專利名稱：制備與樹脂結(jié)合的環(huán)狀肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以片段為基礎(chǔ)制備與樹脂結(jié)合的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類似物的方法，所述類似物含有至少一個在兩個不相鄰的氨基酸殘基側(cè)鏈之間的橋。更具體地講，本發(fā)明涉及固相合成所述環(huán)狀肽類似物的方法以及該方法所用的肽片段。
背景技術(shù)：
環(huán)狀肽亞單位存在于多種具有有用的生物學活性的肽中，包括甲狀旁腺激素類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白類似物、血管活性肽類似物、縮膽囊肽類似物、腫瘤壞死因子(TNF)衍生的肽、降鈣素類似物、促生長素抑制素類似物、細胞粘著調(diào)節(jié)劑、生長激素釋放因子(GRF)類似物、緩激肽拮抗劑、酪氨酸活化基元類似物(TAM模擬物)和糊精激動劑。特別感興趣的是環(huán)狀肽甲狀旁腺激素(hPTH)類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(hPTHrP)類似物。
人甲狀旁腺激素(hPTH)為鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)物，是一個84個氨基酸的蛋白質(zhì)。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(hPTHrP)為與hPTH具有N末端同源性的139-171個氨基酸的蛋白質(zhì)。hPTH和hPTHrP的N末端片段，尤其是由氨基酸1-34組成的那些保留了親代激素的全部生物學活性。
hPTH(1-34)具有下面的氨基酸序列Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.
hPTHrP(1-34)具有下面的氨基酸序列
Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala.
hPTH的生物學活性反映在第二信使系統(tǒng)的活化中G-蛋白偶聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性和G-蛋白偶聯(lián)和未偶聯(lián)蛋白激酶C(PKC)活性。就人和卵巢切除的大鼠中的骨形成而言，N末端片段hPTH(1-34)OH和hPTH(1-34)NH2已分別被證實是合成代謝的。這種骨生長的增加已證實與腺苷酸環(huán)化酶活性的刺激相偶聯(lián)。這些N末端片段的類似物對于治療與骨細胞鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的生理疾病具有顯著的治療功效包括低血鈣；骨質(zhì)疏松；骨質(zhì)減少；和與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少相關(guān)的疾病，如甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退和庫欣綜合癥；糖皮質(zhì)激素和免疫抑制誘導(dǎo)的骨質(zhì)減少；骨折和骨再折術(shù)恢復(fù)。
還已證實從hPTH(1-34)的N末端缺失多達6個氨基酸殘基明顯降低得到的類似物刺激腺苷酸環(huán)化酶的能力，同時對受體結(jié)合幾乎沒有影響。因此，在N末端截短高達6個氨基酸殘基的hPTH(1-34)類似物抑制PTH的作用，可用于治療特征為PTH過量的疾病，如甲狀旁腺過量亢進和與甲狀旁腺功能減退相關(guān)的高血鈣危象、惡性高血鈣疾病、腎衰竭和高血壓。
hPTH(1-27)-(1-34)的無環(huán)類似物公開在美國專利號4,086,196中。hPTH(1-34)和hPTHrP(1-34)的無環(huán)類似物公開在美國專利號5,589,452中。[Nle8，Nle18，Tyr34或Phe34]hPTH(1-34)公開在美國專利號4,656,250中。[Nle8，Nle18，Tyr34]hPTH(1-34)和其N末端截短衍生物公開在美國專利號4,771,124和4,423,037中。PTH(1-34)的其它無環(huán)類似物公開美國專利號5,723,577和5,434,246，WO 97/02834、EPA561412-A1、EPA 747817-A2、WO-94/02510、WO 9603437和WO9511988-A1中。hPTH(1-28)NH2至hPTH(1-31)NH2和[Leu27]hPTH(1-28)NH2至[Leu27]hPTH(1-33)NH2的類似物描述在美國專利號5,556,940中。包括PTH的N末端截短類似物的PTH受體的無環(huán)拮抗劑公開在美國專利號5,446,130、5,229,489、4,771,124和4,423,037中。
公開了hPTH和hPTHrP的單環(huán)和雙環(huán)類似物。環(huán)(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-34)NH2和環(huán)(Lys27-Asp30)hPTH(1-34)NH2公開在美國專利號5,556,940中。Barbier等(藥物化學雜志1997，40，1373)描述了環(huán)(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-31)NH2、環(huán)(Glu22-Lys26)[Leu27]hPTH(1-31)NH2和環(huán)(Lys27-Asp30)hPTH(1-31)NH2。hPTH(1-34)或hPTHrP(1-34)的單環(huán)和雙環(huán)衍生物公開在專利文件WO96/40193、DE19508672-A2和A.Bisello等，生物化學1997，36，3293中。M.Chorev等，生物化學1991，30，5698公開了一種PTH受體的可能的拮抗劑，環(huán)(Lys13-Asp17)hPTH(7-34)NH2。且Kanmera等，“肽化學1993Okada，Y.，編蛋白質(zhì)研究基礎(chǔ)，Osaka，1994，321-324”描述了hPTHrP的一系列含酰胺的類似物。
WO 98/51324公開了式I的環(huán)肽化合物X-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-YI或其可藥用鹽或前藥，其中X選自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-，(f)R1a-A6-A7-A8-A9-，(g)R1a-A7-A8-A9-，(h)R1a-A8-A9-，(i)R1a-A9-，和(j)R1a-；Y選自
(a)-R3，(b)-A28-R3，(c)-A28-A29-R3，(d)-A28-A29-A30-R3，(e)-A28-A29-A30-A31-R3，(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3，(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a為H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b為R1a或下式的基團 或 R2為烷基、鏈烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3為式A35-OR4或A35-NR4R5的基團；R4和R5彼此獨立地為H或低級烷基；R6和R9彼此獨立地為H或烷基；R7為烷基；R8為H、烷基或COR2；R10為H或鹵素；R11為烷基或芳烷基；m為1，2或3；n為3或4；A0不存在或為1-6個氨基酸殘基的肽；A1為Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2為Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；
A3為Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4為Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5為Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6為Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7為Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8為Leu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9為His、Ala、D-Pro或Gly或其等同的氨基酸；A10為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A11為Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12為Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A14為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、His、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A15為Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16為Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A18為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Leu、Lys、Orn、Nle、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A19為Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20為Arg或其等同的氨基酸；A21為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Val、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A22為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Phe、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A23為Leu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24為Leu或其等同的氨基酸；
A25為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、D-Pro、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A26為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A27為Leu或Lys或其等同的氨基酸；A28為Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29為Ala、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gln、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A30為Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A31為Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32為His或其等同的氨基酸；A33為Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34為Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或為1-4個氨基酸的肽；和至少一個下面的氨基酸殘基對的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個橋，這些氨基酸殘基對為A10與A14、A13與A17、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25、A25與A29和A26與A30，并且下面各個氨基酸殘基的側(cè)鏈最多導(dǎo)致形成一個橋，這些氨基酸殘基為A10、A13、A14、A17、A18、A21、A22、A25、A26、A29和A30；條件是當下面的氨基酸殘基對A13與A17或A26與A30的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個橋時，至少一個下面的氨基酸殘基對A10與A14、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25和A25與A29的側(cè)鏈也經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接。
式I的肽化合物的一個優(yōu)選亞組包括如下肽化合物，其中X選自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，
(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-，(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-，(f)R1a-A6-A7-A8-A9-，(g)R1a-A7-A8-A9-，(h)R1a-A8-A9-，(i)R1a-A9-，和j) R1a-；Y選自(a)-R3，(b)-A28-R3，(c)-A28-A29-R3，(d)-A28-A29-A30-R3，(e)-A28-A29-A30-A31-R3，(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3，(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a為H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b為R1a或式 或 R2為烷基、鏈烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3為式A35-OR4或A35-NR4R5；
