蟬擬青霉新菌株的人工培養及其鎮痛化合物的提取與利用的制作方法

專利名稱：蟬擬青霉新菌株的人工培養及其鎮痛化合物的提取與利用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蟲草真菌發酵、有效部位提取及利用技術領域，尤其是涉及一種蟬擬青霉新菌株APC-20的人工固體和/或液體發酵，從中提取出具鎮痛活性的化合物并進而制備成鎮痛藥物。
背景技術：
蟬花自古以來是一種藥用價值很高的珍貴中藥材，它是由蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)(屬蟲草屬)寄生于蟬若蟲的復合體。以往人們主要采集稀有的天然蟬花用于各種保健品或作為配伍用藥材以及滋補藥膳。但天然蟬花已越來越少，且產量低，一年只能采收一次，同時產品質量受環境影響而參差不齊。自然界現有的蟬擬青霉菌存在有長勢、產量、質量不一的問題，不能適應工業化生產的需要；并有文章報導認為(馮立馬，上海應用技術學院學報(自然)2002年02期)，把該天然菌種直接用來進行人工固體培養發酵一般長不出子實體(孢梗束)；而用來工業化液體發酵時存在工藝不配套，菌絲體產量低，品質不佳等問題。這既不能滿足中醫臨床用藥對孢梗束的大量需求，也制約了對蟬擬青霉菌代謝產物的產業化深加工開發利用。
蟲草是一類重要的昆蟲病原真菌，其代謝產物具有多樣性及多種藥理作用等特點，最早報道蟲草對中樞神經系統有作用的是Brewster和Alsberg，他們給家兔及小鼠靜脈或皮下注射冬蟲夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sscc.)浸提液證明對中樞抑制有作用。國內張士善等也報道了冬蟲夏草浸劑有鎮靜及催眠作用(張士善 藥學學報，1991，26[5]326-330)。本研究組陳祝安等報道蟬花及其人工培養物蟬擬青霉(Paecilomycec Cicadae)，以25g生藥/Kg劑量注射小鼠腹腔可抑制由醋酸所致的扭體反應，鎮痛率達95％以上，其效果相當于10mg/Kg嗎啡(陳祝安等，蟬花的人工培養及其藥理作用 真菌學報，1993，12[2]138-144)。此外，細腳擬青霉(Paecilomyces teniupes(Peck)Samson)也有類似作用。李淑芳等報道用小鼠扭體法實驗觀察到，在所試古尼蟲草(Cordyceps Gunnii(Berk.)Berk.)菌絲體浸提液，熱板刺激法15小時后鎮痛閾延長為79％，其鎮痛強度與杜冷丁相似(李淑芳，鮑淑娟 貴陽醫學院學報，1990，15(1)25～28)。雖然國內外報道了蟲草及其無性型具有鎮痛作用，但尚未揭示其鎮痛作用的化學成分。張士善等研究認為冬蟲夏草的鎮靜作用是由氨基酸，尤其是色氨酸所引起。朱振元報道古尼擬青霉(Paecilomyces Gunnii Liang)菌絲體鎮痛作用的活性物質是分子量不高于12000的多肽(朱振元，梁宗琦，常勝軍等 古尼蟲草的生物活性物質I含肽鎮痛組分的分離及性質 微生物學報2002。42(6)722～726)。國外也有報道從粉被蟲草(Cordyceps pruinosa Petch)中分離提取到N6-(2-羥乙基)腺苷及其結構式，由于該化合物的特有性，已用它作為冬蟲夏草制品的質量控制指標之一，其生物學用途一般作為Ca2+拮抗劑和肌肉收縮活性，但該化合物的鎮痛作用未見報道(Tsutomu FuruyaN6-(2-HYDROXYETHYL)ADENOSINE，A BIOLOGICALLY ACTIVECOMPOUND FROM CULTURED MYCELIA OF CORDYCEPS AND ISARIASPECIES，Phytochemistry，Vol.22.No.11，pp.2509-2512，1983)。綜上所述，有關蟬擬青霉的鎮痛活性物質及其制備方法與利用尚未見報道，因此明確蟬擬青霉具鎮痛作用的化學成分及其提取方法，進而開發成新型安全的鎮痛藥物具有重要的社會和經濟效益。

發明內容
本發明針對上述不足，提出以下發明目的，一是從自然界分離并人工選育生活力強、代謝活性物質產量高、質量好的蟬擬青霉新菌株；二是研究提出利用該蟬擬青霉新菌株進行產業化固體培養和/或液體培養，生產高產、優質的孢梗束、菌絲體及其代謝產物與培養基混合物的制備方法；三是明確蟬擬青霉菌發酵產物中所含鎮痛化合物的特性及其結構；四是提出從蟬擬青霉菌發酵產物包括孢梗束、菌絲體及其代謝產物與培養基的混合物中逐步提取具鎮痛活性的各有效部位及其純品的方法；五是進一步將以上提取物制備成多種劑型的鎮痛藥物。
