專利名稱：從大豆異黃酮中快速分離殘留dna的方法
技術領域：
本發明為生物技術領域，尤其涉及一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。
背景技術：
1986年，美國科學家發現大豆中抑制癌細胞的異黃酮。異黃酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亞科等極少數植物中，如大豆、墨西哥小白豆、苜蓿和綠豆等植物中，其中異黃酮含量最高的只有苜蓿和大豆，一般苜蓿中異黃酮的含量為0.5％-3.5％，大豆中異黃酮含量為0.1％-0.5％。大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素。它主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少。80％-90％的異黃酮存在于子葉中，濃度為0.1％-0.3％。胚軸中所含異黃酮種類較多且濃度較高，為1％-2％，但由于胚只占種子總重量的2％，因此盡管濃度很高，所占比例卻很少(10％-20％)。目前已明確大豆異黃酮抗癌的主要作用機制，包括以下幾個方面類似女性雌激素作用以及抗激素作用；抑制與癌相關酶活性的作用，特別是酪蛋酸激酶；在癌細胞增殖的促進階段，具有抑制血管增生作用；消除活性氧，從而具有抗氧化作用；調節細胞周期；此外，還確認染料木黃酮具有抑制一些與DNA切斷有關酶活性的作用等。從大豆中獲取異黃酮在技術上并不復雜，將大豆粉碎脫脂后就可用酒精萃取和純化。我國的豆制品主要是豆腐，傳統生產豆腐時水溶性的異黃酮大量從廢水中排出。現在，科技人員設計了從豆腐黃漿水中回收異黃酮的工藝。直接將豆腐黃漿水的水分蒸發掉就可用于純化，但消耗能量很多。作為工業生產以吸附沉淀為宜，建議采用活性氧化鋁等吸附能力強的吸附劑，然后再用酒精萃取和純化。這也可作為解決豆制品廠環境污染的綜合措施之一。
各種大豆制品中異黃酮含量和種類分布不同，不僅與大豆品種和栽培環境有關，還與大豆制品的加工工藝密切相關。水處理、熱處理、凝固、發酵等加工環節和方法顯著地影響了大豆制品中異黃酮的含量和種類分布，特別是大豆濃縮蛋白和大豆分離蛋白的不同提取方法其中異黃酮含量影響極大。隨著人們對大豆異黃酮的生理功能的認識以及對大豆的大量需求，使我國每年進口大量的大豆和大豆異黃酮產品。然而，世界上主要大豆生產國美國和巴西所生產的大豆及其相應的產品多為轉基因農產品，這就涉及到轉基因生物安全性檢測問題。雖然大豆異黃酮的提取過程簡單，但水處理、熱處理、凝固、發酵、脫脂、萃取和純化等加工環節都顯著影響從大豆異黃酮產品中有效地提取痕跡量DNA，并進行隨后的轉基因生物安全性檢測。
鑒于此，本發明建立了一種從商品化的大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法，Chelex溶液熱處理及Sephadex-G 25柱分離兩個步驟，不僅能有效地從高濃度大豆異黃酮中分離出痕跡量DNA、而且能夠去除混雜的小分子發酵產物以及其它的次生代謝物質，最終獲得可用于PCR等分子檢測手段的較高質量的DNA，該方法簡單且有效、成本低、靈敏度和檢出率高，所獲得的痕跡量DNA可用于定性和定量PCR擴增。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種從商品化的大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。
方法的步驟為1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5-10分鐘；2)12,000rpm離心10-15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。
本發明的優點是1)與常規DNA提取技術相比較，該方法能快速從大豆異黃酮中提取痕跡量DNA，大大縮短了DNA提取時間。2)運用Sephadex-G 25柱分離能有效去除所得DNA中的可能抑制PCR反應的抑制因子，從而獲得可用于PCR等分子檢測手段的痕跡量DNA；3)該方法簡單有效、成本低，其靈敏度和檢出率高于常規DNA提取方法。
圖1.lectin基因PCR擴增結果，圖中M為分子量標記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴增產物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴增產物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴增產物，5為本發明的方法抽提DNA的PCR擴增產物，6為陰性對照；圖2.35S-CTP基因PCR擴增結果，圖中M為分子量標記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴增產物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴增產物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴增產物，5為本發明的方法抽提DNA的PCR擴增產物，6為陰性對照；圖3.Cp4-epsps基因PCR擴增結果，圖中M為分子量標記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴增產物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴增產物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴增產物，5為本發明的方法抽提DNA的PCR擴增產物，6為陰性對照；圖4.Nos終止子基因PCR擴增結果，圖中M為分子量標記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴增產物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴增產物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴增產物，5為本發明的方法抽提DNA的PCR擴增產物，6為陰性對照；圖5.CaMV35S啟動子基因PCR擴增結果，圖中M為分子量標記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴增產物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴增產物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴增產物，5為本發明的方法抽提DNA的PCR擴增產物，6為陰性對照。
具體實施例方式
實施例1.
