專利名稱：免疫測定的制作方法
技術領域：
本發明涉及的免疫測定用于高度敏感測量微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質。
背景技術：
隨著分子生物的迅速發展，對于免疫測定試驗中更高敏感度的需求漸增。在生命科學領域，日益證明多種膜結合細胞表面蛋白在細胞內或細胞間信號轉導中發揮很重要的作用。這些細胞表面蛋白在動物或組織中以多種亞型表達，它們的時程和空間表達模式受到嚴格調節。因此，在今天的生命科學領域，高度敏感檢測細胞表面蛋白對于了解各種生命現象是必需的。然而，大部分膜結合細胞表面蛋白在沒有離子表面活性劑的水溶劑中不溶/微溶或幾乎不能提取。
公共衛生領域中對高敏感免疫測定的需求也漸增。隨著消費者越來越關心遺傳工程植物、BSE、食物過敏原等的使用，他們期望食品制造商對這些蛋白質進行高度敏感檢測。特別是，蛋白質如食物變應原存在于加工食物時，趨向于和加工食物中的其它成分形成復雜的復合體，因此根據經驗，蛋白質不易用沒有離子表面活性劑的水溶劑從加工食物中提取，即使蛋白質本質上是水溶性的。例如，蛋白質趨向于和加工小麥食物中來自小麥的麩質很強結合，因此水提取溶劑缺乏離子表面活性劑時幾乎不能提取蛋白質。
因而，為通過免疫測定實現高度敏感檢測微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，測定中所用抗體的特異性和親和性應改進到足以檢測很少量的這種溶解/提取差的蛋白質的存在。然而，特異性和親和性的改進有一些限制。
因此，在這種高敏感免疫測定中，除了改進抗體的特異性和親和性，應修改測定的整個操作。特別考慮能顯著改進整個測定的敏感性，通過從樣品中有效提取微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質，為了此目的，用離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解/提取微溶于水的蛋白質等可以是一種很有力的技術。然而，離子表面活性劑被認為在隨后的免疫測定中抑制抗原-抗體反應，從而避免在高濃度離子表面活性劑存在下的抗原-抗體反應。
當相對高濃度的離子表面活性劑如SDS用于有效提取蛋白質并因而通過常規免疫測定測量提取的蛋白質時，離子表面活性劑應從提取物中去除或免疫測定前提取物本身應足夠稀釋從而使離子表面活性劑減少至認為表面活性劑不對免疫反應施加不利影響的濃度。實際上，預處理提取物以減少其中離子表面活性劑濃度，通過方法如1)用賽璐玢管等透析提取物，2)溶劑通過離心過濾等與無表面活性劑的溶劑交換，3)溶劑通過凝膠過濾或離子交換層析與無表面活性劑的溶劑交換，或4)用化學物質選擇性沉淀表面活性劑。然而，離子表面活性劑易和蛋白質形成膠束，因此在很多情況中選擇性去除表面活性劑非常難，意味著上述去除處理可能是所需蛋白質的產量顯著減少的原因。此外，首先進行去除處理較麻煩。另外，可適當稀釋完整提取物以減少離子表面活性劑濃度，然而待測量的提取蛋白質濃度也同時被稀釋減少，結果隨后免疫測定中的檢測敏感性根本沒改進。一般認為由于免疫反應的可行性，使用高濃度離子表面活性劑以從樣品中有效提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質與隨后的免疫測定不相容。
日本專利申請待公開(Laid-Open)出版號9-77798(JP 9077798A)描述了離子表面活性劑SDS存在時的抗原-抗體反應(第5頁，右欄，0030段；第6頁，左欄，0033段；第10頁，左欄，0051段)。此參考文獻涉及無穩定結構的血漿蛋白CETP(膽固醇酯轉移蛋白)的穩定和無交叉反應的免疫測定，在此測定中，檢測到用0.001到10％(W/V)SDS預變性的CETP。在此參考文獻中，也描述了甚至在0.001到0.3％(W/V)SDS存在時可進行CETP和相對抗體間抗原-抗體反應，特別優選范圍是0.02到0.03％(W/V)SDS。此外，在本文實施例中，0.25％SDS預處理的CETP進一步稀釋11倍(通過加入200μl抗體溶液到20μl預處理溶液)以調節SDS濃度至約0.023％。其后，進行抗原-抗體反應。
在此參考文獻中，認為0.03％或更高濃度的離子表面活性劑如SDS等抑制免疫測定中的抗原-抗體反應。因此參考文獻講授進行抗原-抗體反應時，含高濃度SDS的樣品應充分稀釋，從而SDS濃度降至0.03％或更低。
發明的揭示因此，本發明的目的是提供一種方法，其中微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質在隨后的免疫反應中敏感且容易檢測，同時維持從樣品提取的高效率，蛋白質需要以很高的敏感度檢測。
與現有技術中的普通技術知識相反，令人驚訝地發現即使存在高濃度離子表面活性劑時，抗原-抗體反應本身不被抑制到不能檢測的水平。也發現即使對于其抗原-抗體反應明顯被高濃度離子表面活性劑抑制的某一蛋白，用抗此蛋白的抗體可令人滿意地影響抗原-抗體反應，蛋白質預先用離子表面活性劑預變性。在這些發現的基礎上，本發明人完成了一種高度敏感和容易的免疫測定，用于微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質。因此根據本發明，提供了一種高度敏感和容易的免疫測定，特征是樣品中所含微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質可用水溶劑提取/溶解，溶劑含相對高濃度的離子表面活性劑，然后所得提取物中的蛋白質能通過免疫測定直接檢測，沒有提取物溶劑與另一種溶劑的交換，或沒有顯著稀釋提取物從而蛋白質濃度未減少到不能檢測的水平。
