專利名稱：測定可能具有單胺氧化酶抑制活性的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及硫氧化的四氫噻喃N-苯基噁唑烷酮化合物，其中的苯基噁唑烷酮部分是通過碳-碳鍵與噻喃環連接的。本發明也涉及新穎的測定噁唑烷酮對人單胺氧化酶的抑制活性的方法。
背景技術：
噁唑烷酮抗菌劑是一類新穎的合成抗微生物劑，它對一些人和獸病原體具有有效的對抗活性，包括革蘭氏陽性需氧菌(例如多耐藥性葡萄球菌和鏈球菌)，革蘭氏陰性需氧菌(例如流感嗜血桿菌和卡他球菌)，以及厭氧生物(例如擬桿菌和梭菌類)，耐酸性生物(例如結核分支桿菌和鳥分支桿菌)。還已知作為一類化合物，噁唑烷酮抑制單胺氧化酶(MAO)，該酶負責防止由內源性和來自飲食的胺即酪胺引起的急性血壓升高。因此，需要發現具有最小MAO抑制活性的噁唑烷酮抗生素，以排除由可能的藥物-藥物相互作用引起的有關副作用。而且，為了測定噁唑烷酮抗生素的MAO抑制活性，目前人們的興趣還在于開發一種高通過量的篩選測定法。
國際公報WO 97/09328；未決美國申請08/696,313號公開了具有與4-8元雜環連接的C-C鍵的苯基噁唑烷酮，這些化合物在屬類上覆蓋了本申請的化合物。
國際公報WO 97/30995公開了抗生的噁唑烷酮衍生物。
其他公開了與苯基噁唑烷酮連接的芳族雜環的參考文獻包括歐洲專利公開No.0352 781 A2、國際公報WO 9309103-A1和美國專利5,130,316、5,254,577和4,948,801。
其他一般性的參考文獻包括Castagnoli Jr.等，“1-甲基-1，2，3，6-四氫吡啶-4-基氨基甲酸酯衍生物的合成和選擇性單胺氧化酶B的抑制性質(R)-和(S)-正芐甲炔胺(Nordeprenyl)的有效前體藥物”，《醫藥化學雜志》，39卷，4756-4761頁(1996)；WalterWeyler和J.I.Salach，“來源于人胎盤的A型線粒體單胺氧化酶的純化和性質”，《生物化學雜志》，260卷，24期，13199-13207頁(1985)(10/25/85)；J.I.Salach和Walter Weyler，“人胎盤和牛肝臟的含有黃素的芳族胺氧化酶的制備”，《酶學方法》，142卷，627-623頁(1987)；Joseph J.P.Zhou等，“單胺氧化酶B的直接連續性熒光測定”，《分析生物化學》，234卷，9-12頁(1996)；Matthew J.Krueger等，“單胺氧化酶A和B的放射化學測定的可靠性檢查”，《分析生物化學》，214卷，116-123頁(1993)；KeithF.Tipton等，“評論-單胺氧化酶活性的放射化學測定-問題和易犯的錯誤”，《生物化學藥理學》，46卷，8期，1311-1316頁(1993)。
發明內容
一方面，本發明是式I化合物 或其藥學上可接受的鹽，其中R1是甲基、乙基、環丙基或二氯甲基；R2和R3是相同或不同的，是氫或氟。本發明的式I既包括反式異構體，也包括順式異構體。
另一方面，本發明是式II化合物
或其藥學上可接受的鹽，其中R2和R3與上述定義相同；R4是乙基或二氯甲基。
優選地，在上式I中，R1是甲基或乙基。
優選地，在上式II中，R4是乙基。
還優選地，式I和II化合物是單氟化合物。
本發明優選的化合物是a.[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，b.[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺，c.[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]環丙烷甲酰胺，d.[4(S)-順式]-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，e.(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺，f.(S)-(-)-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，g.[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺，h.[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]環丙烷甲酰胺，或i.[4(S)-反式]-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺。
更優選的化合物是[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺。