本發明目的是通過下述方案得以實現的。
菌株的分離、選育、鑒定與保藏從浙江溫州不同立地條件、不同生態環境采集標本，從中選擇子實體大，孢梗束粗壯，無污染菌者進行分離純化，分別予以編號，并進一步通過單孢分離方法，建立了25株菌株保存。其中從022009號起始菌中，分離選育到單孢優株APC-20菌株，經固體培養基發酵菌絲生長勢，液體培養基菌絲體干重及多糖含量三個指標的測試表現最好，該菌株經中國科學院微生物研究所復核鑒定為蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)，并通過衛生部菌株安全性毒力實驗為無毒安全菌株，該菌種在40％含水量的無菌土，4℃冰箱中保存544天未見失活。
本發明的蟬擬青霉APC-20菌株已于2004年03月03日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO1104。蟬擬青霉APC-20菌株(CGMCC NO1104)具有以下微生物學特性1、形態特征(1)、孢梗束(蟬花)橙黃色，單生或成叢，30-50×2-5mm，頂尖或反復分枝成花菜狀的頭，并產生大量粉狀分生孢子。
(2)、菌株形態特征在PDA培養基上，菌絲灰白到淺黃，茸毛狀。分生孢子梗分枝，78-203×2.9-50mm，通常2-5個瓶梗簇生于短枝上，成輪狀排列。瓶梗基部近球形膨大，4.2-7(-13.5)×2.3-3.5(-5.2)mm，梗頸細長，向基式產生分生孢子鏈.分生孢子圓柱狀或長卵形，無色單孢，壁光滑，3.5-9×1.5-3.7mm，少數彎曲。
2、培養特征在PSA培養基上生長快，24℃培養14天，菌落直徑60-72mm。菌絲體灰白或淺黃，茸毛狀。有時表面出現輪紋或放射線。產孢后，菌落外貌顯粉質狀，背面無色，滲出液無色，水珠樣。
在Czapek培養基上生長慢而局限，14天直徑為49-55mm。菌落平展，菌苔薄，灰白，茸毛狀密致，背面無色，未見滲出液產生。
在蛋白胨蔗糖瓊脂上生長好，14天直徑54-70mm。菌落表面有隆起環線，邊緣有放射狀溝紋，肉色，背面深褐色，未見滲出液。
在麥粒或麩皮+玉米+谷糠等自然培養基上，菌絲體茸毛狀至絮狀，灰白至淺黃。15天形成菌核，并產生孢梗束。孢梗束掌狀或圓柱狀，橙黃色或蛋黃色，20-30×3-5mm，長的可達80cm。一般30天后產生大量分生孢子，以后孢梗束逐漸枯萎倒伏。
3、碳，氮源利用(1)碳源利用 測定了葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖、甘油等10種C源，除菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖不能利用外，其余均能利用。但用葡萄糖作C源，孢子產量極顯著高于其它C源(t＞t0.01)，用果糖作C源，菌絲體產量顯著高于其它C源(t＞t0.05)。
(2)氮源利用 測定了KNO3、NaNO3、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、NH4NO3、(NH2)2CO、NH4CL、NaNO2、H2NCSNH2含硝基、氨基、亞硝基等9種N源，以KNO3利用為好。但不能利用NaNO2和硫脲，對硝基氮的利用有比氨基氮好的趨勢。
該菌對蔗糖、葡萄糖以及N源中的KNO3利用盡好，但對C源量的要求較敏感。當C源量維持在2％的正常生長發育水平上，提高N源或降低N源，對孢梗束生長和產孢量影響不大；但N源固定在正常生長水平上，將C源從2％降低到0.5％，發現不產生孢梗束或僅極少孢梗束。反之，將C源提高10陪(20％)，則孢梗束多而不易老化，分生孢子有推遲產生現象。
4、人工培養品多糖含量測定天然蟬花多糖含量為4.40％，液體培養品多糖含量為11.4％，固體培養品多糖含量為12.8％。
此外，將APC-20菌株與親株22009(對照)經固體培養與液體培養試驗，在長勢、孢梗束產量，菌絲體干重等方面存在較大區別表1固體培養基上生長狀況

表2液體培養基上菌絲體干重

注搖床培養轉速110r/min，馬鈴薯-蔗糖培養液，培養10天。
