專利名稱：穩(wěn)定的雜交體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到探針和樣品核酸的穩(wěn)定的雜交體的形成。另外本發(fā)明還涉及雜交體的形成中利用的探針、探針載體PCR用引物、以及它們的設計方法。
背景技術：
就象人類基因組計劃所代表的那樣，各種生物的基因正在被闡明，生命活動的機制、疾病、體質(zhì)等與基因的關系正在陸續(xù)被研究。而且通過了解基因有無和其存在量(表達量)，可以了解例如疾病等的更詳細的特征或類型、或有效的治療方法的選擇等。
研究檢體具有的特定基因的有無和其存在量的方法，以前就想出了很多方法，其中，作為應用范圍廣，不管檢測對象如何都適用的方法，廣泛應用選擇作為檢測對象的基因或核酸的特征部分序列，通過研究其部分序列的有無和量來確定其有無或存在量的方法。具體來說，通過準備相當于被選擇出來的部分序列的互補鏈的核酸序列(探針)，用某些手段檢測檢體和探針的雜交，研究檢體中核酸序列的有無的方法。
利用雜交的特定核酸的檢測方法不管是固相、還是液相都可以用。例如在液相中進行時，準備雙鏈形成時使分光特性變化的標記物質(zhì)結(jié)合的探針溶液，將該溶液添加到檢體中，通過測定其分光特性的變化研究檢體中特定核酸的有無的方法就是其中一例。
在固相上進行雜交時，代表性的方法是預先使探針固定或吸附于固相上，向該固相上添加通過某些可檢測的標記物質(zhì)標記的檢體，通過測定來自固相上的標記物質(zhì)的信號，進行檢測的方法。其中，探針固定在玻璃或金屬等平面基板上的微陣列、或固定于微小粒子表面的(磁)珠等是代表性的固相雜交方式。固相上雜交被優(yōu)選的理由是B/F分離容易，預期可以從物理上將檢測區(qū)域微小化，高靈敏度化，通過用物理方法將多種探針隔離，可同時進行多項目的檢測，由于是固相，所以其處理和應用都容易。
例如，在美國Affymetrix公司，使標記的核酸作用于平面基板上合成的寡DNA，通過熒光檢測對其雜交進行測定，檢測檢體中具有的特定核酸的有無和量(參照美國專利第6410229號說明書)。另外，富士膠片公司使用預先導入了氨基的基板制作DNA陣列，利用該陣列檢測標記的22mer單鏈DNA(參照特開2001-128683號公報)。
發(fā)明內(nèi)容
利用固相上雜交的檢測方法也象以往技術中所述的那樣，雖然與其他檢測方法相比，存在著高靈敏度的長處，但對于極微量的核酸檢測的需要要求進行比上述靈敏度高的更高靈敏度、而且高特異的檢測，不用說檢測方法還需要改良。
為了提高檢測性能，嘗試著從各種各樣的角度進行改善。作為改善方法，例如將捕獲靶的探針的Tm值增高，使探針與靶的結(jié)合力提高的方法。另外也采用使對靶的標記率提高的發(fā)出強信號的標記物質(zhì)結(jié)合，或標記物質(zhì)本身被多個標記物質(zhì)多次放大(增感劑)等方法。
然而提高探針結(jié)合力的方法有時會引起非特異的吸附或結(jié)合，使特異性大幅度降低，其效果是有限的。而改善標記方法的方法有時S/N比和定量性顯著降低，其效果仍然是有限的。
除了探針的改良和標記方法以外，作為改善雜交效率的方法，還有使探針和靶形成的雜交體穩(wěn)定的方法。為了使雜交體穩(wěn)定，需要使雜交反應的環(huán)境、即鹽濃度和變性劑濃度最優(yōu)化，但有時仍然出現(xiàn)特異性、S/N比降低等。
因此，強烈期盼在核酸檢測中更有效的穩(wěn)定的雜交體的形成方法、為此目的的探針設計方法、檢體制備方法等的開發(fā)。
為了解決上述課題反復進行了專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將固相上的探針以及探針進行雜交的樣品核酸設定在滿足特定條件的序列上的位置關系，探針和樣品核酸可以形成穩(wěn)定的雜交體。
本發(fā)明的雜交體，是樣品核酸的靶鏈具有的靶序列和與該靶序列互補的該探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體，其特征是上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將上述靶鏈的5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將上述靶鏈3′末端側(cè)的上述標記的序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
本發(fā)明涉及的探針是被設計成與具有靶序列的靶鏈形成上述雜交體的構(gòu)成的探針。
本發(fā)明涉及的探針組是具有2個以上上述探針的探針組，還有，本發(fā)明的探針載體是載體上總探針數(shù)的50％以上為上述探針組的探針載體。
本發(fā)明涉及的探針設計方法是將探針設計成相對于具有靶序列的靶鏈形成上述雜交體的構(gòu)成的探針設計方法。
本發(fā)明涉及的PCR用引物是制備成相對于上述探針可形成上述雜交體的構(gòu)成的樣品核酸的PCR用引物。
本發(fā)明涉及的樣品核酸的檢測方法是特征如下的檢測方法，即在通過使固定于固相的探針核酸與比該探針核酸還長的樣品核酸反應，對得到的雜交體進行檢測的樣品核酸檢測方法中，將上述探針核酸的序列設計成可形成滿足以下構(gòu)成(1)和(2)的雜交體(1)是上述核酸的靶鏈具有的靶序列和與該靶序列互補的該探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體，(2)上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將上述靶鏈的5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端側(cè)的上述標記的序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
本發(fā)明涉及的靶鏈是具有靶序列，和可作為與該靶序列互補的探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體的構(gòu)成的樣品核酸的靶鏈，
上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將上述靶鏈的5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端側(cè)的上述標記的序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
當該方法涉及的樣品核酸是以檢體核酸為模板的PCR擴增產(chǎn)物的情形時，最好是將該PCR用引物和上述探針設計成有可能形成滿足上述構(gòu)成(1)和(2)的雜交體。
本發(fā)明涉及的樣品核酸檢測用的試劑盒是特征如下的試劑盒在具有用于從檢體核酸使具有靶鏈(具有靶序列)的樣品核酸擴增的PCR用引物、和用于確認在以該檢體核酸為模板，使用該PCR用引物擴增的擴增產(chǎn)物中有無上述靶序列的固定于固相探針核酸的樣品核酸的檢測用試劑盒中，上述引物和上述探針核酸的序列被設計成可形成滿足以下構(gòu)成(1)和(2)的雜交體的序列。
(1)是上述探針核酸和樣品核酸通過該樣品核酸的靶鏈具有靶序列和與該靶序列互補的該探針核酸具有的探針序列形成的雜交部分結(jié)合的雜交體，(2)上述樣品核酸具有的靶鏈5′末端處于在上述靶序列5′側(cè)端部的5′方向上至少延長1個堿基的部分的前頭，而且、該靶鏈的3′末端處于上述靶序列的3′側(cè)端部，或處于從上述靶序列的3′側(cè)端部的3′方向至少延長1個堿基的部分，當將上述靶鏈5′末端的部分的堿基數(shù)表示為L1、將上述靶鏈3′末端的上述靶序列3′末端部分延長部分的堿基數(shù)表示為L2(但是，將上述靶鏈3′末端相當于上述靶序列3′側(cè)端部的情形定為L2＝0)時，L1/L2的值滿足0～1.5的關系。
本發(fā)明的雜交體只要是固定于固相的探針核酸和樣品核酸的雜交體，無論使用什么樣的組合都可以實施。其中，就象DNA微陣列所代表的那樣，使作為探針的寡核苷酸和cDNA等的DNA固定于平面基板上，使他們與通過可檢測的標志標記的樣品核酸雜交的雜交體就是本發(fā)明比較優(yōu)選的一個例子。
固定于固相上的探針可以通過各種各樣的方式進行固定，作為代表的固定方法有共價結(jié)合、離子結(jié)合、吸附等，本發(fā)明的雜交體無論用哪一種固定方法都可實施。
這些方法中，通過共價結(jié)合的固定方法比較難于受到伴隨雜交而發(fā)生的各種各樣的條件變化(例如，加熱或高鹽濃度)的影響，在形成穩(wěn)定的雜交體上是優(yōu)選的結(jié)合方式。作為共價結(jié)合的具體的結(jié)合方法，可以無限制地適用通過可導入到固相上的官能團和可導入核酸探針側(cè)的官能團的組合的各種結(jié)合方式，但在探針中使用合成寡核苷酸時，由于巰基和氨基、或其衍生物作為修飾官能團比較容易導入，所以經(jīng)常使用。其中，向寡核苷酸的5′末端或3′末端導入上述官能團的方法在合成上容易，通過在寡核苷酸末端修飾的官能團固定于固相的探針適合用于本發(fā)明的雜交體。而即使在5′末端、3′末端以外，將來自寡核苷酸序列中間部位的核酸的官能團或人工合成的核苷酸衍生物整合到樣品核酸中，也可以利用該官能團進行固定。
還有，DNA由于通過磷酸酯鍵形成其骨架，所以分子整體帶有負電荷，也有可能使其吸附于例如固相上導入了帶有正電荷的被覆劑或固相本體。
作為固定于固相的探針，可以使用具有各種各樣的鏈長的探針。鏈長會帶來特異性、結(jié)合力等各種特征，但具有15～30mer、31～50mer、51mer～80mer的各鏈長的寡核苷酸經(jīng)常用作固定于固相表面的探針，是適合用作構(gòu)成本發(fā)明雜交體的探針的堿基長度。
一般來說，作為探針經(jīng)常使用寡核苷酸等核酸，也可以使用可期待進行強雜交的肽核酸(PNA)作為探針，通過形成本發(fā)明的具有L1和L2關系的雜交體，可以形成更穩(wěn)定的雜交體。
L1和L2的關系只要是L1/L2的值滿足0～1.5的關系，就可以形成本發(fā)明的穩(wěn)定的雜交體。其中，L1/L2的值處于0～1范圍時可以形成更穩(wěn)定的雜交體。
樣品核酸可用于以作為檢查對象的檢體本身、或以用各種方法從檢體提取的核酸片段與探針的反應中，具有作為與探針進行雜交的部分的靶序列。該靶序列只要是可以特定假設有檢體的序列的序列就可以，由于樣品核酸的種類不同，可以是檢體中直接具有的作為檢測對象的序列的一部分本身，也可以是其互補序列。樣品核酸是含具有與探針進行雜交的靶序列(與探針具有的探針序列互補的序列)的靶鏈的核酸，例如、無論雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA哪一種核酸在適當?shù)臈l件下只要是可與固相探針雜交都適用于本發(fā)明。例如、單鏈DNA時，其自身就成了靶鏈。