因此，本法提供免疫測定用于檢測樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，包括步驟(I)用含離子表面活性劑的水溶劑提取和/或溶解樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，(II)加入抗體，抗體用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質作為免疫原獲得，蛋白質預先用步驟(I)中所用離子表面活性劑變性a)上面步驟(I)中所得蛋白質溶液沒有顯著稀釋溶液，或b)稀釋，其中上面步驟(I)中所得蛋白質溶液稀釋的范圍使離子表面活性劑濃度不降至0.03％(W/V)或更低，從而微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質和抗體間形成抗原-抗體復合物，和(III)檢測形成的抗原-抗體復合物。
發現即使步驟(I)的水溶劑中離子表面活性劑濃度高于例如0.03％(W/V)，在用所述水溶劑提取的樣品(蛋白質)溶液中形成抗原-抗體復合物不受抑制。即步驟(II)中的抗原-抗體復合物可在濃度高于0.3％(W/V)的離子表面活性劑存在時形成，優選1％(W/V)或更高。即使樣品溶液應稀釋用于定量分析等目的，離子表面活性劑不需要稀釋到0.03％(W/V)或更低濃度，在現有技術中認為極好的抗原-抗體反應需要0.03％(W/V)或更低濃度，這意味著可實踐本發明方法而不損失離子表面活性劑的高提取力。
本發明的離子表面活性劑可選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶等，如果需要可混合這些表面活性劑。由于其可用性等，生化領域常用的十二烷基硫酸鈉(SDS)尤其能作為較佳例子提及。
已顯示步驟(I)中的水溶劑也可包含還原劑如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，它們能進一步變性蛋白質。因此，步驟(I)中優選水溶劑的非限制例子包括含1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇的水溶劑。
為保證測量的穩定性和可重復性，蛋白質溶液優選在步驟(I)中進一步煮沸，優選在80℃或更高連續煮沸5分鐘或更長。
本發明方法特別有利于高度敏感測量卵清蛋白、卵類粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白，它們處于幾乎不能提取狀態。卵清蛋白、卵類粘蛋白、酪蛋白等本身易溶于水，但存在于加工食物等的復雜基質中時，蛋白質可能用常規水溶劑幾乎不能提取。本發明方法可很有效用于高度敏感測量處于這種不能提取狀態的蛋白質。
因此，由于離子表面活性劑對蛋白質溶解的極好效果和新發現高濃度離子表面活性劑存在時的抗原-抗體反應性質，本發明方法能很有效用于現在的生命科學研究和確保食物質量，其中需要高度敏感檢測微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質。
附圖的簡述
圖1顯示標準卵類粘蛋白的測量結果(在450nm波長和630nm副波長測量的吸光度)，連續稀釋標準后用本發明所述方法(基于EIA原理的固相三明治方法)。
圖2顯示測量系統中未知濃度的含卵類粘蛋白樣品的測量結果(樣品a到c)(在450nm波長和630nm副波長測量的吸光度)，用本發明所述方法(基于EIA原理的固相三明治方法)。
圖3顯示HDTMAB、HDTMAC和HDPC存在時卵清蛋白的測量結果(參考實施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖4顯示LDS、月桂酰肌氨酸鈉、SDS存在時卵清蛋白的測量結果(參考實施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖5顯示HDTMAB、HDTMAC和HDPC存在時卵類粘蛋白的測量結果。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖6顯示LDS、月桂基肌氨酸鈉、SDS存在時卵類粘蛋白的測量結果。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖7顯示吐溫20、Luburol PX、Triton X-100和DOC存在時卵清蛋白的測量結果(參考實施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖8顯示吐溫20、Luburol PX、Triton X-100和DOC存在時卵類粘蛋白的測量結果(參考實施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。
圖9顯示SDS存在時酪蛋白的測量結果。各表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對照)。
圖10顯示SDS存在時β-乳球蛋白的測量結果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對照)。
圖11顯示SDS存在時蕎麥蛋白的測量結果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對照)。
圖12顯示SDS存在時小麥蛋白(麥醇溶蛋白)的測量結果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對照)。
圖13顯示SDS存在時花生蛋白的測量結果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標和縱坐標吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對照)。
圖14顯示卵清蛋白的測量結果，用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體。
