專利名稱：多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種聚乙二醇(PEG)與蛋白質或多肽的結合物及其制備方法，更具體地說，涉及一種多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽的結合物及其制備方法。
背景技術：
各種天然和重組的蛋白質和多肽都具有醫藥有用性，但是在治療應用時，有許多因素都使其很容易從體內循環中清除出去蛋白酶的酶解作用、腎臟的過濾作用、以及免疫系統的抗原抗體反應。在這其中，腎臟的過濾作用以及血液中的各種酶(特別是酯酶的水解作用)是蛋白類藥物在血液中停留時間過短的主要原因。
將蛋白質或多肽與聚合物如PEG結合，可以克服這些問題。Davis等人在美國專利4,179,337中公開了將PEG與蛋白質或多肽(如酶和胰島素)結合以得到結合物，其中蛋白質免疫原性較小并保留了大部分生理活性。Nakagawa等人在美國專利4,791,192中公開了將PEG與胰島素結合以降低副作用和免疫原性的方法。Veronese等人(Applied Biochem and Biotech，11，141-152，1985)公開了用氯甲酸苯酯類化合物活化PEG以修飾核糖核酸酶和過氧化物酶。PEG是一種形式為乙二醇縮合形成的聚醚，有良好的生物相容性，能很好地溶解于水相和有機相，無毒，并且排泄動力學特性良好。目前常用的PEG有線型的和帶兩臂的分叉型兩種，如Shearwater公司的Monfardini和J.Milton Harris公開的一種二臂型PEG(Bioconjugate Chem.，V6(1)，62-69，1995)等。
眾所周知，蛋白質類藥物與高分子結合物的性能和所用高分子材料的結構、分子量、分子量分布以及高分子的構型有關。目前一般的PEG和蛋白質或多肽的結合物因為其結構、構型、溶解度和表觀分子量存在的局限性，使蛋白質類藥物的生理作用沒有被充分發揮，在體內還是很容易被各種酶分解和被腎小球過濾清除。
發明內容
本發明的目的是提供一種多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽的結合物及其制備方法，以更加有效地改善蛋白質類藥物的藥理學半衰期、免疫原性及生物活性保留值。
為了實現這一目的，本發明利用通過三官能團小分子化合物和相應的化學反應形成的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽進行連接反應，通過合理選擇控制反應的緩沖體系、蛋白質或多肽與多臂樹杈型PEG的摩爾比例、反應溫度、反應時間等，并進行提純，從而制備出3臂至8臂的樹杈型PEG蛋白質或多肽結合物純品。具體地講，本發明提供了如下式所示的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽結合物 蛋白質或多肽其中Z＝3-8；m為1-2，蛋白質或多肽都具有一個以上的-NH2基團，即本發明中多臂樹杈型PEG的作用位點。每個蛋白質或多肽可以結合一個以上的多臂樹杈型PEG。本發明中m優選為1。
PEGZ為多臂樹杈型PEG，優選以下9種形式
其中，R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18是用來封閉PEG的單末端羥基的惰性基團；10個碳以下的直鏈烷基，異丙基或芐基都能夠用來封閉PEG的單末端羥基，不會改變PEG的性質，其中優選為甲基；Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7為-H或4個碳以下的低級烷基；優選為甲基；Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8是PEG的另外一個末端羥基在活化過程中形成的；Rn1、Rn2、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10為三功能團的內部連接基團。這些基團可以是0-10碳的低級亞烷基，優選地為-CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)2-、-(CH2)4-、-CH(CH3)(CH2CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-；W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16為是活化后的PEG與三功能團結合所形成的基團，可以是-O-、-S-、-NH-、-NHCH2-、-NHCH2CH2-、-NH(CH2)3-、-NHCH(CH3)2-、-NH(CH2)4-、-NHCH(CH3)(CH2CH3)-、-NHC(CH3)2CH2-、-NHCH(CH3)CH2CH2-、-NHCH2CH(CH3)CH2-，優選地為-NH-和-NHCH2-；