菌絲體干重測定取發酵液100ml用100目紗濾網過濾，每次取樣3次重復，取其中的濾渣菌絲體于CT-C-O型熱風循環烘箱內70℃烘干至恒重，換算成每100毫升發酵液中菌絲的干重。
使用本發明菌株進行人工固體發酵和/或液體深層發酵的方法，包括在含有碳源、氮源，無機物和其它營養物的培養基中培養蟬擬青霉APC-20菌株的步驟、工藝，直至在固體培養基的表層，形成子實體(孢梗束)，在其內層也同時形成了大量的菌絲體及其有效代謝產物；在液體培養基中形成菌絲體的同時，也積累了菌絲體的有效代謝產物，與培養基一起成為具有進一步開發價值的培養產物。
A、固體培養發酵方法1、培養條件(1)菌種制備①、斜面菌種的制備 4℃冰箱內保存的APC-20菌株移植到PSA培養基上培養7天，活化待用。
②、一、二級種子的制備 一級種子的制備每支搖瓶(500ml三角瓶裝200ml種子培養基)移接入斜面菌種上的分生孢子粉3環，置DHZ-C振蕩器內25℃，120r/min轉速下培養4天。二級種子的制備10L發酵罐中裝7.5L(以75％容積計算，下同)二級種子培養基，121℃滅菌30min后冷卻至24℃，接入一級種子，接種量10％(下同)，控制發酵條件(24℃，罐壓約0.01-0.05Mpa，空氣流量約0.75m3/h)，發酵48h。
(2)培養基斜面培養基采用PSA或Richard培養基；一級種子培養基PSA固體培養基(馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g、水1000ml)或Richard培養基(KNO310.0g、KH2PO45.0g、MSO4.7H2O2.5g、FeCl30.02g、蔗糖50.0g、水1000ml)；二級種子培養基PSA液體培養基(馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml)；固態發酵用培養基純麥粒或麩皮(2-4)∶玉米(1-3)∶谷糠(1-3)的重量比配制，優選配方是麩皮2∶玉米1∶谷糠1并加2％果糖；(3)接種 量封閉式培養，接種量用1％-5％，優選為3％；開放式培養，接種量為5％-20％，優選為10％；(4)培養時間 斜面種培養時間以5-7天為宜。1-2級種子采用液體搖床或種子罐培養，齡期2-3天為好，接種后生長旺。固體培養時間20-30天，一般35天后孢梗束開始老化倒伏，菌絲產生自溶現象。
(5)培養溫 度斜面種以及種子培養階段，6-38℃均可生長，其中最適為24-25℃。固體發酵的菌絲體生長階段溫度以24-25℃為宜，孢梗束始發期溫度應控制在20-22℃。
(6)pH pH6.5左右.該菌要求偏酸性，在堿性條件下，菌絲容易老化色變。
(7)光 燈光、自然光均能刺激孢梗束生長，暗培養不產生孢梗束，或孢梗束量少，柔弱、色變。
(8)培養器和培養室 封閉式培養容器可用蘑菇瓶(500mL)或塑料制品ZP4瓶(500ml)或聚丙烯塑料袋來培養。開放培養容器可用金屬或陶瓷淺盤，但高度要求在6cm左右。開放式培養室要求有溫濕調控以及通氣(無菌過濾)、光照等設備，并便于消毒滅菌，潔凈度達到100級。
2、培養方法和步驟用斜面種接種一級種子，500ml三角瓶搖床培養(72h，110-120r/min)；二級種子采用10L種子罐制備(24℃，罐壓0.04-0.05Mpa，空氣流量約0.75m3/h培養36h)；采用70L種子罐制備(24℃罐壓約0.05Mpa，空氣流量1.3-1.6m3/h)培養36h，就可用來接種。接種量為1-5％然后置室內培養，前期培養溫度可控制24-25℃，孢梗束始發后應控制在20-22℃，培養20-30天，可采收。
用曲盤作開放式培養時，滅菌后培養料厚度可控制在1.5-3.0cm左右，接種量為5-20％。接種后料面蓋二層滅菌的濕紗布，紗布上再覆一層滅菌過的聚丙烯薄膜。整個培養過程要注意保濕并保持清潔。孢梗束生長始期后可揭開紗布與聚丙烯薄膜(接種后一周)，20-25天始采收，采收后孢梗束曬干或80℃烘干。
B、液體培養發酵方法1、培養條件(1)菌種種子制備制法同固體培養；(2)培養基斜面母種培養基PSA或PDA培養基馬鈴薯200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、瓊脂20g、水1000ml PH自然；一級種子培養基PSA培養液體培養基馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml；
