季胺白屈菜生物堿硫代磷酸衍生物的制作方法

專利名稱：季胺白屈菜生物堿硫代磷酸衍生物的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及了藥物開發和衛生保健領域，其與白屈菜生物堿及其衍生物有關，其中，白屈菜生物堿分子中的氮為四元氮。此外，本發明還與這種化合物的制作方法、包含這種化合物的混合物以及對各種疾病和身體狀況的治療有關。
技術發展水平白屈菜生物堿以及含有白屈菜生物堿的混合物在此項技術領域中眾所周知，因為它們是白屈菜生物堿或某些白屈菜生物堿衍生物在治療各種身體狀況和疾病(包括代謝紊亂和腫瘤)方面的治療應用。
通過將某些Chelidonium majus L.生物堿與三(1-吖啶基)磷化氫硫化物在有機溶劑中進行反應，DE 2 028 330與US 3 865 830揭示了硫代磷酰胺-異喹啉加合物的制備。
通過與制癌的磷化合物(通過將其轉化成它們的鹽并以水溶形式提供的)進行反應，AT354 644與AT 377 988描述了生物堿的磷衍生物制備工藝。這種已公開工藝的缺點是反應產物沒有完全轉化成水溶性鹽，大部分反應產物仍不溶于水。
US 5 981 512揭示了在AT 377 988和AT 354 644中所得出的物質在治療輻射傷害時的效用。
上述專利中描述的化合物具有不同的抑止細胞生長和制癌活性。生物堿混合物，尤其是Chelidonium majus L.的總生物堿，已證明最有希望成為治癌新藥，其中的約效已在有關癌癥治療的多項研究中加以展示。未反應的反應物從反應完成后的合成混合物中去除。由于三(1-吖啶基)磷化氫硫化物(以下也稱為″硫替派″)可溶于苯、乙醚或氯仿等有機溶劑中，建議在先前的工藝方法中，用乙醚洗滌反應產物將未反應的三(1-吖啶基)磷化氫硫化物從合成的混合物中去除。
盡管上述制造具有藥物活性的白屈菜生物堿衍生物的先前工藝方法同樣需要利用易燃甚或具有爆炸性的有機溶劑凈化最終產物，但目前已發現，還可以使用水溶劑來完成凈化，這樣甚至會得到更好的效果。
本發明簡述一方面，本發明是涉及了利用相應的烴化劑進行的生物堿反應產物——尤其是白屈菜生物堿、氧化白屈菜堿或甲氧基白屈菜生物堿——的新型制備工藝，該工藝最少包含一步在烴化反應完成后利用水溶劑(最好是水)進行洗滌的步驟。
該工藝還包含了將生物堿衍生物轉化成水溶性鹽驟，以制成低毒性且具有寬作用光譜范圍的可注射藥劑的步驟。
另一方面，本發明涉及了水溶性反應產物，例如合成白屈菜生物堿衍生物，其中該生物堿分子開頭的二元氮已被轉化成四元氮，其中該四元氮的第四個配位基很少為烷基原子團，而大多是甲基或乙基原子團，或替代的甲基或乙基原子團，例如硫替派原子團。在首先具體形態中，季胺白屈菜生物堿衍生物具有的性質如在目標組織——尤其是癌組織——中選擇性地進行積聚。
另一方面，本發明涉及了包含上述其中一種季胺生物堿的藥物成分，尤其是季胺白屈菜生物堿——可從按照本發明的工藝中獲得的衍生物。
本發明還涉及了包含作為醫療用藥物的季胺生物堿衍生物的反應產物，以及將上述衍生物用于制作醫療各種疾病或身體狀況的藥物成分。
本發明涉及的其它方面在以下要求中進行了說明。
本發明詳述按照本發明進行的過程包含了在帶有烴化劑(最好是本身具有醫療活性的烴化劑，例如毒害細胞的磷酰胺或至少包含一個吖啶基的磷酸衍生物)的有機溶劑中對生物堿或生物堿混合物進行反應，然后用水洗滌反應產物。用水或類似的水溶劑(例如適度的鹽溶液)進行的洗滌步驟促進了將水溶性差或非水溶性反應產物即季胺生物堿烴化劑轉化成水溶性化合物(例如鹽)的其它后續步驟。如果烴化劑是對細胞有毒害的物質，則該烴化劑最好也是水溶性的，或至少一接觸水便分解成水溶性成分，以便通過水洗將未反應的烴化劑或烴化成分從反應混合物中去除。
水洗步驟可充分簡化制作過程，因為這無需對純有機溶劑(例如甲醚)的爆炸危險采取復雜的安全防范措施，從而可不斷簡化該過程。而且，還將反應混合物中存在的非理想的水溶性成分從反應產物中分離出來并去除。令人吃驚的是，人們還發現，將產物轉化成水溶性的后續步驟的效率比用純有機溶劑進行洗滌的步驟高出10到15倍，通過這種方式，水洗步驟對反應產物的結構和組成具有積極影響，從而極大改善了理想的最終產物的產生。
例如，本過程可用于生物堿與含有AT 377 988要求1中提到的化合物的制癌磷進行烴化反應，這些磷化合物如圖3所示，圖3為尤其適用的當前應用，特別是那些具有吖啶基的應用。
此處使用的術語“白屈菜生物堿”應同樣指從包含白屈菜生物堿、氧化白屈菜堿和甲氧基白屈菜生物堿的分組中選擇的任一成員，除非另行要求或從描述中以隱含方式另行推論。與本發明相符的相應有機溶劑為任何用于反應的生物堿可溶于其中的藥劑。例如，生物堿能夠在促進和導致生物堿反應的有機溶劑中進行分解，例如從由氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷的分組中選擇的溶劑。
