應混合物在4℃反應2小時。
在反應完成后，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)置換反應緩沖液。然后，將反應混合物加到polyCAT柱(PolyLC)上。用20mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的0.15-0.4M線性NaCl梯度洗脫柱子。在柱洗脫過程中，含有與Fab’N末端連接的PEG的Fab’-PEG復合物早于未反應的Fab’被洗脫下來，而未反應的Fab’稍后被洗脫下來，從而除去了未反應的Fab’分子。
<步驟2>Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物的制備和純化為了將以上步驟1中純化的Fab’-PEG復合物與免疫球蛋白Fc的N末端連接，將Fab’-PEG復合物以10mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，并與溶于相同緩沖液中的免疫球蛋白Fc以Fab’-PEG復合物∶Fc摩爾比率1∶5混合。在反應混合物濃縮至蛋白質終濃度50mg/ml后，將還原劑NaCNBH3加入反應混合物中，終濃度為20mM，然后在溫和攪拌下使反應混合物在4℃反應24小時。
反應完成后，將反應混合物加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，并用相同緩沖液以1ml/分鐘的流速洗脫柱子。被偶聯的Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物由于其高分子量而被相對較早地洗脫下來，而未反應的免疫球蛋白Fc和Fab’-PEG復合物則在稍后被洗脫下來，從而除去了未反應的分子。為了完全除去未反應的免疫球蛋白Fc分子，將收集的Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物級分再加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子，由此得到含有與Fab’N末端連接的免疫球蛋白Fc-PEG復合物的純Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物。
實施例10去糖基化免疫球蛋白Fc的制備和純化將根據實施例1中的相同方法制備的200mg免疫球蛋白Fc以濃度2mg/ml溶于100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中，并與300U/mg去糖基化酶PNGase F(NEB)混合。使反應混合物在溫和攪拌下于37℃反應24小時。然后，為了純化去糖基化的免疫球蛋白Fc，將反應混合物加到SP Sepharose FF柱(Pharmacia)上，然后用1M NaCl在10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的0.1-0.6M線性NaCl梯度洗脫柱子。天然免疫球蛋白Fc較早地洗脫下來，而去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)則稍后被洗脫下來。
實施例11IFNα-PEG-DG Fc綴合物的制備為了將實施例10中制備的去糖基化免疫球蛋白Fc與實施例1步驟2中純化的IFNα-PEG復合物連接，將IFNα-PEG復合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的DG Fc以IFNα-PEG復合物∶DG Fc摩爾比例1∶1、1∶2、1∶4和1∶8混合。在將反應溶液的磷酸鹽緩沖液濃度調節到100mM后，將還原劑NaCNBH3以20mM的終濃度加到反應溶液中，并在溫和攪拌下使其在4℃反應20小時。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最少量諸如二聚體等副產物的最佳反應摩爾比例IFNα-PEG復合物∶DG Fc是1∶2。
在偶聯反應后，將反應混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析，以去除未反應的物質和副產物，并純化IFNα-PEG-DGFc蛋白質綴合物。在將反應混合物加到柱子上后，使磷酸鹽緩沖液(pH7.3)以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結合的DG Fc和未反應的物質，隨后柱洗脫，以收集IFNα-PEG-DG Fc蛋白質綴合物級分。由于所收集到的IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物級分包含小量的雜質、未反應的DG Fc和IFNα-PEG復合物，進行陽離子交換層析以去除雜質。將IFNα-PEG-DG Fc蛋白質綴合物級分加到用10mM乙酸鈉(pH4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的0-0.6M NaCl線性梯度洗脫柱子。最后，用陰離子交換柱純化IFNα-PEG-DG Fc蛋白質綴合物。將IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物級分加到用10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的PolyWAX LP柱(PolyLC)上，然后用1M NaCl在10mM Tris-HCl(pH7.5)中的0-0.3M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-DG Fc蛋白質綴合物。
實施例12重組非糖基化免疫球蛋白Fc衍生物的制備和純化
<IgG4 Fc衍生物1表達載體的制備>
為了制備人免疫球蛋白IgG4重鏈恒定區，先制備了在天然鉸鏈區氨基末端具有9個氨基酸缺失的第一種衍生物(IgG4 delta-Cys)和由于鉸鏈區所有12個氨基酸都被缺失而缺少鉸鏈區的第二種衍生物(IgG4單體)。利用了本發明的發明者在本發明前研發的含大腸桿菌分泌序列的表達載體pTl4S1SH-4T20V22Q(Korean Pat.No.38061)。