二級種子培養基PSA培養液馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml；生產發酵培養基馬鈴薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，植物油0.1-0.15％、水77.54-77.59％；(3)接種量 一級種子或二級種子接入二級培養基或生產發酵液的接種量為10％；(4)發酵溫度 溫度的變化對菌絲體的生長影響較明顯，18-34℃均可生長，其中23-26℃生長較好，優選是24-25℃，最佳為24℃，菌絲體生長最快，干重量高(見表3)；表3發酵溫度對蟬擬青霉菌絲生長的影響 (5)PH值APC-20菌株在PH 4-12均能正常生長發育，優選PH為6.5，該范圍菌絲體干重產量最高；也可采用自然PH值，便于生產操作；(6)發酵時間 以菌絲得率為指標，放罐時間選擇在84h左右為最優。
2、培養方法與步驟采用70L發酵罐裝52.5L發酵培養液，其中添加消泡劑植物油0.1-0.15％，121℃滅菌30min后冷卻至24℃接入培養好的二級種子，控制發酵條件(罐壓約0.05Mpa，空氣流量約1.3-1.6m3/h，溫度24℃左右)，發酵84小時后放罐。
C、將以上固體培養物孢梗束和液體培養物菌絲體與天然蟬花主要成份作如下比較分析1、糖醇類成份比較 經硅膠GTLC層析，以異丙醇∶乙酸乙酯∶水(83∶11∶6)為展開劑，0.5％高錳酸鉀及0.5％聯苯胺醇液為顯色劑，二者出現的藍底黃斑點與甘露醇的Rf值一致。
2、有機酸類成份比較 經紙層層析，以正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)為展開劑，溴甲酚綠為顯色劑，培養物出現藍底黃點比天然產物多3個斑點。若以正丁醇∶乙醇∶氨水∶水(4∶1∶2∶2)為展開劑，溴酚藍為顯色劑，兩者出現的斑點、Rf值一致。
3、生物堿類比較 經硅膠GTLC層析，以氯仿∶甲醇(9∶1)為展開劑，出現橙紅色斑點較天然產物少1個。若以正丁醇∶乙醇∶水∶氨(4∶1∶2∶2)為展開劑，兩者出現的斑點和Rf值一致。
4、甾醇類成份比較 經硅膠GTLC層，以茴香醛醋酸硫酸液顯色后置110℃加熱10分鐘，兩者顯示色斑不少于10個，其斑點顏色及Rf值均基本一致。
此外，兩者都含有15種相同水解氨基酸和12種微量元素。由此可見，蟬擬青霉人工培養物和天然蟬花化學成份基本相同，均含有脂肪類、蛋白質、氨基酸、甾醇類、有機酸和生物堿等有效成份。
一種從蟬擬青霉新菌株APC-20人工發酵產物中提取的鎮痛化合物，包括從固體和/或液體培養發酵生產的孢梗束、菌絲體及其代謝產物與固體培養基混合物和/或菌絲體及其代謝產物與液體培養基混合物中提取獲得的具有鎮痛活性的化合物，該化合物純品CYDd-2-A經RP-HPLC分析(中國科學院上海藥物研究所)、紅外譜、ESI高分辨、ESI電噴霧分析、H譜、13C核磁共振譜、碳氫關系(HMQC)核磁共振譜(中國科學院上海有機化學研究所)及傅里葉變換(FTMS)質譜解析，明確該化合物化學名稱為N6-(2-羥乙基)腺苷N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine，有99％的鎮痛率(用小白鼠扭體法測定)，具有下述理化特性(1)分子量311.297；(2)準確分子量311.12297；(3)分子組成C 46.30％；H 5.50％；N 22.50％；O 25.70％；(4)分子式C12H17N5O5；(5)外觀白色粉末；(6)紫外光譜λmax＝213.5nm，267nm(logε＝4.19，4.20)[乙醇中]；(7)紅外光譜IR bands，3300cm-1(OH，NH)和1625cm-1(-C＝N-)；(8)熔點193℃；(9)性狀甲醇培育針晶；(10)溶解性溶于水，甲醇；(11)酸性、中性和堿性的辨別弱堿性物質；(12)顯色反應硫酸-香蘭醛顯色；硫酸∶5％苯酚水(體積比5∶1)顯色；茚三酮不顯色；(13)薄層色譜Rf值0.38，展開溶劑氯仿∶甲醇(體積比)＝5∶1；(14)酸堿穩定性PH＝3，活性不變；(15)熱穩定性100℃下10分鐘，活性穩定；(16)酶穩定性不被胃蛋白酶降解；(17)結構式