生物堿的烴化反應在較高溫度下進行反應，在溶劑達到沸點時效果最佳。
水洗后，最終反應產物被轉化成水溶性的。這可以按照AT 377 988和AT 354 644中所述的過程通過轉化成水溶性鹽，尤其是轉化成鹽酸鹽來實現，例如，在出現鹽酸鹽沉淀的過程中或之后將最終反應產物放入強酸液體或氣體(例如HCl氣體)中，或將HCl溶液加入洗滌的反應產物的有機溶劑中。似乎通過這種酸處理，大多數烴化劑從生物堿和烴化劑之間形成的中間反應化合物中分離出來，留下了變異的生物堿衍生物，其中開頭的三元氮原子已被轉化成四元氮，在四元氮中，氫原子團或產生于烴化劑的原子團作為第四個配合基收到限制，該原 子團最好是從由甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氫硫化物原子團組成的分組中選擇出來的。為了更好的理解，隨后的公式(1)闡明了本發明以白屈菜生物堿為例的典型四元生物堿反應產物R1＝甲基、乙基、三(1-吖啶基)磷化氫硫化物、methyl-R2、ethyl-R2、屬于三(1-吖啶基)磷化氫硫化物一部分的R2根據本發明(見實例3)，從沉淀的其中一個反應產物進行元素分析，似乎——不受理論限制——至少在烴化反應(例如四元反應)終止后通過對反應混合物進行酸處理獲得的一部分烴化劑或分解化合物可能會被某種程度地吸留在沉淀物的晶體中，或通過某種方式牢牢地吸附于晶體上，因此利用乙醚和二氯甲烷等有機溶劑洗滌沉淀物的純化過程不能將其去除。然而，可證明，即使摻入了這種伴隨物質，反應產物的全部作用仍可以完全發揮。
反應產物的水溶性鹽適合注射溶液的應用。
在本發明的具體體現中，反應是與三(1-吖啶基)磷化氫硫化物(CAS No.52-24-4)進行的，在藥典中，該物質也稱為硫替派。其他同義詞為ledertepa、Onco硫替派、TESPA、tespamine、thiophosphamide、thio-TEPA、thiotriethylenephosphoramide、tifosyl、triaziridinylphosphine sulphide、N，N′，N″-tri-1，2-ethanediylphosphorothioine triamide；N，N′，N″-tri-1，2-ethanediylthiophosphoramide、tri-(ethyleneimino)thiophosphoramide；N，N′，N″-triethylenethiophosphoramide、triethylenethiophosphorotriamide、m-triethylenethiophosphoramide、m-tris(aziridin-1-yl)phosphine sulphide、triethylenethiophosphoramide、tris(1-aziridinyl)phosphine sulphor、tris(ethylene-imino)thiophosphate、TSPA及WR 45312。
在本發明的具體體現中，生物堿(隨意，可為Chelidonium majus L.的總生物堿)的萃取物在有機溶劑中與tris(1-aziridinyl)-phosphine sulphide(硫替派)以及最終反應產物(隨意，可作為化合物的混合物)進行反應，然后用水進行至少洗一遍。由于硫替派遇水分解，通過這種方法可將反應過后剩余未轉化的硫替派殘留物從有機相中析出。較好的方法是對包含中間反應產物(即在烴化劑和生物堿之間形成的化合物)的有機溶液用水洗數次，每一次均使其達到飽和。尤為可取的方法是，反復水洗，直至殘余的高毒性硫替派已被完全從反應物中去除。
此外，利用水相可將在醫療應用中會導致逆反應甚至會導致肝硬化的某些溶于水的毒性生物堿從合成的混合物中去除，或使其濃度降低。通過艾姆斯氏試驗表明，根據本發明制備的這種反應產物可引起突變。
當從Chelidonium majus L.的總生物堿萃取物開始時，最終反應產物為含有分子質量較高的硫替派反應產物的生物堿與生物堿的混合物，以及生物堿降解產物的混合物。由于合成過程不同，生物堿的溶解度可能有所變化。反應產物包含約60～70％的未反應的白屈萊堿與約30～40％的三(1-吖啶基)磷化氫硫化物反應產物這二者的混合物。
叔胺生物堿代表了從Chelidonium majus L.獲得的生物堿萃取物最初成分的主要部分。例如，在合成的混合物中可作為最初成分獲得以下叔胺生物堿白屈菜生物堿、普托品、stylopin、別隱品、α高白屈菜生物堿、chelamidine、chelamine、L-金雀花堿、二聚體白屈菜默堿、二氫血根堿、氧化血根堿，氧化白屈菜堿以及甲氧基白屈菜生物堿。