x1、y1、z1、x2、y2、z2、x3、y3、z3、x4、y4、z4、x5、y5、z5、x6、y6、z6、x7、y7、z7、x8、y8和z8為任意數字組合，使得多臂樹杈型PEG的分子量為4000-100000道爾頓的范圍內。
如其中的一個八臂樹杈型PEG-胰島素結合物 其他多臂PEG蛋白質或多肽結合物具有與上述結合物相類似的結構，具體結構主要根據具體臂數及具體藥物的不同而有所不同。具有生理活性的任何蛋白質或多肽都可用于制備與上述PEG的結合物，只要上述蛋白質或多肽含有至少一個可供縮合的氨基。
本發明的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽的結合物和相同分子量的線性和兩臂PEG與蛋白質或多肽的結合物相比，其一，由于多臂樹杈型PEG的流體力學體積大，當它與蛋白質或多肽的某個部位結合后，由于空間位阻的作用，其他部位就很難與另一分子的多臂樹杈型PEG反應，從而提高對結合部位的選擇性，而且這樣蛋白質類藥物的生物活性保留值更高；其二，由于多臂結構的存在，使得多臂樹杈型PEG能更有效地阻止接近蛋白質或多肽表面的大分子或細胞，從而進一步提高結合物在體內循環的時間，減少免疫反應的發生；其三，由于多臂樹杈型PEG的流體力學體積大，本發明的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽結合物的腎臟清除速率大大降低，因而大大地提高了結合物的體內作用時間。
圖1本發明的實施例2中三臂樹杈型PEG-粒細胞集落刺激因子的MALDI-TOF(基質輔助激光解吸/離子化質譜)譜圖。
圖2本發明的實施例1、4-11中三臂樹杈型PEG-蛋白質結合物的SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉一聚丙稀酰胺凝膠電泳)圖。
圖3本發明的實施例20中四臂樹杈型PEG-重組人干擾素β的MALDI-TOF譜圖。
圖4本發明的實施例49中未修飾的干擾素、PEG-INTRON、三臂樹杈型PEG-干擾素以尾靜脈注射方式在大鼠體內的濃度衰減曲線圖。
圖5本發明的實施例50中四臂樹杈型PEG-粒細胞集落刺激因子對小鼠實驗的藥效圖。
具體實施例方式
下面，通過具體實施例對本發明作進一步說明。這些實施例只是為了進行說明，而不是用來限定本發明的范圍。
實施例1三臂樹杈型PEG(分子量為13.3K，分子式如下)-干擾素α2b結合物的制備 將賴氨酸(439mg，3mmol)溶于20ml pH值8.0-8.3的水中，然后在3小時內向其中分6批均勻加入mPEG2CO2PhNO2(二臂單甲氧基PEG對硝基苯酚酯，分子量11,000，其中一臂為5,400，另一臂為5,600，11g，1mmol，其中單甲氧基PEG可縮寫為mPEG)，同時用0.2N的NaOH來維持體系的pH在8.3。在室溫攪拌過夜后，將反應物冷卻到0℃，并用2N的鹽酸將體系的pH值調節到3。先用乙醚從水中提取雜質，再用氯仿連續提取三次，提取液濃縮后加入無水乙醚，得白色沉淀，所得的沉淀經乙醇兩次重結晶后，得到mPEG2單取代的賴氨酸(mPEG2-mono-Lysine)。
向溶有上述產品(9.9g，0.9mmol)的無水二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(TEA)直至pH值達到8。mPEGCO2PhNO2(線型mPEG對硝基苯酚酯，分子量2300，2.415g，1.05mmol)在3個小時之內分6批均勻加入反應液中，同時用TEA維持體系的pH值在8左右。反應物回流72小時后，冷卻至室溫，濃縮后，過濾，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重結晶。過量的mPEGCO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3緩沖液中攪拌過夜后被水解，溶液冷卻至0℃，并用2N的鹽酸將體系的pH值調節到3。然后通過乙醚提取溶液中的對硝基苯酚。再用氯仿連續提取三次，提取液經干燥、濃縮后用無水乙醚沉淀，然后用無水乙醇重結晶。所得產物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼砂緩沖液)進一步純化，得mPEG3CO2H。
將本實施例所制備的mPEG3CO2H(7.98g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(20ml)中，冷卻至0℃后，向其中加入N-羥基丁二酰亞胺(0.138g，1.2mmol)和二環己基碳二亞胺(DCC，0.48g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經濃縮后用無水乙醚沉淀，再經乙酸乙酯重結晶，得純產物mPEG3CO2Su產物。