C12H17N5O5Exact Mass311.12Mol.Wt311.29C，4630；H，5.50；N，22.50；O，25.702-[6-(2-Hydroxy-ethylamino)-purin-9-yl]-5-hydroxymethy1-tetrahydro-furan-3，4-diol在提取上述鎮痛化合物過程中，其各有效部位包括CYD、CYDd和CYDd-2也均含有該化合物，采用小白鼠醋酸扭體法測得鎮痛率分別達95.25％，97.81％及98.20％。
一種從蟬擬青霉新菌株APC-20人工發酵產物中提取鎮痛化合物的方法，包括從固體培養和/或液體培養發酵生產的孢梗束、菌絲體及其代謝產物與固體培養基混合物和/或菌絲體及其代謝產物與液體培養基混合物中提取CYDd-2-A，可按以下順序步驟，條件進行(1)原料粉碎將固態原料或液態原料經80℃通風烘干后粉碎成200目粒徑顆粒，備用；(2)乙醇浸提將粉碎原料與40％乙醇按1∶3(重量體積比)浸漬，經超聲波提取與多次85℃水加熱回流抽濾后，混合所提濾液，70℃旋轉蒸發儀濃縮；(3)溶劑分配將濃縮液按2∶1比例(體積)，分別用二氯甲烷(CH2Cl2)乙酸乙酯(Ethyl Acetate)、正丁醇(n-Butyl Alcohel)分配，得CYA二氯甲烷部位、CYB乙酸乙酯部位、CYC正丁醇部位和CYD水相部位，將其中水相部位蒸干得CYD；(4)CYD去除多糖將CYD與95％乙醇按1∶3體積比混合，3600γ/min4℃離心15min，取上清液1后，在沉淀物中加適量水溶解，離心后去除沉淀，將上清液同上法重復2次，得上清液2、3，合并上清液1、2、3，旋轉蒸干即為去除多糖后的CYDd；(5)CYDd樹脂分離采用CDA-40型大孔樹脂，經9cm×1.0m柱子吸附后，依次加水，50％乙醇，95％乙醇洗脫，將其中50％乙醇洗脫液蒸干得CYDd-2；(6)CYDd-2柱層分離采用Art.10626柱，洗脫液甲醇∶水＝2∶8，得CYDd-2-A、CYDd-2-B、CYDd-2-C，將其中59～77管合并液，蒸干后呈淡黃色(為3.932min的大峰)即為CYDd-2-A；(7)CYDd-2-A柱層析純化 Sephedex LH-20Φ2cm，長50cm，溶劑為甲醇，純化蒸干后得白色粉沫，即為鎮痛化合物純品CYDd-2-A.該化合物的最終提取得率為0.36％。(見實例7)。
在提取上述鎮痛化合物過程中，其各有效部位可采用同樣原料，經60～80℃烘干、粉碎、乙醇浸提、溶劑分配后可得CYD，去除多糖后可得CYDd，再經樹脂分離、50％乙醇回收即得CYDd-2。
本發明的有益效果，一是選育獲得了生長勢強，人工發酵培養物(孢梗束，菌絲體)產量高，品質好的蟬擬青霉APC-20新菌株；二是本發明提出了應用APC-20菌株進行人工培養固體發酵生產子實體(孢梗束)的優化工藝及配套方法，從而實現了人工，周年，大批量生產品質優良(最高單株孢梗束干重達9.77克，平均長度達18.92mm)質量一致的傳統名貴真菌中藥蟬花的目標；三是本發明提出了應用該菌株進行人工培養液體發酵生產菌絲體及其代謝產物與培養液混合物的優化工藝及配套方法，使菌絲體干重產量由親菌株的1.51g/200ml提高到APC-20菌株的2.76mg/200ml，最高的達到3.03mg/200ml，而且液體發酵還具有生產周期短(3-5天)，質量便于控制(工業化標準生產)，操作方便等優點；上述方法生產的產物所含糖醇類、有機酸類、生物堿類及甾醇類均與天然蟬花基本一致；四是本發明首次從蟬擬青霉中分離提取出N6-(2-羥乙基)腺苷N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine，該化合物及其結構式雖與Tsutomu所報導的相同，但提取的生產菌種不同，并首次發現了該化合物具有鎮痛作用，該化合物是通過與d受體結合抑制了神經遞質釋放產生鎮痛作用，其機理不同于目前常用的阿片類鎮痛劑，不具有成癮性，純品鎮痛率高達99.00％，該純品與提取過程中各有效部位可制成多種劑型，安全的鎮痛藥物，具有較大的開發應用前景；五是蟬擬青霉培養條件為23-26℃，較冬蟲夏草菌類低溫度、高海拔的要求為低，故本發明所提出的從菌種培養發酵到鎮痛化合物提取的整套方法，具設計合理，切實可行，得率較高，成本低廉等特點。