另外，樣品核酸的制備方法可以沒有特別限制地運用，作為常用的制備方法，有PCR擴增法、RNA的逆轉(zhuǎn)錄，為了形成本發(fā)明的雜交體使用通過這些制備方法得到的PCR產(chǎn)物、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合適。
就象DNA微陣列等所代表的那樣，將固相上雜交用于特定堿基序列的檢測時，多數(shù)情況下都是使任一個標記物質(zhì)結(jié)合于樣品核酸，整合了標記物質(zhì)的樣品核酸都適合用于本發(fā)明的雜交體的形成。
作為標記物質(zhì)，一般常用處理容易，而且可高靈敏度檢測的熒光物質(zhì)，而利用放射線同位素標記在靈敏度方面優(yōu)越，也適合運用。利用熒光物質(zhì)時，熒光物質(zhì)的種類很多，可以使用任一種熒光色素，但廣泛應用的是Cy3和Cy5等熒光色素，都適合應用于本發(fā)明的雜交體。
雖然樣品核酸的鏈長可以沒有特別限制形成雜交體，但其中樣品核酸的鏈長在500bp以上時可以形成穩(wěn)定的雜交體。而當鏈長處于500bp以上2500bp以下時，可形成更穩(wěn)定的雜交體。
在本發(fā)明中，對為了與樣品核酸形成上述雜交體設計的探針提出了提案。即、對在樣品核酸中可形成本發(fā)明的雜交體的位置上設定探針捕捉區(qū)域，形成固相探針和樣品核酸具有本發(fā)明給出的位置關系的雜交體那樣的探針提出了提案。
另外，對由2個以上不同種類探針構(gòu)成的探針組也提出了提案。而當提供上述探針時，需要設計探針的序列等，也提出了為此目的的探針設計方法的提案。
為了有效利用用于靶核酸(序列)檢測的探針，為了使B/F分離容易進行，有時預先在固體載體上固定探針，為此，對在固體載體上固定至少一個以上本發(fā)明的探針的探針載體也提出了提案。如在固體載體上固定至少一個以上探針的探針載體DNA微陣列，DNA微陣列作為本發(fā)明的探針固定化載體是很合適的一個例子。
另外，作為樣品核酸象上述那樣經(jīng)常使用PCR產(chǎn)物，當制備PCR產(chǎn)物時，對滿足上述L1和L2條件設計的PCR用的引物也提出了提案。
通過本發(fā)明在固相上探針和樣品核酸形成雜交體中，可以得到更穩(wěn)定的雜交體，另外可以獲得其形成的條件。另外，一并提供滿足本發(fā)明條件的探針、引物、和他們的設計方法、以及這些雜交體形成的相應的探針載體。通過本發(fā)明在固相上利用雜交的核酸檢測方法中，可以進行有效而且高靈敏度的檢測。
附圖的簡單說明
圖1是表示固定于固相的A鏈探針和作為樣品核酸的B鏈的雜交體的圖。在樣品核酸中由雜交體形成部分開始的5′側(cè)的堿基鏈長用B5表示，而3′側(cè)的堿基鏈長用B3表示。
圖2是表示pUC118 EcoRI/BAP中3個引物的位置的圖，箭頭表示在各個引物中5′至3′的方向。
圖3是表示在pUC118 EcoRI/BAP中3個引物、和3個探針的圖。
圖4是表示在pUC118 EcoRI/BAP中，由正向引物F1至F8、反向引物R1至R7、共計15種引物的位置關系的圖，箭頭表示在各個引物中5′至3′的方向。
圖5是表示在pUC118 EcoRI/BAP中各引物、和3個探針的位置關系的圖。
圖6是在25mer的探針中輝度值對L1/L2作圖得到的曲線圖。
圖7是在40mer的探針中輝度值對L1/L2作圖得到的曲線圖。
圖8是在60mer的探針中輝度值對L1/L2作圖得到的曲線圖。
圖9是表示固定了3′末端的探針和靶鏈的雜交體、以及L1、L2的位置關系的圖。
圖10是在3′末端固定的25mer的探針中輝度值對L1/L2作圖得到的曲線圖。
具體實施例方式
就本發(fā)明的雜交體進行更詳細說明。
通過本發(fā)明提供的雜交體是探針和在序列的一部分具有互補序列的樣品核酸形成的雜交體，位于樣品核酸的捕捉對象區(qū)域的5′側(cè)的堿基數(shù)作為L1，位于3′側(cè)的堿基數(shù)作為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系的雜交體。圖1表示5′末端固定于固相的單鏈探針(A鏈)與具有互補序列的單鏈核酸(B鏈)的雜交體的模式圖。在該圖中，將B鏈的探針結(jié)合區(qū)域的5′側(cè)的堿基鏈長作為B5(L1)，3′側(cè)的堿基鏈長作為B3(L2)時，具有B5≤B3的關系的雜交體是表示本發(fā)明的一個例子的雜交體。
只要L1/L2的值為0～1.5，就可以形成本發(fā)明的穩(wěn)定雜交體，為了形成更穩(wěn)定的雜交體，優(yōu)選L1/L2的值處于0～1范圍。
探針只要是被固定在任一固相上或固相表面，對其固定形式?jīng)]有限制，可以形成本發(fā)明的雜交體。其中，玻璃基板上固定了核酸的DNA微陣列是其代表例，各種各樣的DNA微陣列可以運用于本發(fā)明的雜交體。作為可用于固相的材料，除了玻璃以外，也可以運用樹脂、金屬、金屬薄膜、纖維等，另外對其形式，沒有限制，可以使用微粒子、光纖維頂端、多孔材料、纖維等。
作為結(jié)合方式，存在著吸附、化學結(jié)合等各種各樣的方式，任一種結(jié)合方式都可以形成雜交體。例如、在用于解決課題的手段中記載的離子結(jié)合中，對于被覆著氨基的玻璃基板或樹脂表面，僅提供給通常的核酸，就可以使其進行離子結(jié)合。
另外，使用對處于5′末端、3′末端、或序列中部的巰基、氨基等官能團進行修飾的修飾寡核苷酸，利用導入的官能團的反應也可以進行固定化。例如利用氨基時，可以預先使與處于固相表面的氨基有效反應的琥珀酰亞胺基結(jié)合、通過將位于5′末端或3′末端等的氨基進行修飾的寡核苷酸供給給固相表面，可以很容易形成共價鍵，適合用作構(gòu)成本發(fā)明雜交體的探針。
而在使用巰基時，例如，通過使馬來酰亞胺基結(jié)合于固相，與使用氨基時同樣，容易形成共價結(jié)合，適合用作本發(fā)明的雜交體。
作為探針的種類，除了DNA等之外，也可以使用PNA等。作為探針也可以使用cDNA等，為了形成精度更高的雜交體，在探針中多使用通過化學手法合成的寡核苷酸，作為該探針的堿基鏈長，根據(jù)探針各自的特性經(jīng)常利用15～30mer、31～50mer、51～80mer的探針。
形成本發(fā)明的雜交體的樣品核酸只要是比固相上的探針鏈長長，可以沒有特別限制地用于本發(fā)明的雜交體。
本發(fā)明的雜交體適用于DNA微陣列、(磁)株等上的核酸序列的檢測。此時，樣品核酸經(jīng)常使用通過PCR擴增的PCR產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄物、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等，這些核酸適用于本發(fā)明的雜交體。即、樣品核酸無論雙鏈、還是單鏈都可以，另外無論是DNA、還是RNA也都可以形成本發(fā)明的雜交體。
另外，利用分光學手法對雜交體的形成進行檢測時，有時需要用任一標記物質(zhì)、例如熒光物質(zhì)對樣品核酸進行標記，具有這樣標記物質(zhì)的樣品核酸也可以形成本發(fā)明的雜交體。其中，以Cy3、Cy5為代表的Cy Dye(Amersham Pharmacia生產(chǎn))經(jīng)常用作核酸標記用的熒光物質(zhì)，具有這些熒光物質(zhì)的樣品核酸可以沒有任何問題適用于本發(fā)明的雜交體。
另外，作為具有與熒光物質(zhì)同一水平的檢測靈敏度的標記材料也經(jīng)常使用32P等放射性同位素等，此時，本發(fā)明的雜交體也可以充分形成。
本發(fā)明的雜交體不管樣品核酸的鏈長多長，都可以形成，其中500bp以上時可形成穩(wěn)定的雜交體，具有500bp以上，2500bp以下的鏈長的樣品核酸可以形成更穩(wěn)定的雜交體。
樣品核酸例如為雙鏈DNA時，與探針形成雜交體部分以外的部分有時樣品核酸本身也可與其互補鏈形成雙鏈，即使是那樣的場合也可能形成本發(fā)明的雜交體。即，固相上探針和樣品核酸形成雜交體中，只要是存在具有上述的L1和L2關系的部分，形成本發(fā)明所示的穩(wěn)定性高的雜交體也是可能的。
即使是當探針和樣品核酸的雙鏈形成部分的鏈長比探針長度還短時，即，探針以包含錯配的方式與樣品核酸形成雜交體的情形，穩(wěn)定的雜交體的形成也是可能的(樣品核酸)。此時，將核酸的5′末端至雙鏈形成部分的末端部分的鏈長作為L1，而將3′末端至同一雙鏈形成部分的末端部分的鏈長作為L2，只要是滿足上述L1和L2的關系，都可以形成本發(fā)明的雜交體。
識別特定堿基序列，用于通過與固相上探針形成雜交體，檢測對象物有無的探針往往是考慮到可以特異而且高靈敏度檢測樣品核酸后設計的。這些設計方法中的很多方法，由于只用于設計堿基序列，雖然在液相系雜交中可進行有效設計，但對于在固相上的雜交，未必進行最適合的探針設計。本發(fā)明的雜交體形成條件提供與固相上的雜交體穩(wěn)定性相關的指標。在此，本發(fā)明中也提出了在固相上探針的設計中滿足先前例舉的條件的探針設計方法。
另外，也提出了通過該探針設計方法設計的探針。還提出了這些探針2個以上匯集的探針組。
作為多個不同種類探針被固定于固體載體上的探針載體的一個例子，如DNA微陣列，作為構(gòu)成這樣的探針載體的探針，利用本發(fā)明的探針時，載體上的總探針數(shù)中的50％以上優(yōu)選是由本發(fā)明的探針構(gòu)成，而70％以上構(gòu)成比率更優(yōu)選。在本發(fā)明中也提出了固定了那樣多個探針(探針組)探針載體的提案。
滿足條件的探針數(shù)的比例只要是在50％以上就可以，75％以上優(yōu)選。
樣品核酸為PCR產(chǎn)物等時，樣品核酸序列中相對的探針區(qū)域可以通過設計的用于實施PCR擴增的引物的設計改變。樣品核酸的堿基序列中可選作為探針區(qū)域的部分希望按照滿足上述條件那樣進行設計，但從特異性等觀點考慮，有時未必在這樣的條件下設定探針。此時，對探針區(qū)域進行設定時，只要進行探針區(qū)域滿足權(quán)利要求1的條件的那樣的樣品核酸的引物設定就可以。在本發(fā)明中也提出了用于針對設定的探針區(qū)域形成滿足上述條件的那樣雜交體的樣品核酸擴增用引物的提案。
實施例以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。但是，以下所述實施例是本發(fā)明涉及到的最好的實施方式的一個例子，本發(fā)明的技術范圍并不限定于這些實施例。