將上述mPEG3CO2Su(100mg)在室溫條件下加入到干擾素-α2b(濃度為5mg/ml，4ml，緩沖液體系為pH7.0的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后，加入1M的甘氨酸100μl終止反應，得到三臂樹杈型PEG-干擾素α2b結合物粗產物。
三臂樹杈型PEG-干擾素α2b結合物粗產物用TSK-GEL Super SW3000分子篩柱純化兩次。將層析柱用pH7.5的50mM NaCl溶液平衡后上樣，上樣為柱體積的2％，280nm檢測，收集第一個洗脫峰，得到三臂樹杈型PEG-干擾素α2b結合物純品。
實施例2三臂樹杈型PEG(分子量為15K，分子式如下)-粒細胞集落刺激因子(G-CSF)結合物的制備
按照實施例1的方法，以分子量為10K的mPEG2CO2PhNO2和分子量為5K的mPEGCO2PhNO2為原料，制備得到分子量為15K的mPEG3CO2Su；經PEG修飾的粒細胞集落刺激因子用這個試劑按照實施例1中所述方法來制備。
所制備的結合物經MALDI-TOF質譜測定(測試方法參考MichaelGrace，J.of interferon and cytokine research，2001，1103-1115)，測定結果如圖1所示。圖中m/z 34641峰為結合物的單電荷峰；m/z 18966峰為極其微量的G-CSF的單電荷峰；m/z 17500為結合物的雙電荷峰；因為G-CSF含量很低，所以其雙電荷峰在圖中不能顯示出來。由圖可見，三臂樹杈型PEG和G-CSF已經成功地連接在一起。按照文獻(Michael Grace，J.of interferon andcytokine research，2001，1103-1115)方法，可以得出結論此結合物的純度非常高，為99％以上。
實施例3三臂樹杈型PEG(分子量為90K，分子式如下)-干擾素α2b結合物的制備 按照實施例1的方法，以分子量為60K的mPEG2CO2PhNO2和分子量為30K的mPEGCO2PhNO2為原料，制備得到分子量為90K的mPEG3CO2Su。經PEG修飾的干擾素用這個試劑按照實施例1中所述方法來制備。
實施例4-13
并且對實施例1、4-11中的產物進行SDS-PAGE電泳檢測(實驗方法參考汪家政，蛋白質技術手冊，科學技術出版社，第一版)，以證明結合物的成功制備，具體見圖2，其中按照從左至右的次序，各條帶(lane)依次為lane1實施例7中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素β結合物；lane2實施例4中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素α1a結合物；lane3實施例6中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素α2a結合物；lane4實施例5中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素α1b結合物；lane5實施例1中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素α2b結合物；lane6實施例9中的三臂樹杈型PEG-重組人粒細胞集落刺激因子結合物；lane7實施例8中的三臂樹杈型PEG-重組人干擾素γ結合物；lane8實施例10中的三臂樹杈型PEG-重組人白細胞介素2結合物；lane9低分子量標記(marker)，分子量分別為14k，20k，31k，43k，66k，97k；lane10實施例11中的三臂樹杈型PEG-重組人粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子結合物；由圖可知，上述結合物都已經成功制備得到。
實施例14四臂樹杈型PEG(分子量16K，分子式如下)-重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)結合物的制備
將賴氨酸鹽酸鹽(365mg，2mmol)溶于100ml pH值為8.0的硼砂緩沖液中，然后向其中加入mPEG2CO2Su(分子量8,000，32g，4mmol)，同時用0.2N的NaOH來維持體系的pH在8.0。在室溫攪拌24小時后，將反應物用去離子水連續提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀經乙醇兩次重結晶后，得到mPEG4CO2H粗產物。粗產物經DEAESephadex FF柱分離后，得到純的mPEG4CO2H。