圖15顯示在用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸卵清蛋白樣品溶液隨著時間對檢測敏感度的穩定性的效果。參考實施例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖16顯示在用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸卵類粘蛋白樣品溶液隨著時間對檢測敏感度的穩定性的效果。參考實施例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖17顯示在用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸花生蛋白樣品溶液隨著時間對檢測敏感度的穩定性的效果。參考實施例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖18顯示在用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸蕎麥蛋白樣品溶液隨著時間對檢測敏感度的穩定性的效果。參考實施例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖19顯示本發明一個優選方面的測定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結合煮沸樣品溶液。例子顯示測量結果，其中各濃度的卵清蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測量，而參考例顯示測量結果，其中使用天然卵清蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖20顯示本發明一個優選方面的測定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結合煮沸樣品溶液。例子顯示測量結果，其中各濃度的卵類粘蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測量，而參考例顯示測量結果，其中使用天然卵類粘蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖21顯示本發明一個優選方面的測定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結合煮沸樣品溶液。例子顯示測量結果，其中各濃度的花生蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測量，而參考例顯示測量結果，其中使用天然花生蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖22顯示本發明一個優選方面的測定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結合煮沸樣品溶液。例子顯示測量結果，其中各濃度的蕎麥蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測量，而參考例顯示測量結果，其中使用天然蕎麥蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
完成發明的最佳模式本發明的主題“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質”是一種蛋白質，在無離子表面活性劑的純水或一般使用的生理緩沖溶液中不表現出顯著溶解性或不能用這種緩沖溶液從樣品中大量提取，但用含本發明離子表面活性劑的緩沖溶液等能溶解或提取蛋白質到可被隨后免疫測定檢測的濃度。換句話說，本發明的“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質”用含離子表面活性劑的緩沖溶液等顯示的溶解性和/或提取效率顯著高于無離子表面活性劑的純水或緩沖溶液。通常，本發明的主題“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質”在含本發明離子表面活性劑的緩沖溶液中可表現出溶解性和/或提取效率改進，至少是無離子表面活性劑的純水或緩沖溶液中溶解性和提取效率的5倍，優選至少10倍，更優選至少50倍。微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質的非限制例子包括結構蛋白和膜結合細胞表面蛋白。特別是，有生化重要功能的膜蛋白例如細胞表面受體和細胞粘附因子是有趣的。微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質的其它例子包括在加工食物等中存在的食物變應原蛋白。例如，卵清蛋白、卵類粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白被認為是重要的食物變應原蛋白。這些蛋白質包括本身溶于水的，但當與加工食物中其它成分強絡合且在食物基質中整合時，可處于幾乎不能提取的狀態。處于這種幾乎不能提取狀態的水溶性蛋白質也在本文所指“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質”的范圍中，只要它們能通過本發明的離子表面活性劑作用第一次提取。
本發明所指“樣品”可以是液體、半固體或固體、或它們的混合物，懷疑含微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，且可有利地是樣品，包括的固體基質具有整合其中的微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，固體基質包括但不限于細胞、細胞膜、組織和器官，也包括食物和材料。