烴化反應終止后，通過水洗步驟將未反應的四元生物堿(例如黃連素)從反應混合物中完全去除，而未反應的水溶性生物堿和烴化的生物堿反應產物仍留在有機溶劑中。根據用于烴化反應的有機溶劑和/或烴化劑的性質，最終的中間反應產物可能包含由硫替派鏈接的化合物，其中一個硫替派分子與一個、兩個或三個白屈菜生物堿、oxy-chelidonine或methoxy-chelidonine分子相鏈接。此外，它還可能包含烴化的生物堿衍生物，其中，白屈菜生物堿、oxy-chelidonine或methoxy-chelidonine等生物堿分子在其四元氮上與短鏈的線性烷基原子團相連，尤其是與甲基或乙基相連。而且其他烴化的反應化合物在烴化反應終止后可能位于反應混合物中。
按照本發明從具有硫替派的Chelidonium majus L.的總生物堿中獲得的反應產物比從利用diethylether等有機溶劑進行洗滌的類似過程中獲得的反應產物具有更好的醫療活性光譜。至少本發明的反應產物中存在的某些化合物，尤其是季胺白屈菜生物堿衍生物能夠在癌組織中有選擇地積聚，并通過使癌細胞死亡來破壞癌細胞，同時——相比于大多數人都了解的細胞生長抑止劑——還不會攻擊健康細胞。這利用該制劑實現了良好的醫療容忍度，并且能夠普遍適應因遺傳排列而導致癌細胞擴散危險較高的醫療使用甚至個人疾病預防使用。其處理簡單，且在醫療劑量中不會出現重大的逆反應。
從具有硫替派的Chelidonium majus L.的總生物堿中獲得的反應產物展示了新陳代謝規則中的生物活性，其不僅適用于預防和治療代謝疾病，例如骨質疏松癥，而且還適用于預防和治療風濕病、過敏癥、病毒感染、癲癇癥、多發性腦脊髓硬化癥、傷疤、皮膚腫瘤、手術后創傷和輻射損傷。
Chelidonium majus L干躁根的提取物可用作合成物的起始反應物。這些根比葉和莖含有更多的生物堿。
令人驚訝的是，最近發現，當從具有商用價值的白屈菜生物堿、氧化白屈菜堿或甲氧基白屈菜生物堿開始并將其作為單獨的生物堿源是，按照本發明的方法(例如參見以上實例3)獲得的最終反應產物所展示的醫療質量和活性至少可與按照實例1的總白屈菜生物堿烴化反應得到的反應產物相媲美。
常規藥物賦形劑，尤其是液劑(例如注射液或浸液)、軟膏、壓布或懸帶，適用于包含按照本發明制備的反應產物的藥物。
說明書附1為Chelidonium majus L.根部處獲得的全部生物堿成分構成的HPLC圖譜。
圖2為根據實例1制得的制劑的HPLC指紋圖譜。
圖3為可用作反應物的某些磷衍生物。
圖4為反應產物U-KRS的核磁共振譜。
圖5為反應產物U-KRS的UV譜。
圖6為白屈菜生物堿鹽酸鹽的UV譜。
圖7為反應產物U-KRS質譜的第一部分。
圖8為清晰度更高的反應產物U-KRS質譜的第二部分。
圖9為白屈菜生物堿鹽酸鹽的質譜。
為進一步闡述本發明，列舉了以下實例。
實例1A)生物堿的萃取a.將25克生物堿鹽混合物置于水中，然后倒入分液漏斗中。添加100毫升二氯甲烷后，搖動分液漏斗。有機相便會分離出來，然后將其過濾到玻璃瓶中。
b.將1N氫氧化鈉(pH8-9)添加到水相中，直至出現渾濁。添加100毫升二氯甲烷后，搖動混合物。有機相便會分離出來，將其與步驟a的二氯甲烷相進行混合。重復該過程，例如重復3遍。過濾并混合有機相。
c.通過添加氫氧化鈉將水相的PH值調到10。添加二氯甲烷后，搖動混合物。有機相便會分離出來，將其過濾并與其他有機相進行混合。現在利用氫氧化鈉將水相的PH值調到13，然后利用二氯甲烷充分萃取。
d.將這些合并的有機相蒸發至產生一種油狀褐色物質。
B)與三(1-吖啶基)磷化氫硫化物進行反應將生物堿殘余物在二氯甲烷中溶解，然后添加三(1-吖啶基)磷化氫硫化物。在80℃的溫度對該混合物進行2小時回流。當冷卻至室溫后，澄清該反應混合物。然后進行過濾，之后在分液漏斗中利用250毫升的水洗滌濾出物數遍，例如3遍或更多遍。
C)與HCl進行反應將洗過的溶液裝入玻璃燒杯中，加入HCl氣體不斷攪拌使其達到飽和，鹽酸鹽便會析出來。將析出物過濾出來，用乙醚洗滌，干燥后將其溶入水中。
在老鼠體內，對于例1制得的反應產物，測定到的LD50值為485mg/kg。在小鼠和大鼠中的驗機表明，根據發明制得的產品調節了胸腺的荷爾蒙水平，并在那些胸腺摘除的動物體內誘導合成了具有有類似胸腺素活性的物質。此效果是基于劑量而獲得的。該制劑增加了外周血中T-淋巴細胞的數量將近50％(4.04±0.43×109/l處理前，6.24±0.73×109/l處理后)，調節了穿透抗原的體液免疫反映以及脾臟細胞的自然殺傷細胞活性(198.20±17.69％，對照組為71.50±9.10％)，并且提高了動物試驗中白血球的干擾素釋放能力。動物試驗的結果是經過臨床觀察而確定的。因此，在癌癥病人身上也觀察到免疫指數得到了改進。