為了得到人免疫球蛋白IgG4重鏈恒定區，用分離自人血液細胞的RNA作為模板進行RT-PCR，步驟如下。首先，用Qiamp RNA血液試劑盒(Qiagen)從大約6ml血液中分離總RNA，以此總RNA為模板用One-Step RT-PCR試劑盒(Qiagen)進行基因擴增。在此PCR中，使用了SEQ ID Nos.1和2代表的一對合成引物以及SEQ ID Nos.2和3代表的另一對合成引物。SEQ ID NO.1是起始自IgG4鉸鏈區如下12個氨基酸殘基中的第10個殘基絲氨酸的核苷酸序列。SEQ ID NO.3被設計成編碼以丙氨酸作為第一個氨基酸殘基的CH2結構域的核苷酸序列。SEQ ID NO.2被設計成具有含終止密碼的BamHI識別位點。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc ccactc agg ttt ata cca ggg ggt acg ggt agt acg ggtGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro為了將各個已擴增的IgG4恒定區片段克隆入含大腸桿菌分泌序列衍生物的表達載體中，利用了本發明的發明者在本發明之前研發的pT14S1SH-4T20V22Q(Korean Pat.No.38061)。此表達載體包含具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的熱穩定性腸毒素分泌序列衍生物。為了便于克隆，用SEQ ID Nos.5和6表示的一對引物，通過定性位誘變將StuI識別位點插入pT14S1SH-4T20V22Q質粒的大腸桿菌熱穩定性腸毒素分泌序列衍生物的一端，以引發誘變，從而在編碼分泌序列最后一個氨基酸殘基的核苷酸序列處引入StuI位點。通過DNA測序發現成功插入了StuI位點。所產生的含StuI位點的pT14S1SH-4T20V22Q質粒被稱為pmSTII。用StuI和BamHI處理pmSTII質粒并進行瓊脂糖凝膠電泳，純化含大腸桿菌熱穩定性腸毒素分泌序列衍生物的大片段(4.7kb)。然后，用BamHI消化已擴增的基因片段，并與線性化的表達載體連接，由此產生了pSTIIdCG4Fc和pSTIIG4Mo。
將最終的表達載體單獨轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中，所產生的轉化體被稱為“BL21/pSTIIdCG4Fc(HM10932)”和“BL21/pSTIIdCG4Mo(HM10933)”，它們在2004年9月15日保藏于韓國微生物培養中心(KCCM)，指定的保藏號分別是KCCM-10597和KCCM-10598。其后，當培養物達到OD600值為80時，將誘導劑IPTG加到培養物中以誘導蛋白質表達。將培養物進一步培養40到45小時，直至600nm的OD值增加到100至120。破碎自發酵液收集的大腸桿菌細胞，對產生的細胞裂解物進行兩步柱層析，以純化存在于大腸桿菌胞質中的重組免疫球蛋白恒定區衍生物。
用PBS平衡5ml蛋白-A親和柱(Pharmacia)，將細胞裂解物以5ml/分鐘的流速加到柱子上。未被結合的蛋白質用PBS洗出，而已結合的蛋白質則用100mM檸檬酸鹽(pH3.0)洗脫。對收集到的級分通過HiPrep 26/10脫鹽柱(Pharmacia)用10mM Tris緩沖液(pH8.0)脫鹽。然后，用50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)進行二次陰離子交換柱層析。將初步純化的重組非糖基化免疫球蛋白Fc級分加到Q-Sepharose HP 26/10柱上，用10mM Tris緩沖液(pH8.0)中的0-0.2M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而得到高純度的重組非糖基化免疫球蛋白Fc(AG Fc)衍生物、IgG4 delta-Cys和高純度的IgG4單體級分。
實施例13IFNα-PEG復合物和重組AG Fc衍生物的綴合物的制備依照與實施例1和11中相同的方法，將IFNα-PEG復合物與實施例12中作為AG Fc衍生物制備的IgG4 delta-Cys的N末端連接。偶聯反應后，將未反應的物質和副產物從反應混合物中去除，由此產生的IFNα-PEG-AG Fc蛋白質綴合物(I)首先用50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)純化，然后進一步用polyCAT 21.5×250柱(polyLC)通過高壓液相層析試驗進行純化，由此高度純化所述綴合物。用10mMTris緩沖液(pH8.0)通過HiPrep 26/10脫鹽柱(Pharmacia)對偶聯反應溶液進行脫鹽。然后，將反應溶液以流速8ml/分鐘加到50ml QHP 26/10柱(Pharmacia)上，并用0-0.2M的線性NaCl梯度洗脫此柱子，以獲得預期的級分。將收集到的級分以流速15ml/分鐘再加到用10mM乙酸鹽緩沖液(pH5.2)平衡的polyCAT 21.5×250柱上，用0.1-0.3M的線性NaCl梯度洗脫此柱子，由此提供高度純化的級分。依照與上述相同的方法，用實施例12中制備的另一種AG Fc衍生物IgG4單體制備另一種IFNα-PEG-AG Fc蛋白質綴合物(II)。
實施例14EPO-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物的制備依照與實施例13中相同的方法，通過將AG Fc衍生物IgG4delta-Cys與EPO-PEG復合物連接而制備EPO-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物。
比較實施例1IFNα-40K PEG復合物的制備將5mg干擾素α溶于100mM磷酸鹽緩沖液中，達到終體積5ml，并與40-kDa活化的甲氧基-PEG-醛(Shearwater)混合，IFNα∶40-kDa PEG的摩爾比例是1∶4。向此混合物中，加入終濃度20mM的還原劑NaCNBH3，并在溫和攪拌下使其在4℃反應18小時。為了滅活不與IFNα反應的PEG，將乙醇胺以50mM的終濃度加到反應混合物中。