I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR(1)引物的設計作為具有檢查對象的序列的檢體的標本，選擇市售的Takara公司生產(chǎn)的載體pUC118 EcoRI/BAP(全長3162bp)，由其堿基序列中設計具有下面序列的3種引物。而有關pUC118 EcoRI/BAP的全堿基序列情報是由Takara公司提供的，另外由公開的數(shù)據(jù)庫等也可以獲得。
在進行引物設計時，要充分照顧到pUC118 EcoRI/BAP中的所期望的部分堿基序列要能夠通過PCR擴增特異而且有效地被擴增、配列、GC％、融解溫度(Tm值)之后進行設計。
設計的引物正向側(cè)(F)2種、反向側(cè)(R)1種，共計3種。通過以pUC118 EcoRI/BAP作為模板，使用F1和R1、或F2和R1的組合進行PCR擴增，應當可以擴增到分別為1324bp(PCR產(chǎn)物1)、940bp(PCR產(chǎn)物2)的PCR產(chǎn)物。表1給出了設計的引物的堿基序列和Tm值。
表1
另外，圖2給出了3種引物在pUC118 EcoRI/BAP全長中的位置。而在該圖中，箭頭表示的方向是各引物鏈的5′末端至3′末端的方向。
(2)引物的合成合成實施例1的(1)中設計的3種引物。各引物的合成根據(jù)通用的方法利用DNA合成儀合成具有各個堿基序列的DNA鏈。純化通過cartridge純化進行，得到3種引物。得到的引物用TE緩沖液稀釋到10μM濃度。
(3)PCR擴增反應使用實施例1的(2)中合成的3種引物、作為模板DNA的Takara公司生產(chǎn)載體pUC118 EcoRI/BAP、和QIAGEN公司生產(chǎn)PCR試劑盒HotStarTaq Master Mix進行PCR擴增反應。在Master Mix中具有dATP、dCTP、dTTP、dGTP 4種脫氧核苷酸，為了通過熒光標記對PCR產(chǎn)物進行標記，加入Amersham Pharmacia公司生產(chǎn)的Cy3dUTP，通過Cy3對PCR產(chǎn)物進行標記。
作為正向引物和反向引物的組合，用(1)中所述2組組合進行PCR擴增。PCR的反應條件按照下面的程序，制備下面表2所示組成的反應液(1)和(2)。
表2反應液組成
關于制備的反應液，使用市售的熱循環(huán)儀按照下面表3的溫度循環(huán)程序進行PCR擴增反應。即、95℃/保持15分后、每一個循環(huán)為92℃(變性)/45秒、55℃(退火)/45秒和72℃(延伸)/45秒，進行25循環(huán)，最后，72℃/保持10分。
表3PCR擴增反應的溫度條件
擴增反應結(jié)束后、PCR擴增產(chǎn)物用純化用柱(Qiagen QIAquickPCR Purification Kit)進行純化。純化后，將PCR擴增產(chǎn)物溶液的液量調(diào)整到50μl。取得到的純化后PCR擴增產(chǎn)物溶液的一部分，按照通常的方法進行電泳，確認在2種PCR產(chǎn)物(1)和(2)中分別出現(xiàn)具有所期望的堿基長度的帶。
II.DNA微陣列的制作(1)探針的設計和合成對于上述PCR產(chǎn)物1設計了3種探針。探針設計與引物的設計同樣，進行設計時要充分考慮到各探針要可以特異識別在PCR產(chǎn)物(1)中選擇的部分堿基序列(靶序列)，另外GC％、雜交體的融解溫度(Tm值)要相同。
表4示出了設計的探針的堿基序列和Tm值。
表4
在該探針設計中，與探針雜交、與探針形成雜交體的是由R1引物延伸的DNA鏈。
而P2和P3作為探針也可以與PCR產(chǎn)物2形成雜交體。
表5示出了在PCR產(chǎn)物1以及2和各探針的雜交體中，將存在于雜交體部的5′側(cè)的靶鏈的鏈長作為L1，將存在于3′側(cè)的鏈長作為L2，對于各PCR產(chǎn)物的各探針的L1、L2和L1/L2的值。
表5
圖3示出了在pUC118 EcoRI/BAP全長中的3種探針、3種引物的位置。
(2)玻璃基板的清洗將合成石英的玻璃基板(大小(W×L×T)25mm×75mm×1mm、飯山特殊玻璃公司生產(chǎn))放入耐熱、耐堿性的槽中，浸入到調(diào)整到所定濃度的超音波清洗用的洗滌液中。于洗滌液中浸泡過夜后，進行20分鐘的超音清洗。然后取出玻璃基板，輕輕地用純水涮涮后，于超純水中進行20分鐘超音清洗。然后將玻璃基板在加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。再次進行純水清洗和超純水清洗，準備DNA微陣列用的洗滌過的石英玻璃基板。
(3)表面處理將硅烷耦合劑KBM-603(信越硅公司生產(chǎn))溶解于純水中使其濃度變?yōu)?％，于室溫下攪拌2小時。然后將洗滌過的石英玻璃基板浸泡于該硅烷耦合劑水溶液中，于室溫下放置20分鐘。提出玻璃基板，用純水輕輕清洗表面后，用氮氣吹玻璃基板的兩面，使其干燥。然后，將氮氣流干燥的玻璃基板在加熱到120℃的烘箱中焙烘1小時，使耦合劑處理完結(jié)。通過該耦合劑處理，來自硅烷耦合劑的氨基被導入到玻璃基板表面。
另一方面，準備將同仁化學研究所公司生產(chǎn)的N-馬來酰亞胺己氧基琥珀酰亞胺(N-(6-Malemidocaproyloxy)Succinimido)；以下、略稱為EMCS)溶解于二甲亞砜和乙醇的1∶1混合溶劑中，使其最終濃度為0.3mg/ml的EMCS溶液。焙烘結(jié)束后、將耦合劑處理后的玻璃基板放冷，在室溫下在制備的EMCS溶液中浸漬2小時。在浸漬處理期間，導入到耦合劑處理過的玻璃基板表面的氨基和EMCS的琥珀酰亞胺基反應，將來自EMCS的馬來酰亞胺基導入到玻璃基板表面。將從EMCS溶液撈出的玻璃基板用上述的二甲亞砜和乙醇的混合溶劑洗滌，再用乙醇洗滌后，于氮氣氛圍下干燥。
(4)探針用DNA的合成合成上述(1)中設計的3種探針。
為了使探針DNA與上述表面導入了馬來酰亞胺基的玻璃基板共有結(jié)合，根據(jù)通用的方法對5′末端實施巰基化處理。然后，為了避免DNA合成時的副反應，脫去實施保護的保護基，再實施HPLC純化和脫鹽處理。
得到的探針DNA溶解于純水中，分別使最終濃度(墨水溶解時)為10μM那樣分注后，進行冷凍干燥，除去水分。
(5)由BJ打印機吐出的探針DNA、以及與基板表面結(jié)合準備含有甘油7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％、尿素7.5重量％、アセチレノ一ルEH(川研フアインケミカル公司生產(chǎn))1.0重量％的水溶液。然后將分注的探針DNA溶解于上述混合溶劑中使之達到規(guī)定濃度(10μM)。將得到的探針DNA溶液充填到BJ打印機(商品名BJF-850，佳能公司生產(chǎn))的墨盒中，裝到印字頭上。
而上述BJ打印機可以改造成可向平板進行噴墨印刷的機器。而改造的泡(霧)噴射印刷機可以按照所定的膜作成方法，通過輸入印字圖形，在約120μM間距點印約5pl的DNA溶液液滴。
然后，使用這個改造的泡(霧)噴射印刷機，進行將探針DNA溶液點印到玻璃基板表面的操作。每1枚DNA微陣列，對于每個探針進行16點的吐出那樣預先做成印字的圖案，進行噴墨印字。用放大鏡等確認DNA溶液確實點印到目的圖案后，于常溫下，在加濕盒內(nèi)靜置30分鐘，使玻璃基板表面的馬來酰亞胺基和探針DNA5′末端的巰基反應。
(6)洗滌在加濕盒內(nèi)進行30分鐘反應后，用具有100mm的NaCl的10mm磷酸緩沖液(pH7.0)將殘留在玻璃基板表面的未反應的探針DNA沖洗掉。得到在玻璃基板表面按照1枚16點，所定的單鏈探針DNA各個被固定了的DAN微陣列。
III.雜交反應使用II中制作的DNA微陣列和作為樣品核酸檢體在I中制作的PCR擴增產(chǎn)物，在微陣列上進行雜交。
(1)DNA微陣列的封閉將BSA(牛血清清蛋白Fraction VSigma公司生產(chǎn))按照終濃度為1重量％那樣溶解于100mM NaCl/10mM磷酸緩沖液，將II制作的DNA微陣列于室溫下在上述溶液浸泡2小時，對玻璃基板面進行封閉。封閉結(jié)束后，用含有0.1重量％SDS(十二烷基硫酸鈉)的2×SSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate(Trisodium CitrateDihydrate，C6H5NA3·2H2O)30mM、pH7.0)進行清洗后，用純水輕洗。然后用旋轉(zhuǎn)干燥裝置除去DNA微陣列的水分。
(2)雜交溶液的制備在各PCR產(chǎn)物按照相互等摩爾那樣制備后，用PCR擴增產(chǎn)物溶液將最終濃度做成如下構(gòu)成的對于各PCR產(chǎn)物的雜交溶液。
<雜交溶液>
6×SSPE/10％Form Amide/PCR擴增產(chǎn)物溶液(6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、pH7.4)(3)雜交將除去水分后的DNA微陣列放置在雜交裝置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中，使用上述組成的雜交溶液，按照下面步驟·條件進行雜交反應。
<雜交條件·步驟>
將上述雜交溶液加熱到65℃并保持3分鐘后，再于92℃保持2分鐘、然后在55℃下保持4小時。完成上述操作后，用2×SSC和0.1％SDS于25℃下進行清洗。再用2×SSC于20℃下進行清洗，根據(jù)需要，可以按照通常的指南用純水輕洗，最后用旋轉(zhuǎn)干燥裝置除去水分，使其干燥。
表6
(4)熒光測定雜交反應結(jié)束后，對于旋轉(zhuǎn)干燥過的DNA微陣列使用DNA微陣列用熒光檢測裝置(Axon公司生產(chǎn)、Genepix4000B)，測定來自雜交體的熒光。下面表7示出了對應于各探針的PCR擴增產(chǎn)物1、2的熒光輝度的測定結(jié)果。
在計算輝度時，將在DNA微陣列上沒有探針DNA點的部分處觀測的熒光強度作為背景值，由從各個點的外表的熒光強度扣除背景值的值作為熒光強度的實測值。而測定進行了2次，給出了他的平均值。
表7
由該結(jié)果可知，即使是對于同一樣品核酸設計成具有幾乎同一的Tm值的探針，熒光輝度值差異也很大，即穩(wěn)定性有很大差別。熒光輝度值上升表明形成的雜交體更多，即，表明雜交體穩(wěn)定。另外，位于雜交體形成部的5′側(cè)、3′側(cè)的部分的堿基鏈長比(L1/L2)不同，雜交體的穩(wěn)定性也不同，特別是5′側(cè)的堿基鏈長比3′側(cè)的堿基鏈長短時可形成更穩(wěn)定的雜交體。
實施例2I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR(1)引物的設計作為具有檢查對象的序列的檢體的標本，選擇市售的Takara公司生產(chǎn)的載體pUC118 EcoRI/BAP(全長3162bp)，由其堿基序列中設計具有下面序列的3種引物。而有關pUC118 EcoRI/BAP的全堿基序列情報是由Takara公司提供的，另外由公開的數(shù)據(jù)庫等也可以獲得。