在本發明方法中，上述微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質用含離子表面活性劑的“水溶劑”溶解/提取。“水溶劑”指水；鹽溶液如氯化鈉、氯化鉀和碳酸氫鈉；多種緩沖溶液一般用于生化領域，例如磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和檸檬酸緩沖液；堿性或酸性溶液，其pH用氫氧化鈉、鹽酸等調節。水溶劑也可包含輔助成分以進一步改進蛋白質的溶解性和提取效率。例如，螯合化合物如乙二胺四乙酸(EDTA)、酶如磷脂酶、控制HLB的非離子表面活性劑可加入水溶劑。也能加入蛋白酶抑制劑用于在提取和貯存中控制溶液中的蛋白質降解，抗微生物劑如疊氮化鈉用于防止微生物繁殖，抗氧化劑如抗壞血酸。此外，極性有機溶劑如甘油和乙醇也可加入水溶劑，加入范圍使隨后免疫測定可行。
加入水溶劑的本發明離子表面活性劑可以是任何已知表面活性劑，因為它能顯著改進微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質的溶解性和提取。離子表面活性劑優選選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶和它們的混合物。從可用性和處理觀點看，十二烷基硫酸鈉(SDS)可作為特別優選的離子表面活性劑提及。特別是，SDS是廣泛用于電泳如SDS-PAGE的離子表面活性劑，但是用于促進電泳與免疫測定關聯的優選離子表面活性劑。
加入的離子表面活性劑濃度可以是充分達到本發明目的的任何濃度，本發明目的是溶解和提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，但通常離子表面活性劑以0.1％(W/V)或更高濃度加入，優選0.3％(W/V)或更高，或甚至0.5％(W/V)或更高。離子表面活性劑更優選以1％(W/V)或更高濃度加入水溶劑，也可使用約10％(W/V)高濃度的離子表面活性劑。在本發明方法中，用含離子表面活性劑的水溶劑以這種高濃度溶解/提取的蛋白質可通過隨后免疫測定檢測，同時充分維持離子表面活性劑濃度。
除了高濃度離子表面活性劑，優選加入還原劑到本發明特別優選的水溶劑，通常是2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、氰氫硼化鈉(SCBH)、二甲胺硼烷(DMAB)、氫硼化鈉(SBH)或半胱氨酸。這是因為通常根據經驗，隨后免疫測定的重復性可通過加入還原劑來改進，盡管沒有揭示此改進的原理。還原劑優選以約1mM到2M的濃度加入水溶劑，通常以約1M的濃度。
如上所述，本發明特別優選的含離子表面活性劑的水溶劑可以是例如含1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇的磷酸緩沖液。
如已證明的，本發明優點在于微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質用離子表面活性劑溶解/提取，離子表面活性劑有溶解蛋白質的強能力，所得提取溶液可經受隨后的免疫測定而沒有大量稀釋提取物。根據常規技術常識，認為當離子表面活性劑如SDS以相對高濃度(例如0.03％或更高)存在于反應溶液時，不能獲得所需抗原-抗體反應。因此在涉及微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質的典型常規免疫測定中，抗體加入樣品溶液前需要麻煩的預處理或大量稀釋樣品溶液，樣品溶液含高濃度離子表面活性劑；即在抗原-抗體反應前通過此預處理或稀釋，樣品溶液中離子表面活性劑濃度必須降至約0.03％。因此，例如在抗原-抗體反應前，含用10％(W/V)SDS提取的微溶蛋白的樣品溶液應稀釋至少300倍(0.03％SDS)，意味著蛋白質檢測敏感性減少到1/300。
另一方面，在本發明方法中，即使存在高濃度離子表面活性劑，抗原-抗體反應可令人滿意地完成，抗原-抗體反應的特異性和親和性能用變性蛋白的抗體顯著改進，變性蛋白通過用相同離子表面活性劑變性目標蛋白質獲得，在此發現基礎上，預期整個測定敏感性用蛋白質溶液改進，蛋白質用含如1％SDS的水溶劑溶解，作為隨后抗原-抗體反應中的樣品溶液而沒有大量稀釋它。在本發明方法中，用含至少10％(W/V)SDS的溶劑溶解的微溶蛋白可通過抗原-抗體反應在10％SDS溶液中測量。為精確定量樣品溶液中的抗原蛋白，通常需要適當連續稀釋的溶液用于確定測量的線性等。在本發明中，不需減少如上連續稀釋中樣品溶液中的SDS濃度，因此避免由于SDS濃度降低的結果微溶于水的蛋白質的可能沉淀。因此在本發明中，離子表面活性劑濃度不需降至0.03％(W/V)或更低，即使含高濃度離子表面活性劑的樣品溶液視情況稀釋。
如上所述，本發明的一個重要特征是以抗原-抗體反應為基礎的本免疫測定用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質的特異抗體進行，蛋白質在前面用特定離子表面活性劑變性，其中變性蛋白的特異抗體獲得自施用變性蛋白作為免疫原的免疫動物。
具體地，當已知樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質可用含SDS的水溶劑提取時，蛋白質用SDS變性，變性蛋白作為免疫原施用給待免疫動物以制備本發明抗體。能容易完成蛋白變性，通過溶解或懸浮溶液中微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質并然后置于室溫至少過夜，溶液含高濃度離子表面活性劑。在本發明較佳例子中，其中用于溶解/提取蛋白質的水溶劑含另外的還原劑如2-巰基乙醇和SDS，免疫原蛋白變性可優選在2-巰基乙醇和SDS存在時進行。在這種情況中，微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質可懸浮/溶解于含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的水溶劑中，然后置于室溫至少過夜，可用作變性蛋白免疫原用于制備本發明抗體。
在施用這樣獲得的變性蛋白到待免疫的動物時，可使用本領域技術人員已知的任何方案，方案的最優化對本領域技術人員也是容易的。作為免疫動物，可使用小鼠、大鼠、綿羊、兔等。