另一方面，本發明提供了測定噁唑烷酮抗生素的MAO抑制活性的方法，該方法包括下列步驟a)將噁唑烷酮與單胺氧化酶在pH值為約7.0至約7.5的緩沖溶液中溫育；b)向所述溫育溶液中加入1-甲基-4-(1-甲基-2-吡咯基)-1，2，3，6-四氫吡啶；和c)測定所述噁唑烷酮的單胺氧化酶抑制活性。
發明的詳細說明本發明提供了如上所定義的式I和式II的硫氧化的四氫噻喃苯基噁唑烷酮。該化合物是有用的抗微生物劑，有效對抗上文公開的一些人和獸病原體。特別是已經發現，盡管作為一類化合物的噁唑烷酮是人單胺氧化酶A(MAO A)和單胺氧化酶B(MAO B)的抑制劑，本發明化合物也具有并非例外的弱MAO抑制活性，這說明這些化合物具有最小化或排除可能的藥物-藥物相互作用的能力，因為對單胺氧化酶的強抑制作用能夠改變其他在正常情況下通過該酶代謝的化合物的清除率，包括若干種藥物。
本發明也提供了新穎的用于測定噁唑烷酮抑制人單胺氧化酶的能力的分光光度測定法。MAO A和MAO B是位于線粒體外膜的膜結合黃素蛋白。這兩種酶在催化生物所產生的和生物異源的胺的氧化脫氨基作用時，會選擇不同的底物。歷史上，已經使用兩種不同的底物通過放射性終點(不連續)法測定了MAO酶。這些方法已經受到批評，因為在普遍的實踐中，它們缺乏在通行的測定條件下的反應時間過程線性化的證據。這些方法的使用也是不適當的，因為在短時間內篩選大量化合物時，顯得不夠方便。該方法涉及多個操作步驟，包括反應產物的溶劑萃取。這些步驟導致所得數據不精確。參見Matthew J.Krueger等，“單胺氧化酶A和B的放射化學測定的可靠性檢查”，《分析生物化學》，214卷，116-123頁(1993)；Keith F.Tipton等，“評論-單胺氧化酶活性的放射化學測定-問題和易犯的錯誤”，《生物化學藥理學》，46卷，8期，1311-1316頁(1993)。
我們現在已經開發出一種連續性、可見的、高通過量篩選MAO的分光光度測定法，該方法基于顯色底物1-甲基-4-(1-甲基-2-吡咯基)-1，2，3，6-四氫吡啶發生氧化反應的有色產物。該測定對MAO-A和MAO-B都是非常適合的。它是敏感的，線性的，對由于增溶和部分純化的MAO A和MAO B所引起的低濁度水平也能耐受。反應產物在很多小時內都是穩定的，兩種酶的反應速率都是時間和酶濃度的線性函數。該測定已經成功地適用于微量滴定板方式，因此能夠在短時間內提供上千種供試噁唑烷酮化合物的信息。即使在用微量滴定板方式進行篩選時，也得到了關于在通行測定條件下的反應速率線性的準確信息。
另外，盡管噁唑烷酮化合物的MAO抑制活性評價是這項測定的最重要的用途，本發明也能用于檢測任意的MAO酶抑制劑。
本發明意義上的術語“藥學上可接受的鹽”指的是可用于本發明化合物給藥的鹽，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、富馬酸鹽等。這些鹽可以是水合形式。
本發明化合物可以按照下列本領域技術人員已知的方法根據流程I和II進行制備。簡單地說，如流程I所示，N-乙酰基噁唑烷酮1與鹽酸羥胺的水解反應例如得到胺2。在堿的存在下，結構2化合物用酰氯或酸酐處理，得到N-酰基噁唑烷酮3，其中n是1或2，R是如上定義的R1或R4。其中n是2的結構1化合物可以按照國際公報WO 97/09328公開的程序得到；其中n是1的結構1化合物可以如流程II所示制備。
流程II中的化合物4可以按照國際公報WO 97/09328公開的程序得到，在適當催化劑和適宜溶劑的存在下，它可被催化氫化作用還原為相應的順式和反式亞砜6和7，如途徑a所述。或者，可以作為如途徑a所示還原反應的副產物分離出硫化物5或者通過6或7與磺酸-碘化鈉系統的還原反應合成硫化物5，在適當溶劑中，它可被適當氧化劑氧化，例如NaIO4或間氯過苯甲酸，得到6和7，如流程II的途徑b所述。6和7的異構體混合物可以用色譜法分離。
流程I
流程II 這些化合物可用于人和其他溫血動物微生物感染的治療，包括眼科學感染，既可以胃腸外給藥也可以口服給藥。
本發明的藥物組合物可以按照下列方法制備利用標準和常規工藝，將本發明的式I和II化合物與固體或液體藥學上可接受的載體混合，可選地還與藥學上可接受的助劑和賦形劑混合。固體形式的組合物包括藥劑、片劑、可分散的顆粒、膠囊、扁囊劑和栓劑。固體載體可以是至少這樣一種物質，它也可以起到下列作用稀釋劑、矯味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑、片劑崩解劑和包封劑。惰性固體載體包括碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、蔗糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、纖維素材料、低熔點蠟、可可脂等。液體形式的組合物包括溶液、混懸液和乳液。例如，所提供的本發明化合物的溶液可以是溶于水、水-丙二醇和水-聚乙二醇系統中的溶液，可選地含有適當的常規著色劑、矯味劑、穩定劑和增稠劑。