將上述mPEG4CO2H(9.6g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(20ml)中，冷卻至0℃后，按照實施例1的方法制備得到純產物mPEG4CO2Su。
將上述mPEG4CO2Su(100mg)在室溫條件下加入到G-CSF(濃度為4mg/ml，5ml，緩沖液體系為pH6.5的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸50μl終止反應，得到四臂樹杈型PEG-G-CSF結合物粗產物，并按照實施例1的方法提純。
實施例15四臂樹杈型PEG(分子量4K，分子式如下)-G-CSF結合物的制備
按照實施例14的方法，以分子量為2K的mPEG2CO2Su為原料制備得到分子量為4K的mPEG4CO2Su；并按照按實施例14方法制備得到經此試劑修飾的G-CSF。
實施例16-24
其中實施例20中的四臂樹杈型PEG-重組人干擾素β結合物經MALDI-TOF質譜測定，結果如圖3所示，其中m/z 36652為結合物的單電荷峰；m/z 20282為少量殘留的干擾素β的單電荷峰；m/z 18277為結合物的雙電荷峰；m/z 10135為少量殘留的干擾素β的雙電荷峰。由圖中可見，四臂樹杈型PEG和重組人干擾素β已經成功地連接在一起。按照文獻(Michael Grace，J.of interferon andcytokine research，2001，1103-1115)方法，可以得出結論此結合物的純度非常高，大約為98％。
實施例25四臂樹杈型PEG(分子量為40K，分子式如下)-鏈激酶結合物的制備 按照實施例1方法制備得到純產物mPEG3CO2PhNO2(分子量30K，單臂長分別為10K)，然后再制備得到mPEG3單取代的賴氨酸(mPEG3-mono-lysine)。向溶有mPEG3-mono-lysine(15g，0.5mmol)的無水二氯甲烷(20ml)中，加入TEA直至pH值達到8.0，mPEGCO2PhNO2(分子量為10K，6g，0.6mmol)在3個小時之內分6批均勻加入反應液中，同時用TEA維持體系的pH值在8左右。反應物回流72小時后，冷卻至室溫，濃縮后過濾，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重結晶。過量的mPEGCO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3緩沖液中攪拌過夜后被水解，溶液被冷卻至0℃，并用2N的鹽酸將體系的pH調節到3。然后通過乙醚提取溶液中的對硝基苯酚。再用氯仿連續提取三次，提取液經干燥，濃縮后用無水乙醚沉淀，然后用無水乙醇重結晶。所得產物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼酸緩沖液)進一步純化，得分子量為40K的mPEG4CO2H。
將本實施例所制備的mPEG4CO2H(20g，0.5mmol)溶于無水二氯甲烷(20ml)中，冷卻至0℃后，向其中加入N-羥基丁二酰亞胺(0.115g，1.0mmol)和DCC(0.40，1.0mmol)，按照實施例1方法得純產物mPEG4CO2Su。
將本實施例所制備的mPEG4CO2Su(100mg)在室溫條件下加入到鏈激酶(濃度為5mg/ml，4ml，緩沖液體系為pH7.0的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸30μl終止反應，得到四臂樹杈型—鏈激酶結合物粗產物。四臂樹杈型PEG-鏈激酶結合物按照實施例1的方法提純。
實施例26四臂樹杈型PEG(分子量100K，分子式如下)蛋白質或多肽結合物的制備 按照實施例25的方法，以分子量為70K的mPEG3CO2PhNO2和分子量為30K的mPEGCO2PhNO2為原料，制備得到分子量為100K的mPEG4CO2Su。并按照實施例25的方法制備得到經此試劑修飾的蛋白質或多肽。
實施例27五臂樹杈型PEG(分子量23.3K，分子式如下)-IL-2結合物的制備 白細胞介素2又稱為白介2，記IL-2。