對于預防和免疫學應用，例1中的制劑的使用量為5毫克/70千克體重。對于癌癥治療，每20千克體重使用5毫克該制劑是比較適宜的。
實例2HPLC指紋該測定通過離子對反相梯度層析以及使用一個DAD探測器在285納米處測量吸光度來完成。同時，色譜圖通過使用參照生物堿來繪出。另外，進行一種HPLC-MSD分析，通過這個分析可以得出沒有哪個峰值在這些生物堿范圍之外的。基于下列實驗數據可以獲得

圖1和2的HPLC圖譜柱LiChrospher 60RP Select B，5μm，125×24mm ID洗脫液A)200ml(乙腈)+800ml(水)+1.5g(己烷磺酸)+0.3ml(85％磷酸)B)900ml(乙腈)+100ml(水)+1.5g(己烷磺酸)+0.3ml(85％磷酸)梯度5分鐘等度洗脫100％ A；24分鐘到40％ B1分鐘到100％ B5分鐘100％ B；5分鐘100％ A平衡探測UV燈285納米處洗脫流率1ml/min，35分鐘后停止進樣體積10μl樣品制備反應之前萃取(圖1)將25毫克生物堿通過超聲波溶解在40毫升甲醇，接近50毫升，然后通過膜濾器過濾。
反應產物(圖2)將反應產物轉化為鹽酸鹽，以1mg/ml的濃度溶解在水中并調節pH在2.5和6.5之間。
實例3根據實例1中所述的條件，具有商業可用性的已純化的白屈菜生物堿(Sigma)與三(1-吖啶基)磷化氫硫化物(＝硫替派)進行了反應。烴化反應終止后，進行洗滌和利用HCl氣體進行轉化的步驟，按照下列方式進一步處理最終產物將340克經過HCl處理的水溶性反應物溶于水中，并使其濃度接近飽和，然后將其置于8℃的冰箱中。數小時后出現自然產生的沉淀，取出264毫克沉淀物(以下稱為U-KRS)。該沉淀物由淡黃色的吸水性晶體組成，這種晶體的熔點范圍非常小，介于205-207℃(指完全結晶的產物)，用366納米的UV光照射時會發出淺藍色的熒光，同時還可以看到黃色的軌跡，橙色和紅色的熒光帶。當利用薄層色譜分析該產物時，其沒有移動，仍然位于起始位置(Rf＝0)，只是軌跡移動到Rf＞0.1。從核磁共振(NMR)譜(圖4)中可以清楚地看到U-KRS包含與白屈菜生物堿分子中含有的芳環同類的芳環。UV光譜(圖5)顯示吸收最大值為148、155、160、205、230及282納米，非常類似于白屈菜生物堿的UV光譜(圖6)，不同于在白屈菜生物堿為240納米而U-KRS為230納米時單獨出現在峰值中的光譜。這表面U-KRS中的氮為四元，而白屈菜生物堿中的為三元。
從圖7與圖8(U-KRS)以及圖9(白屈菜生物堿)中所示的質譜中可得出進一步的詳細分析，從U-KRS的元素分析結果中揭示了以下事物成分(表1)表1U-KRS的元素成分占總體的百分比
以下實例說明了從實例3產生的化合物U-KRS的各種應用實例4通過抗腫瘤藥U-KRS對體外細胞增長的選擇性抑止材料和方法細胞培養是在含有8％ CO2的潮濕空氣中在溫度為37-37.5℃的Roux瓶中進行的。合流培養由0.01％的胰島素和0.2％的EDTA與磷酸鹽緩沖鹽水的溶液加以分離的，分離比例為1∶5到1∶25。
人類內皮細胞通過膠原酶處理與臍靜脈相隔離。內皮細胞的培養液是利用15％熱鈍化的胎牛血清、200μg/ml內皮細胞增長因子以及90μg/ml的肝磷脂補充的的M199。
熒光顯微鏡檢術細胞在35毫米的器皿中生長，在U-KRS為100μg/ml時30-60分鐘便可孵化。將培養液的空氣排空，細胞利用PBS洗滌兩遍。將蓋玻片安裝在細胞上，利用配有氬激光器的共焦激光掃描顯微鏡使熒光感光，。在]光電倍增器通道上檢測所發射的光。其信號便成像于使用MRC 600影像處理軟件的視頻監視器上。
結果1.在20-40μg/ml U-KRS范圍內測出，內皮細胞的增長約55％收到抑止。該濃度殺死了人類骨肉瘤細胞系。這兩種細胞類型的雜和具有于正常細胞幾乎相同的敏感性。
2.由于自身熒光的特點，因此可在細胞內對U-KRS進行檢測。激光掃描顯微鏡顯示了在惡性細胞中對U-KRS的高度攝取。
實例5U-KRS用作抗癌劑-耗氧量材料和方法在老鼠體內進行試驗。兩到五只對照動物均被注射了50μl的Ehrlich鼠腹水懸浮液i.p.，該懸浮液為8d old，是從完全成年的捐贈動物身上攝取的。該對照組未加以進一步治療。在腫瘤培植后立即在測試組的腹部注射了10毫克U-KRS/千克動物質量。
結采在U-KRS腹腔內注射或皮下注射后植入了腹水腫瘤的老鼠存活時間長于未經其他方法治療的植入動物。