在進行引物設計時，要充分照顧到pUC118 EcoRI/BAP中的所期望的部分堿基序列要能夠通過PCR擴增特異而且有效地擴增，配列、GC％、融解溫度(Tm值)后進行設計。
設計的引物正向側(cè)(F)8種、反向側(cè)(R)7種，共計15種。通過以pUC118 EcoRI/BAP作為模板，使用正向側(cè)和反向側(cè)的引物各一種的組合進行PCR擴增，應當可以擴增到104bp至2345bp的各種各樣鏈長的PCR產(chǎn)物。表8示出了設計的引物的堿基序列和Tm值。
表8名稱 序列(5′→3′)FP1CTTAATCGCCTTGCAGCACATCSEQ ID NO7FP2TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGSEQ ID NO8FP3GAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTSEQ ID NO9FP4TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTSEQ ID NO10FP5CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCASEQ ID NO11FP6GCATCTTACGGATGGCATGACASEQ ID NO12FP7TGAAGCCATACCAAACGACGAGSEQ ID NO13FP8TTACTCTAGCTTCCCGGCAACASEQ ID NO14RP1TTCGGTGATGACGGTGAAAACCSEQ ID NO15RP2ACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCASEQ ID NO16RP3ATCAGCAATAAACCAGCCAGCCSEQ ID NO17RP4TACGGGAGGGCTTACCATCTG
SEQ ID NO18RP5CATCCATAGTTGCCTGACTCCCSEQ ID NO19RP6ACGCTCAGTGGAACGAAAACTCSEQ ID NO20RP7GCGCCTTATCCGGTAACTATCGSEQ ID NO21另外，圖4示出了15種引物在pUC118 EcoRI/BAP全長中的位置。而在該圖中，箭頭表示的方向是各引物鏈的5′末端至3′末端的方向。
(2)引物的合成合成實施例2的(1)中設計的15種引物。各引物的合成根據(jù)通用的方法利用DNA合成儀合成具有各個堿基序列的DNA鏈。純化通過cartridge純化進行，得到15種引物。得到的引物用TE緩沖液稀釋到10μM濃度。
(3)PCR擴增反應使用實施例2的(2)中合成的15種引物、作為模板基因DNA的Takara公司生產(chǎn)載體pUC118 EcoRI/BAP、和Invitrogen公司生產(chǎn)PCR試劑盒AccuPrime Taq DNA Polymerase System進行PCR擴增反應。在AccuPrime的試劑盒含有的專用的緩沖液中具有dATP、dCTP、dTTP、dGTP的4種脫氧核苷酸，為了通過熒光標記對PCR產(chǎn)物進行標記而加的Amersham Pharmacia公司生產(chǎn)的Cy3dUTP，進行PCR擴增反應。
就象表9所示那樣，將正向引物和反向引物組合成24種組合，每一種組合都進行PCR擴增反應。
表9No. 正向引物反向引物 PCR產(chǎn)物的長度1 FP1 RP18112 FP1 RP213363 FP1 RP417864 FP1 RP620195 FP1 RP723456 FP2 RP413987 FP2 RP719578 FP3 RP410149 FP3 RP6124710 FP3 RP7157311 FP4 RP490912 FP5 RP364013 FP5 RP471414 FP6 RP336715 FP6 RP444116 FP6 RP7100017 FP7 RP319018 FP7 RP426419 FP7 RP530520 FP7 RP649721 FP8 RP310422 FP8 RP417823 FP8 RP521924 FP8 RP6411反應條件按照下面的程序進行下面表10所示組成的反應液的制備。
表10
關于制備的反應液使用市售的熱循環(huán)儀，按照下面表11的溫度循環(huán)程序進行PCR擴增反應。即、94℃/保持2分鐘后，按照一個循環(huán)為92℃(變性)/30秒、55℃(退火)/45秒、和72℃(延伸)/60秒進行30循環(huán)、最后，72℃/保持10分鐘。
表11
擴增反應結(jié)束后、PCR擴增產(chǎn)物用純化用柱(Qiagen QIAquickPCR Purification Kit)進行純化。純化后，將PCR擴增產(chǎn)物溶液的液量調(diào)整到50μl。取得到的純化過的PCR擴增產(chǎn)物溶液的一部分，按照通用的方法進行電泳，確認在24種PCR產(chǎn)物中分別出現(xiàn)了具有所期望的堿基長度的帶和各PCR產(chǎn)物的生成量。
II.DNA微陣列的制作(1)探針的設計為了檢測上述24種PCR產(chǎn)物，針對pUC118 EcoRI上的3個區(qū)域設計探針。圖5示出了pUC118 EcoRI上的探針區(qū)域。對于3個區(qū)域中的各區(qū)域設計鏈長不同的3個探針。鏈長為25mer、40mer、60mer的3種。探針設計與引物的設計同樣，各探針選擇可以特異識別檢體中選擇的部分堿基序列(靶序列)的那樣序列，另外對于各探針都要充分照顧到GC％、融解溫度(Tm值)一致后進行設計。
表12示出了共計9種設計的探針的名稱、堿基序列、和Tm值。
表12名稱序列(5′→3′) Tm值A25 ATG GTG CAC TCT CAG TAC AAT CTG G 75.7SEQ ID NO22B25 GTG GGT TAC ATC GAA CTC GAT CTC A 75.8SEQ ID NO23C25 GAT AAA GTT GCA GGA CCA CTT CTG C 75.7SEQ ID NO24A40 ATG GTG CAC TCT CAG TAC AAT CTG CTC TGA TGC CGC ATA G 80.7SEQ ID NO25B40 AGT TGG GTG CAC GAG TGG GTT ACA TCG AAC TGG ATC TCA A 80.9SEQ ID NO26C40 TAG ACT GGA TGG AGG CGG ATA AAG TTG CAG GAC CAC TTC T 80.8SEQ ID NO27A60 TTT TAT GGT GCA CTC TCA GTA CAA TCT GCT CTG ATG CCG CAT 83.3AGT TAA GCC AGC CCC GACSEQ ID NO28
B60 GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT CTC AAC AGC GGT AAG ATC83.3CTTGAGAGTTTT CGC CCC GAASEQ ID NO29C60 CTT CCC GGC AAC AAT TAA TAG ACT GGA TGG AGG CGG ATA83.3AAG TTG CAG GAC CAC TTC TGCSEQ ID NO30上述探針在pUC118 EcoRI序列上，由于是處于與正向引物相同的序列上的序列，與該探針雜交形成雙鏈的是作為互補鏈的反向引物側(cè)的序列(反向引物延伸鏈)。
在各PCR產(chǎn)物(靶鏈)與各探針的雜交體中，將存在于雜交體部的5′側(cè)的靶鏈的鏈長作為L1，將存在于3′側(cè)的鏈長作為L2，表中示出了對于各PCR產(chǎn)物的各探針的L1、L2以及L1/L2的值。表13給出了25mer的探針A25、B25、C25，表14給出了40mer的探針，表15示出了60mer的探針。
表13No.正向引物反向引物探針PCR產(chǎn)物的長度L1(bp)L2(bp)L1/L21 FP1 RP1 A25 811 152 634 0.242 FP1 RP2 A25 1336 677 634 1.073 FP1 RP2 B25 1336 169 1142 0.154 FP1 RP4 A25 1786 1127 634 1.785 FP1 RP4 B25 1786 619 1142 0.546 FP1 RP4 C25 1786 109 1652 0.077 FP1 RP6 A25 2019 1360 634 2.158 FP1 RP6 B25 2019 852 1142 0.759 FP1 RP6 C25 2019 342 1652 0.2110 FP1 RP7 A25 2345 1686 634 2.66
11 FP1 RP7 B25 2345 1178 1142 1.0312 FP1 RP7 C25 2345 668 1652 0.4013 FP2 RP4 A25 1398 1127 246 4.5814 FP2 RP4 B25 1398 619 754 0.8215 FP2 RP4 C25 1398 109 1264 0.0916 FP2 RP7 A25 1957 1686 246 6.8517 FP2 RP7 B25 1957 1178 754 1.5618 FP2 RP7 C25 1957 668 1264 0.5319 FP3 RP4 B25 1014 619 370 1.6720 FP3 RP4 C25 1014 109 880 0.1221 FP3 RP6 B25 1247 852 370 2.3022 FP3 RP6 C25 1247 342 880 0.3923 FP3 RP7 B25 1573 1178 370 3.1824 FP3 RP7 C25 1573 668 880 0.7625 FP4 RP4 B25 909 619 265 2.3426 FP4 RP4 C25 909 109 775 0.1427 FP5 RP3 B25 640 545 707.7928 FP5 RP3 C25 640 35580 0.0629 FP5 RP4 B25 714 619 708.8430 FP5 RP4 C25 714 109 580 0.19931 FP6 RP3 C253367 35307 0.1132 FP6 RP4 C25 441 109 307 0.3633 FP6 RP7 C25 1000 668 307 2.1834 FP7 RP3 C25 190 35130 0.2735 FP7 RP4 C25 264 109 130 0.8436 FP7 RP5 C25 305 150 130 1.1537 FP7 RP6 C25 497 342 130 2.6338 FP8 RP3 C25 104 35440.8039 FP8 RP4 C25 178 109 442.48