用Sephadex G-25柱(Pharmacia)除去未反應的PEG，并用另一種緩沖液置換厚緩沖液。首先，用兩倍柱體積(CV)的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡此柱子，然后加反應混合物上樣。通過用UV分光光度計測定260nm處的吸收值來檢測流過液。當柱子用同一種緩沖液洗脫時，因在N末端加入PEG而被修飾具有較高分子量的干擾素α較早被洗脫下來，而未反應的PEG則較晚被洗脫下來，從而可以只分離IFNα-40K PEG。
進行以下層析以進一步從收集的級分中純化IFNα-40K PEG復合物。用10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡3ml PolyWAX LP柱(PolyLC)。將收集到的含有IFNα-40K PEG復合物的級分以流速1ml/分鐘加樣到柱子上，用15ml平衡緩沖液洗脫柱子。然后，用30ml 1M NaCl以0-100％的線性NaCl梯度洗脫柱子，由此順序洗脫與三-、二-和單-PEG綴合的干擾素α。為了進一步純化單-PEG-綴合的干擾素α，對收集到的含有單-PEG-綴合干擾素α的級分進行大小排阻層析。將級分濃縮并加樣到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，用相同緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫柱子。三和二-PEG-綴合的干擾素α分子由于其早于單-PEG-綴合的干擾素α被洗脫下來的特性而被去除，從而以高純度形式分離出單-PEG-綴合的干擾素α。
依照上述同一種方法，將40-kDa PEG與人生長激素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和G-CSF衍生物的N末端綴合，從而得到hGH-40K PEG、G-CSF-40K PEG和40K PEG-17S-G-CSF衍生物復合物。
比較實施例2IFNα-PEG-白蛋白綴合物的制備為了將實施例1步驟2中純化的IFNα-PEG復合物與白蛋白的N末端連接，將IFNα-PEG復合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的人血清白蛋白(HSA，約67kDa，Green Cross)以IFNα-PEG復合物∶白蛋白摩爾比例1∶1、1∶2、1∶4和1∶8混合。將反應溶液中的磷酸鹽緩沖液濃度調節到100mM后，將還原劑NaCNBH3以終濃度20mM加到反應液中，并在溫和攪拌下使其在4℃反應20小時。通過此實驗，發現具有最高反應性且產生最少量諸如二聚體等副產物的最佳反應摩爾比例IFNα-PEG復合物∶白蛋白是1∶2。
在偶聯反應后，將反應混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析，以去除未反應的物質和副產物，并純化所產生的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質綴合物。在將反應混合物濃縮并加樣到柱子上后，使10mM乙酸鈉緩沖液以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結合的白蛋白和未反應的物質，隨后進行柱洗脫，以僅僅純化IFNα-PEG-白蛋白蛋白質綴合物。由于所收集到的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質綴合物級分包含小量的雜質、未反應的白蛋白和干擾素α二聚體，故進行陽離子交換層析以去除雜質。將IFNα-PEG-白蛋白蛋白質綴合物級分加樣到用10mM乙酸鈉(pH4.5)平衡的SP5PW柱(Waters)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的0-0.5M NaCl線性梯度洗脫，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質綴合物。
依照上述同一種方法，將白蛋白與人生長激素、G-CSF和G-CSF衍生物綴合，從而提供hGH-PEG-白蛋白、G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF-PEG-白蛋白綴合物。
比較實施例3Fab’-S-40K PEG復合物的制備通過在活化緩沖液(20mM乙酸鈉(pH4.0)，0.2mM DTT)中保溫1小時激活實施例8步驟1中純化的Fab’的游離半胱氨酸殘基。用PEG修飾緩沖液置換所述緩沖液后，將50mM磷酸鉀(pH6.5)、馬來酰亞胺-PEG(MW40kDa，Shearwater)以Fab’∶40-kDa PEG摩爾比例1∶10加到其中，并在溫和攪拌下在4℃反應24小時。
反應完成后，將反應液加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，用相同緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫柱子。被Fab’綴合的40-kDa PEG(Fab’-40K PEG)由于其高分子量而相對較早地洗脫下來，而未反應的Fab’則稍后洗脫下來，從而去除了未反應的Fab’。為了完全去除未反應的Fab’，再次將收集到的Fab’-40K PEG復合物級分加樣到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH4.5)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫此柱，從而提供了含有與Fab’的-SH基團連接的40-kDa PEG的純Fab’-S-40K PEG復合物。
實驗實施例1蛋白質綴合物的鑒定和定量分析<1-1>蛋白質綴合物的鑒定用4-20％梯度凝膠和12％凝膠以及ELISA(R&D System)通過非還原性SDS-PAGE分析上述實施例中制備的蛋白質綴合物。
SDS-PAGE分析的結果如圖3中所示，其中生理學多肽、非肽聚合物、PEG和免疫球蛋白Fc片段的偶聯反應導致成功形成了IFNα-PEG-Fc綴合物(A)、17Ser-G-CSF-PEG-Fc綴合物(B)和EPO-PEG-Fc綴合物(C)。
此外，用非還原性12％SDS-PAGE分析實施例10中制備的DG Fc。如圖6b中所示，在與缺乏糖基部分的天然Fc的分子量相應的位置處檢測到了DG Fc條帶。