特別是，當本發明抗體以多克隆抗體形式使用時，多克隆抗體制備自免疫動物的抗血清。具體地能特定獲得來自免疫動物的抗血清，例如通過皮下注射含佐劑的免疫原到待免疫動物，以適當間隔(如1周)預定次數(如5次)重復此皮下施用，最終免疫后收集全血，分離抗血清。這些方法描述于例如《新編免疫學實驗指南》(Current Protocols in Immunology)，2.4章，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork出版。可完成從抗血清純化多克隆抗體，通過將動物免疫所用變性蛋白固定到層析樹脂上，例如CNBr-活化瓊脂糖或HiTrapNHS-活化(Amersham Pharmacia生產)，然后應用抗血清到固定樹脂上以特異吸收抗血清中的抗體到樹脂上，用合適的緩沖液或離液序列高的離子洗脫來回收樹脂上吸附的抗體。多克隆抗體也可通過任何其它方法純化。
當本發明抗體作為單克隆抗體獲得時，免疫小鼠的脾細胞通過本領域技術人員已知技術與用于細胞融合的親代細胞融合，如骨髓瘤細胞株，合適的融合細胞選白所得雜交瘤，然后克隆，體外或體內培養，高度特異的單克隆抗體收集自培養混合物。
作為本發明的抗體，不僅能用上述多克隆/單克隆抗體，也能用酶消化抗體所得的反應性抗體片段。抗體片段的例子包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、H-鏈單體、L-鏈單體或二聚體、一條H鏈和一條L鏈組成的二聚體。片段可通過用蛋白酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得，接著如果需要用還原劑處理。H-或L-鏈單體也可用還原劑如二硫蘇糖醇處理完整抗體獲得，然后分離純化的鏈。
在本發明中，離子表面活性劑-變性蛋白的抗體優選用于測量，但顯示用于某些蛋白質時，不總是需要其變性蛋白的抗體，其天然蛋白的抗體也可用于獲得容許的檢測。然而，觀察到在用這種天然蛋白的抗體的檢測中，檢測敏感性一般與時間段成比例減少，其中留下含離子表面活性劑的樣品溶液。即當微溶于水/幾乎不能提取的特定蛋白質用含離子表面活性劑的水溶劑提取并然后相對立即進行隨后抗原-抗體反應時，意識到形成相對穩定的抗原-抗體復合物，但提取后，復合物形成的速度隨著時間減少。這意味著在用天然蛋白的抗體的免疫測定中，在測定完成前測定的重復性能以時間-依賴的方式降低。
另一方面，發現當使用本發明的變性蛋白的抗體時，這種隨著時間的檢測變化可忽略。也發現特別是當提取物在前面被煮沸時，能完成高重復性的測定。即在本發明進一步的優選方面中，微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質用含高濃度離子表面活性劑的水溶劑提取，然后煮沸所得蛋白質溶液，如在80℃或更高溫度加熱5分鐘或更長，然后冷卻，離子表面活性劑-變性蛋白的抗體加入溶液以形成抗原-抗體復合物。
因此，提供了一種高度敏感免疫測定方案，在有效溶解/提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質后能有效完成抗原-抗體反應且沒有通過稀釋等損失高程度提取。
本發明免疫測定包括檢測以上述方式形成的抗原-抗體復合物，要理解的是此檢測能用本領域技術人員已知的任何方法完成。例如，在作為本發明免疫測定例子之一的三明治免疫測定中，本發明離子表面活性劑-變性蛋白的抗體可用于包被固相如孔底以提供捕獲-側(capture-side)抗體，而另一種變性蛋白的抗體(可以和捕獲-側抗體相同或不同)能用放射性物質、有色顆粒或酶標記以提供檢測-側抗體。含離子表面活性劑的樣品溶液加入有捕獲-側抗體的孔并孵育一段預定時間后，樣品提取物從各孔中取出，孔用合適的緩沖溶液充分洗滌，檢測-側的抗體加入孔。孵育一段預定時間后，洗孔，然后檢測到捕獲-側抗體/分析物/檢測-側抗體復合物的形成。此檢測取決于標記檢測-側抗體的標記物質的性質。當標記是放射性物質時檢測到放射量，或當標記是有色顆粒時檢測到著色強度或吸光度，當標記是酶時檢測到合適的底物加入孔并預定孵育后的吸光度(ELISA方法)。ELISA方法中酶標記所用的酶沒有特別限制，酶如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶可有利地使用。在辣根過氧化物酶標記的情況中，3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺等能用作酶的底物。當使用堿性磷酸酶時，p-硝基苯基磷酸作為底物提及。在免疫測定的測量結果的基礎上，可檢測到本發明主題微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質。
本領域技術人員根據上面描述可充分利用本發明而不需更多描述。在下文中，給出實施例僅用于解釋。以下除非另有說明，濃度(％)表示為重量/體積(W/V)％。
實施例1通過固相三明治方法測量含SDS樣品中的卵類粘蛋白(用天然卵類粘蛋白的抗體)(1)抗卵類粘蛋白抗體的固定兔抗(天然)卵類粘蛋白多克隆抗體以lμg/ml溶于碳酸鹽緩沖液(pH9.6)。此溶液以100μl/孔體積吸入微量滴定板(Nunc生產的微型平板Maxsorp-F8)并置于環境溫度中2小時。
(2)封閉微量滴定板抗體溶液從各孔去除后，300μl封閉溶液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含150mM NaCl、0.05％吐溫20、0.1％牛血清清蛋白)加入各孔并置于環境溫度中2小時。