優選地，藥物組合物是利用常規工藝所提供的單位劑型，含有有效量或適量活性組分，即根據本發明的式I或II化合物。
活性組分，即根據本發明的式I或II化合物在藥物組合物及其單位劑型中的量可以是不同的或者是被廣泛調節的，這取決于特定的應用、特定化合物的功效和所需濃度。一般來說，活性組分的量在0.5％至90％之間的范圍內，以組合物重量計。
在治療或對抗溫血動物細菌感染的治療用途中，該化合物或其藥物組合物將以達到和維持一定濃度的劑量口服、局部、透皮和/或胃腸外給藥，也就是說，活性組分在受治療動物內的量或血液水平將是抗菌有效的。一般來說，活性組分劑量的該抗菌有效量是在約0.1至約100、更優選為約3.0至約50mg/kg體重/天的范圍內。可以理解的是，劑量可以因下列因素而異患者的需要、所治療細菌感染的嚴重性和所用的特定化合物。還可以理解的是，為了快速達到所需血液水平，初始給藥劑量可以超過該上限水平，或者根據具體情況，初始劑量可以低于該最優值，在治療過程中可以逐漸增加每日劑量。如果需要的話，每日劑量也可以分為多劑量給藥，例如每天二至四次。
根據本發明的式I和II化合物是胃腸外給藥的，即注射，例如通過靜脈內注射或其他胃腸外給藥途徑。用于胃腸外給藥的藥物組合物一般含有藥學上可接受量的根據式I或II的化合物的可溶性鹽(酸加成鹽或堿鹽)，溶解在一種藥學上可接受的液體載體中，例如注射用水，還有緩沖劑，以提供適當緩沖的等滲溶液，例如具有約3.5-6的pH。適當的緩沖劑包括例如正磷酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、N-甲基葡糖胺、L(+)-賴氨酸和L(+)-精氨酸，以上列舉的僅是一部分代表性緩沖劑。根據式I或II的化合物一般溶解在載體中的量足以提供藥學上可接受的可注射濃度，在約1mg/ml至約400mg/ml溶液的范圍內。所得液體藥物組合物給藥，以得到上述劑量的抗菌有效量。根據本發明的式I和II化合物有利地以固體和液體劑型口服給藥。
本發明的噁唑烷酮抗菌劑具有對抗多種生物的有用活性。本發明化合物的體外活性可以用標準試驗操作進行評估，例如利用瓊脂稀釋法測定最小抑制濃度(MIC)，見“Approved Standard.Methodsfor Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for BacteriaThat Grow Aerobically”，1993年第3版，National Committee forClinical Laboratory Standards，Villanova，Pennsylvania，USA。本發明化合物對抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)的活性如表1所示。
用于測定MAO活性的連續性分光光度測定法基于顯色底物1-甲基-4-(1-甲基-2-吡咯基)-1，2，3，6-四氫吡啶被MAO酶作用的有色氧化產物。該產物在室溫下保持多日穩定。從MAO酶與底物混合開始，底物向氧化產物的轉化被連續跟蹤，初始反應速率曲線被直接觀察。亮黃綠色氧化產物在421nm具有峰吸收，可以測量的寬帶在390nm至440nm之間。因此，測定可以用最簡單的分光光度設備進行。底物本身是無色的；在測定條件下也不會自發轉化為產物；因此沒有干擾背景速率。
測定是敏感的，即使底物濃度發生非常低水平的變化(＜1％)也可以精確地測量速率。測定的敏感性允許測量可以針對非常低濃度的MAO酶進行，無論純品或組織勻漿均可。測定對所有在210-350nm之間產生吸收的生物來源物質的背景干擾不敏感。
測定顯示，反應速率對廣泛MAO酶、底物和噁唑烷酮濃度以及對任意底物或酶濃度下的大部分進程曲線都是線性的。例如，測定顯示，在下列條件下的反應速率都是線性的最終噁唑烷酮濃度為約1mM至約1nM；在421nm下足以產生0.0005-0.05/分鐘的吸光度變化的任意酶濃度；底物濃度為約10μM至約10mM。即使在低酶濃度下，反應速率對長時間間隔(長達90分鐘)也是線性的。這些性質使高精確性的速率測定成為底物濃度、酶濃度或噁唑烷酮抑制劑濃度的函數。
測定可以在一種緩沖溶液中進行，后者不應對反應產生不利影響，并提供約7.0至7.5的pH值范圍。優選的緩沖溶液是磷酸鈉。用于測定的優選pH值為約7.3。而且，測定優選在約25℃至約40℃的溫度下進行。最優選的測定溫度約為37℃。
顯色底物1-甲基-4-(1-甲基-2-吡咯基)-1，2，3，6-四氫吡啶的制備方法可以見N.Castagnoli Jr.等《醫藥化學雜志》，39卷，4756-4761頁(1996)，引用其作為參考文獻。底物制備成50mM磷酸鈉中的10-15mM儲備溶液。溶液在冰上或冷凍保存，在測定時通常用50mM磷酸鈉(pH＝7-7.5)稀釋1/10-1/100。