圖1 鎮痛化合物CYDd-2-A及各有效部位提取工藝流程示意2 原料乙醇浸提流程示意3 CYD對胃蛋白酶穩定性測定示意4 CYD去除多糖流程示意5 CYDd-2-A RP-HPLC分析譜6 CYDd-2 RP-HPLC分析譜7 CYDd-2-A紅外譜8 CYDd-2-A的ESI高分辨譜9 CYDd-2-A的ESI電噴霧分析譜10 H譜圖-1圖11 H譜圖-2圖1213C核磁共振譜圖-1圖1313C核磁共振譜圖-2圖14 碳氫關系(HMQC)核磁共振譜圖-1圖15 碳氫關系(HMQC)核磁共振譜圖-2圖16 傅里葉變換質(FTMS)譜圖具體實施方式
通過以下實施例將更詳細說明本發明，以下實施例僅是說明性的，本發明并不受這些實施例的限制。
實施例1(固體培養發酵方法《1》)取4℃冰箱內保存的APC-20菌株移植到斜面培養基上(注1)培養7天，活化待用；每支500ml三角瓶裝200ml一級種子培養基(注2)，接入斜面菌種孢子粉3環，置DHZ-C振蕩器內25℃，120r/min轉速，培養4天為一級種子；在10L發酵罐中裝7.5L二級培養基(注3)，121℃滅菌30min冷卻至24℃，按10％接種量接入一級種子，24℃，罐壓約0.04Mpa，空氣流量約0.75m3/h，發酵48小時為二級種子。將固體培養基(注4)與水按1∶2拌勻后，一種方式可直接裝入培養容器內，裝料約占容量的2/5為宜，置高壓蒸汽鍋內，經121℃，0.11Mpa滅菌1.5小時后，冷卻到20℃，按1.5％的接種量接入二級種子拌勻后進行封閉式室內培養，前期溫度保持24℃，待孢梗束始發后降至21℃，培養20-30天，可采收；另一種方式，可將同法滅菌后的固體培養基裝入邊高約6公分的曲盤中，(料厚3公分)，按20％接種量接種拌勻后，在料面上復蓋二層滅菌濕紗布及一層聚丙烯薄膜以保濕防蒸發，置經消毒，潔凈，明亮室內進行開放式培養，溫度同上，一周后孢梗束始發，揭開紗布與薄膜，培養20-25天可采收，采收后曬干或80℃烘干。
注1斜面培養基，采用PSA或PDA培養基馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g、水1000ml PH自然；注2一級種子PSA培養液，馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml；注3二級種子PSA培養液，馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml，加植物油1-1.5ml；注4固體發酵培養基，麩皮、玉米、谷糠，按3∶2∶2重量組份配比。
實施例2(固體培養發酵方法《2》)本實施例的固體發酵培養基為麩皮∶玉米∶谷糠按2∶1∶1配比；固體培養基干料與水按1∶2.9重量組份比例拌勻；容器封閉式培養的二級菌種接種量為3％；曲盤開放式培養的二級菌種接種量為10％；本實施例的培養基及其余工藝與步驟均同于實施例1。
實施例3(固體培養發酵方法《3》)以小麥麥粒為固體培養基，先將麥粒用水浸泡過夜，蒸熟(直至麥粒開裂)，裝入容器或曲盤均占容積三分一為宜；容器封閉式培養的二級或三級菌種接種量為3％；曲盤開放式培養的菌種接種量為10％；其余培養工藝與步驟均同于實施例1。
實施例4(液體培養發酵方法《1》)本實施例菌種制備的斜面、一、二級種子培養基及方法基本同于實施例1，僅在二級種子培養基中加入植物油0.1％作為消泡劑；其發酵培養基也同于二級種子培養基；本實施例采用70L發酵罐裝52.5L發酵培養液，PH4.5，121℃滅菌30min后冷卻至24℃，按10％接種量接入培養好的二級種子，控制罐壓約0.05Mpa，空氣流量1.3m3/h，溫度24℃，發酵84小時后放罐即成。
實施例5(液體培養發酵方法《2》)本實施例二級種子培養基和生產發酵培養液中均加入0.15％植物油作消泡劑；PH為6.5；溫度控制在26℃；空氣流量為1.6m3/h；本實施例的其余工藝與步驟均同于實施例4。
實施例6(液體培養發酵方法《3》)本實施例菌種制備的斜面、一、二級種子培養基及方法基本同于實施例1，生產發酵培養基為馬鈴薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，植物油0.1-0.15％、水77.54-77.59％。
本實施例的其余工藝與步驟均同于實施例4。