40 FP8 RP5 C25 219 150 443.4141 FP8 RP6 C25 411 342 447.7表14No.正向引物反向引物探針PCR產(chǎn)物的長度L1(bp)L2(bp)L1/L21 FP1 RP1 A40 811 137 634 0.222 FP1 RP2 A40 1336 662 634 1.043 FP1 RP2 B40 1336 168 1128 0.154 FP1 RP4 A40 1786 1112 634 1.755 FP1 RP4 B40 1786 618 1128 0.556 FP1 RP4 C40 1786 111 1635 0.077 FP1 RP6 A40 2019 1345 634 2.128 FP1 RP6 B40 2019 851 1128 0.759 FP1 RP6 C40 2019 344 1635 0.2110 FP1 RP7 A40 2345 1671 634 2.6411 FP1 RP7 B40 2345 1177 1128 1.0412 FP1 RP7 C40 2345 670 1635 0.4113 FP2 RP4 A40 1398 1112 246 4.5214 FP2 RP4 B40 1398 618 740 0.8415 FP2 RP4 C40 1398 111 1247 0.0916 FP2 RP7 A40 1957 1671 246 6.7917 FP2 RP7 B40 1957 1177 740 1.5918 FP2 RP7 C40 1957 670 1247 0.5419 FP3 RP4 B40 1014 618 356 1.7420 FP3 RP4 C40 1014 111 863 0.1321 FP3 RP6 B40 1247 851 356 2.3922 FP3 RP6 C40 1247 344 863 0.4023 FP3 RP7 B40 1573 1177 356 3.3124 FP3 RP7 C40 1573 670 863 0.78
25 FP4 RP4 B40 909 618 251 2.4626 FP4 RP4 C40 909 111 758 0.1527 FP5 RP3 B40 640 545 707.7928 FP5 RP3 C40 640 37563 0.0729 FP5 RP4 B40 714 618 5611.0430 FP5 RP4 C40 714 111 563 0.2031 FP6 RP3 C40 367 37290 0.1332 FP6 RP4 C40 441 111 290 0.3833 FP6 RP7 C40 1000 670 290 2.3134 FP7 RP3 C40 190 37113 0.3335 FP7 RP4 C40 264 111 113 0.9836 FP7 RP5 C40 305 152 113 1.3537 FP7 RP6 C40 497 344 113 3.0438 FP8 RP3 C40 104 37271.3739 FP8 RP4 C40 178 111 274.1140 FP8 RP5 C40 219 152 275.6341 FP8 RP6 C40 411 344 2712.表15No.正向引物反向引物探針PCR產(chǎn)物的長度L1(bp)L2(bp)L1/L21 FP1 RP1 A60 811 115 636 0.182 FP1 RP2 A60 1336 640 636 1.013 FP1 RP2 B60 1336 148 1128 0.134 FP1 RP4 A60 1786 1090 636 1.715 FP1 RP4 B60 1786 598 1128 0.536 FP1 RP4 C60 1786 911635 0.067 FP1 RP6 A60 2019 1323 636 2.088 FP1 RP6 B60 2019 831 1128 0.749 FP1 RP6 C60 2019 324 1635 0.20
10 FP1 RP7 A60 2345 1649 636 2.5911 FP1 RP7 B60 2345 1157 1128 1.0312 FP1 RP7 C60 2345 650 1635 0.4013 FP2 RP4 A60 1398 1090 248 4.4014 FP2 RP4 B60 1398 598 740 0.8115 FP2 RP4 C60 1398 911247 0.0716 FP2 RP7 A60 1957 1649 248 6.6517 FP2 RP7 B60 1957 1157 740 1.5618 FP2 RP7 C60 1957 650 1247 0.5219 FP3 RP4 B60 1014 598 356 1.6820 FP3 RP4 C60 1014 91863 0.1121 FP3 RP6 B60 1247 831 356 2.3322 FP3 RP6 C60 1247 324 863 0.3823 FP3 RP7 B60 1573 1157 356 3.2524 FP3 RP7 C60 1573 650 863 0.7525 FP4 RP4 B60 909 598 251 2.3826 FP4 RP4 C60 909 91758 0.1227 FP5 RP3 B60 640 524 569.3628 FP5 RP3 C60 640 17563 0.0329 FP5 RP4 B60 714 598 5610.6830 FP5 RP4 C60 714 91563 0.1631 FP6 RP3 C60 367 17290 0.0632 FP6 RP4 C60 441 91290 0.3133 FP6 RP7 C60 1000 650 290 2.2434 FP7 RP3 C60 190 17113 0.1535 FP7 RP4 C60 264 91113 0.8136 FP7 RP5 C60 305 132 113 1.1737 FP7 RP6 C60 497 324 113 2.8738 FP8 RP3 C60 104 17270.63
39 FP8 RP4 C60 178 91273.3740 FP8 RP5 C60 219 132 274.8941 FP8 RP6 C60 411 324 2712.00(2)微陣列的制作從上述探針的合成至微陣列制作都象實施例1那樣進行。在本實施例中，對于9種探針的每一個都制作了微陣列。與實施例1同樣，1枚微陣列上固定了16點。
III.雜交反應使用II制作的DNA微陣列和作為樣品核酸檢體在I制作的24種PCR擴增產(chǎn)物，在微陣列上進行表13至表15記載的全部243種雜交。
(1)DNA微陣列的封閉象實施例1那樣用BSA進行封閉。
(2)雜交溶液的制備在各PCR產(chǎn)物按照相互等摩爾那樣制備后，用PCR擴增產(chǎn)物溶液制備最終濃度為如下構(gòu)成的對于各PCR產(chǎn)物的雜交溶液。
<雜交溶液>
6×SSPE/10％ Form Amide/0.05％ SDS/PCR擴增產(chǎn)物溶液(6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、pH7.4)(3)雜交將除去水分后的DNA微陣列放置在雜交裝置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中，使用上述組成的雜交溶液，按照下記步驟·條件進行雜交反應。
<雜交條件·步驟>
將上述雜交溶液加熱到65℃并保持3分鐘后，再于92℃保持2分鐘，然后在55℃下保持4小時。完成上述操作后，用2×SSC和0.1％SDS于25℃下進行清洗。再用2×SSC于20℃下進行清洗，根據(jù)需要，可以按照通常的指南用純水輕洗，最后用旋轉(zhuǎn)干燥裝置除去水分，使其干燥。
表16
(4)熒光測定雜交反應結(jié)束后的熒光測定與實施例1同樣進行。在表17至表19給出了對應于每個探針長的各PCR產(chǎn)物的輝度值。輝度的計算也與實施例1同樣進行。
表17L1 L2No.正向引物反向引物探針PCR產(chǎn)物的長度L1/L2熒光強度(bp)(bp)1 FP1 RP1 A25 811 152 634 0.24 3172.02 FP1 RP2 A25 1336 677 634 1.07 52.43 FP2 RP2 B25 1336 169 11420.15 3638.84 FP2 RP4 A25 1786 1127634 1.78 2.2
5 FP1 RP7 B25 1786 619 11420.54 3077.46 FP1 RP4 C25 1786 109 16520.07 3519.97 FP1 RP6 A25 2019 1360634 2.15 0.68 FP1 RP6 B25 2019 852 11420.75 3020.59 FP1 RP6 C25 2019 342 16520.21 3449.810 FP1 RP7 A25 2345 1686634 2.66 1.611 FP1 RP7 B25 2345 117811421.03 722.512 FP1 RP7 C25 2345 668 16520.40 2252.713 FP2 RP4 A25 1398 1127246 4.58 1.514 FP2 RP4 B25 1398 619 754 0.82 2202.015 FP2 RP4 C25 1398 109 12640.09 2762.216 FP2 RP7 A25 1957 1686246 6.85 1.417 FP2 RP7 B25 1957 1178754 1.56 24.118 FP2 RP7 C25 1957 668 12640.53 1951.819 FP3 RP4 B25 1014 619 370 1.67 22.420 FP3 RP4 C25 1014 109 880 0.12 2763.221 FP3 RP6 B25 1247 852 370 2.30 0.522 FP3 RP6 C25 1247 342 880 0.39 2203.123 FP3 RP7 B25 1573 1178370 3.18 0.524 FP3 RP7 C25 1573 668 880 0.76 519.725 FP4 RP4 B25 909 619 265 2.34 1.826 FP4 RP4 C25 909 109 775 0.14 1893.227 FP5 RP3 B25 640 545 70 7.79 1.128 FP5 RP3 C25 640 35 580 0.06 2009.729 FP5 RP4 B25 714 619 70 8.84 1.630 FP5 RP4 C25 714 109 580 0.19 1388.631 FP6 RP3 C25 367 35 307 0.11 1338.632 FP6 RP4 C25 441 109 307 0.36 484.533 FP6 RP7 C25 1000 668 307 2.18 1.3