按照實施例1方法制備mPEG3單取代的賴氨酸(分子量13.3K，臂長分別為5.6K，5.4K，2.3K，mPEG3-mono-lysine)。向溶有mPEG3-mono-lysine(2.66g，0.2mmol)的無水二氯甲烷(20ml)中，加入TEA直至pH值達到8.0，mPEG2CO2PhNO2(分子量為10K，2.5g，0.25mmol)在3個小時之內分6批均勻加入反應液中，同時用TEA維持體系的pH值在8左右。反應物回流72小時后，被冷卻至室溫，濃縮后，過濾，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重結晶。過量的mPEG2CO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3緩沖液中攪拌過夜后被水解，溶液被冷卻至0℃，并用2N的鹽酸將體系的pH調節到3。然后通過乙醚提取溶液中的對硝基苯酚。再用氯仿連續提取三次，提取液經干燥、濃縮后用無水乙醚沉淀，然后用無水乙醇重結晶。所得產物用QAE SephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼酸緩沖液)進一步純化，得mPEG5CO2H。
在0℃，向溶有上述mPEG5COOH(分子量為23.3K，4.66g，0.2mmol)的無水二氯甲烷(20ml)中加入對硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經濃縮后用無水乙醚沉淀，再經乙酸乙酯重結晶，得純產物mPEG5COOPhNO2。
將上述mPEG5CO2PhNO2(120mg)在室溫條件下加入到IL-2(濃度為2mg/ml，10ml，緩沖液體系為pH8.0的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸50μl終止反應，得到五臂樹杈型PEG-IL-2結合物粗產物。五臂樹杈型PEG-IL-2結合物按照實施例1的方法提純。
實施例28五臂樹杈型PEG(分子量為6K，分子式如下)蛋白質或多肽結合物的制備 按照實施例27的方法，以分子量為4K的mPEG3CO2PhNO2和分子量為2K的mPEG2CO2PhNO2為原料制備得到分子量為6K的mPEG5CO2PhNO2；并由實施例27的方法制備得到經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例29五臂樹杈型PEG(分子量為90K，分子式如下)蛋白質或多肽結合物的制備
按照實施例27的方法，以分子量為60K的mPEG3CO2PhNO2和分子量為30K的mPEG2CO2PhNO2為原料，制備得到分子量為90K的mPEG5CO2PhNO2。并按照實施例27方法制得經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例30五臂樹杈型PEG(分子量為25K，分子式如下)-ser125IL-2結合物的制備 按照實施例14，以mPEG2CO2H(分子量為10K，每條臂分子量為5K，30g，3mmol)制備mPEG4CO2H。
按照實施例27，以本實施例所制備的mPEG4CO2H(26g，1.3mmol)和mPEGCO2PhNO2(分子量為5K，7.5g，1.5mmol)制備得到mPEG5PhNO2。
按照實施例27，mPEG5CO2PhNO2(分子量為25K，120mg)和IL-2(濃度為2mg/ml，10ml)制備得到五臂樹杈型PEG-ser125IL-2結合物純品。
實施例31五臂樹杈型PEG(分子量為5K，分子式如下)蛋白質或多肽結合物的制備
按照實施例30的方法，以分子量為4K的mPEG4CO2PhNO2和分子量為1K的mPEGCO2PhNO2為原料，制備得到分子量為5K的mPEG5PhNO2；并由實施例30的方法制得經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例32五臂樹杈型PEG(分子量為100K，分子式如下)蛋白質或多肽結合物的制備 以分子量為80K的mPEG4CO2PhNO2和分子量為20K的mPEGCO2PhNO2為原料，制備得到分子量為100K的mPEG5PhNO2。并由實施例30的方法制得經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例33六臂樹杈型PEG(分子量24K，分子式如下)-人紅細胞生長素(EPO)結合物的制備 按照實施例1，以mPEG2CO2PhNO2(分子量10K，其中一臂為5K，另一臂為5K，10g，1mmol)，和mPEGCO2PhNO2(分子量2K，2.1g，1.05mmol)制備mPEG3CO2Su(分子量12K)。
按照實施例14，以本實施例所制備的mPEG3CO2Su(10.8g，0.9mmol)得到mPEG6CO2Su(分子量為24K)。
將上述mPEG6CO2Su(240mg)在室溫條件下加入到EPO(濃度為2mg/ml，10ml，緩沖液體系為pH8.0的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸30μl終止反應，得到六臂樹杈型PEG(分子量為24K)-EPO結合物的粗產物。六臂樹杈型PEG-EPO結合物用實施例1的方法提純。