將人胎盤MAO A增溶并純化，例如參見N.Castagnoli Jr.等《醫藥化學雜志》，39卷，4756-4761頁(1996)和J.I.Salach等《生物化學雜志》，260卷，13199頁(1985)。人胎盤MAO以濃溶液(5nmols/ml)形式得到。將牛肝臟MAO B純化，方法見N.CastagnoliJr.等《醫藥化學雜志》，39卷，4756-4761頁(1996)和J.I.Salach等《酶學方法》，142卷，627-623頁(1987)。牛肝臟MAO B以濃溶液(8nmols/ml)形式得到。酶溶液的測定儲備液是將原始儲備溶液以1/50稀釋在50mM磷酸鈉和可選的10％甘油中制備的。該溶液保存在冰上，直到最后稀釋進行測定。或者，冷凍的MAO酶可以以800-3200倍稀釋在50mM磷酸鈉緩沖溶液中，然后立即使用。在篩選大量噁唑烷酮時，這種方法是有用的。
噁唑烷酮在DMSO中制備，濃度為50mM。在DMSO中連續對50mM儲備溶液進行稀釋，得到另外的儲備溶液，濃度為20mM至0.3125mM。然后將儲備溶液冷凍備用。在測定時將儲備溶液以1/100稀釋為最終酶測定體積。
通常，在測定前將酶、以及噁唑烷酮抑制劑在磷酸鈉緩沖液中預溫育約15分鐘。反應從加入底物開始。一般經過一至六十分鐘的間隔記錄初始速度。
在用分光光度計比色杯評價單獨噁唑烷酮的MAO抑制活性時，測定是完美的。測定也已經成功地適用于對高通過量的微量滴定板進行操作(即96、384和1536孔板讀數器)。可以同時進行上百個測定。測定體積為250μl，孔的有效通路長度為0.75cm。一般來說，微量滴定板中測定的最終組成包含0.05mM磷酸鈉(pH＝7.3)、濃度高至500μM的噁唑烷酮、1％DMSO、80μM底物(MAO A)或200μM底物(MAOB)和足量的酶，以在421nm下產生每分鐘0.0005至0.050的吸光度變化。反應在37℃下進行，通過在約37℃下對板和儲備溶液進行預溫育可以實現測定溶液的快速溫度平衡。反應后記錄在421nm下吸光度的增加。氧化產物在420下的消光系數為25,000M-1cm-1。見N.Castagnoli Jr.等《醫藥化學雜志》，39卷，4756-4761頁(1996)。利用421nm下進程曲線對吸光度變化為0.06-0.12的線性回歸來測定初始速率。該范圍代表測定中的底物消耗約為5％。由下列等式確定噁唑烷酮的百分抑制率％抑制率＝100{1-[速率(I)-速率(陰性對照)]/[速率(陽性對照)-速率(陰性對照)]}上式中，術語“陰性對照”指的是用1％DMSO但沒有MAO酶進行的完整測定。術語“陽性對照”指的是用1％DMSO但沒有抑制劑進行的完整測定。術語“速率(I)”指的是在完整測定條件下的反應速率。術語“速率(陰性對照)”指的是在陰性對照條件下的反應速率。術語“速率(陽性對照)”指的是在陽性對照條件下的反應速率。在以微量滴定板篩選方式評價單獨噁唑烷酮的MAO抑制活性的情況下，分別重復進行兩次陽性對照測定和兩次陰性對照測定，計算平均對照速率。在微量滴定板方式用于導出噁唑烷酮抑制劑的抑制常數(Ki)的情況下，每板含有四至八個沒有抑制劑的孔(陽性對照)。這些速率取平均，得到板的平均未抑制對照速率。每種抑制劑試驗六至八個濃度。每種濃度的抑制百分率相對于未抑制的對照速率而言。由于噁唑烷酮是MAO酶的競爭性抑制劑，使用下列等式從初始速度數據計算離解常數Ki
％抑制率＝100[I]/([I]+Ki(1+[S]/Km(S))見I.H.Segel，《酶動力學》，957卷，105頁(1975)，WileyInterscience.NY，NY。該等式中，[S]指的是顯色底物的濃度；[I]指的是噁唑烷酮抑制劑的濃度；Km(s)指的是MAO酶底物的離解常數。在實踐中，將從抑制劑實驗得到的數據點用非線性最小平方回歸分析擬合為該等式。用回歸程序估算Ki參數及其標準偏差。低Ki值表示供試抑制劑具有緊密的與MAO酶結合的能力，因此是強MAO抑制劑。
具體實施例方式
聯系下列實施例有助于更好地理解本發明的化合物及其制備，實施例意在闡述本發明，而不是對發明范圍的限制。
實施例1[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備 在40psi氫氣氛下，將(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(3，6-二氫-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺S-氧化物(4.50g，可以按照國際公報WO 97/09328所公開的操作得到)與氧化鉑(697mg)在甲醇(164ml)中的混合物在帕爾儀器上搖動18小時。然后通過硅藻土過濾除去催化劑，濾液在減壓下濃縮，殘余物進行硅膠色譜(230-400目，350g)，用甲醇/二氯甲烷(3/97-7/93)梯度洗脫。收集并濃縮TLC(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.44的級分，得到標題化合物，mp 203-204℃。