34 FP7 RP3 C25 190 35 130 0.27 590.135 FP7 RP4 C25 264 109 130 0.84 73.436 FP7 RP5 C25 305 150 130 1.15 168.337 FP7 RP6 C25 497 342 130 2.63 2.738 FP8 RP3 C25 104 35 44 0.80 797.239 FP8 RP4 C25 178 109 44 2.48 709.440 FP8 RP5 C25 219 150 44 3.41 643.441 FP8 RP6 C25 411 342 44 7.77 3.表18PCR產(chǎn)物 L1 L2No.正向引物反向引物探針 L1/L2熒光強度的長度 (bp)(bp)1 FP1 RP1 A40 811 137 634 0.22 6310.52 FP1 RP2 A40 1336 662 634 1.04 466.23 FP1 RP2 B40 1336 168 11280.15 7415.44 FP1 RP4 A40 1786 1112634 1.75 10.05 FP1 RP4 B40 1786 618 11280.55 6451.36 FP1 RP4 C40 1786 111 16350.07 8547.47 FP1 RP6 A40 2019 1345634 2.12 4.88 FP1 RP6 B40 2019 851 11280.75 5920.89 FP1 RP6 C40 2019 344 16350.21 8037.610 FP1 RP7 A40 2345 1671634 2.64 3.011 FP1 RP7 B40 2345 117711281.04 1942.112 FP1 RP7 C40 2345 670 16350.41 6506.213 FP2 RP4 A40 1398 1112246 4.52 3.214 FP2 RP4 B40 1398 618 740 0.84 5026.415 FP2 RP4 C40 1398 111 12470.09 7090.116 FP2 RP7 A40 1957 1671246 6.79 3.717 FP2 RP7 B40 1957 1177740 1.59 121.1
18 FP2 RP7 C40 1957 670 12470.54 5571.019 FP3 RP4 B40 1014 618 356 1.74 105.620 FP3 RP4 C40 1014 111 863 0.13 7291.521 FP3 RP6 B40 1247 851 356 2.39 4.022 FP3 RP6 C40 1247 344 863 0.40 6122.623 FP3 RP7 B40 1573 1177356 3.31 0.524 FP3 RP7 C40 1573 670 863 0.78 1967.125 FP4 RP4 B40 909 618 251 2.46 19.926 FP4 RP4 C40 909 111 758 0.15 5674.527 FP5 RP3 B40 640 545 70 7.79 3.528 FP5 RP3 C40 640 37 563 0.07 4904.329 FP5 RP4 B40 714 618 56 11.044.030 FP5 RP4 C40 714 111 563 0.20 4248.731 FP6 RP3 C40 367 37 290 0.13 3611.132 FP6 RP4 C40 441 111 290 0.38 1810.233 FP6 RP7 C40 1000 670 290 2.31 7.434 FP7 RP3 C40 190 37 113 0.33 1390.335 FP7 RP4 C40 264 111 113 0.98 334.436 FP7 RP5 C40 305 152 113 1.35 579.737 FP7 RP6 C40 497 344 113 3.04 13.738 FP8 RP3 C40 104 37 27 1.37 1434.039 FP8 RP4 C40 178 111 27 4.11 1674.240 FP8 RP5 C40 219 152 27 5.63 1737.641 FP8 RP6 C40 411 344 27 12.7414.表19PCR產(chǎn)物 L1 L2No.正向引物反向引物探針 L1/L2熒光強度的長度 (bp)(bp)1 FP1 RP1 A60 811 115 636 0.18 9191.0
2 FP1 RP2 A60 1336 640 636 1.01 1963.33 FP1 RP2 B60 1336 148 11280.13 10343.44 FP1 RP4 A60 1786 1090636 1.71 42.75 FP1 RP4 B60 1786 598 11280.53 11856.16 FP1 RP4 C60 1786 91 16350.06 10930.57 FP1 RP6 A60 2019 1323636 2.08 10.78 FP1 RP6 B60 2019 831 11280.74 11330.29 FP1 RP6 C60 2019 324 16350.20 11745.810 FP1 RP7 A60 2345 1649636 2.59 5.311 FP1 RP7 B60 2345 115711281.03 5436.412 FP1 RP7 C60 2345 650 16350.40 10108.013 FP2 RP4 A60 1398 1090248 4.40 10.914 FP2 RP4 B60 1398 598 740 0.81 9617.415 FP2 RP4 C60 1398 91 12470.07 9193.616 FP2 RP7 A60 1957 1649248 6.65 7.617 FP2 RP7 B60 1957 1157740 1.56 826.518 FP2 RP7 C60 1957 650 12470.52 8783.019 FP3 RP4 B60 1014 598 356 1.68 1061.520 FP3 RP4 C60 1014 91 863 0.11 9409.121 FP3 RP6 B60 1247 831 356 2.33 44.622 FP3 RP6 C60 1247 324 863 0.38 9139.923 FP3 RP7 B60 1573 1157356 3.25 0.824 FP3 RP7 C60 1573 650 863 0.75 3470.725 FP4 RP4 B60 909598 251 2.38 306.826 FP4 RP4 C60 90991 758 0.12 7428.827 FP5 RP3 B60 640524 56 9.36 9.128 FP5 RP3 C60 64017 563 0.03 5929.929 FP5 RP4 B60 714598 56 10.6811.930 FP5 RP4 C60 71491 563 0.16 6037.3
31 FP6 RP3 C60 367 17 290 0.06 5069.832 FP6 RP4 C60 441 91 290 0.31 2892.633 FP6 RP7 C60 1000 650 290 2.24 15.434 FP7 RP3 C60 190 17 113 0.15 2119.335 FP7 RP4 C60 264 91 113 0.81 649.636 FP7 RP5 C60 305 132 113 1.17 1108.037 FP7 RP6 C60 497 324 113 2.87 37.438 FP8 RP3 C60 104 17 27 0.63 1448.239 FP8 RP4 C60 178 91 27 3.37 2060.340 FP8 RP5 C60 219 132 27 4.89 2130.941 FP8 RP6 C60 411 324 27 12.0059.8IV.結(jié)果的解析接下來以該結(jié)果為基礎，做成輝度值相對于L1/L2值的曲線圖。為了容易理解，縱軸、橫軸都用對數(shù)表示。圖6為25mer的曲線圖，圖7為40mer的曲線圖，圖8為60mer的曲線圖。
由該結(jié)果可知，對于同一樣品核酸設計的使得對應于探針長，具有幾乎同一的Tm值的探針，即使對同一濃度的檢體進行雜交時，熒光輝度值也有很大不同，即穩(wěn)定性有很大不同?？芍狶1/L2值處于0至1.5的范圍可以得到很大的輝度值的穩(wěn)定的雜交體。特別是當L1/L2值為0到1時，可知可以得到特別穩(wěn)定的雜交體。與此相反，可知當L1/L2的值在2以上時，除了一部分例外，只得到輝度極低的熒光輝度，雜交體的穩(wěn)定性也極低。
實施例3(1)探針的設計就實施例2中設計的9種探針中的25mer 3種，制作3′末端進行了巰基修飾的下面的探針。巰基只在3′末端進行修飾，在5′末端不結(jié)合巰基。
表20示出了共計3種設計的探針的名稱、堿基序列、以及Tm值。
表20名稱序列(5′→3′)Tm值AR25ATGGTGCACTGTGAGTAGAATGTGC 75.7SEQ ID NO24BR25GTGGGTTAGATGGAACTGGATGTGA 75.8SEQ ID NO25CR25GATAAAGTTGCAGGAGCAGTTbTGG 75.7SEQ ID NO26與實施例2同樣，與該探針雜交形成雙鏈的是作為互補鏈的反向引物側(cè)的序列(反向引物延伸鏈)。
圖9示出了這里合成的3種探針和實施例2中合成的各PCR產(chǎn)物(靶鏈)的雜交體的1個例子。將存在于雜交體部的5′側(cè)的靶鏈的鏈長作為B5(L1)，將存在于3′側(cè)的鏈長作為B3(L2)。表21示出了針對實施例2合成的各PCR產(chǎn)物的各探針的L1、L2以及L1/L2的值。由于探針和各PCR產(chǎn)物產(chǎn)物(靶鏈)的位置關系沒有變，所以L1、L2和L1/L2的值與實施例2相同。
表21No.正向引物反向引物探針PCR產(chǎn)物的產(chǎn)度L1(bp) L2(bp)L1/L21 FP1 RP1 AR25811 152634 0.242 FP1 RP2 AR251336 677634 1.073 FP1 RP2 BR251336 1691142 0.154 FP1 RP4 AR251786 1127 634 1.785 FP1 RP4 BR251786 6191142 0.546 FP1 RP4 CR251786 1091652 0.07