實施例34六臂樹杈型PEG(分子量為24K，分子式如下)-EPO結合物的制備 按照實施例14，以mPEG2CO2H(分子量為8K，40g，5mmol)制備mPEG4CO2H。繼續按照實施例27以本實施例所制備的mPEG4CO2H(分子量16K，32g，2mmol)和mPEG2CO2PhNO2(分子量為8K，17.6g，2.2mmol)制備得到mPEG6PhNO2。按照實施例33方法制備和提純六臂樹杈型PEG-EPO結合物。
實施例35七臂樹杈型PEG(分子量20K，分子式如下)-腫瘤壞死因子α結合物的制備
腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是能夠引起腫瘤組織出血壞死、并且具有多方面的細胞因子。
按照實施例1，以mPEG2CO2PhNO2(分子量8K，8g，1mmol)和mPEGCO2PhNO2(分子量2K，2.1g，1.05mmol)制備得到mPEG3-mono-lysine(分子量為10K)。
按照實施例14，以mPEG2CO2Su(分子量5K，20g，4mmol)制備得到mPEG4CO2PhNO2(分子量為10K)。
繼續按照實施例27，以mPEG3-mono-lysine(分子量為10K，2g，0.2mmol)和mPEG4CO2PhNO2(分子量為10K，2.5g，0.25mmol)制備得到mPEG7CO2PhNO2(分子量20K)。
將上述mPEG7CO2PhNO2(分子量為20K，240mg)在室溫條件下加入到TNFα(濃度為2mg/ml，10ml，緩沖液體系為pH8.0的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸30μl終止反應，得到七臂樹杈型PEG-TNFα結合物粗產物。七臂樹杈型PEG-TNFα結合物用實施例1的方法提純。
實施例36七臂樹杈型PEG(同實施例35)-TNFβ結合物的制備按照實施例35的方法，以mPEG7CO2PhNO2(200mg)和TNFβ(濃度為4mg/ml，5ml，緩沖液體系為pH8.0的50mM磷酸緩沖液)制備得到七臂樹杈型PEG-TNFβ結合物。
實施例37八臂樹杈型PEG(分子量40K，分子式如下)-胰島素結合物的制備 按照實施例14的方法，制備mPEG4COSu(分子量為20K)，以所制備的mPEG4COSu為原料，將賴氨酸鹽酸鹽(365mg，2mmol)溶于200ml pH值為8.0的硼砂緩沖液中，然后向其中加入mPEG4CO2Su(80g，4mmol)，同時用0.2N的NaOH來維持體系的pH在8.0。在室溫攪拌24小時后，將反應物用去離子水連續提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀經乙醇兩次重結晶后，得到mPEG8CO2H粗產物。粗產物經DEAE Sephadex FF柱分離后，得到純的mPEG8CO2H。將上述mPEG8CO2H(24g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(40ml)中，按照實施例1的方法制備mPEG8CO2Su。
將上述mPEG8CO2Su(100mg)在室溫條件下加入到胰島素(濃度為6mg/ml，1ml，緩沖液體系為pH6.5的50mM磷酸緩沖液)中，反應1小時后加入1M的甘氨酸50μl終止反應，得到八臂樹杈型PEG-胰島素結合物粗產物。八臂樹杈型PEG-胰島素結合物用實施例1的方法進行提純。
實施例38八臂樹杈型PEG(分子量6K，分子式如下所示)蛋白質或多肽結合物的制備
按照實施例37的方法，以分子量為4K的mPEG5CO2PhNO2和分子量為2K的mPEG3CO2PhNO2為原料，制備得到分子量為6K的mPEG8CO2Su；并按照實施例37的方法制備得到經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例39八臂樹杈型PEG(分子量100K，分子式如下所示)蛋白質或多肽結合物的制備
按照實施例37的方法，以分子量為70K的mPEG5CO2PhNO2和分子量為30K的mPEG3CO2PhNO2為原料，制備得到分子量為100K的mPEG8CO2Su。并按照實施例37的方法制備得到經此試劑修飾的蛋白質或多肽結合物。
實施例40-48
實施例49多臂樹杈型PEG-蛋白質或多肽結合物的藥動學實驗這里以實施例1中制備的三臂樹杈型PEG(分子量為13.3K)-干擾素IFNα2b結合物為例，檢測了經多臂樹杈型PEG修飾后，對藥物在體內的衰減時間及衰減曲線的影響。