本實施例中所用的試劑除氯仿、乙醇、異戊醇、異丙醇為國產試劑外，其余試劑均為promega產品。
(一)CTAB法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。將粉末狀的干物質加入400μl預冷的CTAB提取緩沖液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90分鐘，其間不時輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存備用。
(二)Chelex直接煮沸法取0.1g大豆異黃酮粉末。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振蕩數分鐘，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm離心5min，上清液即可用于PCR。
(三)試劑盒法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。加入25ml正己烷，充分混合后2小時后，加入2.5ml BufferA后，再65℃水浴中加熱，并不斷混合，2小時后以12,000rpm離心10min，使有機相和水相分開，取水相并加入40μl(500ng/μl)鮭魚精DNA。加入與上清等體積的Buffer B，混勻，常溫放置10min后，12,000g離心5min，棄上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用槍頭將其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下顛倒充分混勻10次后，取出離心柱，將離心柱放置在一個2ml的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min；將離心柱和2ml套管一起用8000g離心30秒后，棄2ml套管中的溶液，在離心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前請按照試劑瓶上的提示加入乙醇)，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl WashBuffer II，8000g離心30秒后，棄去溶液；12,000g離心30秒，以除去離心柱中痕量殘余溶液；將離心柱放置在一個新的1.5ml離心管中，網離心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g離心30秒；若需提高得率，可用離心下來的50μl Elution Buffer重新進行洗脫，即37℃放置2min后，12,000g再離心30秒；離心管中的溶液即可作為PCR反應的模板，建議一個PCR反應使用2μl DNA，其余樣品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I(100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴預熱。將上述干物質在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60min(時間長，DNA產量高)，不時搖動。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10min，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。室溫下5000rpm離心5min。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置30min，用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以幫助溶解。將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min左右，12,000rpm離心10min，70％乙醇漂洗，將DNA重溶解于1ml TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃貯存。
(五)本發明的方法提取大豆異黃酮中提取殘留DNA的方法1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5分鐘；2)12,000rpm離心10min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。
(六)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增總反應體系為50μl，10μl上述四種方法所提取的不同來源的模板DNA，5μl10×PCR反應緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35次擴增反應循環，進行PCR。最后一輪循環結束后，于72℃下保溫10min，使反應產物擴增充分。
PCR擴增的引物分別為1.lectin基因Lec-F15’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’Lec-R15’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’2.35S-CTP基因SC-F15’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’SC-R15’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’3.Cp4-epsps基因CE-F15’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’CE-R15’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’4.Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’
Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’5.CaMV35S啟動子基因35S-F5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’35S-R5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’(七)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應的凝膠板；取10μl PCR產物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進行電泳；當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
實施例2.