<1-2>蛋白質綴合物的定量分析用HiLoad 26/60 Superdex 75柱(Pharmacia)通過大小排阻層析對以上實施例中制備的蛋白質綴合物進行定量，其中以10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)作為洗脫緩沖液，并將其中各蛋白質綴合物的峰面積與對照組的峰面積相比較。將先前已定量分析的標準品、IFNα、hGH、G-CSF、17S-G-CSF、EPO和Fc單獨進行大小排阻層析，測定濃度和峰之間的轉換因子。對預定量的各蛋白質綴合物進行相同大小排阻層析。通過從由此獲得的峰面積中減去相應于免疫球蛋白Fc片段的峰面積，測定存在于各蛋白質綴合物中的生理學活性蛋白質的數量值。圖4顯示了已純化的IFNα-PEG-Fc綴合物的大小排阻層析結果，其中觀察到了單一的峰。此結果表明，已純化的蛋白質綴合物不包含諸如二聚體、三聚體和更高數量單體等多聚體雜質。
當用特異于生理學活性多肽的抗體對與Fc綴合的生理學活性多肽進行定量分析時，抗體與多肽的結合被阻止，導致了數值低于由層析計算的真實值。以IFNα-PEG-Fc綴合物為例，ELISA中得到的ELISA數值相當于真實值的大約30％。
<1-3>蛋白質綴合物的純度和質量分析對以上實施例中制備的蛋白質綴合物進行大小排阻層析，并檢測280nm處的吸收值。結果顯示，IFNα-PEG-Fc、hGH-PEG-Fc、G-CSF-PEG-Fc和17Ser-G-CSF-PEG-Fc綴合物在70至80-kDa大小的物質保持時間處顯示出單一峰。
另一方面，進行反相HPLC，以確定實施例1、11和13中制備的蛋白質綴合物IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物的純度。利用了反相柱(259 VHP54柱，Vydac)。利用配制于0.5％TFA中的40-100％乙腈梯度洗脫柱子，通過檢測280nm處的吸收值分析純度。結果如圖8所示，樣品中不含有未結合的干擾素或免疫球蛋白Fc，且發現所有蛋白質綴合物IFNα-PEG-Fc(A)、IFNα-PEG-DG Fc(B)和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物(C)的純度都高于96％。
為了確定已純化蛋白質綴合物的準確分子量，用高通量MALDI-TOF質譜儀(Voyager DE-STR，Applied Biosystems)分析各個綴合物的質量。用芥子酸作為基質。將0.5μl各待測樣品包被在樣品載玻片上并空氣干燥，再與等體積的基質溶液混合并空氣干燥，放入離子源中。用線性模式TOF分析儀以陽性方式進行檢測。離子用通過延遲提取(delayed extraction，DE)操作的分裂提取源加速，在總加速電壓約2.5kV處采用750鈉秒至1500納秒的延遲提取時間。
由MALDI-TOF質譜儀觀察到的各實施例中制備的Fc蛋白質綴合物的分子量如下表1中所示。圖5顯示了EPO-PEG-Fc綴合物的MALDI-TOF質譜分析結果，而圖7顯示了IFNα-PEG-Fc和IFNα-PEG-DG Fc綴合物的MALDI-TOF質譜分析結果。結果發現，EPO-PEG-Fc蛋白質綴合物純度高于95％，且分子量非常接近理論分子量。此外，發現EPO與免疫球蛋白Fc片段以1∶1的比例偶聯。
表1
此外，當用MALDI-TOF質譜儀測定實施例1O中制備的Fc和DG Fc的分子量時，發現DG Fc是50kDa，這比天然Fc小大約3-kDa(圖6a)。由于這3-kDa分子量相應于糖基部分的理論大小，該結果證實了糖基部分完全被去除了。
下表2顯示了實施例11中制備的IFNα-PEG-DG Fc綴合物和實施例13中所制備的IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物(I和II)的MALDI-TOF質譜分析結果。發現IFNα-PEG-DG Fc綴合物比IFNα-PEG-Fc綴合物的75.9kDa小3kDa，而IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物(I)比IFNα-PEG-Fc綴合物的75.9kDa小大約3-4kDa。與Fc單體偶聯的IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物(II)顯示出分子量降低了24.5kDa，這相應于Fc單體的分子量。
表2
實驗實施例2藥物代謝動力學分析I評估天然形式的生理學活性蛋白質(對照)以及實施例和比較實施例中制備的蛋白質綴合物-40K PEG復合物、-PEG-白蛋白綴合物、-PEG-Fc綴合物、-PEG-DG Fc綴合物和-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物在SD大鼠(每組5只大鼠)中的血清穩定性和藥物代謝動力學參數。以100μg/kg的劑量單獨皮下注射對照以及-40K PEG復合物、-PEG-白蛋白綴合物、-PEG-Fc綴合物、-PEG-DG Fc綴合物和-PEG-重組AG Fc衍生物綴合物(試驗組)。皮下注射后，在0.5、1、2、4、6、12、24、30、48、72和96小時收集對照組的血樣，在1、6、12、24、30、48、72、96、120、240和288小時收集試驗組的血樣。血樣收集在裝有抗凝劑肝素的試管中，用Eppendorf高速小型離心機離心5分鐘以去除血細胞。用特異于所述生理學活性蛋白質的抗體通過ELISA檢測血清蛋白質水平。
天然形式的IFNα、hGH、G-CSF和EPO以及它們的-40K PEG復合物、它們的-PEG-白蛋白綴合物、它們的-PEG-Fc綴合物以及它們的-PEG-DG Fc綴合物的藥物代謝動力學分析結果如下表3至7中所示。在以下的表中，Tmax表示達到最大藥物血清濃度所需的時間，T1/2指藥物的血清半壽期，而MRT(平均停留時間)指藥物分子在身體中停留的平均時間。
表3干擾素α的藥物代謝動力學
表4人生長因子的藥物代謝動力學
表5G-CSF的藥物代謝動力學
表617S-G-CSF衍生物的藥物代謝動力學
表7EPO的藥物代謝動力學
如表3的數據和圖9的藥物代謝動力學曲線所示，IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物的血清半壽期是90.4小時，這比天然IFNα高大約50倍，而比比較實施例1中制備的IFNα-40K PEG的35.8小時半壽期高大約2.5倍。此外，發現本發明的IFNα-PEG-Fc蛋白質綴合物在血清半壽期上優于IFNα-PEG-白蛋白，后者的半壽期為17.1小時。