R4和R5彼此獨立地為H或低級烷基；R6和R9彼此獨立地為H或烷基；R7為烷基；R8為H、烷基或COR2；R10為H或鹵素；R11為烷基或芳烷基；A0不存在或為1-6個氨基酸殘基的肽；A1為Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2為Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3為Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4為Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5為Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6為Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7為Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8為Leu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9為His、Ala、Gly、D-Pro或其等同的氨基酸；A10為Ala、Asn、Gly、Asp或D-Pro或其等同的氨基酸；A11為Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12為Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13為Ala、Gly、Lys或其等同的氨基酸；A14為Ala、His、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A15為Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17為Ala、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A18為Lys或其等同的氨基酸；A19為Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20為Arg或其等同的氨基酸；A21為Arg、Asp、Lys、Val或其等同的氨基酸；A22為Asp、Glu、Lys、Orn或其等同的氨基酸；
A23為Leu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24為Leu或其等同的氨基酸；A25為Arg、Asp、Glu、His、Lys或其等同的氨基酸；A26為His、Lys或其等同的氨基酸；A27為Leu或Lys或其等同的氨基酸；A28為Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29為Ala、Asp、Glu、Gln或其等同的氨基酸；A30為Asp、Glu、Lys或其等同的氨基酸；A31為Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32為His或其等同的氨基酸；A33為Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34為Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或為1-4個氨基酸的肽。
上述肽化合物公開于WO 98/51324，它們具有有用的特性，更具體地說為藥物學特性。它們特別適用于治療能夠通過可與甲狀旁腺激素受體結(jié)合的伴隨或不伴隨刺激腺苷酸環(huán)化酶活性的化合物來調(diào)節(jié)的疾病。本發(fā)明涉及合成這些肽化合物的改進的方法。
環(huán)狀肽的固相合成通常包括，在肽合成樹脂上順次加成氨基酸以得到與樹脂結(jié)合的具有所需環(huán)肽的全部或部分氨基酸序列的肽。然后將準備環(huán)化的氨基酸側(cè)鏈殘基脫保護并進行環(huán)化。如果環(huán)化在整個氨基酸序列完成之前進行，則加入剩余的氨基酸，然后將完成了的肽從樹脂上裂解并進行純化。
但是，制備肽和環(huán)肽的線性方法通常不很有效，因此在大量制備肽時成本很高。當以線性方式裝配肽時，隨著肽中氨基酸殘基數(shù)量的增加，肽的純化會越來越困難。此外，對于環(huán)肽，在合成接近結(jié)束時制備側(cè)鏈橋?qū)o整個肽帶來與制備側(cè)鏈橋有關(guān)的問題，包括收率低、副反應(yīng)和雜質(zhì)的去除。因此，在長肽中摻入環(huán)狀單元增加了直鏈肽合成的難度。上文中所描述的公開于WO 98/51324中的那些環(huán)狀hPTH類似物的商業(yè)可行性合成需要克服了長的和環(huán)狀成分的復(fù)雜因素，并且就藥物生產(chǎn)而言能夠進行商業(yè)有用量的制備的合成方法。本發(fā)明涉及通過使用橋接和非橋接片段的方法更有效地制備環(huán)狀hPTH和HRPHrP類似物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及制備下式的環(huán)狀hPTH和HRPHrP類似物的方法 其中J、L和M是線性肽片段，K1不存在或為環(huán)狀肽片段，且K2是環(huán)狀肽片段；該方法包括如下步驟(1)通過向樹脂上順次連接適宜保護的氨基酸殘基制備M-_，制得M-_ III其中_是適宜的肽合成樹脂，M是多肽片段；(2)通過常規(guī)的肽合成單獨制備式IV的N-末端保護的環(huán)狀多肽片段 其中P是適宜的胺保護基，(3)將III與IV偶聯(lián)得到式V的肽 (4)如果K2不存在，則(a)以式VI的單個多肽的形式制備多肽片段J和L 然后將多肽VI與肽V偶聯(lián)得到式VII的肽 或者，選擇性地，(b)向式V的肽片段中順次加入多肽J和L的保護了的單個氨基酸單元，或者，選擇性地，(c)以多肽片段的形式單獨制備J和/或L，并偶聯(lián)到從式V的片段開始的正在延伸的肽上，(5)當存在環(huán)肽K1時，則(a)通過常規(guī)的肽合成方法單獨制備式VIII的多肽片段 其中P是適宜的胺保護基，(b)制備式IX的肽片段 并與肽片段V偶聯(lián)得到式X的肽片段 且(c)將環(huán)狀肽片段VIII與式X的肽片段偶聯(lián)得到式XI的肽片段
(d)制備式XII的肽片段 并將片段XII與片段XI偶聯(lián)，然后(6)將樹脂裂解并脫保護。
在本文所述的方法中，單獨制備環(huán)狀肽片段用于和樹脂或與樹脂結(jié)合的肽偶聯(lián)。通過單獨制備環(huán)狀肽片段，可以進行與樹脂結(jié)合的環(huán)肽的會聚合成，從而提高了所生成的環(huán)肽的收率和產(chǎn)量。與制備橋接片段有關(guān)的困難被局限在了較小的肽亞單位，所述肽亞單位可以在和固相合成樹脂偶聯(lián)之前進行純化。該技術(shù)在某些優(yōu)選的hPTH和hPTHrP類似物中的實踐需要合成新的肽片段和新的操作順序。
發(fā)明詳述若無另外說明，如上面以及整個說明書所使用的下列術(shù)語將被理解為具有下面的含義。
術(shù)語的定義“烷基”指鏈中含有約1-約20個碳原子的直鏈或支鏈脂族烴基團。支鏈指一個或多個低級烷基基團與直鏈烷基鏈相連。“低級烷基”指在可為直鏈或支鏈的鏈中含有約1-4個碳原子。烷基基團實例為甲基、乙基、正丙基和異丙基、正、仲、異和叔丁基等。
“鏈烯基”指包含碳-碳雙鍵的脂族烴基基團，其可為在鏈中含有約2-約20個碳原子的直鏈或支鏈?！暗图夋溝┗敝冈诳蔀橹辨溁蛑ф湹逆溨泻屑s2-4個碳原子。作為實例的鏈烯基基團包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、環(huán)己基丁烯基和癸烯基。
“炔基”指包含碳-碳三鍵的脂族烴基基團，其可為在鏈中含有約2-約20個碳原子的直鏈或支鏈?！暗图壢不敝冈诳蔀橹辨溁蛑ф湹逆溨泻屑s2-4個碳原子。作為實例的炔基基團包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、3-甲基丁-2-炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸烯基。
“亞烷基”指通過除去兩個氫原子而從直鏈或支鏈飽和烴衍生的二價基團，例如亞甲基、1，2-亞乙基、1，1-亞乙基、1，3-亞丙基、2，2-二甲基亞丙基等。
“苯基烷基”指經(jīng)亞烷基與母體分子部分相連的苯基。亞烷基優(yōu)選含有約1至約7個碳原子。代表性的苯基烷基包括芐基、2-苯基乙基、2-苯基丙基等。
“胺保護基”指本領(lǐng)域已知的易于除去的基團，該基團可以防止氨基在合成過程中發(fā)生不利的反應(yīng)并且可以被選擇性地除去。N-保護基的使用是防止基團在合成過程中發(fā)生不利反應(yīng)的本領(lǐng)域中熟知的，并且許多這種保護基是已知的，參見，例如T.H.Greene和P.G.M Wuts，有機合成中的保護基，第2版，John Wiely & Sons，New York(1991)，該文獻引入本文作為參考。優(yōu)選的N-保護基是?；?，包括甲?；⒁阴；?、氯乙?；?、三氯乙?；⑧?硝基苯乙酰基、鄰-硝基苯氧基乙?；?、三氟乙?；?、乙酰乙?；?、4-氯丁?；?、異丁?；?、鄰-硝基硝基肉桂?；?、吡啶甲?；?、?；惲蚯杷狨?、氨基己?；⒈郊柞；?，以及酰氧基，包括甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、2，2，2-三氟乙氧羰基、2-三甲基硅烷基乙氧羰基、乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基(BOC)、1，1-二甲基丙炔氧羰基、芐氧羰基(CBZ)、對-硝基苯基亞磺?；?硝基芐氧羰基、2，4-二氯芐氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)等。
“氨基酸”指如本文所定義的選自天然和非天然氨基酸的氨基酸。取決于側(cè)鏈的取代基，氨基酸可為中性、帶正電或帶負電?！爸行园被帷敝赴粠щ姾傻膫?cè)鏈取代基的氨基酸。作為實例的中性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸。“帶正電的氨基酸”指在生理pH下側(cè)鏈取代基帶正電的氨基酸。作為實例的帶正電的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸?！皫ж撾姷陌被帷敝冈谏韕H下側(cè)鏈取代基帶凈負電的氨基酸。作為實例的帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。優(yōu)選的氨基酸為α-氨基酸。最優(yōu)選的氨基酸為在α-碳原子上具有L-立體化學的α-氨基酸。
“氨基酸殘基”指摻入到肽或肽片段中的各氨基酸單元。
“天然氨基酸”指選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的α-氨基酸。
“非天然氨基酸”指沒有核酸密碼子的氨基酸。非天然氨基酸的實例包括例如上述天然α-氨基酸的D-異構(gòu)體；Aib(氨基丁酸)、bAib(3-氨基異丁酸)、Nva(正纈氨酸)、β-Ala、Aad(2-氨基己二酸)、bAad(3-氨基己二酸)、Abu(2-氨基丁酸)、Gaba(γ-氨基丁酸)、Acp(6-氨基己酸)、Dbu(2，4-二氨基丁酸)、α-氨基庚二酸、TMSA(三甲基硅基-Ala)、aIle(別異亮氨酸)、Nle(正亮氨酸)、叔亮氨酸、Cit(瓜氨酸)、Orn、Dpm(2，2’-二氨基庚二酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)、α-或β-Nal、Cha(環(huán)己基-Ala)、羥基脯氨酸、Sar(肌氨酸)等；環(huán)狀氨基酸；Nα-烷基化的氨基酸，如MeGly(Nα-甲基甘氨酸)、EtGly(Nα-乙基甘氨酸)和EtAsn(Nα-乙基天冬酰胺)；和α碳原子具有兩個側(cè)鏈取代基的氨基酸。
“等同的氨基酸”指在根據(jù)本發(fā)明的肽中可被另一個氨基酸替換而沒有任何顯著的功能喪失的氨基酸。在進行這些改變中，根據(jù)側(cè)鏈取代基的相對相似性進行類似氨基酸的替換，例如考慮如本文所描述的大小、電荷、親水性、hydropathicity和疏水性。
如被本文引作參考的美國專利號4,554,101所詳細描述的，氨基酸殘基被確定具有下面的親水性值A(chǔ)rg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)和Trp(-3.4)。應(yīng)理解一個氨基酸殘基可替換具有類似親水性值的另一個氨基酸(例如在+或-2.0的值之間)，并且仍獲得生物學等同的多肽。
用類似的方法，可根據(jù)親水性指數(shù)的相似性進行替換。根據(jù)其疏水性和電荷特性各氨基酸殘基被確定了一個親水性值。那些親水性指數(shù)為Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。在根據(jù)親水性指數(shù)進行替換中，優(yōu)選+或-2.0之間的值。
“肽”和“多肽”指單體為經(jīng)酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。本發(fā)明優(yōu)選的肽化合物為包含α-氨基酸的那些。首選的本發(fā)明的肽含有在α-碳具有L立體化學的α-氨基酸。
“環(huán)肽”指含有一個或多個本文所定義的環(huán)肽片段的肽。
“肽片段”指母肽的肽亞單位。肽片段可以包括靶肽的直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的亞單位。