(一)CTAB法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。將粉末狀的干物質加入400μl預冷的CTAB提取緩沖液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90分鐘，其間不時輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存備用。
(二)Chelex直接煮沸法取0.1g大豆異黃酮粉末。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振蕩數分鐘，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm離心5min，上清液即可用于PCR。
(三)試劑盒法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。加入25ml正己烷，充分混合后2小時后，加入2.5ml Buffer A后，再65℃水浴中加熱，并不斷混合，2小時后以12,000rpm離心10min，使有機相和水相分開，取水相并加入40μl(500ng/μl)鮭魚精DNA。加入與上清等體積的Buffer B，混勻，常溫放置10min后，12,000g離心5min，棄上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用槍頭將其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下顛倒充分混勻10次后，取出離心柱，將離心柱放置在一個2ml的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min；將離心柱和2ml套管一起用8000g離心30秒后，棄2ml套管中的溶液，在離心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前請按照試劑瓶上的提示加入乙醇)，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl WashBuffer II，8000g離心30秒后，棄去溶液；12,000g離心30秒，以除去離心柱中痕量殘余溶液；將離心柱放置在一個新的1.5ml離心管中，網離心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g離心30秒；若需提高得率，可用離心下來的50μl Elution Buffer重新進行洗脫，即37℃放置2min后，12,000g再離心30秒；離心管中的溶液即可作為PCR反應的模板，建議一個PCR反應使用2μl DNA，其余樣品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I(100mmol/L Tris.Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴預熱。將上述干物質在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60min(時間長，DNA產量高)，不時搖動。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10min，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。室溫下5000rpm離心5min。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置30min，用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以幫助溶解。將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min左右，12,000rpm離心10min，70％乙醇漂洗，將DNA重溶解于1ml TE緩沖液(10mmo/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃貯存。
(五)本發明的方法提取大豆異黃酮中提取殘留DNA的方法1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮10分鐘；2)12,000rpm離心15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。
(六)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增總反應體系為50μl，10μl上述四種方法所提取的不同來源的模板DNA，5μl10×PCR反應緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35次擴增反應循環，進行PCR。最后一輪循環結束后，于72℃下保溫10min，使反應產物擴增充分。
PCR擴增的引物分別為1.lectin基因Lec-F15’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’Lec-R15’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’2.35S-CTP基因SC-F15’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’SC-R15’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’3.Cp4-epsps基因CE-F15’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’CE-R15’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’4.Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’5.CaMV35S啟動子基因35S-F5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’35S-R5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’(七)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應的凝膠板；取10μl PCR產物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進行電泳；當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
權利要求
1.一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。其特征在于，方法的步驟為1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5-10分鐘；2)12,000rpm離心10-15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈式反應擴增。
2.根據權利要求1所述的一種從大豆異黃酮中分離殘留DNA的方法。其特征在于，所說Sephadex-G 25柱的制備方法為取10g Sephadex-G 25緩慢加入無菌的蒸餾水中反復洗滌，除去可溶性的葡聚糖，用TE緩沖液平衡凝膠，高壓滅菌15min，TE緩沖液為10mmo/L Tris堿，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH7.6；將0.45μm的微孔濾膜放入試管柱中，用Sephadex-G 50裝柱，1×TEN緩沖液平衡，不斷加入凝膠直至試管柱完全裝滿，1×TEN緩沖液為10mmol/L Tris堿，1mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L氯化鈉，pH8.0；1600g離心4min后，繼續補加凝膠使柱床體積達到0.9ml；將0.1ml 1×TEN緩沖液加入柱中，1600g離心4min，并重復2次，加滿1×TEN緩沖液密封4℃保存備用。
全文摘要
本發明公開了一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。方法的步驟為取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5－10min；12,000rpm離心10－15min，吸取上清液，Sephadex－G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。與常規DNA提取方法相比，該方法可快速從大豆異黃酮中分離殘留DNA，該技術流程可有效去除所得DNA中抑制PCR反應的抑制因子，可用于聚合酶鏈式反應的模板。該方法簡單、快速、成本低、靈敏度和檢出率高，所獲得的痕跡量DNA可用于定性和定量PCR擴增。該技術流程適用于轉基因農產品的多聚酶鏈式反應檢驗及相關領域，也可用于大豆異黃酮提取工藝的質控和優化。
文檔編號C07H1/06GK1660880SQ20041009315
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月17日 優先權日2004年12月17日
發明者李德葆, 董海濤, 戴承恩, 婁沂春, 姜玉新 申請人:浙江大學