另一方面，如表3和圖11中所示，IFNα-PEG-DG Fc綴合物的血清半壽期為71.0小時，這幾乎與IFNα-PEG-Fc綴合物相同，表明Fc的去糖基化確實極大影響了IFNα-PEG-DG Fc綴合物的體內穩定性。此外，發現用通過重組方法產生的重組AG Fc衍生物制備的綴合物具有與天然形式衍生的DG Fc相同的效應。不過，與Fc單體偶聯的復合物的血清半壽期大約是與正常Fc二聚體偶聯的復合物的血清半壽期的一半。
如表4中所示，人生長激素在依照本發明與IgG Fc片段綴合時也顯示出了血清半壽期延長。也就是說，與天然形式(1.1小時)相比，hGH-40K PEG復合物和hGH-PEG-白蛋白綴合物的半壽期稍微延長，分別為7.7小時和5.9小時，而本發明的hGH-PEG-Fc蛋白質綴合物則顯示出半壽期明顯延長至11.8小時。
正如從表5和6中有關G-CSF和其衍生物的藥物代謝動力學數據中顯而易見的，G-CSF-PEG-Fc和17S-G-CSF-PEG-Fc綴合物呈現出比-40K PEG復合物和-PEG-白蛋白綴合物長得多的血清半壽期。發現免疫球蛋白Fc片段在血清中延長了天然形式的生理學活性蛋白質的作用持續時間，而它們的具有某些氨基酸殘基改變的衍生物也呈現出與天然形式相似水平的這種特性。從這些結果中可很容易的預計本發明的方法會對其它蛋白質及其它們的衍生物具有類似的影響。
如表7和圖10中所示，天然糖基化EPO與Fc片段的綴合也導致了血清半壽期的延長。也就是說，EPO在天然形式時，血清半壽期為9.4小時，當為了提高血清穩定性而將其高度糖基化時，其血清半壽期延長至18.4小時。EPO-PEG-Fc綴合物(包含依照本發明與免疫球蛋白Fc片段偶聯的EPO)顯示出血清半壽期顯著延長至61.5小時。此外，當與大腸桿菌來源的重組非糖基化(AG)Fc衍生物綴合時，EPO的血清半壽期則延長至87.9小時，表明Fc片段的非糖基化使得蛋白質綴合物的制備不影響無抗體功能的蛋白質的血清穩定性。
正如從以上結果中顯而易見的，依照本發明通過非肽聚合物與免疫球蛋白Fc片段共價鍵合的蛋白質綴合物呈現出血清半壽期比其天然形式的血清半壽期延長了數倍至數十倍。此外，當免疫球蛋白Fc由于在大腸桿菌中產生而為非糖基化形式或由于通過酶處理而去糖基化時，它的延長其蛋白質綴合物的血清半壽期的效果保持在相似水平。
特別是，與為了延長蛋白質在血清中的持續作用時間而用PEG分子中具有最長持續作用時間的40-kDa PEG修飾的蛋白質相比，免疫球蛋白Fc蛋白質綴合物具有更為優越的血清穩定性。此外，與偶聯了白蛋白而非免疫球蛋白Fc的蛋白質綴合物相比，本發明的蛋白質綴合物呈現出極高的血清穩定性，表明本發明的蛋白質綴合物在研發長效形式的蛋白質藥物中是有效的。這些結果，即與常規PEG-或白蛋白-綴合蛋白質相比，本發明的蛋白質綴合物對包括點突變的集落刺激因子衍生物在內的多種蛋白質的血清穩定性以及MRT具有極好的影響，表明本發明綴合物的穩定性提高和持續時間延長的效果可適用于其它的生理學活性多肽。
另一方面，當用如上所述的相同方法評估利用非肽聚合物10-kDa PEG制備的IFNα-10K PEG-Fc蛋白質綴合物(實施例7)的血清半壽期時，顯示出其血清半壽期為48.8小時，這稍微短于用3.4-kDa PEG制備的蛋白質綴合物的血清半壽期(79.7小時)。
此外，蛋白質綴合物的血清半壽期隨著非肽聚合物PEG的分子量的增加而降低。這些結果表明，提高蛋白質綴合物的血清穩定性并延長其持續時間的主要因素是被綴合的免疫球蛋白Fc片段，而不是非肽聚合物。
即使當PEG的反應性基團被除醛基外的反應性基團置換時，含PEG的蛋白質綴合物仍然顯示了與偶聯了具有醛反應性基團的PEG的那些綴合物相似模式的表觀分子量和血清半壽期。
實驗實施例3藥物代謝動力學分析II為了測定實施例8和9中制備的Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及比較實施例3中制備的Fab′-S-40KPEG復合物的血清半壽期，依照實驗實施例2中相同的方法以Fab′作為對照進行了綴合物和復合物的藥物代謝動力學分析。結果如圖12中所示。
如圖12中所示，Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物呈現出血清半壽期與Fab′或Fab′-S-40K PEG復合物相比延長了兩或三倍。
實驗實施例4蛋白質綴合物細胞內活性的評估<4-1>IFNα蛋白質綴合物細胞內活性的比較為了比較IFNα蛋白質綴合物的細胞內活性，用感染了皰疹性口腔炎病毒的Madin Darby牛腎(MDBK)細胞(ATCC CCL-22)通過細胞培養物生物測定法評估IFNα-PEG-Fc(實施例1)、IFNα-PEG-DG Fc(實施例11)、IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物(實施例13)、IFNα-40K PEG(比較實施例1)和IFNα-PEG-白蛋白(比較實施例2)的抗病毒活性。以可獲自生物學標準品和對照國家研究院(NIBSC)的未PEG化干擾素α-2b作為標準物質。
在補充了10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的MEM(最低基本培養基，JBI)中于37℃，5％CO2的條件下培養MDBK細胞。用培養基將待分析樣品和標準物質稀釋至預定濃度，將100-μl等分試樣加入96孔板的各孔中。分離所培養的細胞，將其加入以100μl的體積含有樣品的平板中，在37℃和5％CO2的條件下培養約1小時。然后，將5-7×103PFU的皰疹性口腔炎病毒(VSV)50μl加入平板的各孔中，細胞在37℃、5％CO2的條件下進一步培養大約16-20小時。將不合樣品或標準物質而只包含病毒的孔用作陰性對照，而只含有細胞的孔則用作陽性對照。
去除培養基后，將100μl中性紅溶液加入平板中對存活的細胞染色，隨后在37℃、5％CO2的條件下保溫2小時。去除上清液后，將100μl 100％乙醇和1％乙酸的1∶1混合物加入平板的每個孔中。充分混合以溶解自被染色細胞洗脫的所有中性紅結晶后，檢測540nm的吸收值。將陰性對照用作空白，計算ED50值(造成50％細胞生長抑制的劑量)，其中陽性對照的細胞生長被設定為100％。