通過在體外使用電極的方式對腹水腫瘤懸浮液的耗氧量進行測試發現，添加U-KRS后耗氧量略微增加，但隨后快速下降，不同于未混有U-KRS的對照懸浮液。
實例6在嚙齒動物中使用U-KRS的嗎啡止痛效果的改進。
材料和方法動物在雄性Albino Swiss鼠和雄性Wistar鼠身上進行試驗。
治療將最低劑量為20mg/kg和25mg/kg的U-KRS分別注射到Albino Swiss鼠和Wistar鼠上。
試驗過程在每次試驗中，這四組動物均注射了)安慰劑，2)嗎啡，3)U-KRS，4)U-KRS與嗎啡結果結果表明，同時注射U-KRS和嗎啡改進了麻醉止痛藥的藥效。在老鼠身上反復進行的測試中，這兩種物質產生了止痛效果，并且跡象顯示止痛持續時間更長。
此結果顯示，同時結合嗎啡使用的U-KRS將試驗動物的敏感度轉變成了所描述測試中的感受傷害反應。此結果表明，U-KRS能夠與用于癌癥的止痛藥物互相作用。
實例7通過衍生的U-KRS在惡性細胞中產生的雙模程序化細胞的死亡。
材料和方法使用K562 erythroleukaemia細胞系，U-KRS產生完全結晶形式，并溶于濃度為1.2mg/ml的水中。
利用亞丙基和流式細胞測量計分析在各種濃度的U-KRS中顯示的K562細胞的DNA內容。
結果此項研究的結果表明，U-KRS產生了雙模細胞死亡程序，其中第一個形態——細胞調亡——是由對奎尼丁敏感的Ca2+-dependent K+通道導致的；第二個形態——水泡細胞死亡——是通過防止微管形成從而產生多倍性而導致的。
實例8U-KRS對DNA、RNA和蛋白質在惡性細胞中的合成等的影響材料和方法將標有溶于20μl介質中0.5μCi的標有3H的胸腺嘧啶核苷；尿核苷，溶于20μl介質中0.5μCi的白氨酸；溶于20μl介質中1.0μCi的20μl放置在U-KRS濃度不同的四個槽中2-4小時。在這之前，使該細胞系、豚鼠肝細胞、C1L肝細胞人類扁桃體細胞、鼠科淋巴瘤、鼠科骨髓瘤、Yoshida細胞、兩個HeLa族、EsB-、EB、淋巴瘤、ZAC/1、P815在37℃、96 microtiter的槽內成長24小時。
在U-KRS濃度為1、4、8及14μg/ml時WiDr細胞在6小時至24小時內開始以不同的方式孵化。
結果熒光評估顯示了U-KRS與針對其它癌細胞區域的癌細胞原子核元素的更強吸引力。熒光現象可能清楚地顯示U-KRS在腫瘤和轉移區域中所顯露的強大且快速的吸引力。在以迄今測試的對癌細胞具有100％抑止作用的方式對待的正常細胞中未發現有毒性作用。
實例9U-KRS對人類異種移植物的影響材料和方法從人類腫瘤異種移植物中攝取腫瘤細胞，并連續將其移植到裸鼠體內。這些細胞用于體外集落形成化驗。利用多種濃度的藥物U-KRS，腫瘤細胞至少一個星期的時間不斷孵化。這是利用六個不同類型實現的，并且針對每個腫瘤對集落形成進行記分。其藥效在本T/C(測試/對照)中進行了報道。
結果許多不同類的腫瘤均對與U-KRS測試的種類相應的U-KRS產生敏感。此處該腫瘤影響似乎取決于免疫器官的再生能力，刺激和調節工作可能由U-KRS來完成。
實例10U-KRS對人類惡性細胞系的影響材料和方法使用四個不同的惡性細胞系1)鼠惡性毒瘤；2)女性乳房癌；3)人類結腸癌；4)人類黑素瘤向培養液中添加U-KRS和PP9AA02衍生物。
照射后，每個幻燈片均使200個細胞鍍有金色，這些細胞孵化一個星期，然后對其進行著色和計數。
結果此處顯示的結果表明U-KRS和PP9AA02衍生物會作為毒性物質協同作用于人類惡性細胞系。
實例11U-KRS在人類表皮癌細胞系中誘發的G2/M吸引和調亡材料和方法將主要人類角化細胞與新生皮膚樣本相隔離。使表皮薄片受胰蛋白酶作用，并通過離心過濾來獲取單細胞懸浮液。
結果U-KRS根據劑量來抑止細胞周期進程。
U-KRS治療影響細胞周期分配，并在A431和ME180中引發細胞調亡。
細胞周期素、CDKs與CDKp27抑止因素的表達在利用U-KRS進行治療后會發生變化。
實例12U-KRS的抗代謝影響及其對帶有黑素瘤B-16的老鼠的氧代謝與能量代謝的影響材料和方法在133 C57B/6雄性鼠身上進行試驗。將B-16移植到每只老鼠的正確皮膚肌肉上。在該腫瘤移植后的第10天，將試驗動物劃分為兩組。對于第一組，將體積為0.05毫升、劑量為1mg/kg的U-KRS注射到眼睛的靜脈竇中兩天內一次注射五次。對于第二組以同樣的方式將消毒的生理溶液注射到靜脈竇中。