實施例2[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備 第1步[4(S)-順式]-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮的制備將[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺(實施例1，2.50g)與鹽酸羥胺(2.36g)在吡啶(30.6ml)與乙醇(3.4ml)中的混合物在100℃螺帽小瓶中攪拌22小時，然后在室溫下攪拌16小時，其間另加入鹽酸羥胺(944mg)和吡啶(4ml)。反應混合物然后在減壓下濃縮，用飽和含水碳酸氫鈉(100ml)和鹽水(50ml)稀釋，用固體碳酸鈉調pH為11，用甲醇/二氯甲烷萃取(10/90，5×100ml)。合并后的有機相在減壓下濃縮，粗產物進行硅膠色譜(230-400目，150g)，用甲醇/二氯甲烷(6/94-10/90)梯度洗脫。收集并濃縮TLC(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.14的級分，得到標題化合物，mp 159-161℃。
第2步[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備將[4(S)-順式]-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮(實施例2，第1步，150mg)、丙酸酐(62μl)與吡啶(75μl)的二氯甲烷溶液在氮氣氛下攪拌66小時，其間另加入丙酸酐(12μl)。反應混合物然后用水(15ml)稀釋，用二氯甲烷萃取(2×20ml)，合并后的有機相用鹽水(10ml)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，在減壓下濃縮，得到粗產物，進行硅膠色譜(230-400目，35g)，用甲醇/二氯甲烷(3/97-5/95)梯度洗脫。收集并濃縮TLC(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.51的級分，從二氯甲烷/二乙醚中重結晶，得到標題化合物，mp 212-214℃(分解)。
實施例3[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]環丙烷甲酰胺的制備 將[4(S)-順式]-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮(實施例2，第1步，250mg)與三乙胺(0.16ml)在二氯甲烷(3.1ml)中的溶液在0℃氮氣氛下用環丙烷碳酰氯(73μl)處理，在0℃下攪拌2小時。反應混合物然后用二氯甲烷(25ml)稀釋，用水(10ml)和鹽水(10ml)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，在減壓下濃縮，得到粗產物，進行硅膠色譜(230-400目，40g)，用甲醇/二氯甲烷(5/95)洗脫。收集并濃縮TLC(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.65的級分，然后用二氯甲烷/二乙醚(50/50)研制，并過濾，得到標題化合物，mp 242-243℃(分解)。
實施例4[4(S)-順式]-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備 按照實施例3的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用二氯乙酰氯代替環丙烷碳酰氯，得到標題化合物，mp 198-200℃(分解)。
實施例5(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備 第1步(S)-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮的制備按照實施例2第1步的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺S，S-二氧化物(可以按照國際公報WO97/09328所公開的程序得到)代替[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，得到標題化合物，mp 194℃(分解)。