以未修飾的rhIFNα2b為陰性對照組，PEG-INTRON(Schering-PloughCorporation公司產品，所連接的為分子量為12K的線型PEG)為陽性對照組進行藥動學研究。實驗對象為150-170g的大鼠，尾靜脈注射，注射劑量為400μg/ml。陰性對照組為連續4天注射；試驗組和陽性對照組為單劑量注射。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測，檢測所用的抗體為抗-rhIFNα，藥動學分析模型為權重w＝1/CC的二室模型。
實驗發現，以三臂樹杈型PEG修飾干擾素得到的PEG3-IFN結合物的半衰期為IFN的4.02倍，為Shering-Plough公司的PEG-INTRON的202％，具體結果如表1所示。
表1三種物質的半衰期比較表實驗還發現，藥物在大鼠體內的濃度衰減曲線也非常明顯地顯示了三臂PEG-IFN相對于其他兩種對照物，在體內的循環時間延長，平均血藥濃度提高了，具體結果見圖4。
實施例50多臂樹杈型PEG-蛋白質或多肽結合物的藥效實驗這里分別以實施例1和實施例14中制備的多臂樹杈型PEG-蛋白質或多肽結合物為例，檢測了經多臂樹杈型PEG修飾后，對蛋白質或多肽的藥效的影響。
1.三臂樹杈型PEG-干擾素α2b結合物的抗病毒活性檢測依照《細胞因子研究方法學》(孫衛民，人民衛生出版社，1999)對rhIFNα2b、三臂樹杈型PEG-IFN的抗病毒活性進行檢測。發現未修飾的干擾素的比活為3.45×107IU/mg，經三臂樹杈型PEG修飾的干擾素的比活為4.0×106IU/mg，很明顯，修飾后干擾素IFN的抗病毒活性大約增加了10倍。
2.四臂樹杈型PEG-G-CSF藥效檢測集落刺激因子是能夠誘導人(或小鼠)骨髓細胞或造血細胞在半固體瓊脂系統中呈克隆生長的因子。集落刺激因子中能促進造血細胞形成粒細胞集落的稱為粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。對于G-CSF的動物體內藥效學檢測方法是在小鼠體內注射后，檢測小鼠血液中白細胞的增加。以注射后白細胞的增加作為有效性的檢測指標。
小鼠靜脈注射四臂PEG-G-CSF(記PEG4-G-CSF)，劑量為250μg/kg，單劑量注射；同時以G-CSF為陰性對照組，以緩沖液作為背景對照組，以兩臂PEG(每條臂長分子量為5K)-G-CSF(記PEG2-G-CSF，按照Phillippe，American J of hematology，2001，245-251方法制備)為陽性對照組，連續四天注射，劑量相同。小鼠注射后，眼眶取血，進行白細胞計數。最后一次注射記為第0天，取血時間分別是第0天注射前，第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天，第7天。所有的小鼠，在注射前測定白細胞數量，以此數量為基數；以后測定的數據為白細胞增加的倍數測定數/基數，從白細胞計數結果，發現PEG4-G-CSF的體內半衰期大于7天，而G-CSF在體內迅速衰減。實驗同時表明PEG4-G-CSF在小鼠體內的藥效相對PEG2-G-CSF的藥效有大幅度的提高(具體見圖5四臂樹杈型PEG-粒細胞集落刺激因子對小鼠的藥效圖)。
所以從以上兩個實施例可以看出，三臂樹杈型PEG-干擾素和四臂樹杈型PEG-G-CSF結合物和原蛋白質及單、雙臂PEG-蛋白質結合物相比，由于多臂結構的存在，流體力學體積大，一方面，蛋白質類藥物的生物活性保留值更高，另一方面，在體內的濃度衰減可以趨緩，清除率降低，在體內的循環時間延長，藥效提高非常明顯；而且，隨著多臂樹杈型PEG的臂數增多，其流體力學體積進一步增大，顯而易見，其他的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽結合物也能增加循環時間、促進藥效，能夠用于制備相應的治療和預防疾病的藥物；并且還可以利用治療惰性載體對本發明的多臂樹杈型PEG與蛋白質或多肽結合物進行修飾，制備相應的藥物組合物，用于制備相應的治療和預防疾病的藥物，這些都是本領域的公知知識，在這里就不再贅述。
權利要求
1.一種多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述結合物的通式為 蛋白質或多肽其中m為1或2；PEGZ為多臂樹杈型聚乙二醇，Z為臂數，為3-8。
