專利名稱：一種多酚酸有效部位的提取方法
技術領域：
本發明涉及從中藥中提取有效部位的方法。具體地說，涉及從鼠尾草屬植物中提取多酚酸有效部位的方法，更具體地涉及從丹參中提取多酚酸有效部位的方法。
背景技術：
傳統上，丹參是一種用于治療如心絞痛、高血壓、冠心病和中風等心血管性疾病的常用有效中藥。但一般用的都是從丹參中提取的粗提品，或直接用丹參切片。近二十多年來，體外實驗發現丹參中的有效成分，主要是多酚酸類化合物，特別是丹酚酸B及其鹽類。體外研究結果顯示，丹酚酸B及其鹽類，除了用于治療心血管性疾病(中國專利CN02155004，01110378和98111076)外，還具有治療其它多種疾病的潛力，如慢性肝病(中國專利CN 99113644)、腫瘤(中國專利CN 02136970和94103933)、消化性潰瘍(中國專利CN 98114172)、乙型肝炎(中國專利CN 95105902)和艾滋病等(美國專利US 6043276，中國專利CN 95105902和99809677，參考文獻Antiviral Research 5591-96，2002)。從其它鼠尾草屬的植物，如Coleus parvifolius和Cordia spinescens中，分離出的丹酚酸B及其鹽類，體外實驗同樣證明它們具有抗艾滋病毒的作用(參考文獻Phytotherapy Research 17232-239，2003和11490-495，1997)。
隨著丹參中多酚酸類化合物新用途的不斷發現，分離純化多酚酸類化合物制備方法的專利也在不斷增加。這些方法大致可分為兩種類型(一)先用熱水浸提丹參粉末，浸出水溶性的多酚酸后，再經不同方法純化。如再用酸提和大孔樹脂分離(中國專利CN02160771)；用大孔樹脂層析和乙醇精制(中國專利CN 98111076)；酸提，Sephadex LH20和高壓液相層析(中國專利CN 99809677)；或再經硅膠樹脂和高壓液相層析(中國專利CN 98114172)。(二)用有機溶劑水溶液取代熱水浸提丹參粉末，浸出水溶性的多酚酸后，再經不同方法純化。如用50-80％丙酮水或95-60％乙醇水對丹參粉末浸提，再用不同的樹脂、或某種樹脂加高壓液相層析(中國專利CN 02160771，02137375和95113971)進行純化。
本發明的目的，是建立一種更簡單、成本更低和產品質量更穩定可控的方法，從鼠尾草屬植物特別是丹參中分離純化出一種多酚酸有效部位，滿足市場的需求。
發明內容
本發明用一種簡單易行的二步法，從鼠尾草屬植物特別是丹參中分離純化出一種多酚酸部位。由于制備方法十分簡單，因此結果重復性好，組合物的質量完全穩定可控。本發明的方法包括以下兩個步驟(1)植物粉末提取植物粉末用無水甲醇提取，提取充分后除去甲醇，殘留物溶于水后離心過濾，除去沉淀；(2)柱層析濾液經大孔樹脂柱層析，以適量水洗柱后，用甲醇洗脫，減壓蒸去甲醇和水，殘留物干燥后即得多酚酸有效部位。
所得多酚酸有效部位，經高壓液相層析，高效硅膠簿板層析，比色和質譜等分析，發現它的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，它們的結構式如圖1所示，占總量的73％以上(如圖2和圖3所示)，它們的分子量分別是718，740和773(如圖4和圖6所示)。次要成分是咖啡酸三聚體和二聚體，兩者共占13％左右(如圖2和圖3所示)。根據質譜分析，咖啡酸三聚體以分子量520和516的多酚酸為主(如圖7所示)；二聚體以分子量為296的多酚酸為主((如圖8所示)。
在相同實驗條件下，對來自四個不同時間制備的多酚酸有效部位，比較了它們的高壓液相層析和高效硅膠簿板層析。結果顯示，四批多酚酸有效部位，無論是它們的高壓液相層析，還是高效硅膠簿板層析圖譜，彼此都十分相似(如圖9和圖10所示)。說明用本發明制備的多酚酸有效部位，結果重復性好，組合物的質量完全穩定可控。
本發明和現有技術的制備方法不同之處在于，打破常規，第一步用無水甲醇取代熱水或有機溶劑水溶液，浸提植物粉末。實驗表明，用熱水或有機溶劑水溶液浸提100克丹參粉末，浸出物可達到50-60克，而用無水甲醇浸提，浸出物只有30克左右。由于無水甲醇的疏水性低，這一變革既可以浸出水溶性的多酚酸，又可以大量減少丹參中其它一些易溶于水的物質進入浸提液而干擾后面的純化。因此，再進行一步大孔樹脂層析，便可得到更富集的多酚酸有效部位，它的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總量的73％以上(丹酚酸B是咖啡酸的四聚體)；次要成分是咖啡酸的三聚體和二聚體，兩者共占13％左右。
圖1是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽的分子量與結構式，其中，丹酚酸B 718 R＝HH鎂鹽740 R＝Mg銨鉀鹽 773 R＝NH4K圖2是多酚酸有效部位的高壓液相色譜圖。