實施例7(鎮痛化合物純品提取方法1)整個方法步驟按圖1所示進行，將固體和/或液體發酵的蟬擬青霉產品(孢梗束或菌絲體及其代謝產物與培養基混合物)，經60～80℃烘干，粉碎成200目顆粒(稱重525g)；—→將粉碎原料與40％乙醇按1∶3比例浸提，(浸提流程如圖2)，合并濾液1、2、3，旋轉蒸發儀70℃濃縮為1800ml；—→將濃縮液按2∶1比例(體積)，分別用二氯甲烷(CH2Cl2)乙酸乙酯(Ethyl Acetate)、正丁醇(n-ButylAlcohel)分配，得CYA二氯甲烷部位、CYB乙酸乙酯部位、CYC正丁醇部位和CYD水相部位，分別蒸干，進行鎮痛率測定；—→將水相部位CYD去除多糖，儀器TH-1型梯度混合器(上海滬西機電廠)，LC-6離心機(上海離心機械研究所)，試劑乙醇、乙醚和丙酮為國產分析純(流程見圖3)，得CYDc(多糖)與去除多糖后的CYDd，進行鎮痛率測定；→將CYDd進行大孔樹脂分離，采用CDA-40型大孔樹脂南京化工大學生產，加樣90g經9cm×1.0m柱子吸附后，依次加水，50％乙醇，95％乙醇洗脫，分別蒸干后得CYDd-1 65.904g，CYDd-211.094g，CYDd-3 0.494g，并進行鎮痛活性測定；—→將CYDd-2LOBAR柱分離采用Art.10626柱，BSZ-100自動部分收集器，1管/3min，15ml/管，壓力500psi，流速8ml/min，洗脫液甲醇∶水＝2∶8，每隔10管作RP-HPLC檢測，相同的合并，得CYDd-2-A、CYDd-2-B、CYDd-2-C，其中CYDd-2-A為59～77管合并液，蒸干后呈淡黃色，為3.932min的大峰；CYDd-2-B為最后沖冼柱子部分；CYDd-2-C為1～56管，3.932min大峰前部分，經鎮痛率測定CYDd-2-A上升為99.0％；—→將CYDd-2-A Sephedex LH-20純化 Sephedex LH-20Φ2cm，長50cm，溶劑為甲醇，純化蒸干后得白色粉沫1.892克，即為鎮痛化合物純品，其提取得率為0.36％。
實施例8(各鎮痛有效部位的提取方法)各鎮痛有效部位的提取方法采用實施例7同樣原料，經60～80℃烘干、粉碎后，乙醇浸提、溶劑分配得CYD，去除多糖后得CYDd，再經樹脂分離、50％乙醇回收即得CYDd-2，各步驟具體方法同實施例7(見附圖1)。
實施例9(鎮痛膠囊的制造)以CYD、CYDd、CYDd-2或CYDd-2-A為原料，80℃烘干，粉碎過100目，均勻加入適量淀粉(100目)，測含量后，用膠囊機分裝(5號膠囊殼)，使制成鎮痛膠囊含CYDd-2-A 50mg/粒，成品檢驗合格后包裝。
實施例10(片劑的制造)將原料藥CYDd-2-A，以及微晶纖維素，乳糖分別粉碎過100目，按等量遞加將上述三組分混勻，用8％淀粉漿混勻制成16目顆粒，通風干燥3-6小時(水分5％以內)，呈14目整粒后，加入羧甲基淀粉鈉(80目)、硬脂酸鎂(80目)混合均勻，測含量后沖壓成片劑，毛重1.5g/粒，含有效成分50mg/粒，成品檢驗合格后包裝。
實施例11(注射用粉劑的制造)在100級潔凈環境下將藥物原料CYDd-2-A加水溶解，加針用活性肽，無菌過濾，噴霧干燥，粉碎過300目篩，分裝于去除熱源的無菌玻璃瓶中，100mg/瓶，立即加塞，鋁蓋密封。使用時用注射用無菌水溶解。
試驗例1(鎮痛活性各有效部位及化合物對動物鎮痛率的試驗)實驗動物昆明小白鼠雌雄各占50％，體重25g/頭左右，統一飼養3-4天，由中國科學院上海藥物研究所動物試驗中心提供。
鎮痛測定方法采用扭體法，處理劑量為5g生藥/Kg體重，注射給藥(Sc)，30-40分鐘后腹腔注射0.7％乙酸，記錄小白鼠10分鐘內的扭體數，計算對0.7％乙酸產生的疼痛扭體反應的抑制率。
(1)提取物溶劑分配后鎮痛率測定由表4可見，溶劑分配后鎮痛活性主要集中在CYD部位。
表4不同溶劑部位對小白鼠的鎮痛作用(扭體法)

注**P＜0.01水平顯著；生理鹽水為對照；
(2)CYD去除多糖后的鎮痛率測定由表5可見，去多糖后的CYD即CYDd鎮痛率顯示最高，達97.81％，而多糖CYDc鎮痛率為0。
表5CYDa～d對小白鼠的鎮痛作用

注**P＜0.01水平極顯著(3)CYDd經樹脂分離后鎮痛率的測定CYDd經樹脂分離后，其中CYDd-2(50％乙醇部位)鎮痛率最高(見表6)。