7 FP1 RP6 AR252019 1360 634 2.158 FP1 RP6 BR252019 8521142 0.759 FP1 RP6 CR252019 3421652 0.2110 FP1 RP7 AR252345 1686 634 2.6611 EP1 RP7 BR252345 1178 1142 1.0312 FP1 RP7 CR252345 6681652 0.4013 FP2 RP4 AR251398 1127 264 4.5814 FP2 RP4 BR251398 619754 0.8215 FP2 RP4 CR251398 1091264 0.0916 FP2 RP7 AR251957 1686 246 6.8517 FP2 RP7 BR251957 1178 754 1.5618 FP2 RP7 CR251957 6681264 0.5319 FP3 RP4 BR251014 619370 1.6720 FP3 RP4 CR251044 109880 0.1221 FP3 RP6 BR251247 852370 2.3022 FP3 RP6 CR251247 342880 0.3923 FP3 RP7 BR251573 1178 370 3.1824 FP3 RP7 CR251573 668880 0.7625 FP4 RP4 BR25909 619265 2.3426 FP4 RP4 CR25909 109775 0.1427 FP5 RP3 BR25640 545707.7928 FP5 RP3 CR25640 35 580 0.0629 FP5 RP4 BR25714 619708.8430 FP5 RP4 CR25714 109580 0.1931 FP6 RP3 CR25367 35 307 0.1132 FP6 RP4 CR25441 109307 0.3633 FP6 RP7 CR251000 668307 2.1834 FP7 RP3 CR25190 35 130 0.2735 FP7 RP4 CR25264 109130 0.84
36 FP7 RP5 CR25305 150130 1.1537 FP7 RP6 CR25497 342130 2.6338 FP8 RP3 CR25104 35 440.8039 FP8 RP4 CR25178 109442.4840 FP8 RP5 CR25219 150443.4141 FP8 RP6 CR25411 342447.77(2)微陣列的制作使用3種探針的DNA微陣列制作與實施例2同樣，對各個探針都制作每1微陣列有16點的DNA微陣列。
(3)雜交反應和熒光測定雜交反應和反應結(jié)束后的熒光測定與實施例2同樣進行。表22示出了由各微陣列得到的輝度值。
表22PCR產(chǎn)物 L1 L2No.正向引物反向引物探針 L1/L2熒光強度的長度 (bp)(bp)1 FP1 RP1 AR25811 152 634 0.24 2569.32 FP1 RP2 AR251336 677 634 1.07 54.03 FP1 RP2 BR251336 169 11420.15 3056.64 FP1 RP4 AR251786 1127634 1.78 1.85 FP1 RP4 BR251786 619 11420.54 2277.36 FP1 RP4 CR251786 109 16520.07 3379.17 FP1 RP6 AR252019 1360634 2.15 0.58 FP1 RP6 BR252019 852 11420.75 2476.89 FP1 RP6 CR252019 342 16520.21 2207.910 FP1 RP7 AR252345 1686634 2.66 1.4
11 FP1 RP7 BR252345 117811421.03 556.312 FP1 RP7 CR252345 668 16520.40 1667.013 FP2 RP4 AR251398 1127246 4.58 1.314 FP2 RP4 BR251398 619 754 0.82 1431.315 FP2 RP4 CR251398 109 12640.09 2679.316 FP2 RP7 AR251957 1686246 6.85 1.217 FP2 RP7 BR251957 1178754 1.56 48.818 FP2 RP7 CR251957 668 12640.53 1678.519 FP3 RP4 BR251014 619 370 1.67 18.820 FP3 RP4 CR251014 109 880 0.12 2321.121 FP3 RP6 BR251247 852 370 2.30 0.022 FP3 RP6 CR251247 342 880 0.39 2137.023 FP3 RP7 BR251573 1178370 3.18 0.424 FP3 RP7 CR251573 668 880 0.76 556.025 FP4 RP4 NR25909 619 265 2.34 3.726 FP4 RP4 CR25909 109 775 0.14 1666.027 FP5 RP3 BR25640 545 70 7.79 0.828 FP5 RP3 CR25640 35 580 0.06 1748.529 FP5 RP4 BR25714 619 70 8.84 0.130 FP5 RP4 CR25714 109 580 0.19 1222.031 FP6 RP3 CR25367 35 307 0.11 1030.732 FP6 RP4 CR25441 109 307 0.36 382.833 FP6 RP7 CR251000 668 307 2.18 1.134 FP7 RP3 CR25190 35 130 0.27 454.435 FP7 RP4 CR25264 109 130 0.84 67.636 FP7 RP5 CR25305 150 130 1.15 140.637 FP7 RP6 CR25497 342 130 2.63 2.938 FP8 RP3 CR25104 35 44 0.80 693.539 FP8 RP4 CR25178 109 44 2.48 524.9
40 FP8 RP5 CR25219 150 44 3.41 540.441 FP8 RP6 CR25411 342 44 7.77 4.8(4)結(jié)果的解析與實施例2同樣，做成輝度值相對于L1/L2值的曲線圖，如圖10所示。在本實施例中，縱軸、橫軸都用對數(shù)表示。由該曲線圖可以得到L1/L2值在0至1.5之間的高輝度，可知形成穩(wěn)定的雜交體。另外也可看出這一傾向特別是在0至1之間更顯著。
這一結(jié)果表明在通過3(末端的巰基固定的探針中，也與5(末端固定的場合同樣可以得到對應于L1和L2的值的穩(wěn)定的雜交體，不管探針固定方法如何，都可以得到本發(fā)明的穩(wěn)定的雜交體。
序列表<110>佳能株式會社<120>穩(wěn)定的雜交體<130>10003817CN01<150>JP2003-324647<151>2003-09-17<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工<220>
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<220>
<223>PCR引物R1<400>3atcagcaata aaccagccag cc 22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物P1<400>4atggtgcact ctcagtacaa tctgc25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物P2<400>5gtgggttaca tcgaactgga tctca25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物P3<400>6gataaagttg caggaccact tctgc25<210>7
<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP1<400>7cttaatcgcc ttgcagcaca tc 22<210>8<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP2<400>8tgatttgggt gatggttcac gtag 24<210>9<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP3<400>9gagctgcatg tgtcagaggt tt 22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP4<400>10
ttcttagacg tcaggtggca ct 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP5<400>11ccttcctgtt tttgctcacc ca 22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>Primer，PF6<400>12gcatcttacg gatggcatga ca 22<210>13<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物FP7<400>13tgaagccata ccaaacgacg ag 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物FP8<400>14ttactctagc ttcccggcaa ca 22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP1<400>15ttcggtgatg acggtgaaa cc22<210>16<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP2<400>16actggtgagt actcaaccaa gtca 24<210>17<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP3<400>17atcagcaata aaccagccag cc 22<210>18