“直鏈的肽”指其中的氨基酸是通過一個氨基酸的N-末端與另一個氨基酸的C-末端之間的酰胺鍵彼此連接的肽或多肽。
“支鏈的肽”指其中的一個或多個帶有羧基或胺側(cè)鏈的組成氨基酸通過這些側(cè)鏈與其它肽取代基連接的肽或多肽。
“環(huán)狀肽片段”指本文所定義的肽片段，其中，一個氨基酸殘基上的取代基與肽片段中另一個氨基酸殘基上的取代基相連。連接優(yōu)選是在肽片段中的兩個氨基酸殘基的側(cè)鏈之間，優(yōu)選通過酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接。兩個氨基酸側(cè)鏈之間的鍵在此指定為 連接環(huán)肽的兩個氨基酸殘基的酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵在側(cè)鏈功能基之間形成。因此，酰胺鍵在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基之間形成；酯鍵在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和含羥基氨基酸殘基的側(cè)鏈羥基之間形成；二硫鍵由含有側(cè)鏈巰基的氨基酸殘基形成；羊毛硫氨酸橋通過將相應(yīng)的二硫化物脫硫形成。
由按照以上描述形成的酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵所產(chǎn)生的橋中的原子數(shù)量將根據(jù)側(cè)鏈的長度和鍵的類型(即酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵)而改變。所述的橋優(yōu)選含有2-12個原子，更優(yōu)選6-10個原子。橋中所含原子的最優(yōu)選的數(shù)量為7，該橋優(yōu)選含有Lys和Asp殘基的側(cè)鏈功能基之間的酰胺鍵。
“樹脂“指用活潑基團修飾的固體載體，從而該固體載體可以和本文所定義的氨基酸、肽或環(huán)肽片段的羧基或N-末端偶聯(lián)。代表性的樹脂包括Merrifield樹脂(氯甲基化的聚苯乙烯)、羥甲基樹脂、2-氯三苯甲基氯化物樹脂、三苯甲基氯化物樹脂、Rink酸樹脂(4-芐氧基-2′，4′-二甲氧基二苯基甲醇樹脂)、三苯甲醇樹脂、PAM樹脂(4-羥基甲基-苯基乙酰氨基甲基樹脂)、Wang樹脂(對-芐氧基芐醇樹脂)、MBHA樹脂(對-甲基二苯甲基胺樹脂)、BHA樹脂(二苯甲基胺樹脂)、Rink酰胺樹脂(4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基樹脂)和PAL樹脂(5-(4-Fmoc-氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基)戊酸-MBHA樹脂)。優(yōu)選的樹脂是氯代三苯甲基樹脂、Rink酸樹脂和Rink酰胺樹脂。
“固體載體”指對本文所述的反應(yīng)物和反應(yīng)條件呈惰性，并且在所用的溶媒中基本不溶的底物。代表性的固體載體包括無機底物如硅藻土、硅膠和可控孔度玻璃；有機聚合物，包括聚苯乙烯，包括1-2％共聚苯乙烯二乙烯基苯(凝膠形式)和20-40％共聚苯乙烯二乙烯基苯(大孔形式)、聚丙烯、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、纖維素等；復(fù)合無機/聚合物組合物如固定在硅藻土顆粒基質(zhì)內(nèi)聚丙烯酰胺。參見，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.(Chicago，IL，1984)。
此外，“固體載體”還包括固定在第二種惰性載體上的上述固體載體，所述第二種惰性載體是，例如技術(shù)手冊，MultipinTMSPOC，Chiron Technologies(1995)和其中的參考文獻中所描述的針，所述的針含有基于聚乙烯或聚丙烯的接有氨基功能基化的甲基丙烯酸酯共聚物的可檢測的頭和惰性的干。
此外，“固體載體”還包括聚合物載體，例如Janda等，美國國家科學院院報，92，6419-6423(1995)和S.Brenner，WO 95/16918中記載的聚乙二醇載體，該載體可溶于多種溶劑，但可以通過加入導(dǎo)致沉淀的溶劑析出沉淀。
本文使用的天然和非天然氨基酸和其殘基的名稱遵循由IUPAC有機化學命名委員會建議的和IUPA-IUB生物化學命名委員會在“α-氨基酸命名法(推薦，1974)”生物化學，14(2)，(1975)中提出的命名規(guī)則。鑒于用于本發(fā)明說明書和所附權(quán)利要求中的氨基酸和其殘基的命名和縮寫不同于所述的那些，不同的名稱和縮寫將使所述內(nèi)容變得清楚。
如本發(fā)明方法中制備的代表性的肽化合物指例如環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2，相連的氨基酸殘基位于“環(huán)”后面的圓括號中，取代的天然序列的氨基酸放置在方括號中。hPTH代表人PTH，PTHrP代表人甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白。第二個圓括號中的數(shù)字指從N末端開始氨基酸殘基在肽化合物中的數(shù)目(即hPTH的前31個氨基酸)。
優(yōu)選的實施方案如反應(yīng)方案1所示，與樹脂結(jié)合的環(huán)肽的制備涉及將環(huán)狀和無環(huán)的肽片段與樹脂、樹脂結(jié)合的氨基酸或樹脂結(jié)合的肽偶聯(lián)。
反應(yīng)方案1 _是適于肽合成的樹脂。T是H2N、氨基酸或環(huán)狀或無環(huán)的肽；E和Q均是或彼此獨立地是N末端保護的氨基酸，或N末端保護的環(huán)狀或無環(huán)的肽片段。
偶聯(lián)優(yōu)選在肽片段的羧基末端和樹脂、樹脂結(jié)合的氨基酸或樹脂結(jié)合的肽之間完成。當肽片段與樹脂結(jié)合的氨基酸或肽偶聯(lián)時，偶聯(lián)優(yōu)選通過環(huán)肽片段的羧基末端和與樹脂結(jié)合的氨基酸或肽的N末端之間的酰胺鍵來完成。
為了使偶聯(lián)反應(yīng)進行，必需將肽片段的羧基活化。有多種活化方法可用于本發(fā)明的實踐，包括，例如預(yù)形成的對稱酸酐(PSA)、預(yù)形成的混合酸酐(PMA)、酰氯、活潑酯；以及將羧酸就地活化的方法，參見Fields & Noble，1990，“利用9-芴基甲氧羰基氨基酸進行固相肽合成”，國際肽與蛋白質(zhì)研究雜志(Int.J.Pept.Protein Res.)，35161-214。
代表性的活化試劑包括，氯甲酸異丙酯、二異丙基碳二亞胺(DIC)、DIC與1-羥基苯并三唑(HOBT)的混合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、二(2-氧代-3-惡唑烷基)膦酰氯(BOP-Cl)、苯并三唑-1-基氧基-三((二甲氨基)鏻)六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、溴代-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸鹽(PyBROP)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、2-[2-氧代-1-(2H)-吡啶基]-1，1，3，3-二亞戊基脲鎓四氟硼酸鹽(TOPPipU)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、DCC與HOBT的混合物等。用于偶聯(lián)反應(yīng)的適宜溶劑包括二氯甲烷、DMF、DMSO、甲苯、THF等。偶聯(lián)時間為約1至約48小時，這取決于待偶聯(lián)的樹脂和羧酸衍生物、活化試劑、溶劑和溫度。偶聯(lián)在約-10℃至約50℃下進行，優(yōu)選在大約室溫下進行。
為了防止干擾上述的偶聯(lián)反應(yīng)，將環(huán)肽部分的N末端用對酸或堿敏感的基團保護。所述保護基應(yīng)當在酰胺鍵形成的條件下是穩(wěn)定的，同時又很容易被除去而不會破壞伸長的肽鏈，或使其中所含的任何手性中心外消旋化。適宜的保護基是9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、二苯基異丙氧羰基、叔戊氧羰基、異冰片基氧羰基、(α，α)二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基、鄰硝基苯基亞磺?；?、2-氰基-叔丁氧羰基等。優(yōu)選9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護基。
同樣，對環(huán)肽片段中的活潑側(cè)鏈功能基也需要進行保護。特別優(yōu)選的側(cè)鏈保護基是，對于賴氨基和精氨酸的側(cè)鏈氨基基團為2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(pmc)、硝基、對甲苯磺?；?、4-甲氧基苯基磺?；?、Cbz、Boc、Alloc(烯丙基氧羰基)和金剛烷基氧羰基；對于酪氨酸芐基、鄰溴芐基氧羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙?；?Ac)；對于絲氨酸叔丁基、芐基和四氫吡喃基；對于組氨酸三苯甲基、芐基、Cbz、對甲苯磺酰基和2，4-二硝基苯基；對于色氨酸甲?；虰oc；對于天冬酰胺和谷氨酰胺Trt(三苯甲基)；對于天冬氨酸和谷氨酸O-t-Bu和O-烯丙基和O-芐基。
片段與樹脂或樹脂結(jié)合肽的偶聯(lián)優(yōu)選在約室溫下、用約2摩爾當量(相對于樹脂)Fmoc-保護的、用約等摩爾量的苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和羥基苯并三唑水合物活化的環(huán)肽片段在約4當量二異丙基乙基胺的存在下在二甲基甲酰胺中于約16-48小時內(nèi)完成。
必需對偶聯(lián)的完成程度進行評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員對于公知的監(jiān)測試驗是熟知的，例如茚三酮(Kaiser試驗)、苦味酸、2，4，6-三硝基-苯磺酸(TNBS)、熒光胺和氯醌試驗，這些試驗是基于試劑與游離氨基反應(yīng)生成發(fā)色化合物。如果使用亞氨基酸(例如Pro和Hyp)，優(yōu)選的方法是靛紅監(jiān)測。Fields & Noble，文獻出處同上。在反應(yīng)過程中可以對反應(yīng)的完成程度進行定量，參見，例如Salisbury等(國際專利公開文本W(wǎng)O 91/03485)。
對于Fmoc合成，優(yōu)選Kaiser和TNBS試驗。在Kaiser試驗中，可以將樹脂肽樣品用來自Pierce Chemical的茚三酮試劑按照Sarin等提出的方法(1981，分析生物化學，117147-157)進行試驗。同樣，也可將樹脂肽樣品用可從Fluka獲得的三硝基苯磺酸(TNBS)按照Takajashi提出的方法(1984，化學通訊，1127)進行試驗。
如果有試驗表明偶聯(lián)反應(yīng)未完成，則可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法強行使反應(yīng)結(jié)束，包括，(a)用1-5倍過量的保護的氨基酸重復(fù)進行偶聯(lián)，(b)用不同的或添加的溶劑(例如三氟乙烷)重復(fù)進行偶聯(lián)，或者(c)加入離液序列高的鹽如NaCIO4或LiBr(Klis & Stewart，1990，“肽化學，結(jié)構(gòu)和生物學”，Rivier & Marshall編，ESCOM Publ.，p.904-906)。
優(yōu)選的樹脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式II的結(jié)構(gòu) 其中 是樹脂；P是胺保護基；A不存在或是式 的基團；B是式-A23-A24-A25的基團；C是式-A26-A27-A28-A29-A30-的基團；D是-A31-、-A31-A32-、-A31-A32-A33-或-A31-A32-A33-A34-；其中 是內(nèi)酰胺、酯、二硫化物或羊毛硫氨酸橋；A13、A17、A18和A22是氨基酸殘基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15和A28彼此獨立地是Ile或Leu；Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A23是Phe或TrP(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)或His(Trt)；A26和A30是氨基酸殘基，其中A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸鍵結(jié)合；A27是Leu或Lys(Boc)；A29是Ala或Gln(Trt)；A31是Ile或Val；A32是His(Trt)；A33是Asn(Trt)或Thr(tBu)；A34是Ala或Phe。
另一種優(yōu)選的樹脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式II的結(jié)構(gòu)，其中， 是內(nèi)酰胺橋，并且A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過酰胺鍵結(jié)合。
另一種優(yōu)選的樹脂結(jié)合環(huán)肽具有式II的結(jié)構(gòu)，其中， 是內(nèi)酰胺橋；A13和A18是Lys；A17和A22是Asp；A26是Lys(Boc)；A30是Asp(OtBu)；或者A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過酰胺鍵結(jié)合。