(3)測量卵類粘蛋白封閉溶液從各孔去除后，100μl卵類粘蛋白標準(商品名蛋胰蛋白酶抑制劑，Nacalai Tesque生產)溶液用樣品稀釋液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含0.1％牛血清清蛋白、150mM NaCl、0.05％吐溫20和0％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％SDS)連續稀釋，加入各孔并置于環境溫度中2小時。(在測量下示多種樣品中，當樣品中所含卵類粘蛋白的量在上面系統測量范圍以外時，用樣品稀釋液測量前進一步稀釋樣品以致卵類粘蛋白的量在系統測量范圍內。)然后，各孔用300μl洗滌溶液洗6次，100μl辣根過氧化物酶標記的抗卵類粘蛋白多克隆抗體溶液加入各孔并置于環境溫度中30分鐘，抗體溶液預先用20mMTris-HCl緩沖液(pH7.4)稀釋，緩沖液含0.1％BSA、150mM NaCl和0.05％吐溫20。然后，各孔用300μl洗滌溶液洗5次，TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)溶液以100μl/孔體積加入，然后在環境溫度中暗處反應10分鐘。之后，100μl 1N硫酸加入各孔以終止反應。用微量滴定板讀數器在450nm主波長和630nm副波長測量各孔的吸光度。所得標準曲線示于圖1。
如從圖1可見，確定在此測量系統中，即使存在SDS時也能定量卵類粘蛋白，因為0.01到1.0％SDS溶液中樣品的標準曲線幾乎與無SDS溶液中樣品的曲線相同。
實際測量多種樣品中卵類粘蛋白的量時，在以此方式獲得的標準曲線基礎上確定樣品中卵類粘蛋白的量。
(4)樣品的免疫測定根據上述測試，實際進行樣品的免疫測定。來自3種商業購買mayonnaise產品的樣品溶液通過用含1％SDS的樣品稀釋液3倍連續稀釋mayonnaise樣品來制備，在制備自同時測量標準卵類粘蛋白的標準曲線基礎上，確定樣品的卵類粘蛋白濃度。如圖2中的結果所示，獲得經過坐標原點的極佳線性。
(5)回收測試根據上述測試方法進行抗原回收測試。
3種商業購買的餅干產品用作樣品以制備含1％SDS的提取物。即各餅干均一壓成粉末，稱重2g粉末并收集。含1％SDS的38ml樣品稀釋液加入粉末并用勻漿器攪勻30秒兩次，所得混合物以3,000xg離心20分鐘。所得上清用5A濾紙過濾，過濾物在測量中用作食物提取物(含1％SDS的提取物)。然后，標準卵類粘蛋白加入提取物且進行免疫測定，從測量中確定加入的卵類粘蛋白的回收。回收表示為(進一步加入抗原的樣品中檢測的抗原量-原始樣品中檢測的抗原量)/(加入的抗原量[％])的比例。
如表1所示，回收高達88.7到96.1％，表明食物中的卵類粘蛋白可通過本發明的方法準確和敏捷測量。
表1.回收測試的結果
實施例2通過固相三明治方法測量含多種離子表面活性劑或非離子表面活性劑的樣品中的卵類粘蛋白和卵清蛋白(用抗天然蛋白的抗體)SDS、十二烷基硫酸鋰(LDS)和月桂基)肌氨酸鈉作為本發明的陰離子表面活性劑，溴化十六烷基三甲銨(HDTMAB)、氯化十六烷基三甲銨(HDTMAC)和氯化十六烷基吡啶(HDPC)作為陽離子表面活性劑，吐溫20、Luburol PX和Triton X-100作為參考的非離子表面活性劑，脫氧膽酸(DOC)作為具類固醇骨架的表面活性劑，在與實施例1相同條件下檢測它們對卵類粘蛋白和卵清蛋白的免疫測定系統(參考實施例)的影響。
即在上述各表面活性劑以不同濃度存在時，測量免疫測定中含64ng/ml卵清蛋白和64ng/ml卵類粘蛋白的樣品，確定吸光度。結果示于表2到5和圖3到8。
表2.卵清蛋白測量系統中離子表面活性劑的影響
表3.卵類粘蛋白測量系統中離子表面活性劑的影響
表4.卵清蛋白測量系統中非離子表面活性劑的影響
表5.卵類粘蛋白測量系統中非離子表面活性劑的影響
此測試結果顯示在卵清蛋白測量系統中，測量敏感性顯著降低且免疫測定被相對高濃度(如0.1％或更高)離子表面活性劑抑制，而在卵類粘蛋白測量系統中，即使存在很高濃度約10％離子表面活性劑時測量也是充分可行的。因此證明除了抗(天然)卵清蛋白抗體即使抗天然蛋白抗體，也可用于使免疫測定系統達到極佳檢測敏感性和準確性，結合本發明離子表面活性劑的高蛋白提取能力。參考的非離子表面活性劑和脫氧膽酸在卵清蛋白或卵類粘蛋白測量系統中不施加影響。
實施例3測量酪蛋白和β-乳球蛋白(用抗天然蛋白的抗體)酪蛋白或β-乳球蛋白在與實施例1幾乎相同的流程中測量，除了使用抗(天然)酪蛋白抗體或抗(天然)β-乳球蛋白抗體取代抗(天然)卵類粘蛋白抗體。即乳蛋白質以64ng/ml的量加入樣品稀釋液，連續稀釋至10％到0.156％SDS濃度，產生測量的樣品溶液。樣品中的酪蛋白和β-乳球蛋白分別通過商業購買的酪蛋白牛奶免疫測定試劑盒和β-乳球蛋白牛奶免疫測定試劑盒測量，都用來自MorinagaInsutitute of Biological Science Co.，Ltd.，的天然蛋白的抗體(商品名，用于特殊物質的Morinaga免疫測定試劑盒，牛奶測量試劑盒(酪蛋白)；用于特殊物質的Morinaga免疫測定試劑盒，牛奶測量試劑盒(β-乳球蛋白))。結果示于圖9和10。
圖9和10顯示即使使用天然蛋白的抗體，免疫測定酪蛋白和β-乳球蛋白也可在高濃度離子表面活性劑SDS存在時令人滿意地完成。
實施例4測量蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白(用抗天然蛋白的抗體)離子表面活性劑對測量蕎麥蛋白、小麥蛋白(麥醇溶蛋白)和花生蛋白的影響以和實施例3相同的方式證明。回收實驗所用蕎麥蛋白制備如下碾磨蕎麥谷粒，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類如氯化鈉，然后離心所得提取物以回收其上清，上清應用于凝膠過濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由Amersham Pharmacia生產)，回收洗脫范圍在70到500kD分子量的部分。