表8
如表8中所示，IFNα-40K PEG活性降低至天然IFNα的4.8％。尤其是，當PEG部分的大小增加時，蛋白質綴合物具有提高的血清穩定性，但活性逐漸降低。據報道，干擾素α在用12-kDa PEG修飾時具有25％的體外活性，而當用40-kDa PEG修飾時則具有大約7％的活性(P.Bailon等，Bioconjugate Chem.12195-202，2001)。也就是說，由于隨著PEG部分分子量的增加，蛋白質綴合物的半壽期變長，但生物學活性急速降低，所以需要研發具有較長半壽期和較強活性的蛋白質綴合物。此外，IFNα-PEG-白蛋白綴合物展示了弱的活性，與天然IFNα相比大約為5.2％。相反，本發明的IFNα-PEG-Fc和IFNα-PEG-DG Fc綴合物呈現了顯著提高的相對活性，與天然IFNα相比大約為28.1％和25.7％。此外，IFNα與重組AG Fc衍生物的綴合導致了活性的相似提高。從這些結果預計，與免疫球蛋白Fc片段綴合的干擾素α具有顯著延長的血清半壽期和極大提高的體內藥效。
<4-2>人生長激素蛋白質綴合物細胞內活性的比較為了比較人生長激素蛋白質綴合物的細胞內活性，比較了hGH-PEG-Fc、hGH-40K PEG和hGH-PEG-白蛋白的細胞內活性。
用大鼠結節淋巴瘤細胞系Nb2(歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)#97041101)通過體外試驗檢測hGH綴合物的細胞內活性，所說細胞系顯示了人生長激素依賴型有絲分裂。
將Nb2細胞培養于補充了10％FBS(胎牛血清)、0.075％NaCO3、0.05mM 2-巰基乙醇和2mM谷氨酰胺的Fisher′s培養基中，并進一步在不合10％FBS的相似培養基中培養24小時。然后，對所培養的細胞進行計數，將大約2×104個細胞的等分試樣加至96孔板的各孔中。將hGH-PEG-Fc、hGH-40K PEG、hGH-PEG-白蛋白、可獲自生物學標準品和對照國家研究院(NIBSC)作為對照的標準品和天然人生長激素(HM-hGH)稀釋，并以多種濃度加入各孔中，隨后在37℃5％CO2的條件下保溫48小時。之后，為了通過測定各孔中的細胞數目來檢測細胞增殖活性，將25μl Cell Titer 96 Aqueous One SolutionReagent(Promega)加入各孔中，將細胞進一步培養4小時。檢測490nm處的吸收值，計算各樣品的效價。結果如下表9中所示。
表9
如表9中所示，同樣以人生長激素為例，與40-kDa PEG的綴合(hGH-40K PEG)導致了活性降低至大約為天然形式的7.6％，而hGH-PEG-白蛋白綴合物顯示出大約為天然hGH的5.2％的低體外活性。不過，本發明的hGH-PEG-Fc綴合物顯著提高了相對活性，達到天然hGH的28％以上。從這些結果預計，與免疫球蛋白Fc片段連接的人生長激素具有顯著延長的血清半壽期和極大提高的體內藥效。此外，我們認為本發明免疫球蛋白Fc蛋白質綴合物活性的提高是由于血清穩定性的提高，而與受體的結合親和力的保留則歸因于免疫球蛋白Fc或非肽聚合物形成的空間。這些效果預計可適用于與其它生理學活性蛋白質偶聯的免疫球蛋白Fc蛋白質綴合物。
<4-3>G-CSF蛋白質綴合物的細胞內活性比較為了比較具有G-CSF衍生物的蛋白質綴合物的細胞內活性，比較了天然G-CSF(Filgrastim，Jeil Pharm.Co.，Ltd.)、17Ser-G-CSF衍生物、20K PEG-G-CSF(Neulasta)、40K PEG-17S-G-CSF、17Ser-G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF-PEG-Fc的細胞內活性。
首先，將人骨髓細胞系HL-60(ATCC CCL-240，前髓細胞性白血病患者/36歲白種女性)培養于補充了10％FBS的RPMI 1640培養基中。將培養的細胞以大約2.2×105個細胞/ml的密度懸浮，并在其中加入DMSO(二甲亞砜，培養級，Sigma)至終濃度1.25％(v/v)。然后，將90μl細胞懸浮液接種于96孔板(Corning/低蒸發96孔板)的各孔中，從而密度大約為每孔2×104個細胞，在37℃含5％CO2的培養箱中培養大約72小時。
將蛋白質濃度用G-CSF ELISA試劑盒(R&D systems)測定過的各樣品用RPMI 1640稀釋至同一濃度10μg/ml，再進一步用RPMI 1640稀釋19次，每次稀釋2倍。將連續的兩倍稀釋液10μl獨立加到含HL-60細胞的各孔中，從而各樣品濃度起始為1μg/ml。然后，將細胞在37℃培養箱培養72小時。
用Cell Titer 96TM(Cat.NO.G4100，Promega)檢測HL-60細胞的增殖，通過測量670nm的吸收值確定增加的細胞數。
表10
如表10中所示，與具有氨基酸取代的G-CSF衍生物17Ser-G-CSF的免疫球蛋白Fc蛋白質綴合物同樣呈現出了與天然G-CSF-偶聯蛋白質綴合物相似的效果。先前報道了17Ser-G-CSF-PEG與未PEG化的17Ser-G-CSF(韓國專利公開文件2004-83268)相比具有相對較長的血清半壽期，但活性有所降低。尤其是，當PEG部分的大小增大時，蛋白質綴合物的血清穩定性增加，但活性逐漸降低。17Ser-G-CSF-40KPEG顯示出非常低的活性，與天然形式相比低于大約10％。也就是說，由于蛋白質綴合物隨著PEG部分的分子量增加而具有較長的血清半壽期但活性急速降低，所以需要研發一種具有長血清半壽期和強活性的蛋白質綴合物。17Ser-G-CSF-PEG-白蛋白也顯示出與天然G-CSF相比大約為其23％的低活性。相反，17Ser-G-CSF-PEG-Fc則大大提高了相對活性，其相對活性大于天然G-CSF的51％。從這些結果中，預計與免疫球蛋白Fc片段連接的17Ser-G-CSF具有顯著增加的血清半壽期，且極大提高了其體內藥效。
<4-4>Fab′綴合物的細胞毒性中和測定用實施例8和實施例9中制備的Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及比較實施例3中制備的Fab′-S-40KPEG復合物進行體外活性測定。通過基于測量TNFα-介導的細胞毒性的細胞毒性測定，評估Fab′綴合物以確定其是否在小鼠成纖維細胞系L929(ATCC CRL-2148)中中和了TNFα-誘導的凋亡。