圖3是實施例1的產物和檢測例1中的餾分7、6和5的高效硅膠簿板層析譜。
圖4是多酚酸有效部位的質譜(ES-MS)圖。
圖5是對照用的純丹酚酸B及其鹽類的質譜圖。
圖6是多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分7的質譜圖。
圖7是多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分6的質譜圖。
圖8是多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分5的質譜圖。
圖9是四批提取物的高壓液相色譜圖。
圖10是四批提取物的高效硅膠簿板層析圖。
具體實施例方式
下面提供的實施例僅為進一步說明本發明，它們對本發明并不構成任何限制。
實施例1第一步，無水甲醇提取向10公斤丹參粉末內，加無水甲醇浸泡三次，依次加60，50和40立升，每次浸泡8小時，合并三次浸出液。減壓蒸去浸出液中甲醇，加30立升水，使殘留物溶解后，離心過濾(4000轉/分)，收集濾液。
第二步，柱層析濾液經AmberliteXAD-4柱層析。層析柱直徑為30厘米，高80厘米，內裝20公斤樹脂。將近30立升濾液慢慢加入柱內，依次用水、20％和80％的甲醇水溶液洗柱，每次150立升。所要的多酚酸有效部位洗脫在80％甲醇水溶液內。減壓蒸去甲醇和水，進一步干燥后即得到淺棕色多酚酸有效部位0.15公斤，按丹參計得率為1.5％。以上二步，除蒸餾外，均在室溫下操作。
檢測例1多酚酸有效部位的高壓液相色譜分析將實施例1的產物進行高壓液相色譜分析，采用反相柱C18(10×250mm)，進樣量125微克，以甲醇∶水∶三氟醋酸＝4∶6∶0.05％洗脫，流速為1.5ml/min。結果見圖2，其中，餾分5為咖啡酸二聚體；餾分6為三聚體；餾分7為丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽。
檢測例2多酚酸有效部位的高效硅膠簿板層析分析將實施例1的產物和檢測例1中的餾分7、6和5進行高效硅膠簿板層析。點樣順序為1.實施例1的產物；2.餾分5；3.餾分6；4.餾分7；5.對照品純丹酚酸B及其鎂鹽。展開采用仿-丙酮-甲酸(體積比＝8∶8∶1)。圖3為高效硅膠簿板層析結果。圖中，a，b和c分別表示咖啡酸三聚體、二聚體和丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽移動的位置。
檢測例3多酚酸有效部位的質譜(ES-MS)分析采用負離子反映模式。樣品為水溶液，進樣量約5微克。圖4為多酚酸有效部位的質譜圖。圖中，丹酚酸B的結構式如右上圖，屬咖啡酸的四聚體，分子量為718，故m/z717來自丹酚酸B；m/z739和771則分別來自丹酚酸B的鎂鹽和銨鉀鹽。離子m/z519及其附近較小的m/z559，515和493，都來自屬于是咖啡酸的三聚體，它們有的可能本來就存在于提取物內。在進行質譜時，分子會發生降解和聚合，因此有的可能來自丹酚酸B及其鹽類降解物，如m/z519有可能來自丹酚酸B去掉一個水合咖啡酸。離子m/z321，339，和295，都來自屬于是咖啡酸的二聚體，像三聚體一樣，它們有的可能本來就存在于提取物內，有的可能來自三和四聚體分子在測定時生成的碎片。在m/z1457附近的離子是咖啡酸四聚體的聚合物，如m/z1457就是來自丹酚酸B及其鎂鹽的聚合物。圖中44是CO2的分子量，16是O的原子量。
檢測例4.對照用純丹酚酸B及其鹽類的質譜圖實驗條件同檢測例3，結果見圖5。圖中可見丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽離子峰，同時也可見在測定時它們產生的分子碎片咖啡酸三聚體，二聚體和它們的聚合物的離子峰。這些離子峰與上述組合物的相應的離子峰基本上一致。定量分析結果表明，提取物中丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽占總量的73％以上，咖啡酸三聚體和二聚體約占13％，此處質譜分析結果與其吻合。其它說明同檢測例3。
檢測例5餾分7的質譜分析實驗條件同檢測例3，結果見圖6。圖中可見丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽離子峰，它們的分子碎片咖啡酸三聚體，二聚體和它們的聚合物的離子峰，都與圖5純丹酚酸B及其鹽類的質譜圖上相應的離子峰幾乎一致。表明溜分7是由丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽組成。其它說明同檢測例3。