2.如權利要求1所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述PEGZ為以下9種形式之一 其中R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18為10個碳以下的直鏈烷基、異丙基或芐基；Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7為-H或4個碳以下的低級烷基；Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8、Rn1、Rn2、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10為0到10個碳的低級亞烷基；W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16為-O-、-S-、-NH-、-NHCH2-、-NHCH2CH2-、-NH(CH2)3-、-NHCH(CH3)2-、-NH(CH2)4-、-NHCH(CH3)(CH2CH3)-、-NHC(CH3)2CH2-、-NHCH(CH3)CH2CH2-、-NHCH2CH(CH3)CH2-；x1、y1、z1、x2、y2、z2、x3、y3、z3、x4、y4、z4、x5、y5、z5、x6、y6、z6、x7、y7、z7、x8、y8和z8為任意數字組合，使得多臂樹杈型PEG的分子量在4000-100000道爾頓的范圍內。
3.如權利要求2所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述的R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18為甲基。
4.如權利要求2所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述的Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7為-H。
5.如權利要求2所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述的Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8、Rn1、Rn、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10為-CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)2-、-(CH2)4-、-CH(CH3)(CH2CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-或-CH2CH(CH3)CH2-。
6.如權利要求2所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述的W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16，為-NH-或-NHCH2-。
7.如權利要求1～6中任一項所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物，其特征在于，所述的蛋白質或多肽為重組人干擾素、重組白細胞介素、重組人紅細胞生長素、重組人抗腫瘤壞死因子、重組人集落刺激因子、重組精氨酸脫亞胺酶、重組鏈激酶或重組人胰島素。
8.一種權利要求1所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟將3-8臂樹杈型PEG先和蛋白質或多肽進行連接反應，再由反應混合物中提純出多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物。
9.權利要求1所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物在制備用于治療或預防疾病的藥物中的應用。
10.一種藥物組合物，該組合物包含權利要求1所述的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物和治療惰性載體。
全文摘要
本發明公開了一種新型的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物及其制備方法，利用由三官能團小分子化合物通過相應的化學反應形成的多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽進行連接反應，制備得到多臂樹杈型聚乙二醇與蛋白質或多肽的結合物并提純。這種結合物在體內循環時間長，水溶性好，保留了修飾前的蛋白質或多肽的生物活性，而且不易產生修飾前的蛋白質或多肽的不利免疫反應。
文檔編號C07K14/62GK1569892SQ20041003519
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者胡小劍, 張映輝, 溫華歡, 陳劍, 魏曉慧, 盧潔, 周向軍, 黃駿廉, 徐宇虹, 徐敏 申請人:新峰生物科技(上海)有限公司