所用小麥蛋白(麥醇溶蛋白)是獲得自Asama Kasei Co.，Ltd.的商業購買產品。花生蛋白制備如下碾磨花生，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類如氯化鈉，然后離心所得提取物以回收其上清，上清應用于凝膠過濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由Amersham Pharmacia生產)，回收洗脫范圍在30到100kD分子量的部分作為花生蛋白。用這些樣品的免疫測定通過來自Morinaga Insutitute of Biological Science Co.，Ltd.，的商業購買免疫測定試劑盒(用于特殊物質的Morinaga免疫測定試劑盒，蕎麥測量試劑盒；用于特殊物質的Morinaga免疫測定試劑盒，小麥測量試劑盒(麥醇溶蛋白)；用于特殊物質的Morinaga免疫測定試劑盒，花生測量試劑盒，任何一種都使用天然蛋白的抗體)。結果示于圖11到13。
圖11到13顯示在高濃度離子表面活性劑存在時，免疫測定蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白可用天然蛋白的抗體令人滿意地完成。
實施例5制備抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體實施例1到4顯示在免疫測定卵類粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白中特異抗原-抗體反應可在高濃度離子表面活性劑存在時完成，即使使用抗天然蛋白的抗體，但這種抗原-抗體反應不能在卵清蛋白的免疫測定中完成。因此，用蛋白抗體的方法以下列方式檢測，蛋白質預先用離子表面活性劑處理變性。
(1)蛋白的變性下列蛋白質以0.1到10mg/ml濃度溶解于含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的溶液，然后仍在室溫過夜。
1.卵清蛋白(商品名蛋清蛋白，5x Cryst.(雞)，購自Seikagaku Corporation)2.卵類粘蛋白(商品名胰蛋白酶抑制劑(來自雞蛋白)，購自Nacalai Tesque)3.花生蛋白以下列方式制備。
1)碾磨花生，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類如氯化鈉。
2)離心提取物以回收上清。
3)上清應用于凝膠過濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由AmershamPharmacia生產)，回收洗脫范圍在30到100kD分子量的部分。
4.蕎麥蛋白以下列方式制備。
1)碾磨蕎麥谷粒，然后用緩沖液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖液含鹽類如氯化鈉。
2)離心提取物以回收上清。
3)上清應用于凝膠過濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由AmershamPharmacia生產)，回收洗脫范圍在70到500kD分子量的部分。
(2)制備兔多克隆抗體使用弗氏佐劑，如上所述變性的各蛋白質被乳化，所得乳劑皮下注射到待免疫的兔。各免疫施用1mg變性蛋白，此施用以1周間隔進行5次。最終免疫后1周，收集免疫兔的全血以制備抗血清。從抗血清中制備本發明抗體根據下列流程完成。即免疫兔所用變性蛋白經共價鍵固定到樹脂HiTrapNHS-活化(AmershamPharmacia生產)，抗血清應用到此固定樹脂。然后，結合固定樹脂上蛋白部分的抗體用0.1M Gly-HCl調至pH2.7，產生本發明抗體。
實施例6通過抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體的測量免疫測定(ELISA)用根據本發明的離子表面活性劑-變性蛋白的抗體，在下列規程基礎上評估。
1.制備1μg/mL離子表面活性劑-變性蛋白的兔多克隆抗體溶液，如上在碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中。
2.溶液以100μl/孔體積吸入微量滴定板(Nunc生產的微型平板Maxsorp-F8)然后置于環境溫度中2小時。
1.固定抗體后，去除抗體溶液，300μl封閉溶液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含150mM NaCl、0.05％吐溫20、0.1％牛血清清蛋白)加入各孔并置于環境溫度中2小時。
1.標準蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，然后通過在100℃熱水浴中煮沸加熱1到10分鐘。
2.加熱后，標準蛋白用上面相同的緩沖溶液稀釋至1到64ng/ml。
1.封閉后，各濃度的標準蛋白溶液以100μl/孔體積加入抗體-固定的平板，然后在環境溫度中進行靜止反應1小時。
2.反應后，各孔用300μl洗滌溶液洗6次，20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中辣根過氧化物酶標記的抗體溶液以100μl/孔體積加入，緩沖液含0.1％BSA、150mM NaCl和0.05％吐溫20，然后在環境溫度中進行靜止反應30分鐘。
3.各孔用300μl洗滌溶液洗6次，TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)溶液以100μl/孔體積加入，然后在環境溫度中暗處反應10分鐘。
4.100μl 1N硫酸加入各孔以終止反應。用微量滴定板讀數器在450nm主波長和630nm副波長測量各孔的吸光度。所示結果是一式兩份測量的平均值。
(1)測量卵清蛋白卵清蛋白不能用天然蛋白的抗體測量(參見圖3和4)，用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體測量。測量結果示于圖14。在此實驗中，含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的緩沖溶液(PBS，pH6.5)中各濃度卵清蛋白溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻，通過上述ELISA檢測。