另一種優(yōu)選的樹脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式III的結(jié)構(gòu) 其中， 是內(nèi)酰胺橋；A18是Lys；A19是Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Val；A22是Asp；A23是Trp(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)；A26是Lys(Boc)；A27是Leu；A28是Leu；A29是Gln(Trt)；A30是Asp(OtBu)；A31是Val。
按照以上描述制得的樹脂結(jié)合肽還可以進行進一步的加工，例如與一個或多個另外的環(huán)肽片段偶聯(lián)、與一個或多個肽片段偶聯(lián)、順次加成單個的氨基酸或以上描述的各種組合。
然后將完成的環(huán)肽從樹脂上裂解并純化?？梢栽趶臉渲狭呀庵?、之后或同時除去保護基?？蓪⑼耆摫Ｗo的肽通過以下方法之一或其組合進行純化酸-堿提取、重結(jié)晶、冷凍干燥、采用以下類型之一或其全部的一系列色譜步驟在乙酸鹽形式的弱堿性樹脂上進行離子交換；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如AMBERLITE_XAD)上進行疏水性吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上進行離子交換色譜；在例如SEPHADEX_G-25、LH-20上進行分配色譜或進行逆流分配；高效液相色譜(HPLC)、特別是在辛基-或十八烷基硅烷基-硅膠結(jié)合相柱填料上進行反相HPLC。
肽片段的制備所述片段通過合成肽主鏈進行制備，所述肽主鏈使構(gòu)成片段的氨基酸以其適當?shù)捻樞蜓b配。片段的肽主鏈可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法進行合成。對于固相肽合成，多種技術(shù)的綜述可以參見J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，W.H.Freeman Co.(SanFrancisco)，1963和J.Meienhofer，激素蛋白和肽，第2卷，46頁，Academic Press(New York)，1973。對于經(jīng)典的溶液合成，可以參見G.Schroder和K.Lupke，肽，第1卷，Acacemic Press(New York)，1965。
正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的，在固體載體上進行肽合成通常涉及從羧基或C-末端開始構(gòu)建肽，其中，α-氨基被保護了的C-末端氨基酸與固相聚合物相連。然后裂解掉N-保護基，將同樣是N-保護的下一個氨基酸通過與連接在上述固體載體上的氨基酸之α-氨基之間的肽鍵偶聯(lián)。重復(fù)前一氨基酸的脫保護和下一氨基酸的偶聯(lián)的循環(huán)，直至肽完成。將氨基酸的所有活潑側(cè)鏈通過能夠經(jīng)受得住偶聯(lián)和Nα-脫保護過程但可以在合成結(jié)束時被除去的化學基團進行保護。當用固相方法制備肽片段時，通過從樹脂上裂解得到用于與其它片段偶聯(lián)的片段。
環(huán)肽片段按照類似的方式制備。但是，在主鏈裝配后進行(1)將待環(huán)化的側(cè)鏈功能基選擇性地脫保護，(2)環(huán)化，和(3)選擇性地除去所有剩余的保護基。
使用Fmoc氨基酸是肽合成的一種策略。Boc(叔丁氧羰基保護的氨基)策略還可用于制備與固體載體結(jié)合的肽(例如Geysen等，1987，免疫學方法雜志102259-274.)。
用于肽合成的氨基酸可以是Merrifield(1963，美國化學會志852149-2154)所描述的常規(guī)的Boc(Nα-氨基保護的Nα-叔丁氧羰基)氨基酸，或是Carpino和Han(1972，有機化學雜志373403-3409)所描述的對堿不穩(wěn)定的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和BocNα-氨基保護的氨基酸均可以從Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem或Peninsula Labs或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它化學品公司得到。此外，本發(fā)明的方法也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它Nα-保護基。固相肽合成可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法完成(參見Stewart和Young，1984，固相合成，第2版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Fields和Noble，1990，國際肽、蛋白研究雜志，35161-214)，或用例如ABS所售的自動合成儀合成。
盡管C-末端至N-末端肽合成是常規(guī)的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，也可以從N-末端至C-末端來合成肽片段。
內(nèi)酰胺橋的制備內(nèi)酰胺橋接的環(huán)肽片段通過在以上所述的活化劑的存在下，在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基之間形成酰胺鍵制得。優(yōu)選的酸性氨基酸殘基包括Asp、Glu、-NHCH[(CH2)3CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-。首選Asp。優(yōu)選的堿性氨基酸殘基包括His、Lys、Orn、-NHCH(CH2NH2)CO-和-NHCH[(CH2)2NH2]CO-，首選Lys。
當環(huán)肽片段的肽前體含有一個以上的酸性或堿性氨基酸殘基時，應(yīng)對環(huán)肽片段中其它的酸性或堿性氨基酸的保護基進行選擇，以便使待環(huán)化的氨基酸可以被選擇性地脫保護。優(yōu)選所需的酸性和堿性氨基酸殘基同時被脫保護。此外，除了對用于脫保護選定的堿性和酸性氨基酸殘基所用的試劑穩(wěn)定外，其余氨基酸殘基上的保護基還應(yīng)對所用的環(huán)化條件是穩(wěn)定的。
當用于指側(cè)鏈保護基時，術(shù)語“正交性”指如本文所述的在分子上具有兩種或多種類型保護基，每一種在特定的條件下被最佳地除去，而同時對用來除去其它類型保護基的條件保持穩(wěn)定的情況。因此，可除去一種類型的所有保護基，而保持所有其它保護基的完整性。
優(yōu)選的具有所需正交性的保護基為對于待環(huán)化的酸性氨基酸殘基烯丙基；對于待環(huán)化的堿性氨基酸殘基烯丙基氧羰基(alloc)；對于任何其它酸性氨基酸殘基叔丁基(tBu)；對于任何其它堿性氨基酸殘基叔丁基氧羰基(Boc)。
在用固相或液相技術(shù)合成了環(huán)肽片段的肽主鏈后，通過用鈀，優(yōu)選四(三苯基膦)鈀(O)在N-甲基苯胺的存在下處理，同時除去烯丙基和烯丙氧羰基保護基。接著如本文對酰胺鍵形成所描述的完成酰胺橋的形成。
用于制備本發(fā)明的樹脂結(jié)合環(huán)肽的優(yōu)選的環(huán)肽片段具有式XV、XVI或XVII的結(jié)構(gòu)， 其中 是內(nèi)酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸橋；P是胺保護基；A13、A17、A18、A22、A26和A30是氨基酸殘基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
更優(yōu)選的環(huán)肽片段具有式IV、V或VI的結(jié)構(gòu)，其中 是內(nèi)酰胺橋；P是Fmoc；
A13、A18和A26是Lys；A17、A22和A30是Asp；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
用于制備本發(fā)明的樹脂結(jié)合環(huán)肽的仍更優(yōu)選的環(huán)肽片段是Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH。
適于用本發(fā)明的方法制備的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類似物公開于I.Condon等，U.S.系列號60/046,472(1997年5月14日申請)；2.Willick等，U.S.專利號5,556,940(1997年9月17日)；3.Chorev等，U.S專利號5,717,062(1998年2月10日)；4.Vickery等，WO 96/40775(1996年12月19日公開)。
適于用本發(fā)明的方法制備的優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)X-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-YI其中X選自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-，(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-，(c)R1b-A3-A4-A5-A6-，(d)R1b-A4-A5-A6-，(e)R1b-A5-A6-，(f)R1b-A6-和(g)R1b-，其中R1a選自(1)H，(2)由1-6個氨基酸組成的肽，(3)烷基，(4)苯基烷基，(5)-COR2，其中R2選自烷基、鏈烯基、鏈炔基、苯基、萘基和苯基烷基，R1b選自(1)H，(2)烷基，(3)苯基烷基和(4)-COR2，其中R2選自烷基、鏈烯基、鏈炔基、苯基、萘基和苯基烷基，A1選自Ser和Ala或其等同的氨基酸殘基，A2、A3、A4和A6是氨基酸殘基，A5選自Ile和His或其等同的氨基酸殘基；A7、A9、A11和A12是氨基酸殘基；A8是Leu或Nle或其等同的氨基酸殘基；A10是Asp或Asn或其等同的氨基酸殘基；A13和A17是氨基酸殘基，其中A13和A17的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接；
A14是His或Ser或其等同的氨基酸殘基；A15和A28彼此獨立地是Ile或Leu或其等同的氨基酸殘基；A16是Asn或Gln或其等同的氨基酸殘基；A18和A22是氨基酸殘基，其中A18和A22的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接；A19是Arg或Glu或其等同的氨基酸殘基；A20是Arg或其等同的氨基酸殘基；A21是Arg或Val或其等同的氨基酸殘基；A23是Phe或Trp或其等同的氨基酸殘基；A24是Leu或其等同的氨基酸殘基；A25是Arg或His或其等同的氨基酸殘基；A26和A30是氨基酸殘基，其中A26和A30的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接；A27是Leu或Lys或其等同的氨基酸殘基；A29是Ala或Gln或其等同的氨基酸殘基；A31是Ile或Val或其等同的氨基酸殘基；Y選自(a)R3，(b)A32-R3，(c)-A32-A33-R3和(d)-A32-A33-A34-R3-，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此獨立地選自氫和低級烷基，A32是His或其等同的氨基酸殘基，A33是Asn或Thr或其等同的氨基酸殘基，A34是Ala或Phe或其等同的氨基酸殘基。
式I的肽具有有用的藥物特性。它們特別適用于治療能夠通過可與甲狀旁腺激素受體結(jié)合的伴隨或不伴隨刺激cAMP酶活性的化合物來調(diào)節(jié)的疾病。參見U.S.系列號60/046,472。
適于用本發(fā)明方法制備的代表性的優(yōu)選環(huán)肽包括但不僅限于，環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，2，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，3，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，4，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，5，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，6，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，7，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2
