專利名稱：一種肝過氧化氫酶的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種酶的制備方法，確切講是指肝臟過氧化氫酶的制備方法。本方法所涉及的方法是利用動物肝臟生產肝過氧化氫酶，在制備過程中是先將動物的肝臟進行勻漿處理。
背景技術：
隨科學技術的進步和對環境問題的重視，全球過氧化氫的使用量正以10％速度逐年增加。如印染業更多采用過氧化氫進行坯布的漂白；造紙業用過氧化氫替代氯進行紙漿的漂白；食品工業中采用過氧化氫滅菌等。在應用中為去除處理液殘留的過氧化氫，必然大量使用過氧化氫酶。因此近年來對過氧化氫酶的需求量大大增加。
過氧化氫酶生產的傳統工藝，參見《生化藥物》1989，(1)30，“從牛肝中提取過氧化氫酶工藝探討”，該工藝是將動物的肝臟經勻槳處理后，再在低溫下離心分離。由于肝臟結締組織豐富，肝糖原含量高，因此勻漿后形成比重較大、粘度很高的溶液，用常規離心法離心極為困難，因此產物收率很低，生產周期很長。
國內外近期開辟了以微生物發酵生產過氧化氫酶方法，如《生物化學與生物物理進展》1990年第17卷，第5期，“細菌過氧化氫酶的分離、結晶及性質”和《微生物學報》42卷3期2002年6月，“重組大腸桿菌熱穩定性過氧人氫酶的純化及性質研究”。但這類工藝的設備投資巨大，以年產干噸量計算，至少需設備投資5000萬元。
發明內容
本發明提供一種新的利用動物肝臟制備肝過氧化氫酶的方法。
本發明是先將動物肝臟進行勻漿處理，其特征是在經勻漿處理后的動物肝臟中加入1至4倍肝重量的磷酸緩沖液，混勻后裝入發酵罐中，在22±5℃下進行發酵，期間保持體系的pH值為5～6，發酵48±12小時后，再加入適量有機酸使體系的pH值降為4.0～4.5，靜置15～35分鐘后在體系中加入氯化鈉2～4％(濃度比)，放置1.5～2.5小時，再在體系中加入0.5～1.2％(濃度比)的1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(以下簡稱PT)和適量的氫氧化鈉將體系的pH值調到6～7，攪勻后靜置1.5～2.5小時，分離出體系中的上清液，再將上清液用離心機分離，可得淡黃色的含肝過氧化氫酶水溶液。本發明所采用的有機酸可以是醋酸或檸檬酸。
實驗發現，在實施本發明時在勻漿后的肝液中加入磷酸緩沖液的量對其效果的影響最為顯著，但加入量過大則其后處理壓力太大，本發明建議采用的肝水比為1∶2。另外，發酵時體系pH值保持在5.0～5.6。在發酵完成后在體系中加入檸檬酸或醋酸等有機酸，調節體系的pH值為4.1，靜置20分鐘后在體系中加入氯化鈉3％(濃度比)放置2.0小時。再在體系中加入1％PT和適量的氫氧化鈉將體系的pH值調到6.5，攪勻后靜置2小時。
以前述方法得到產物后可再用離心分離、微濾、超濾、濃縮處理，使其達到滿足使用要求的活力指標。作為生產液態酶的商品時，還應當與現有技術一樣，再在其中加入適量的防腐劑和酶活力保護劑。
另外，也可以將經超濾濃縮處理后的產物再用DEAE-CELL離子交換樹脂進行層析，經層析后的產物進行冷凍干燥處理，得到固體的肝過氧化氫酶。
本發明的最佳發酵條件為在經勻漿處理的肝臟中加入2倍肝重量的磷酸緩沖液，發酵時體系pH值保持在5.5、溫度22℃的條件下，48小時完成發酵。
本發明在體系中加入檸檬酸等有機酸調節體系的pH值為4.1時其去除雜蛋白的效果最好。體系在這種條件下再加入3％氯化鈉，放置2小時去除雜蛋白。
當本發明中加入1％的PT，并在pH6.5條件下，進一步去除雜蛋白的效果最好。
本發明的方法在經勻漿處理的肝臟中加入帶有磷酸緩沖液的水時，還可加入適量的含硒化合物或銅鹽或二氯苯酚等促使酶加速形成的激發劑。有關實驗表明在勻漿肝液中加入適量的類似硒化合物，或者銅鹽，或者二氯苯酚等物質，可以使酶的產量增加，加速酵解的過程，提高酶收率。其加入的硒化合物，或者銅鹽，或者二氯苯酚等物質的數量可以通過試驗優選確定。需特別注意的是，當此類物質加入量過多時會引起酶完全失活，反而影響酶的收率，而當加入量過少時則不會起到促進酶收率效果。本發明中建議加入30mg/L(體系容積)的亞硒酸鈉和0.1mg/L的二氯苯酚混合物時有最好的效果。
本發明的方法是通過發酵法從動物肝臟中生產更多的過氧化氫酶，其收率高于傳統工藝一倍以上。同時，本發明的顯著特點是充分利用了動物肝臟發酵過程中結締組織、粘蛋白及酵解過程中產生的CO2共同形成天然過濾網層系統。這種天然過濾網層系統使發酵液自動分層而獲得高活力酶提取液，從而徹底革除傳統工藝周期長、離心困難的弊端。本發明的生產周期僅及傳統工藝的十分之一。與傳統工藝和微生物發酵工藝相比，本發明的生產周期、生產成本和固定投資都有明顯優勢。據測算，本發明年產1000噸過氧化氫酶的固定資產投資僅為90萬，而傳統工藝所需固定資產投資達800萬元，微生物發酵工藝的固定資產投資將高達5000萬元。另外采用本發明制備肝過氧化氫酶，可以充分利用動物的肝臟，同時處理后不產生污染物。