結果結果本研究顯示了在對U-KRS進行初次靜脈注射一天后，肌肉組織中的氧療法指數得到了顯著改善。pO2水平的變化速率在氧吸入過程中增加到最大值，并且在吸入停止以后，其速率又從最大值降低到初始水平。在動物實驗組中，在服用制劑一天以后，肝臟線粒體中的氧化磷酸化的某種指數得到了改善。眾所周知，在惡化過程中，氧吸入和代謝受到抑止。在小鼠中，經過5次U-KRS注射以后，此種抑止效果減弱。在對照動物組中，肌肉組織中的氧氣密度水平和對該組織的輸氧速率較高。概括所獲得的數據，或許可以下定這么一個結論，U-KRS可以改善對帶有B/16黑素瘤的小鼠中的組織的輸氧，也可以從機體生物能學角度上考慮可以抑止了惡化過程中的破壞性效果。
下面的諸多實例解釋了U-KRS的免疫調節和代謝調節性能，指出了U-KRS尤其適合用于過敏反映、病毒疾病(HIV、甲乙丙肝、大腸桿菌、流行性感冒)、骨質疏松癥、多發性關節炎、牛皮癬、和其他疾病或身體狀況的治療處理。
實例13通過U-KRS來提高巨噬細胞抗腫瘤活性材料和方法在實驗室中BALB/c小鼠通過兄妹交配來獲得。通過皮下注射來將D1DMBA/3腫瘤常規移植到BALB/c中。在經過培植5天后，腫瘤變得明顯。
在皮下腫瘤培植后5天時，用U-KRS進行體內處理。此過程中使用了三種使用路線，即靜脈內、腹膜內、和皮下注射、這三個實驗組，每組至少10只小鼠，注入了5.0μU-KRS濃度的0.15ml PBS溶液。該劑量選擇用于預備實驗。
結果經過處理的小鼠中腫瘤增長的速率明顯得到了降低。注入U-KRS的小鼠沒有顯示任何有毒的藥物相關副作用。
實例14U-KRS對正常人淋巴細胞顯型的體外影響材料和方法該項研究通過對10位志愿者外周血中分離得到的淋巴細胞進行研究來完成。這些細胞通過Ficoll-Paque密度梯度離心來分離得到。細胞的發育能力通過0.1％的臺盼藍著色來測定，結果為95％。
淋巴細胞子總體式通過螢光免疫檢驗法測定相對于總T細胞、T-helper細胞和T-suppressor細胞的單克隆抗體數量來測定。然后，細胞使用FITC/conjugatedrabbit F/ab/2 fragments anti-mouse IgG進行處理，并用PBS進行洗滌，并使用聚乙烯醇和甘油將其固定在片子上。在制作對照時，使用PBS或正常小鼠血清來代替單克隆抗體。
結果目前的這個研究顯示了U-KRS對T細胞子人口數量直接影響的可能性，并證明了早期觀察結果，就是U-KRS是癌癥病人細胞免疫性能的一種良好的免疫激勵因子。
實例15U-KRS對人類外周血單核細胞的致有絲分裂屬性材料和方法外周血單核細胞。外周血通過包含1mM EDTA并且pH7.5的等體積PBS進行稀釋，并在Histopaque 1077上部進行分層。然后以2000rmp的轉速離心30分鐘。收集表面層并用RPMI組織培養介質洗滌3次，其中含有淋巴細胞。
結果研究發現，甚至采用U-KRS進行某個很短時間的預處理會對PHA有絲分裂產生一個強力的協作效應，和那些只有PHA存在的情況相比，會獲得更多的細胞刺激。而且，還發現PHA對細胞的短期處理對于U-KRS產生協作效應來說是必需的。
本研究展示，用U-KRS對處理惡化末期階段的病人，將可以大大增加循環淋巴細胞的數量。
實例16免疫效應因子通過U-KRS對體內細胞溶解活性和腫瘤增長抑止的調節材料和方法腫瘤細胞肥大細胞瘤P815和AKR白血病AKIL細胞系，生長于DMEM培養基，帶有9.0％胎牛血清，包含青霉素和鏈霉素。
結果當前的體內研究是一種有效的生物應答調節劑，使得異源免疫小鼠脾臟淋巴細胞的細胞溶解活性增加了48倍。通過將U-KRS加入到細胞介導性消退測定血清中，IL-2處理的脾臟細胞和腹膜漿淋巴細胞得到的細胞溶解活性也得到了顯著增加。
將這些結果與U-KRS也能提高脾臟淋巴細胞的細胞溶解活性的結果聯系起來，得出體內觀察到的U-KRS治療效果能夠通過刺激免疫效應細胞的細胞溶解活性來進行調停。
實例17U-KRS對體內體外免疫血液性狀的影響材料和方法96只Wistar大鼠用于此項研究。雌鼠和雄鼠的最初年齡均為16周。
U-KRS和PHA通過對T淋巴細胞的一項#Hthymidine檢測而被檢測，以此來評估從0.01到20μg/ml不同濃度劑量的激勵指標。
結果U-KRS刺激了屬于造血和免疫系統的不同的子系統。在該實驗中，引起了網狀細胞過多癥，它可能是某些干細胞刺激或紅血球生成系統全面激活的一個跡象。就絕對白血球數量沒有改變這一點，可以假定通過U-KRS的作用，僅僅可以增強調節屬性，比如在本實驗中會出現不同子系統的混亂。
還可以發現體外刺激，和這些實驗中獲得的刺激具有可比性，它主要包括癌癥細胞的凋亡。