環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，10，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，11，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，12，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，13，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，14，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，15，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，16，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17，Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp17，22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22，Lys26-Asp30)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-34)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17，Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp17，22，Leu27]hPTH(1-34)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22，Lys26-Asp30)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Lys18Asp22]hPTHrP(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Lys18，26，30，Asp22，Leu23，28，31，Glu25，29]hPTHrP(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(7-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Lys18，Asp22]hPTHrP(7-34)NH2二環(huán)(Lys13，Asp17，Lys18-Asp22)[Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(7-34)NH2，和二環(huán)(Lys18-Asp22，Lys26-Asp30)[Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(7-34)NH2.
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中的氨基酸殘基是在α-碳上具有L立體化學的α-氨基酸殘基。
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中的X選自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-，其中R1a是H或Pro，A1是Ser或Ala，A2是Val，A3是Ser，A4是Glu，A5是Ile或His，A6是Gln，(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-，其中A2、A3、A4、A5和A6如上所定義，R1b是H，(c)R1b-A3-A4-A5-A6-，其中R1b、A3、A4、A5和A6如上所定義，(d)R1b-A4-A5-A6-，其中R1b、A4、A5和A6如上所定義，(e)R1b-A5-A6-，其中R1b、A5和A6如上所定義，(f)R1b-A6-，其中R1b和A6如上所定義，(g)R1b-，其中R1b如上所定義，A7是Leu；A8是Leu或Nle；A9是His；A10是Asp或Asn；A11是Leu；A12是Gly；A13、A17、A18、A22和A30彼此獨立地選自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A14是His或Ser；A15是Ser或Leu；A16是Asn或Gln；A19是Arg或Glu；A20是Arg；A21是Arg或Val；A23是Phe或Trp；A24是Leu；A25是Arg或His；A26是His或彼此獨立地選自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A27是Leu或Lys；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln；A31是Ile或Val；Y選自(a)-R3，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此獨立地選自氫和1-4個碳原子的烷基，(b)-A32-R3，其中R3如上所定義，A32是His，(c)-A32-A33-R3，其中R3和A32如上所定義，A33是Asn或Thr和(d)-A32-A33-A34，其中A34是Ala或Phe。
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中(i) A18和A22的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，(ii) A13和A17的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，并且A18和A22的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，(iii)A18和A22的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，并且A26和A30的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，或(iv) A13和A17的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，A18和A22的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接，并且A26和A30的側(cè)鏈通過酰胺鍵連接。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中A13選自Lys和Ala，A17選自Ser和Asp，A18是Lys，A22是Asp，A26是Lys，A30是Asp。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中X是R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中A1是Ala，A8是Nle，A27是Leu。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中R1a是H，Y是NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中R1a是H，Y是-A32-A33-A34-NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中X選自(a)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-，(b)R1b-A3-A4-A5-A6-，(c)R1b-A4-A5-A6-，(d)R1b-A5-A6-，(e)R1b-A6-和(f)R1b-。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中A8是Nle，A27是Leu。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式I的結(jié)構(gòu)，其中X是H，Y是-A32-A33-A34-NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的更優(yōu)選的環(huán)肽選自環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，2，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，3，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，4，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，5，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，6，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，7，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，10，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，11，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，12，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，13，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，14，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，15，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，16，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17，Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp17，22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22，Lys26-Asp30)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2
適于用本發(fā)明方法制備的仍更優(yōu)選的環(huán)肽選自環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17，Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp17，22，Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22，Lys26-Asp30)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2適于用本發(fā)明方法制備的仍更優(yōu)選的環(huán)肽是環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2。
參照以下實施例可以更好地理解以上的描述，給出這些實施例是為了說明，而并非想要限定本發(fā)明的范圍。
實施例1環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1，Nle8，Lys18，Asp22，Leu27]hPTH(1-31)NH2的制備Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn- 步驟1Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂將5g(0.64mmole/g，3.2mmole)Rink Amide MBHA樹脂(0.5-0.7毫當量/g滴度，Nova Biochem，LaJolla，CA，美國)通過振搖用60mL二甲基甲酰胺溶脹，然后將樹脂潷干并用每份60mL的二甲基甲酰胺洗滌兩次。然后將樹脂用60mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺處理20分鐘除去9-芴基甲氧羰基(FMOC)，然后將樹脂用每份60mL的二甲基甲酰胺洗滌4次(TNBS陽性)。將Fmoc-Val-OH(2.17g，6.4mmole)和2.43g(6.4mmole)O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)的150mL二甲基甲酰胺溶液用32mL(12.8mmole)N-甲基嗎啉在0℃下處理10分鐘，然后將混合物加入到樹脂肽中，并將混合物室溫振搖約1.3小時。將樹脂潷干，然后用每份150mL的二甲基甲酰胺洗滌3次(TNBS陰性)。將樹脂用乙醚洗滌兩次然后干燥過夜；由偶聯(lián)所引起的重量增加為0.88g，意味著加成了2.75mmole Val)。依次用各5.6摩爾的FMOC-Asp(OtBu)、FMOC-Gln(Trt)、FMOC-Leu、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Arg(PMC)、FMOC-Leu和FMOC-Trp(BOC)進行去除FMOC(如上所述)和偶聯(lián)(如上所述)的步驟繼續(xù)進行合成，在每次偶聯(lián)時使用5.6摩爾當量的HBTU、11.2毫摩爾N-甲基嗎啉和50mL二甲基甲酰胺。最終的重量增加為5.8g。將一部分裂解得到保留有FMOC但側(cè)鏈脫保護了的標題肽，純度86A％。LC-MS1390.6；計算值1390.8)。
步驟2Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH 方法A固相合成a.順序裝配Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-氨代三苯甲基樹脂的合成。
用7.89g(18.9mmole)Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH、82g(39.9mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和10.2g(78.8mmole)二異丙基乙基胺在150mL二氯甲烷中完成Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH與15g 1.05毫當量/g填充量(共15.75mmole)的1％交聯(lián)氯代三苯甲基樹脂的偶聯(lián)。將混合物振搖，然后潷干并將樹脂用每份150mL的二氯甲烷/甲醇/二異丙基乙基胺(17∶2∶1)洗滌3次，然后用每份150mL的二氯甲烷洗滌3次。將樹脂的樣品進行TNBS試驗，試驗呈陰性。將Fmoc-保護的樹脂結(jié)合的氨基酸用150mL 5％哌啶在二氯甲烷-二甲基甲酰胺(1∶1)中的溶液處理10分鐘，然后用150mL20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液處理30分鐘，除去N-末端9-芴基甲氧羰基。將樹脂結(jié)合的氨基酸按照以上描述進行洗滌。將Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH(在該步驟后取出10％)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(ε-Alloc)-OH分別按照相同的方式偶聯(lián)，并采用相同的操作順序，但在TNBS試驗之前用3至5次的二甲基甲酰胺洗滌代替3次的二氯甲烷洗滌。無需重復(fù)偶聯(lián)。將最終的樹脂結(jié)合肽用150mL四氫呋喃和150mL乙醚洗滌，然后真空干燥得到27.23g。