第2步(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備按照實施例2第2步的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用(S)-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮(實施例5，第1步)代替[4(S)-順式]-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮，并允許反應時間為2小時，得到標題化合物，mp 200-201℃。
實施例6(S)-(-)-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備
按照實施例3的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用二氯乙酰氯代替環丙烷碳酰氯，用(S)-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1，1-二氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮(實施例5，第1步)代替[4(S)-順式]-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮，并用甲醇/氯仿(2/98)對粗產物進行色譜，得到標題化合物，mp 136-137℃(分解)。
實施例7[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備 第1步(S)-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備按照實施例1的一般操作，進行非關鍵性改變，但是收集并濃縮TLC色譜(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.67的級分，得到標題化合物，mp 202-205℃。C17H21FN2O3S分析計算值C，57.94；H，6.01；N，7.95；S，9.10；實測值C，57.95；H，5.98；N，7.94；S，8.97。
第2步[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備將(S)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺(實施例7，第1步，2.50g)在二氯甲烷(35ml)中的漿液在0℃氮氣氛下用MCPBA(2.16g，純度＜85％，＜10.64mmol)分兩部分處理。使所得混合物加溫至室溫，攪拌20分鐘，其間另加入MCPBA(360mg，純度＜85％，＜1.77mmol)。反應物然后用二氯甲烷(50ml)稀釋，用飽和含水碳酸氫鈉(50ml)洗滌，水相再用甲醇/二氯甲烷萃取(2×50ml，5/95)，合并后的有機相用鹽水(25ml)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，在減壓下濃縮。粗反應混合物進行硅膠色譜(230-400目，350g)，用甲醇/二氯甲烷(3.5/96.5-5/95)梯度洗脫，收集TLC(甲醇/氯仿，10/90)Rf＝0.42的級分，濃縮得到順式與反式亞砜產物的混合物。隨后用HPLC純化(Chiralcel OD柱，乙醇洗脫劑)，然后用二氯甲烷/二乙醚(50/50)研制，得到標題化合物，mp211-212℃。
第3步[4(S)-反式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮的制備按照實施例2第1步的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺代替[4(S)-順式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，得到標題化合物，mp 138-140℃。
第4步[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]丙酰胺的制備按照實施例2第2步的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用[4(S)-反式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮代替[4(S)-順式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮，得到標題化合物，mp 200-202℃(分解)。