檢測例6餾分6的質譜分析實驗條件同檢測例3，結果見圖7。其中，離子m/z519，521和515都屬于咖啡酸三聚體。離子m/z519來自丹酚酸B去掉一個水合咖啡酸分子；m/z521可能來自離子m/z519的飽和物；m/z515可能來自丹酚酸A的鈉鹽(494+22-1)。高壓液相層析時，溜分6和7有一點重疊，因此可見丹酚酸B鎂鹽的離子峰。離子m/z359和321屬于咖啡酸二聚體，它們可能來自在測定時咖啡酸三和四聚體產生的分子碎片，也可能在本實驗條件下高壓液相層析時它們和三聚體分不開。
檢測例7餾分5的質譜分析實驗條件同檢測例3，結果見圖8。其中，離子m/z379，335和295都屬于咖啡酸二聚體，離子m/z379可能來自前紫草酸的鈉鹽，m/z335是m/z321的甲酯，m/z295來自丹酚酸G去掉一個CO2。正如前述，離子m/z559，521，515和493都屬于咖啡酸三聚體，可能在本實驗條件下高壓液相層析時，它們和上述二聚體分不開。
檢測例8四批提取物的高壓液相色譜分析圖9是四批提取物的高壓液相色譜圖，其中，A，B，C和D分別表示樣品來自四個不同的批號。這里，在進行層析時，0到30分鐘，儀器靈敏度為0.02，30分鐘后，改為0.1，這表示同樣的峰高，和30分鐘后的相比，30分鐘前的被放大了5倍。其它說明如圖2。
檢測例9四批提取物的高效硅膠簿板層析圖10是四批提取物的高效硅膠簿板層析，其中，1到4點的樣品來自與圖8相同的四個不同批號；5是對照品純丹酚酸B及其鎂鹽。點樣量都是30微克左右。其它說明如圖3。
檢測例10多酚酸有效部位中重金屬、甲醇和氯仿殘留物含量測定按照中國藥典的要求，測定了實施例1中得到的多酚酸有效部位中重金屬和甲醇殘留物的含量，發現它們均低于國家規定標準的含量限值。
檢驗結果如下
具體的測定條件和測定法如下溶劑殘留量的測定條件儀器為Agilent 6890氣相色譜儀，FID檢測器；色譜柱為DB624(6％氰丙基苯-94％甲基硅氧烷基共聚物，30m×0.53mm×3μm)色譜柱；載氣為氮氣；柱流速為氮氣2.0ml/min(恒流)；分流進樣(分流比1∶1)；柱溫使用程序升溫，初始溫度為50℃，保持5分鐘，然后以每分鐘50℃的升溫速率升至80℃，保持6分鐘，然后以每分鐘50℃的升溫速率升至200℃，保持4分鐘；進樣口溫度為180℃；檢測器溫度為260℃；進樣量為1.0μl。
溶劑殘留量的測定法為精密稱取甲醇、氯仿各適量，加二甲亞砜定量稀釋制成每1ml中分別約含甲醇150μg、氯仿3μg的溶液作為對照品；另取本品約0.5g，精密稱定，精密加入二甲亞砜10ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。精密量取上述兩種溶液各1μl，用DB624(6％氰丙基苯-94％甲基硅氧烷基共聚物，30m×0.53mm×3μm)色譜柱，依法進行測定，記錄色譜圖，各組峰間的分離度應符合要求，按外標法以峰面積計算，(甲醇≤3000ppm，氯仿≤60ppm)
重金屬的測量方法是取熾灼殘渣項下遺留的殘渣，照中國藥典2000年版二部附錄VIIIH(第二法)項下方法檢查。與標準鉛溶液(10mg/ml)1ml制成的對照溶液比較。供試品溶液的顏色均淺于對照液(≤10ppm)。
權利要求
1.從鼠尾草屬植物中提取多酚酸有效部位的方法，其特征在于.包括以下兩個步驟(1)植物粉末提取植物粉末用無水甲醇提取，提取充分后除去甲醇，殘留物溶于水后離心過濾，除去沉淀；(2)柱層析濾液經大孔樹脂柱層析，以適量水洗柱后，用甲醇洗脫，減壓蒸去甲醇和水，殘留物干燥后即得多酚酸有效部位。
2.如權利要求1所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述鼠尾草屬植物為丹參。
3.如權利要求1或2所述的提取多酚酸有效部位的方法，其特征在于提取所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總量的73％以上；次要成分是咖啡酸的三聚體和二聚體，兩者共占13％。
4.如權利要求1或2所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述大孔樹脂包括Amberlite XAD系列，Diaion HP系列和國產非極性大孔樹脂。
5.如權利要求4所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述國產非極性大孔樹脂為GDX-104。
全文摘要
本發明公開一種多酚酸有效部位的提取方法，采用無水甲醇提取和大孔樹脂分離二步。所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總量的73％以上；次要成分是咖啡酸三聚體和二聚體，兩者共占13％左右。本發明工藝簡單，產品中有效成分含量高，質量穩定，成本低，適合大規模生產。
文檔編號C07B63/00GK1654067SQ20041010104
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月6日 優先權日2004年12月6日
發明者邵明川 申請人:百愈生物醫藥有限公司