b.Lys18和Asp22的烯丙基和Alloc的脫除Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹脂的合成。
將10g以上制得的Fmoc-(Lys-Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)樹脂用100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1∶1∶0.2 v/v/v)振搖20分鐘使其溶脹，然后將樹脂小心地潷干。加入2.9g四(三苯膦)鈀(O)在240mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1，v∶v)中的溶液，然后加入60mL二氯甲烷和16.2g(150mmole)N-甲基苯胺，然后將混合物振搖2小時。將樹脂潷干并用每份100mL的二氯甲烷洗滌3次。將樹脂用100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1 v∶v)溶脹，然后小心地潷干并直接用于Lys18-Asp23環(huán)化。
c.Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋的形成Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹脂的合成。
將以上實施例的樹脂肽用5.2g(10mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和2.6g(20mmole)二異丙基乙基胺在100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1 v∶v)中處理，然后將混合物振搖4小時。將樹脂潷干并用每份100mL的二甲基甲酰胺洗滌3次，然后取出一部分潷干的樹脂進行TNBS試驗(陰性)。將樹脂用四氫呋喃和乙醚各100mL洗滌，然后真空干燥。
d.Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH的樹脂裂解和產(chǎn)物分離。
將以上Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋形成實施例中制得的樹脂肽在振搖器中用130mL乙酸/二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇(1∶8∶1)處理20分鐘。將液體部分與樹脂分離，并用500mL甲基叔丁基醚和100mL乙醚處理，然后將混合物離心。除去上清液，向殘余物中加入乙醚，然后離心。除去上清液并將殘余物干燥過夜得到2.77g黃色固體(MS1172；41％化學計量學收率，粗品)。將其通過快速色譜純化(85∶15至60∶40二氯甲烷∶甲醇)得到1g Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH(15％收率，以樹脂計)，純度為85A％。
方法B在溶液中合成a.順序裝配Boc-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向3L的三頸燒瓶中加入1，1-二甲基乙氧羰基-(L)-天冬氨酸芐酯(50g，154.5mmol)、二氯甲烷(96mL)、烯丙醇(9.438，162.3mmol)和4-N，N-二甲氨基吡啶(10mg)。將反應(yīng)混合物冷卻至8℃，然后在8-11℃下于1.5小時內(nèi)加入二環(huán)己基碳二亞胺(32g，154.5mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。加入二環(huán)己基碳二亞胺溶液的同時，析出二環(huán)己基脲的沉淀。將反應(yīng)混合物于11-12℃攪拌2小時，此時HPLC顯示原料消失。濾出二環(huán)己基脲并將濾液濃縮。將油狀殘余物加入甲基叔丁基醚(250mL)中，然后將溶液過濾除去殘余的二環(huán)己基脲，用30mL 0.2N鹽酸、30mL水、20mL飽和碳酸氫鈉水性溶液、30mL水和2×50mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到55.88g油狀的BOC-(L)AsP(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值363.4；M+l實測值364)。HCl-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在裝有機械攪拌器的3L三頸燒瓶中，將BOC-Asp(O-烯丙基)-OBzl(110.5g，302.7mmol)的500mL乙酸乙酯溶液冷卻至5℃，并向反應(yīng)混合物中通入氯化氫氣體2.5小時，在此期間內(nèi)反應(yīng)溫度達到約22℃。HPLC顯示無原料存在。向溶液中通入氮氣過夜，形成白色沉淀，過濾收集沉淀并用100mL乙酸乙酯洗滌。將殘余物真空干燥得到84g白色結(jié)晶固體狀(顯微鏡觀察)HCl.Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值263；M+1實測值264)。
BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向BOC-Val-OH(25.4g，116.7mmol)的乙酸乙酯(85mL)溶液中加入羥基苯并三唑水合物(16.55g，122.5mmol)的二甲基甲酰胺(122.3mL)溶液。將混合物冷卻至5℃，然后在1小時內(nèi)加入二環(huán)己基碳二亞胺(25.2g，122.5mmol)的乙酸乙酯(58.7mL)溶液，在此期間內(nèi)，溫度升至約18℃并有二環(huán)己基脲沉淀生成。停止冷卻并將混合物攪拌2小時，然后在25分鐘內(nèi)加入HCl·H2N-Asp(OAll)-OBzl(35g，116.7mmol)的189mL二甲基甲酰胺溶液。在0.5小時內(nèi)緩慢加入N-甲基嗎啉(12.8mL)使反應(yīng)混合物的pH達到7，然后將混合物室溫攪拌36小時。將反應(yīng)混合物過濾除去二環(huán)己基脲，將濾液用甲基叔丁基醚稀釋，攪拌2小時然后過濾。將濾液用100mL水、100mL 0.5M檸檬酸水溶液、100mL水、100mL飽和碳酸氫鈉水溶液、100mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到41.3g油狀的BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值462；M+1實測值463)。
HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向2-4℃的BOC-Val-Asp(OAll)-OBzl(31.7g，68.5mmol)的乙酸乙酯(300mL)溶液中通入氯化氫氣體2小時。停止冷卻并將混合物攪拌48小時。向溶液中劇烈地通入氮氣1小時。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得到38.3g白色固體，將其用乙酸乙酯結(jié)晶得到24.2g HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值362M+1實測值363)。FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在裝有機械攪拌器的3L三頸燒瓶中加入17.25g(26mmol)FMOC-Arg(PMC)和300mL乙腈，然后將混合物室溫攪拌直至形成透明的溶液。加入苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)，將溶液冷卻至2℃，加入2.6g(26mmol)N-甲基嗎啉，形成白色的焦油。緩慢加入二甲基甲酰胺(52mL)直至焦油溶解，然后將混合物于3℃攪拌30分鐘。在2-3℃下于20分鐘內(nèi)加入HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(10.4g，26mmol)的39mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入N-甲基嗎啉(7.5mL)達到pH7。停止冷卻，將混合物攪拌2.5小時。然后將混合物用250mL水和250mL乙酸乙酯稀釋。分出乙酸乙酯層，用水(2×100mL)和鹽水(2×100mL)洗滌然后濃縮得到白色固體，將其用175mL乙酸乙酯結(jié)晶，得到18.5g FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(95A％)。將乙酸乙酯濾液濃縮并將膠狀殘余物用乙酸乙酯研制另外得到3.12g產(chǎn)物。(M計算值1007；M+1實測值1008)。Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(16g，15.9mmol)的二氯甲烷(267mL)溶液中加入哌啶(23g，27mmol，26.7mL)。將反應(yīng)液攪拌2.5小時然后用水(2×60mL)和鹽水(2×60mL)洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到半固體。將所述半固體加入400mL乙酸乙酯中，將溶液攪拌3天然后過濾。將濾液用水洗滌(2×60mL)，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到23.5g含有哌啶-亞甲基茚加合物雜質(zhì)的產(chǎn)物(MS分析)。將固體溶于400mL乙酸乙酯，過濾，用水洗滌(2×60mL)，干燥(硫酸鎂)然后濃縮得到固體，將其真空干燥過夜得到12.55g白色固體狀A(yù)rg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl。(M計算值784M+1實測值785)。
FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成2℃下，向FMOC-Glu(tBu)(6.73g，15.8mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP，8.18g，15.8mmol)的105mL乙腈溶液中加入N-甲基嗎啉(1.58g，15.8mmol)并將反應(yīng)混合物于2-4℃攪拌30分鐘。在2℃下于20分鐘內(nèi)加入L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(12.4g，15.8mmole)的70mL乙腈溶液。然后加入N-甲基嗎啉達到pH7。停止冷卻，使混合物升溫至室溫，然后繼續(xù)攪拌共3小時。將乳狀的反應(yīng)混合物過濾(慢)并將白色殘余物在濾紙上干燥過夜得到10.8g FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl。將濾液濃縮得到膠狀物，將其加入30mL乙腈中并放置48小時，另外得到3.45g產(chǎn)物。FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的總收率為14.3g。(M計算值1192；M+1實測值1192.4)。
Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl(12.3g，10.3mmol)的105mL二氯甲烷溶液中加入哌啶(3.5g，41.3mmol)。將混合物攪拌2小時，然后用庚烷稀釋，濃縮至一半的體積，然后在冰箱中放置過夜。從油狀殘余物中潷析出液體，然后將殘余物加入二氯甲烷中。將溶液用0.5M檸檬酸水溶液、水和鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮。將粗品固體用庚烷研制兩次然后過濾得到9.0g白色粉末狀Glu(OtBu)-(L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值970.2；M+1實測值971)。
FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成。
5℃下，將FMOC-Lys(Alloc)(4.2g，9.3mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP，4.8g，9.3mmol)在69mL乙腈中的懸浮液用N-甲基嗎啉(0.94g，9.3mmol)處理，然后將形成的溶液于5℃攪拌30分鐘。加入Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl(9g，9.3mmole)在52mL乙腈中的懸浮液，使反應(yīng)混合物變成白色混濁液。加入N-甲基嗎啉直至反應(yīng)混合物達到pH7，然后將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌1.33小時。將混合物過濾并將固體殘余物用乙腈洗滌(2×40mL)，然后在氮氣流下真空干燥過夜得到12.8g灰白色硬的固體，將其用200mL甲基叔丁基醚研制，過濾收集并真空干燥得到9.7gFMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計算值1404.7；M+1實測值1406)。