實施例8[4(S)-反式]-(-)-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]環丙烷甲酰胺的制備
按照實施例3的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用[4(S)-反式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮代替[4(S)-順式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮，得到標題化合物，mp189-191℃。
實施例9[4(S)-反式]-2，2-二氯-N-[[3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺的制備 按照實施例3的一般操作，進行非關鍵性改變，但是用二氯乙酰氯代替環丙烷碳酰氯，用[4(S)-反式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮代替[4(S)-順式]-(-)-3-[3-氟-4-(四氫-1-氧橋-2H-噻喃-4-基)苯基]-5-氨甲基-2-噁唑烷酮，得到標題化合物，mp 206-208℃(分解)。
實施例10噁唑烷酮對人MAO-A的抑制活性評價增溶和純化形式的人MAO-A和底物從Dr.Neal Castagnoli Jr’slab in Department of Chemistry，Virginia Technical University，Blacksburg，Virginia得到。
緩沖溶液的制備制備磷酸鈉的50mM儲備溶液，37℃下pH＝7.3。供試化合物的制備在DMSO中制備供試化合物的儲備溶液(50mM)。在DMSO中進行50mM儲備溶液的連續稀釋，形成另外的儲備溶液，濃度范圍為20mM至0.3125mM。然后冷凍這些儲備溶液備用。在測定時，將儲備溶液以1/100稀釋為最終酶測定體積。在50mM磷酸鹽緩沖液中制備顯色底物的10mM儲備溶液，分成等份，然后冷凍備用。
酶測定-在SPECTRAmax 250微板分光光度計(Molecular DevicesCorp.，Sunnyvale，CA)中進行初始速度測定。測定溶液的最終組成包含0.05M磷酸鈉(pH＝7.3)、80μM底物、濃度高至500μM的抑制劑、1％DMSO和在421nm下足以產生0.0005-0.005/分鐘的吸光度改變的酶。反應在37℃下進行。反應后記錄421nm下吸光度的增加。在開始反應前將抑制劑與MAO A在反應混合物中預溫育15分鐘。使用上述等式，從初始速度數據測定Ki值。
結果也如表1所示。
表1抗金黃色葡萄球菌UCNo.9213和革蘭氏陰性細菌流感嗜血桿菌30063的體外活性和人MAO A的抑制活性數據
權利要求
1.測定可能具有單胺氧化酶抑制活性的化合物的方法，包括下列步驟a)將可能的抑制劑與單胺氧化酶在pH值為約7.0至約7.5的緩沖溶液中溫育；b)向所述溫育溶液中加入1-甲基-4-(1-甲基-2-吡咯基)-1，2，3，6-四氫吡啶；和c)測定所述噁唑烷酮的單胺氧化酶抑制活性。
2.權利要求1的方法，其中所述抑制劑是噁唑烷酮抗生素。
3.權利要求1的方法，其中所述緩沖溶液是磷酸鹽溶液。
4.權利要求1的方法，其中所述緩沖溶液的pH值為約7.3。
5.權利要求1的方法，其中溫育時間為約15分鐘。
6.權利要求1的方法，其中所述單胺氧化酶是單胺氧化酶A。
7.權利要求1的方法，其中所述單胺氧化酶是單胺氧化酶B。
8.權利要求1的方法，其中所述噁唑烷酮的最終濃度為約1mM至約1nM。
9.權利要求1的方法，其中所述MAO酶在421nM下足以產生0.0005-0.05/分鐘的吸光度變化。
10.權利要求1的方法，其中所述底物的濃度為約50μM至約500μM。
11.權利要求1的方法，其中所述的測定是在分光光度計中進行的。
12.權利要求1的方法，其中所述的測定是在微量滴定板分光光度計中進行的。
全文摘要
測定可能具有單胺氧化酶抑制活性的化合物的方法，包括下列步驟a)將可能的抑制劑與單胺氧化酶在pH值為約7.0至約7.5的緩沖溶液中溫育；b)向所述溫育溶液中加入1－甲基－4－(1－甲基－2－吡咯基)－1，2，3，6－四氫吡啶；和c)測定所述噁唑烷酮的單胺氧化酶抑制活性。
文檔編號C07D263/20GK1532535SQ20041003282
公開日2004年9月29日 申請日期1998年11月23日 優先權日1997年12月5日
發明者T－J·波爾, J·P·小馬丁, M·R·巴巴奇恩, T-J 波爾, 小馬丁, 巴巴奇恩 申請人:法瑪西雅厄普約翰美國公司