按兩倍系列稀釋Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及Fab′-S-40K PEG復合物，將100-μl等分溶液加到96孔板的孔中。將rhTNF-α(R&D systems)和放線菌素D(Sigma)作為RNA合成抑制劑分別以終濃度10ng/ml和1μg/ml加入各孔中，在37℃含5％CO2的培養箱中保溫30分鐘，再轉移到微量滴定板上供檢測。將L929細胞以5×104個細胞/50μl培養基的密度加入各孔中并在37℃含5％CO2的培養箱中培養24小時。去除培養基后，將以5mg/ml濃度溶于PBS中的50μl MTT(Sigma)加入各孔中，細胞進-步在37℃含5％CO2的培養箱中培養大約4小時。將150μl DMSO加入各孔中，通過測定540nm的吸收值確定細胞毒性中和的程度。作為對照，使用了實施例8步驟1中純化的Fab′。
如圖13中所示，所有用于此試驗的蛋白質綴合物都具有與Fab′相似的效價。這些結果表明，當將免疫球蛋白Fc通過PEG連接至Fab′的N末端或C末端附近的游離半胱氨酸來制備蛋白質綴合物時，Fab′呈現出顯著增高的血清半壽期和高體內活性。
<4-5>補體依賴型細胞毒性(CDC)測定為了確定在大腸桿菌轉化體表達并純化的實施例中制備的衍生物和相應于免疫球蛋白恒定區的蛋白質是否結合人C1q，進行了如下的酶聯免疫吸附測定(ELISA)。在試驗組中，使用了HM10932和HM10927轉化體產生的免疫球蛋白恒定區以及以上實施例中制備的衍生物，所說的兩個轉化體于2004年9月15日保藏于韓國微生物保存中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10597、KCCM-10588。作為標準參照，使用了糖基化的免疫球蛋白(IVIG-球蛋白S，Green Cross PBM)和數種作為治療抗體的商品化抗體。試驗和標準樣品以濃度1μg/ml配制于10mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中。樣品以每孔200ng的量等分至96孔板(Nunc)中，并將平板在4℃包被過夜。然后，將各孔用PBS-T(137mM NaCl，2mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.05％Tween 20)漂洗三次，用250μl封閉緩沖液(溶于PBS-T中的1％牛血清白蛋白)室溫封閉1小時，再用同樣的PBS-T漂洗三次。將標準和試驗樣品在PBS-T中稀釋至預定濃度，并添加到抗體包被的孔中，將平板在室溫保溫1小時，并用PBS-T洗三次。之后，將2μg/ml C1q(R&D Systems)加入平板中，并于室溫反應2小時，然后將平板用PBS-T洗6次。將200μl 1∶1000稀釋于封閉緩沖液中的人抗人C1q抗體-過氧化物酶綴合物(Biogenesis，USA)加入各孔中，并于室溫反應1小時。用PBS-T將各孔漂洗三次后，混合等體積的顯色試劑A和B(顯色劑A穩定的過氧化物和顯色劑B穩定的色素原；DY 999，R&D Systems)，將200μl混合物加到各孔中，隨后保溫30分鐘。然后，在各孔中加入50μl反應終止液，2M硫酸。用微量滴定板讀數儀(Molecular Device)對平板讀數。在波長450nm處測量標準和試驗樣品的吸收值，結果分別參見圖14和15。
在相互比較免疫球蛋白亞型之間其免疫球蛋白Fc片段中的補體活性時，發現人免疫球蛋白IgG1(Fitzgerald)具有最高的C1q結合親和力，其次是IgG2(Fitzgerald)，然后是IgG4(Fitzgerald)，表明在亞型之間補體活性存在差異。此試驗中所用的IVIG是IgG亞型的合并物，由于IgG1占了IVIG的大部分，所以IVIG呈現出與純化的IgG1近乎相同的C1q結合親和力。與這些標準相比，在由于去糖基化而造成的C1q結合親和力的改變方面，具有最強的補體活性的IgG1 Fc在非糖基化時此活性顯著降低。IgG4 Fc，已知不會誘發補體的活化，它對C1q幾乎沒有結合親和力，表明IgG4 Fc可被用作無補體活性的極好重組載體(圖14)。
為了確定載體是否在即使與生理學活性肽綴合后仍保持了對C1q沒有結合親和力的特性，用糖基化的Fc、酶促去糖基化的Fc和非糖基化重組Fc作為IFNα的載體制備IFNα-Fc綴合物，并評估其對C1q的結合親和力。發現偶聯了糖基化Fc的IFNα綴合物(IFNα-PEG-Fc糖基化IgG1Fc)保持了對C1q的高結合親和力。相反，當將干擾素α與用PNGase F和其他酶去糖基化的Fc偶聯時，所產生的綴合物(IFNα-PEG-DGFc去糖基化IgG1Fc)展示了明顯降低的C1q結合親和力，這與大腸桿菌來源的非糖基化Fc綴合物類似。此外，當以IgG4部分替換偶聯了非糖基化IgG1 Fc的干擾素α綴合物(IFNα-PEG-AGFcG1非糖基化IgG1Fc)的IgG1部分時，發現所產生的干擾素綴合物(IFNα-PEG-FcG4衍生物1非糖基化IgG4Fc)完全喪失了其與C1q的結合親和力。當IgG1 Fc部分被IgG4 Fc單體替換時，所產生的綴合物(IFNα-PEG-FcG4衍生物2非糖基化IgG4Fc)。這些結果顯示這樣的IgG4 Fc片段形式可用作不具有抗體片段效應器功能的極好載體(圖15)。
工業適用性如上文所描述的，本發明的藥物綴合物極大的延長了多肽藥物的血漿半壽期，其水平高于任何常規修飾的蛋白質。另一方面，所述蛋白質綴合物克服了常規長效制劑最顯著的缺陷，即藥物效價降低，從而使血液循環時間和體內活性超過了原先已知最有效的白蛋白。此外，所述蛋白質綴合物沒有誘發免疫應答的風險。由于這些優勢，該蛋白質綴合物可用于開發蛋白質藥物的長效制劑。依照本發明的蛋白質藥物長效制劑能減少患者頻繁注射的痛苦，在較長時間內保持活性多肽的血清濃度，從而使藥效穩定。
此外，本發明制備蛋白質綴合物的方法克服了遺傳操作生產融合蛋白質的缺點，包括表達體系難以建立、糖基化作用不同于天然形式、誘發免疫應答和蛋白質融合的方位有限、由于非特異性反應造成的低產率以及用作粘合劑的化合物的毒性等化學偶聯的問題，從而可以方便且經濟的提供血清半壽期延長并具有高活性的蛋白質藥物。
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序列表<110>Hanmi Pharm.Go.，Ltd.