(4)CYDd-2柱析純化后鎮痛率的測定表6CYDd-2～CYDd-2-C對小白鼠的鎮痛作用(扭體法)

注**P＜0.01水平顯著；生理鹽水為對照。
表6表明，純化后的CYDd-2-A鎮痛率達99％，說明該鎮痛化合物純度越高，活性越高。
試驗例2(鎮痛化合物對胃蛋白酶、胰蛋白酶及酸性穩定性試驗)
胃蛋白酶購于美國HyClone-PIERCE公司。
PH＝3的Buffer配制檸檬酸(0.1M 18.6ml)+檸檬酸鈉(0.1M 1.4ml)。
試驗流程如圖4。
由表5可見，CYD不受胃蛋白酶的影響，胃蛋白PH4，30℃反應12h，不改變鎮痛活性，CYDa鎮痛率仍達95.10％，而且酸性下(PH3)穩定，即CYDb鎮痛率達96.30％。
權利要求
1.一種蟬擬青霉新菌株APC-20(CGMCC NO1104)，其特征在于通過固體和/或液體發酵所產生的人工培養物與天然蟬花化學成份基本相同，并能提高其孢梗束和/或菌絲體的產量。
2.蟬擬青霉APC-20菌株進行人工固體和/或液體培養發酵的方法，其特征在于經過斜面和一、二級種子在固體和/或液體培養基中培養蟬擬青霉菌株APC-20(CGMCC NO1104)，其中固體發酵培養 以純麥粒或麩皮(2-4)∶玉米(1-3)∶谷糠(1-3)重量份比配制成培養基，封閉式容器菌種接種量為1-5％，開放式容器接種量為5-20％，菌絲體生長階段為24-25℃，孢梗束始發后為20-22℃，PH4.5-6.5，燈光或自然光下生長20-30天直至采收孢梗束。液體發酵培養 按10％菌種量接入發酵罐培養基馬鈴薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，余量為水，發酵溫度23-26℃，罐壓約0.05Mpa，空氣流量1.3-1.6m3/h，PH4-12，發酵48-120小時采收菌絲體。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于所述固體發酵培養基配方為麩皮2∶玉米1∶谷糠1并加2％的果糖，封閉式容器菌種接種量為3％，開放式容器接種量為10％，PH為5.8；所述液體發酵培養，培養溫度為24-25℃，最佳為24℃，PH為4.5-6.5，最佳發酵時間為84小時。
4.一種從權利要求2所述方法培養產物中提取的鎮痛化合物，其特征在于該化合物從蟬擬青霉菌株APC-20人工固體和/或液體培養發酵生產的孢梗束、菌絲體及其代謝產物與固體培養基混合物和/或菌絲體及其代謝產物與液體培養基混合物中提取獲得，該化合物名稱為N6-(2-羥乙基)腺苷，其純品CYDd-2-A分子量為311，分子式為C12O5H17N5，不受胃蛋白酶的影響、酸穩定(PH＝3)、熱穩定(100℃)。
5.按權利要求4所述的鎮痛化合物，其特征在于該化合物純品CYDd-2-A，在提取過程中的各有效部位包括CYD、CYDd和CYDd-2也均含有該化合物而具備不等的鎮痛活性。
6.一種權利要求4所述鎮痛化合物的提取方法，其特征在于以蟬擬青霉菌株APC-20人工固體和/或液體培養發酵產物孢梗束、菌絲體及其代謝產物與固體培養基混合物和/或菌絲體及其代謝產物與液體培養基混合物為原料，經60～80℃烘干、粉碎、乙醇浸提、溶劑分配、去除多糖、樹脂分離回收、柱層析提純，獲得鎮痛化合物CYDd-2-A的白色粉狀純品。
7.按權利要求6所述鎮痛化合物的提取方法，其特征在于所述各有效部位采用同樣原料，經60～80℃烘干、粉碎、乙醇浸提、溶劑分配后得CYD，去除多糖后得CYDd，再經樹脂分離、50％乙醇回收即得CYDd-2。
8.利用權利要求4或5所述鎮痛化合物制備而成的鎮痛藥物，其特征在于該藥物包括膠囊、片劑及粉劑。
全文摘要
本發明公開了一種蟬擬青霉新菌株的人工培養及其鎮痛化合物的提取與利用。本發明從自然界分離選育出生活力強、代謝活性物質產量高、質量好的蟬擬青霉新菌株APC－20；提出利用該菌株進行產業化固體培養和/或液體培養進行發酵生產的方法；進而提出從該發酵產品中提取所含鎮痛化合物及各有效部位與制備成多種劑型鎮痛藥物的方法；該化合物化學名稱為N
文檔編號C07K1/14GK1614003SQ20041009451
公開日2005年5月11日 申請日期2004年10月30日 優先權日2004年10月30日
發明者柴一秋, 韋忠民, 陳祝安, 厲曉臘, 劉又高, 王根鍔 申請人:浙江省農業科學院