如從圖14可見，即使在高濃度離子表面活性劑存在時幾乎不能用天然蛋白的抗體測量的蛋白質可用抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體以很高敏感性測量。
(2)煮沸樣品溶液的效果顯示使用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法，能通過預先煮沸樣品溶液來顯著改進測量穩定性和敏感性。結果示于圖15到18。
例子顯示測量結果，其中各蛋白質以64ng/ml濃度溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后置于室溫0到6小時，用根據本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體進行ELISA測量。一方面，參考例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液，然后用于測量。結果表明當使用天然蛋白的抗體且不加熱樣品溶液時，能維持相對短時間的高檢測敏感性，但敏感性隨著時間減少。進一步顯示當使用天然蛋白的抗體且加熱樣品溶液時，檢測敏感性比開始時顯著減少。
另一方面，顯示當使用本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體且預先煮沸樣品溶液時，維持長時間的高檢測敏感性，測定可以相當高的重復性和敏感性完成。
(3)測定敏感性本發明一個優選方面中的測定敏感性示于圖19到22，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結合煮沸樣品溶液。例子顯示測量結果，各蛋白以各種濃度溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測量。圖中的參考例顯示測量結果，其中使用天然蛋白的抗體且加熱樣品溶液。如從這些圖中可見，本發明方法有很高的重復性和敏感性。
工業可應用性通過使用本發明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體，即使在高濃度離子表面活性劑存在時能令人滿意地完成蛋白質的免疫測定，如實施例6所特別證明。因此，微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質通過離子表面活性劑對溶解蛋白質的極佳效果來溶解/提取，可用免疫測定直接檢測，本發明方法能很有效地用于生命科學研究和確保食物質量，它們需要這種高敏感性檢測。
權利要求
1.一種檢測樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質存在的免疫測定，其特征在于，所述方法包括步驟(1)用含離子表面活性劑的水溶劑提取和/或溶解樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質，(2)加入抗體，抗體用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質作為免疫原獲得，蛋白質預先用步驟(1)中所用離子表面活性劑變性a)上面步驟(1)中所得蛋白質溶液沒有顯著稀釋溶液，或b)稀釋，其中上面步驟(1)中所得蛋白質溶液稀釋的范圍使離子表面活性劑濃度不降至0.03％(W/V)或更低，從而微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質和抗體間形成抗原-抗體復合物，(3)檢測形成的抗原-抗體復合物。
2.如權利要求1所述的測定，其特征在于，步驟(1)中水溶劑的離子表面活性劑濃度高于0.3％(W/V)。
3.如權利要求1或2所述的測定，其特征在于，步驟(2)中抗原-抗體復合物的形成在濃度高于0.3％(W/V)的離子表面活性劑存在時完成。
4.如權利要求1到3所述的測定，其特征在于，離子表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶和它們的混合物。
5.如權利要求4所述的測定，其特征在于，離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
6.如權利要求1到5中任一項所述的測定，其特征在于，步驟(1)中的水溶劑進一步包括還原劑。
7.如權利要求6所述的測定，其特征在于，還原劑是2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或它們的混合物。
8.如權利要求7所述的測定，其特征在于，步驟(1)中的水溶劑包括1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇。
9.如權利要求1到8中任一項所述的測定，其特征在于，步驟(1)中進一步煮沸蛋白質溶液。
10.如權利要求9所述的測定，其特征在于，煮沸至少在80℃連續5分鐘。
11.如權利要求1到10中任一項所述的測定，其特征在于，蛋白質選自卵清蛋白、卵類粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白，它們處于幾乎不能提取的狀態。
全文摘要
本發明提供一種方法，其中微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質在隨后的免疫反應中敏捷銳且容易檢測，同時維持從樣品提取的高效率。揭示了一種高度敏感和容易的免疫測定，特征是樣品中微溶于水的蛋白質或處于幾乎不能提取狀態的蛋白質用水溶劑提取/溶解，水溶劑含相對高濃度的離子表面活性劑，然后提取物中的蛋白質通過抗蛋白質的抗體直接檢測，蛋白質預先用離子表面活性劑變性。
文檔編號C07K16/16GK1697973SQ20048000002
公開日2005年11月16日 申請日期2004年3月3日 優先權日2003年9月30日
發明者村岡嗣朗, 渡邊由美子, 境雅壽, 本莊勉 申請人:森永制果株式會社