<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP4<400>18tacgggaggg cttaccatct g21<210>19<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP5<400>19catccatagt tgcctgactc cc 22<210>20<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP6<400>20acgctcagtg gaacgaaaac tc 22<210>21<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物RP7<400>21
gcgccttatc cggtaactat cg 22<210>22<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針A25<400>22atggtgcact ctcagtacaa tctgg25<210>23<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針B25<400>23gtgggttaca tcgaactcga tctca25<210>24<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針C25<400>24gataaagttg caggaccact tctgc25<210>25<211>40<212>DNA<213>人工
<220>
<223>探針A40<400>25atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag40<210>26<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針B40<400>26agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa40<210>27<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針C40<400>27tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct40<210>28<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針A60<400>28ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 60<210>29
<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針B60<400>29gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 60<210>30<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針C60<400>30cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 60
權(quán)利要求
1.一種雜交體，是樣品核酸的靶鏈具有的靶序列和與該靶序列互補的該探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體，其特征是上述樣品核酸的靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將上述靶鏈5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端的上述靶序列以外部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
2.權(quán)利要求1所述的雜交體，上述探針核酸被固定于固相。
3.權(quán)利要求2所述的雜交體，其中上述探針是DNA。
4.權(quán)利要求3所述的雜交體，其中固定于固相的探針DNA通過共價鍵被固定。
5.權(quán)利要求3所述的雜交體，其中固定于固相的探針DNA通過導入到5′側(cè)末端的官能團被固定。
6.權(quán)利要求3所述的雜交體，其中固定于固相的探針DNA通過導入3′側(cè)末端的官能團固定。
7.權(quán)利要求3所述的雜交體，其中固定于固相的探針DNA通過導入到序列中的官能團被固定。
8.權(quán)利要求5所述的雜交體，其特征是導入的官能團是巰基。
9.權(quán)利要求6所述的雜交體，其特征是導入的官能團是巰基。
10.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中探針是PNA。
11.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中探針的堿基鏈長為15～30mer。
12.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中探針的堿基鏈長為31～50mer。
13.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中探針的堿基鏈長為51～80mer。
14.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中L1/L2處于0～1范圍。
15.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中樣品核酸是雙鏈DNA。
16.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中樣品核酸是單鏈DNA。
17.權(quán)利要求14所述的雜交體，其中樣品核酸是PCR產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中樣品核酸是RNA。
19.權(quán)利要求1所述的雜交體，其中樣品核酸通過可直接或間接檢測的標記物質(zhì)標記。
20.權(quán)利要求19所述的雜交體，其中標記物質(zhì)是熒光物質(zhì)。
21.權(quán)利要求20所述的雜交體，其中熒光物質(zhì)是Cy3或Cy5。
22.權(quán)利要求1所述的雜交體，樣品核酸的鏈長在500bp以上。
23.權(quán)利要求22所述的雜交體，其中樣品核酸的鏈長在500bp以上、2500bp以下。
24.一種設計的探針，是以相對于具有靶序列的靶鏈，可形成權(quán)利要求1所述的雜交體的構(gòu)成而設計的。
25.權(quán)利要求24所述的探針，其中上述探針被固定于固體載體上。
26.一種由2個以上探針構(gòu)成的探針組，其中構(gòu)成的探針是權(quán)利要求24所述的探針。
27.一種探針載體，是固定用于檢測靶核酸的探針的探針載體，其特征是權(quán)利要求26所述探針的構(gòu)成比率是全部探針數(shù)的50％以上。
28.權(quán)利要求27所述探針載體，其特征是構(gòu)成比率在70％以上。
29.一種探針設計方法，是將探針設計成相對于具有靶序列的靶鏈可形成權(quán)利要求1所述的雜交體的構(gòu)成。
30.一種PCR用引物，用于制備相對于權(quán)利要求1所述探針可以形成權(quán)利要求1所述的雜交體的構(gòu)成的樣品核酸。
31.一種樣品核酸的檢測方法，是在通過檢測使固定于固相的探針核酸與比該探針核酸還長的樣品核酸反應得到的雜交體的樣品核酸的檢測方法中，其特征是將上述探針核酸的序列設計成可形成滿足以下構(gòu)成(1)和(2)的雜交體(1)是樣品核酸的靶鏈具有的靶序列和與該靶序列互補的探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體，(2)上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，將該靶鏈的5′末端側(cè)的上述上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
32.權(quán)利要求31所述的檢測方法，上述樣品核酸是以檢體核酸為模板的PCR擴增產(chǎn)物，將該PCR用引物以及上述探針設計成可形成滿足上述構(gòu)成(1)和(2)的雜交體。
33.一種樣品核酸檢測用試劑盒，具有用于從檢體核酸擴增具有靶序列的靶鏈的樣品核酸的PCR用引物和固定于固相用于確認在以該檢體核酸為模板使用該引物進行擴增的擴增產(chǎn)物中有無上述靶序列的探針核酸，其特征是，上述引物和上述探針核酸的序列被設計成可形成滿足以下構(gòu)成(1)和(2)的雜交體(1)是樣品核酸的靶鏈具有的靶序列和與該靶序列互補的探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體，(2)上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將該靶鏈的5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
34.一種樣品核酸的靶鏈，具有靶序列，可與該靶序列互補的探針核酸的探針序列結(jié)合的雜交體而構(gòu)成，其特征是上述靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，當將該靶鏈的5′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L1、將3′末端側(cè)的上述靶序列以外的部分的堿基數(shù)表示為L2時，滿足0≤L1/L2≤1.5的關系。
全文摘要
本發(fā)明提供在利用固相上雜交的核酸檢測方法中用于進行更高靈敏度、而且高特異的微量檢測的雜交體。作為固定于固相的探針核酸和樣品核酸形成的雜交體，提供通過使上述樣品核酸的靶鏈比上述探針核酸的探針序列長，具有該靶鏈的5′末端的部分至少延長到上述靶序列的5′側(cè)，而該靶鏈的3′末端相當于上述靶序列的3′側(cè)端部，或處于在上述靶序列的3′側(cè)端部的3′方向延長至少1個堿基的部分的前端，當將具有上述靶鏈的5′末端的部分的堿基數(shù)表示為L1、將上述靶鏈3′末端的上述靶序列伸出的部分的堿基數(shù)表示為L2時，L1/L2の值滿足0～1.5關系的雜交體。
文檔編號C07H21/04GK1616676SQ20041007879
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者鈴木智博, 石井美繪 申請人:佳能株式會社