實例18U-KRS對小鼠體內卵清蛋白抗原性和抗卵清蛋白IgE抗體響應的抑止效應材料和方法在BALB/c和F1(BALB/c×C57B1/6J)小鼠中，檢測了U-KRS對卵清蛋白誘導的致敏作用的抑止能力。將U-KRS加入到小鼠里，該小鼠處在含有抗原(卵清蛋白)和輔佐劑(明礬)混合物中，可以抑止小鼠的致敏作用，主要反映在抗-OA IgE抗體響應較低以及從激活小鼠腹膜腔分離得到的肥大細胞上的抗原誘導組胺釋放降低。在過敏性反映中U-KRS對卵清蛋白抗原性的影響可以通過大鼠異源PCA反應來進行檢測。
結果結果顯示，使用U-KRS而在混合物中制得的OA與抗-OA IgE抗體的反應能力下降，這些抗-OA IgE抗體的產生是用來對抗小鼠中和在異源PCA反應中固定在大鼠肥大細胞表面上的天然OA。結果暗示，U-KRS的OA預處理可以影響其抗原性屬性和與用于對抗天然IgE分子的抗-OA IgE抗體的反應能力。
實例19使用U-KRS對早期骨質疏松癥治療的影響材料和方法U-KRS以30毫克/千克的劑量對患有卵巢切除術誘導的早期骨質疏松癥的雌大鼠每兩天進行腹腔給藥持續六個月。在手術的第二天，開始進行U-KRS給藥。在采用U-KRS長期治療的最后，測定每只大鼠的肱骨強度和大鼠腿節的一些性能。
結果結果顯示，通過六個月的U-KRS治療可以阻止肱骨的機械強度降低以及卵巢切除術導致的腿節變化。
實例20U-KRS制劑對流行性感冒病毒和大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的影響材料和方法APR8/HON1/34菌株的流行性感冒病毒，在老母雞胚胎上培養10天時間；使用大腸桿菌為當前應用的臨床材料以及金黃色葡萄球菌菌株209P。290614系列U-KRS制劑。
結果本研究證明，U-KRS制劑在受感染巨大機體中具有抗感染性能。這個影響通過宿主免疫系統中的一些部分的刺激來完成，而這個刺激由微生物或經這些微生物感染的細胞的二級破壞來實現。
實例21對于流行性感冒病毒的生物活性材料和方法A型病毒，Port-Chalmers 1/73 culture，抗原性的H3N2變種。每個胚胎分別以1、10和100 EID50濃度注入。U-KRS重新溶解在Hanks溶液中。
結果研究證明，U-KRS對感染過程具有牽制行為。
實例22U-KRS對輻射影響的行為材料和方法16/20g體重的CBA/J雄小鼠。
對小鼠進行范圍從6.0Gy到7.5Gy的短期全身γ輻射。使用CEGO裝置并使用8.75Gy的累積量來完成長期輻射。
U-KRS以0.1、1.4和12毫克/千克體重的劑量進行腹腔給藥。
結果對小鼠通過使用0.1到12毫克/千克的U-KRS藥物劑量來研究改變輻射影響的能力。研究發現U-KRS對于5.00到7Gy輻射量來說小鼠的存活率增加了50-60％，而對于7.5Gy的輻射量沒有產生影響。變化藥物劑量不會影響輻射的結果。
目前研究的主要結果是發現了U-KRS在同時使用預防和治療方法時能夠改變輻射影響。
實例23抵抗電離輻射的效果材料和方法布雷斯特癌科，結腸直腸腺癌，惡性腦瘤和胰腺癌細胞系。U-KRS制劑。
測試了U-KRS在0.2μG ML向上濃度范圍內對細胞存活的效果。暴露時間為1、3和24小時，此后細胞用磷酸鹽緩沖液和新配培養液進行洗滌。
結果U-KRS治療導致了克隆細胞存活上的分化時間和劑量依賴性的降低。對全部檢測的人體腫瘤細胞系顯示，它們對于U-KRS具有不同的靈敏性，與經過24小時的人體纖維原細胞相比較，克隆存活率下降了高達100倍。
權利要求
1.一種生物堿反應產品，至少包括一種來自于一種或多種生物堿與烷化劑反應得到的生物堿衍生物，這里在季胺衍生物中含有一個首位叔基氮，作為第四個配基，連接有一個氫殘基或來自于烷化劑的一個殘基，該殘基最好從下列基團中選用甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氫硫化物殘基，或來自于三(1-吖啶基)磷化氫硫化物的一部分。
2.根據要求1獲得的生物堿反應產物，其中至少一種生物堿衍生物以水溶鹽的形式存在，最好以鹽酸鹽的形式存在。
3.根據要求1獲得的生物堿反應產物，其中生物堿至少為一種存在于Chelidoniummajus L.藥草中的生物堿，最好為Chelidonium majus L.幾種或全部生物堿的混合物。
4.根據要求1到3中任意一條獲得的生物堿反應產物，其中生物堿從下列物質中選擇白屈菜堿，普托品，stylopin，別隱品，高白屈菜堿，血根堿，chelamidine，chelamine，L-金雀花堿和氧化白屈菜堿。
5.根據要求1到4中任意一條獲得的生物堿反應產物，其中自屈菜堿、氧化白屈菜堿或甲氧基白屈菜堿作為一種單獨的生物堿來源而存在。
6.根據要求1到5中任意一條獲得的生物堿反應產物，其中產品至少包括一種化合物，來自于下列物質未反應的叔胺生物堿、未反應的烷化劑和烷化劑的分解產物。