b.從Lys18和Asp22上脫除Alloc和烯丙基FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室溫下，向裝有機械攪拌器并通氮氣流的1L三頸燒瓶中加入167mL二氯甲烷和1.37g(1.18mmol，0.2當量)Pd(PPh3)4。向橙色的溶液中通入氮氣2分鐘，然后加入8.3g(5.91mmol，1.0當量)FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的66.4mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入13.3g，(124mmol，21當量)甲基苯胺。將溶液室溫攪拌1小時。將混合物用700mL甲基叔丁基醚稀釋導(dǎo)致固體形成。將懸浮液攪拌1小時然后過濾。將固體殘余物用200mL甲基叔丁基醚研制，過濾然后干燥得到5.0淺黃色固體。由濾液得到1.1g淺黃色固體狀的第二批產(chǎn)物，總收率6.1g FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M計算值1280.6；M+1實測值1281)。
c.Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋的形成FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室溫及氮氣氛下，將6.0g(4.69mmol)FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl在1L三頸燒瓶中溶于300mL二甲基甲酰胺，然后加入3.44g(6.61mmol，1.41當量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、0.89g(6.57mmol，1.40當量)羥基苯并三唑水合物和1.73g(13.4mmol；2.85當量)二異丙基乙基胺。將橙色溶液室溫攪拌1小時，然后用300mL水稀釋形成油狀殘余物。潷析出混濁的液體(主要含雜質(zhì))。將油狀殘余物在100mL水中攪拌過夜，過濾收集形成的硬的固體，得到4.2g淺黃色固體。由濾液得到1.0g黃色固體狀第二批產(chǎn)物，總收率5.2g FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M計算值1262M+1實測值1262.5)。
d.芐酯的脫除FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH的合成。
將5.9g(4.7mmol)FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OBzl的25mL二甲基甲酰胺溶液用5.9g木炭處理并過濾，然后用0.59g 10％Pd/C處理并在Parr裝置中置于50psig氫氣下。1.5小時后，將混合物過濾，再次用木炭處理，過濾，再次加入0.59g 10％Pd/C并和置于50psig氫氣下2小時。將混合物過濾并將濾液用50mL水稀釋，用3×200mL二氯甲烷萃取。將合并的二氯甲烷萃取液濃縮得到1.2g油狀的FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH。(M計算值1171；M+1實測值1172.3)。
3.純化將400mg FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH樣品溶于10mL 1∶1三氟乙醇/異丙醇。將樣品分成兩個5mL栓注射到用55％B(A＝0.1％vl/vl三氟乙酸水溶液；B＝v/v 75％乙腈/25％異丙醇+0.1％三氟乙酸)平衡的制備HPLC柱(Microsorb MV C 18，300Ang，8u，41.4×250mm)上。將填料以70mL/分鐘的流速洗脫，洗脫梯度為在30分鐘內(nèi)從55％B至65％B，在1分鐘內(nèi)從65％B至95％B，然后用95％B進行恒溶劑成分柱洗脫10分鐘。用UV在210nM監(jiān)測流出液。收集純度為93.5A％或更高的餾份，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮。將殘余物冷凍干燥得到200mg FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH(M計算值1171M+1實測值1172.6)。
步驟3 Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂將FMOC-[Trp23(BOC)，Arg25(PMC)，Lys26(BOC)，Leu27，Gln29(Trt)]HPTH(23-31)-氯代三苯甲基樹脂(1g，0.185mmole)在10mL二甲基甲酰胺中振搖30分鐘進行溶脹，然后潷干，用10mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理并振搖30分鐘。將樹脂潷干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗滌。加入240mg(0.205mmole，1.1當量)FMOC-環(huán)(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH、312mg(0.6mmole，3當量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和156mg(1.2mmole，6當量)二異丙基乙基胺的10mL二甲基甲酰胺溶液，并將混合物攪拌16小時。將樹脂潷干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS陽性)，再次用FMOC-環(huán)(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH/PyBOP/iPr2NEt處理16小時，然后將樹脂潷干并用3×10mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS陰性)。按照方法A步驟2中的描述用試劑K將一部分標題肽從樹脂上裂解下來，得到側(cè)鏈脫保護了的肽片段。(LC-MSM計算值2001；M實測值2000.5)。剩余的物質(zhì)用于步驟4。
步驟4 Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂所需的樹脂結(jié)合肽通過將1.38g(0.244mmole，以Trp23的滴度計)步驟3的樹脂結(jié)合肽按照步驟1除去Fmoc保護基，然后按照步驟1順次進行FMOC脫除和用各0.5毫摩爾的FMOC-Ser(OtBu)-OH、FMOC-Asn(Trt)-OH、FMOC-Leu-OH、FMOC-His(Trt)-OH和FMOC-Lys(BOC)-OH偶聯(lián)的循環(huán)，在每次偶聯(lián)時使用190mg(0.5mmole)O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和2mmole N-甲基嗎啉的25mL二甲基甲酰胺溶液。偶聯(lián)在室溫下進行約1小時。將最終的樹脂肽用每份25mL的二甲基甲酰胺、四氫呋喃和乙醚洗滌，然后真空干燥(1.93g)。將一部分標題肽按照以下描述從樹脂上裂解(試劑K)得到側(cè)鏈脫保護了的肽片段(LC-MSM計算值2579.4；M實測值2580.7)，純度52A％。
步驟5Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OHFMOC-[Ala1，Ser3(OtBu)，Glu4(OtBu)，Gln6(Trt)，His9(Trt)，Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)標題肽通過將2.65g(5mmole)Fmoc-Leu-OH與5g(3mmole)1％交聯(lián)的0.6毫當量/g的Gly-2-氯代三苯甲基樹脂用3.9g(7.5mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、1.94g(15mmole)二異丙基乙基胺在50mL二甲基甲酰胺/四氫呋喃(v/v)中振搖0.5小時偶聯(lián)制得。將樹脂潷干，然后用二甲基甲酰胺/四氫呋喃洗滌5次并用甲醇洗滌1次(茚三酮陰性)。將樹脂用二甲基甲酰胺洗滌一次，然后用60mL20％哌啶/二甲基甲酰胺處理2次，每次15分鐘，在各次處理之間用3×60mL二甲基甲酰胺和1×60mL甲醇處理。在第二次處理后，茚三酮呈強陽性。重復(fù)該循環(huán)，每次循環(huán)采用單次的0.5小時哌啶二甲基甲酰胺處理，并使用各2.5摩爾當量的FMOC-Asn(Trt)、FMOC-His(Trt)、FMOC-Nle、FMOC-Leu、FMOC-Gln(Trt)、FMOC-Ile、FMOC、Glu(OtBu)、FMOC-Ser(OtBu)、FMOC-Val和FMOC-Ala以及各2.5摩爾當量的PyBOP和二異丙基乙基胺。通過與100mL乙酸/三氟乙烯/和二氯甲烷(1∶1∶8)一起振搖1小時將樹脂裂解。從樹脂中潷析出液體，然后將樹脂用200mL二氯甲烷洗滌；然后將洗滌液與液體的主要部分合并。將其依次從己烷、乙酸乙酯和異丙醇中蒸發(fā)。將殘余物用乙醚研制，然后干燥(真空，過夜)得到2.24g標題肽(HPLC83A％純度)。將樹脂再次在裂解條件下處理，將液體按照第一次裂解后的方式處理，最后得到2.75g第二批的標題肽，總收率為4.95g(2.1mmole，70％收率，以樹脂計)。[LC-MS(M計算值1514.8；M實測值1514.7]。該物質(zhì)直接用于步驟6。
步驟6
Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly- Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂將步驟5制得的肽(900mg，0.114mmole)在振搖下在15mL二甲基甲酰胺中溶脹40分鐘，然后將樹脂潷干并用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理45分鐘。將樹脂潷干并用3×30mL二甲基甲酰胺處理(樹脂TNBS試驗陽性)。向其中加入15mL二甲基甲酰胺、775mg(0.33mmole，以23位的滴度計，為2.7摩爾當量)FMOC-[Ala1，Ser3(OtBu)，Glu4(OtBu)，Gln6(Trt)，His9(Trt)，Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)(由步驟4制得)、151mg(0.29mmole，0.2摩爾當量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、39mg(0.25摩爾)羥基苯并三唑水合物和75mg(0.58mmole)二異丙基乙基胺，然后將混合物振搖3天。將樹脂潷干，用3×30mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS，弱陽性和陰性小珠的混合物)，然后用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理，潷干，用每份15mL的二甲基甲酰胺、四氫呋喃和乙醚各洗滌3次，然后干燥并按照步驟7從樹脂上脫保護、裂解。
步驟7Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn- 將步驟6制得的樹脂按照方法A步驟1的描述處理以除去Ala1上的FMOC，然后在33/2/2/1/2三氟乙酸、苯酚、茴香硫醚、乙二硫醇和水的混合物(試劑K，總稀釋度10mL/g樹脂-肽)中同時進行裂解和脫保護3小時。將樹脂潷干，將反應(yīng)混合物加入到冷的叔丁基甲基醚(50mL/g樹脂-肽)中使產(chǎn)物從濾液中沉淀出來。將混合物放置15分鐘，然后離心(2000rpm，5分鐘)。潷析出液體，將剩余的固體用乙醚洗滌，通過離心分離混合物的上清液并將上清液除去。將得到的固體在0.1％三氟乙酸水溶液(6mL/g樹脂肽)中攪拌1小時，以確保完全除去對酸敏感的基團。將溶液冷凍干燥得到414mg白色固體狀標題肽(37A％純度，26.3％純度(wt/wt)，以Trp23計，26.3％收率)。(LC-MSM計算值3632.0；M+1實測值3633.4)。
步驟8純化將1g以上制得的物質(zhì)溶于10mL水并將該溶液注射到2″×25cm預(yù)先用75/5/200.1％三氟乙酸水溶液(A)/0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(B)/異丙醇(C)平衡的制備HPLC(10微米，120A或300A)上。將柱子以115mL每分鐘，以在30分鐘內(nèi)從75A/5B/20C到60A/20B/20C的梯度洗脫，然后用30％A，60％B，20％C沖洗并再次用75A/5B/20C平衡。用UV在280nm檢測流出液。將含有大約75面積百分比純度的標題肽的餾份合并，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(約35℃)濃縮。將濃縮的含水溶液泵到相同的制備柱上并再次用相同的30分鐘梯度洗脫。將含有90A％或更高的面積百分比純度標題肽的餾份合并，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(約35℃)濃縮。然后將濃縮的溶液泵到預(yù)先用75％0.1M乙酸銨水溶液(用乙酸調(diào)至pH6)(D)/15％乙腈(E)/10％異丙醇(C)平衡的制備柱上。將柱子以115mL/分鐘，以在30分鐘內(nèi)從75D/15E/10C至60D/30E/10C的梯度洗脫，然后用30D/60E/20C沖洗。將含有95A％或更高的面積百分比純度標題肽的餾份合并然后冷凍干燥，得到固體狀乙酸鹽形式的純化產(chǎn)物(從1g粗品得到約100-200mg@大約95A％純度)。在每一階段，用分析HPLC在C18柱(4.6mm×25cm，5微米，120A或300A)上分析餾份的含量和純度，梯度為30分鐘內(nèi)25-40％B(A＝0.1％三氟乙酸/水；B＝0.1％三氟乙酸/乙腈)，流速為1mL/分鐘，用UV在220nm檢測。
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<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
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<221>MOD_RES<222>(8).