<120>利用免疫球蛋白片段的蛋白質復合物及其制備方法<150>KR10-2003-0080299<151>2003-11-13<160>6<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cgtcatgccc agcacctgag ttcctggggg gacca 35<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gggggatcct catttaccca gagacaggga gaggctcttc tg 42<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cggcacctga gttcctgggg ggaccatca29<210>4<211>69<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>4atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60gcccaggcg 69<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5tctattgcta caaatgccca ggccttccca accattccct tatcc 45
<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6agataacgat gtttacgggt ccggaagggt tggtaaggga atagg 4權利要求
1.含有共價連接的生理學活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段的蛋白質綴合物。
2.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物通過其自身兩端的反應性基團與生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段共價連接。
3.依照權利要求2的蛋白質綴合物，其中生理學活性多肽和非肽聚合物的一個或多個復合物與單個分子的免疫球蛋白Fc片段共價連接。
4.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。
5.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、CH2、CH3和CH4結構域中的一個至四個結構域組成。
6.依照權利要求5的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段中另外還包括鉸鏈區。
7.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段選自來自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
8.依照權利要求7的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段選自來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
9.依照權利要求8的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段。
10.依照權利要求9的蛋白質綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人的非糖基化IgG4 Fc片段。
11.依照權利要求2的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物的反應性基團選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物。
12.依照權利要求11的蛋白質綴合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物是琥珀酰亞胺基丙酸酯、琥珀酰亞胺基羧甲基、羥基琥珀酰亞胺基或琥珀酰亞胺基碳酸酯。
13.依照權利要求12的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物在其兩末端具有活性醛基作為反應性基團。
14.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物在各末端都與免疫球蛋白Fc片段和生理學活性多肽的氨基末端、賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱氨酸殘基處的游離反應性基團連接。
15.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物選自聚乙二醇單聚合物、聚丙二醇單聚合物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解性聚合物、脂類聚合物、幾丁質、透明質酸及其組合。
16.依照權利要求15的蛋白質綴合物，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。
17.依照權利要求1的蛋白質綴合物，其中所述生理學活性多肽選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉錄調控因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白質、配體蛋白質和受體。
18.依照權利要求17的蛋白質綴合物，其中所述生理學活性多肽選自人生長因子、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素樣肽、G蛋白偶聯受體、白介素、白介素受體、酶、白介素結合蛋白、細胞因子結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態反應抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調節蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質、降鈣素、胰島素、心房肽激素(atriopeptin)、軟骨誘發因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、促胰液素、生長調節素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子(autotaxin)、乳鐵蛋白、筒箭毒堿(myostatin)、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒來源的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。
19.依照權利要求18的蛋白質綴合物，其中所述生理學活性多肽是人生長激素、α干擾素、粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素或Fab′抗體片段。
20.制備權利要求1的蛋白質綴合物的方法，包括(a)共價連接一個或多個在其兩末端具有反應性基團的非肽聚合物、一個或多個生理學活性多肽和一個或多個免疫球蛋白Fc片段；并(b)分離所述蛋白質綴合物，該綴合物中實質上含有共價連接的生理學活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段。
21.依照權利要求20的方法，其中的步驟(a)包括(a1)將免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽與活化的非肽聚合物的一端共價連接；(a2)從所得反應混合物中分離含有與所述非肽聚合物共價連接的免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽的復合物；并(a3)將免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽與所述分離復合物中非肽聚合物的另一端共價連接，以得到含有與非肽聚合物各端連接的免疫球蛋白Fc片段和生理學活性多肽的蛋白質綴合物。
22.依照權利要求21的方法，其中，在步驟(a1)中，生理學活性多肽和非肽聚合物以反應摩爾比例1∶1.25至1∶5使用。
23.依照權利要求21的方法，其中，在步驟(a1)中，免疫球蛋白Fc片段和非肽聚合物以反應摩爾比例1∶5至1∶10使用。
24.依照權利要求21的方法，其中，在步驟(a3)中，獲自步驟(a2)的復合物與免疫球蛋白Fc片段或生理學活性多肽以反應摩爾比例1∶0.5至1∶20使用。
25.依照權利要求21的方法，其中步驟(a1)和(a3)是在還原劑的存在下進行的。
26.依照權利要求25的方法，其中所述還原劑選自氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。
27.增強生理學活性多肽的體內持續時間和穩定性的藥物組合物，其中包含權利要求1的蛋白質綴合物及其藥用可接受載體。
28.依照權利要求27的藥物組合物，其中非肽聚合物通過其自身兩端的反應性基團與生理學活性多肽和免疫球蛋白Fc片段共價連接。
29.依照權利要求28的藥物組合物，其中生理學活性多肽和非肽聚合物的一個或多個復合物與單分子免疫球蛋白Fc片段共價連接。
30.依照權利要求27的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。
31.依照權利要求27的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、CH2、CH3和CH4結構域中的一個至四個結構域組成。
32.依照權利要求31的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段中還包括鉸鏈區。
33.依照權利要求27的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段選自來自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
34.依照權利要求33的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段選自來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體。
35.依照權利要求34的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段。
36.依照權利要求35的藥物組合物，其中免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化IgG4 Fc片段。
37.依照權利要求28的藥物組合物，其中非肽聚合物的反應性基團選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物。
38.依照權利要求37的藥物組合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物是琥珀酰亞胺基丙酸酯、琥珀酰亞胺基羧甲基、羥基琥珀酰亞胺基或琥珀酰亞胺基碳酸酯。
39.依照權利要求38的藥物組合物，其中非肽聚合物在其兩末端具有活性醛基作為反應性基團。
40.依照權利要求27的藥物組合物，其中非肽聚合物在各末端都與免疫球蛋白Fc片段和生理學活性多肽的氨基末端、賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱氨酸殘基處的游離反應性基團連接。
41.依照權利要求27的藥物組合物，其中非肽聚合物選自聚乙二醇單聚合物、聚丙二醇單聚合物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解性聚合物、脂類聚合物、幾丁質、透明質酸及其組合。
42.依照權利要求41的藥物組合物，其中非肽聚合物是聚乙二醇。
43.依照權利要求27的藥物組合物，其中生理學活性多肽選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉錄調控因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白質、配體蛋白質和受體。
44.依照權利要求43的藥物組合物，其中生理學活性多肽選自人生長因子、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素樣肽(例如GLP-1等)、G蛋白偶聯受體、白介素、白介素受體、酶、白介素結合蛋白、細胞因子結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態反應抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調節蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質、降鈣素、胰島素、心房肽激素(atriopeptin)、軟骨誘發因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、促胰液素、生長調節素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子(autotaxin)、乳鐵蛋白、筒箭毒堿(myostatin)、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒來源的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。
45.依照權利要求44的藥物組合物，其中生理學活性多肽是人生長激素、α干擾素、粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素或Fab′抗體片段。
全文摘要
本文公布了在體內持續時間和穩定性上有所改進的蛋白質綴合物以及它們的用途。所說蛋白質綴合物包含生理學活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段。由于這三種組分是共價連接的，就該生理學活性多肽而言，所述蛋白質綴合物的體內持續時間延長且穩定性增強。對于該生理學活性多肽而言，所述蛋白質綴合物能使體內活性維持在相對高的水平，并且顯著延長了血清半壽期，而引起不需要的免疫應答的風險較低。因此，所述蛋白質綴合物可用于開發各種多肽藥物的長效制劑。
文檔編號C07K16/42GK1723219SQ200480001770
公開日2006年1月18日 申請日期2004年11月13日 優先權日2003年11月13日
發明者金榮民, 金大振, 裴城敏, 林昌基, 權世昌, 李寬淳 申請人:韓美藥品工業株式會社