7.根據要求1到6中任意一條獲得的生物堿反應產物，其中產品至少采用下列一種分析手段來顯示其結果圖4中的NMR光譜，圖5中的紫外光譜，圖7和8中的質譜，和表1中的基本分析。
8.根據要求1到7中任意一條獲得的生物堿反應產物，可以根據在要求11-22中限定的工藝來生成。
9.一種白屈菜堿衍生物，其中天然產生的白屈菜堿按照下列分子式(I)并以一種季胺形式存在， 其中作為第四個配基，可以為氫或甲基或乙基殘基。
10.要求9中的白屈菜堿衍生物呈現水溶形態，最好是一種強酸的鹽，尤其更好的是一種鹽酸鹽。
11.生產一種生物堿反應產物的一種工藝限定在要求1中，包括a)提供了一種反應混合物，包括一種有機溶劑、和至少一種化學結構上有叔基氮的生物堿、和一種烷化劑，并且在有機溶劑存在的情況下，讓至少一種生物堿和烷化劑進行一個烷化反應，來使得形成至少一種反應產物，其中烷化發生在生物堿叔基氮位置，因此可以將叔基氮轉化成一個季基氮；b)在反應結束并得到相應的反應產物后，用液態溶劑或水至少進行一次洗滌步驟，以此來除去存在于反應產物中的可溶成分；以及c)使得氣態或液態的強酸來處理反應產物，最好為氣體氯化氫或一種鹽酸溶液，來用于將至少一種剩余反應產物轉化成一種水溶形態，尤其為一種水溶鹽。
12.要求11的工藝，其中在步驟c)中在用酸進行處理后，反應產物出現沉淀，然后沉淀從有機溶劑中分離，更好的是使用有機溶劑可選擇的進行進一步純化。
13.要求11或12的工藝，其中烷化反應在較高溫度下進行，尤其在溶劑的沸點溫度最合適。
14.根據要求11到13中任意一條工藝，其中至少一種生物堿存在于Chelidoniummajus L.藥草中，最好為Chelidonium majus L.幾種或全部生物堿，可以作為生物堿源使用。
15.與要求11-14的任意一條相關的流程，其中生物堿是從由白屈菜生物堿、普托品、stylopin、別隱品、高白屈菜生物堿、血根堿、chelamidine、chelamine、L-金雀花堿及氧化白屈菜堿中組成的分細中選擇出來的。
16.與要求11-15的任意一條相關的流程，其中白屈菜生物堿、氧化白屈菜堿或甲氧基白屈菜生物堿可用作單獨的生物堿源。
17.與要求11-16的任意一條相關的流程，其中烴化劑在生理機能上為活性劑，更適宜的說，應為細胞毒劑。
18.與要求11-17的任意一條相關的流程，其中烴化劑可溶于水，或遇水分解為可溶于水的成分。
19.與要求11-18的任意一條相關的流程，其中有機溶劑促進或導致生物堿反應，這種溶劑最好是從由氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷的分組中選擇的。
20.與要求11-19的任意一條相關的流程，其中烴化劑為三(1-吖啶基)磷化氫硫化物(CAS52-24-4)。
21.與要求11-20的任意一條相關的流程，其中，反應產物至少包含一個從由白屈菜生物堿、氧化白屈菜堿和甲氧基白屈菜生物堿組成的分組中選擇的化合物，其中所說的化合物具有四元氮原子，作為該原子的第四個配合基，氫原子團或源自烴化劑的原子團收到限制，該原子團最好是從由甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氫硫化物原子團組成的分組中選擇出來的。
22.與要求21的任意一條相關的流程，其中三(1-吖啶基)磷化氫硫化物用作烴化劑，其中所說的殘留物為所說的烴化劑的一部分，由于使用酸來進行處理，因此可隨意形成分解產物。
23.將要求1到10的任意一條中定義的反應產物用作藥物或藥劑。
24.將要求1到10的任意一條中定義的反應產物用于制造預防或治療從由以下疾病組成的分組中選擇的疾病或身體狀況的藥物成分病毒感染、癌癥、免疫功能紊亂、代謝紊亂和輻射損傷。
25.按照要求24加以使用，在該要求中，疾病是從由過敏癥、骨質疏松癥、皮膚腫瘤、流感病毒感染、風濕性疾病、傷疤、手術后創傷、癲癇癥和多發性腦脊髓硬化癥組成的分組中選擇的。
全文摘要
本發明涉及了可從以下過程中獲得的生物堿反應產物生物堿與烴化劑(最好是硫替派)進行反應，之后通過水洗或利用適當的水溶劑洗滌，將未反應的烴化劑和其它溶于水的成分從反應混合物中去除，然后利用強酸，最好是硫化氫(HCl)對反應混合物進行處理，以沉淀反應物的水溶性鹽。沉淀的反應產物至少包含一個季胺生物堿衍生物，并可用作疾病預防或治療應用的藥物，尤其是用作治療免疫功能紊亂或代謝紊亂以及癌癥的藥物。
文檔編號C07D491/00GK1706845SQ200410045600
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優先權日2004年6月11日
發明者沃瑟, 諾維克 申請人:林士煌