<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>2Ala Ala Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>3<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>3Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>4<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>4Ala Val Ser Ala Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>5<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18 )..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>5Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>6<211>31<212>PRT<213>未知
<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>6Ala Val Ser Glu Ile Ala Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>7Ala Val Ser Glu Ile Gln Ala Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>8<211>31
<213>未知<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>8Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>9<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>9Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Ala Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>10<211>31<212>PRT<213>未知
<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>10Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Ala Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>11<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>11Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Ala Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>12<211>31<212>PRT
<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<22l>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>12Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Ala His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>13<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>13Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>14
<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>14Ala Val ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Ala Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>15Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30
<210>16<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(13)..(17)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>16Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>17<211>31<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(26)..(30)<223>“在26位的Lys與在30位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”
<220>
<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>17Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>18<211>34<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>18Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>19<211>34<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle
<220>
<221>肽<222>(13)..(17)<223>“在13位的Lys與在17位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>19Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>20<211>34<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>20Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>21
<211>34<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>21Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>22<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<220>
<221>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<400>22Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>23
<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>23Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Lys Arg Arg Arg Asp1 5 10 15Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala20 25<210>24<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(7)..(11)<223>“在7位的Lys與在11位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>24Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Asp Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25
<210>25<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<220>
<221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(20)..(24)<223>“在20位的Lys與在24位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>25Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>26<211>34<212>PRT<213>未知<400>26Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>27<211>34<212>PRT<213>未知
<400>27Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>28<211>9<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(7)<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(8)<223>Asp(OtBu)<220>
<221>肽<222>(9)<223>“此C-末端氨基酸通過酰胺鍵與氯三苯甲基樹脂鍵合”<400>28Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>未知
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220>
<221>肽<222>(3)<223>產(chǎn)物＝Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(4)<223>產(chǎn)物＝Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(7)<223>產(chǎn)物＝Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(8)<223>產(chǎn)物＝Asp(OtBu)<220>
<221>肽<222>(9)<223>其它“此C-末端氨基酸通過酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹脂鍵合”<400>29Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>30<211>5<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<400>30Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>31<211>14<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(6)<223>Trp(BOC)<220>
<221>肽<222>(8)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(9)<223>Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(12)<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(13)<223>Asp(OtBu)<220>
<221>肽<222>(14)<223>“此C-末端氨基酸通過酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹脂鍵合”<400>31Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5 10<210>32<211>19<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(2)<223>His(Trt)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Asn(Trt)<220>
<221>肽<222>(5)<223>Ser(OtBu)<220>
<221>肽<222>(6)..(10)<223>“在6位的Lys與在10位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽
<221>肽<222>(14)<223>Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(17)<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220>
<221>肽<222>(6)..(10)<223>“合成肽在6位的Lys與在10位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<400>30Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Gln Asp Val<210>31<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220>
<221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(6)<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(9)
<223>His(Trt)<220>
<221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<400>31Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly1 5 10<210>32<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220>
<221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(6)<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(9)<223>His(Trt)<220>
<221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<220>
<221>肽<222>(13)<223>Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(14)<223>His(Trt)<220>
<221>肽<222>(16)<223>Asn(Trt)<220>
<221>肽<222>(17)<223>Ser(OtBu)<220>
<221>肽<222>(18)..(22)<223>“合成肽在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(19)<223>Glu(PtBu)<220>
<221>肽<222>(20)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(22)..(30)<223>“合成肽在13位的Lys與在30位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(23)<223>Trp(BOC)<220>
<221>肽<222>(25)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(26)<223>Lys(BOC)<220>
<221>肽<222>(29>
<223>Gln(Trt)<220>
<221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220>
<221>肽<222>(30)<223> “此C-末端氨基酸通過酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹脂鍵合”<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>X＝正亮氨酸；Nle<400>32Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>33<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(1)<223>BOC-Val<220>
<221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>33Val Asp1<210>34<211>2<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>肽<222>(1)<223>“N-末端氨基酸是以鹽酸鹽的形式”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>34Val Asp1<210>35<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>35Arg Val Asp1<210>36<211>3<212>PRT<213>未知<220>
<221>肽<222>(1)<223>Arg(PMC)
<220>
<221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>36Arg Val Asp1<210>37<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>37Glu Arg Val Asp1<210>38<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>Glu(OtBu)
<220>
<221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>38Glu Arg Val Asp1<210>39<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>39Lys Glu Arg Val Asp1 5
<210>40<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>40Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>41<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“合成肽在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)
<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(1)<223>“合成肽在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>41Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“合成肽在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(5)<223>“合成肽在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<400>42Lys Glu Arg Val Asp1 5
<210>43<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220>
<221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹脂鍵合”<400>43Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>44<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)
<220>
<221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹脂鍵合”<400>44Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>45<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220>
<221>肽<222>(1)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹脂鍵合”<220>
<221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220>
<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220>
<221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹脂鍵合”<220>
<221>肽<222>(1)..(5)<223>“合成肽在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過酰胺鍵連接”<400>45Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>46<211>34
<2L2> PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述HPTH類似物<220>
<221>肽<222>(1)<223>產(chǎn)品＝Ala<220>
<221>MOD_RES<222>(8)<223>Xaa＝正亮氨酸(Nle)<220>
<221>肽<222>(18)<223>產(chǎn)品＝Lys<220>
<221>肽<222>(18)<223>Lys的側(cè)鏈通過酰胺橋與Asp的側(cè)鏈鍵合<220>
<221>肽<222>(22)<223>產(chǎn)品＝Asp<220>
<221>肽<222>(22)<223>Asp的側(cè)鏈通過酰胺橋與Lys的側(cè)鏈鍵合<220>
<221>肽<222>(26)<223>產(chǎn)品＝Lys<220>
<221>肽<222>(26)<223>Lys的側(cè)鏈通過酰胺橋與Asp的側(cè)鏈鍵合<220>
<221>肽<222>(27)<223>產(chǎn)品＝Leu<220>
<221>肽<222>(30)
<223>產(chǎn)品＝Asp<220>
<221>肽<222>(30)<223>Asp的側(cè)鏈通過酰胺橋與Lys的側(cè)鏈鍵合<400>46Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe
權(quán)利要求
1.選自下列的肽環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂，環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂，環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂，F(xiàn)moc環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl，F(xiàn)moc環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH，F(xiàn)moc環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹脂。
2.選自下列的肽Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹脂，F(xiàn)moc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH，BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，HCl·Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，F(xiàn)moc-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，Arg(Pmc)-Val-Asp(OAll)-OBzl，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，F(xiàn)moc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl，F(xiàn)moc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl，F(xiàn)moc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-氯代三苯甲基樹脂，F(xiàn)moc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及以片段為基礎(chǔ)固相合成與樹脂結(jié)合的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類似物的方法，所述類似物含有至少一個在兩個不相鄰的氨基酸殘基側(cè)鏈之間的橋，本發(fā)明還涉及該方法所用的肽片段。
文檔編號C07K5/078GK1552737SQ20041003866
公開日2004年12月8日 申請日期1999年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月15日
發(fā)明者A·W·斯萊迪斯基, J·J·曼西爾, A W 斯萊迪斯基, 曼西爾 申請人:阿溫蒂斯藥物制品公司