圖1為本發明的pH值與肝過氧化氫酶活力及雜蛋白含量關系(等電點沉淀處理結果)，其中淺色曲線為酶活力曲線，深色曲線為雜蛋白濃度。
圖2為在pH值6.5條件下，不同用量的PT對肝過氧化氫酶活力及雜蛋白含量關系的影響，其中淺色曲線為酶活力曲線，深色曲線為雜蛋白濃度。
具體實施例方式
以下提供本發明的具體實施情況取牛肝臟1000kg粉碎勻漿后加入1000～3000kg 0.01mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液，經充分攪拌后再將液體轉入發酵罐中，在22±5℃下進行發酵，期間保持體系的pH值為5～6，發酵48±12小時后，罐內液體會自然分層，取上清液體，加入適量醋酸使體系的pH值降為4.0～4.5，靜置15～35分鐘后再在體系中加入氯化鈉2～4％(濃度比)，再放置1.5～4.5小時。然后，再在體系中加入0.5～1.2％PT和適量的氫氧化鈉將體系的pH值調到6～7，攪勻后靜置1.5～2.5小時。此時部份雜蛋白會自然沉降，取上層液體用105管式離心機離心即可得淡黃色酶液，該酶液經2μm膜微濾、截留分子量3萬超濾膜超濾、濃縮得約780kg黃色濃縮酶液，經測試其酶活力為6.0～6.2萬μ/ml。該濃縮酶液用0.1mol/L的磷酸緩沖液將體系的pH調至6～7，再先后加入防腐劑、酶活力保持劑，經檢測，酶收率為90％。
經對本發明中溫度、肝與水的比例、體系pH值及酵解時間等工藝參數的正交試驗表明，肝水比例是影響酵解的主要因素，其次是酵解時間和酵解溫度，影響最小的是體系pH值，其中最佳的工藝參數是肝水比1∶3，酵解溫度22℃，pH5.5，酵解時間為48小時。但由于肝水比1∶3對后處理壓力太大，故采用肝水比1∶2。
本發明進行等電點沉淀時，體系的pH值在4.0～4.5較好，當pH為4.1時，其雜蛋白濃度最低，而肝過氧化氫酶的活力最高。關于這一點可參見附圖1。
在體系中加入的PT量在1％(濃度比)左右，其去除雜蛋白效果最佳。PT量對處理結果的影響參見附圖2。
如果將經超濾濃縮后的產物用DEAE-CELL離子交換樹脂層析，再進行真空冷凍干燥處理，即可以得到固態的肝過氧化氫酶。
以下是本發明的最佳實施例取豬肝臟1000kg勻漿后，加入2000kg 0.01mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液，經充分攪拌后再將液體轉入發酵罐中，在22℃下進行發酵，期間保持體系的pH值為5.5，發酵48小時后，罐內液體會自然分層，取中層液體，加入適量檸檬酸使體系的pH值降為4.1，靜置20分鐘后在體系中加入3％氯化鈉，放置2.0小時，再在體系中加入1％PT和適量的氫氧化鈉將體系的pH值調到6.5，攪勻后靜置2.0小時。取上層清液用105管式離心機離心得淡黃色酶液，該酶液經2μm膜微濾、截留分子量3萬超濾膜超濾、濃縮得780kg黃色濃縮酶液，經測試其酶活力為6.8萬單位/ml。該濃縮酶液用0.1mol/L的磷酸緩沖液將體系的pH調至6.5，再先后加入防腐劑、酶活力保護劑，經測試其過氧化氫酶的收率為90％。
如果在上實施例中，在勻漿后的肝中加入磷酸緩沖液時，還可以加入適量的類似硒化合物，或者銅鹽，或者二氯苯酚等物質，這可以使酶的產量增加，提高酶的收率。如果在肝中加入30mg/L(體系容積)的亞硒酸鈉和0.1mg/L的二氯苯酚混合物時可提高酶收率約7％左右。
權利要求
1.一種肝過氧化氫酶的制備方法，以動物肝臟為原料，先將動物肝臟進行勻漿處理，其特征是在勻漿處理后的動物肝臟中加入1至3倍肝重量的磷酸緩沖液，混勻后裝入發酵罐中，在22±5℃下進行發酵，期間保持體系的pH值為5～6，發酵48±12小時后，加入適量有機酸使體系的pH值降為4.0～4.5，靜置15～35分鐘后，再在體系中加入2～4％的氯化鈉，放置1.5～2.5小時，再在體系中加入0.5～1.2％的1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(以下簡稱PT)和適量的氫氧化鈉將體系的pH值調到6～7，攪勻后靜置1.5～2.5小時，分離出體系中的上清液，再將上清液離心分離、微濾、超濾濃縮。
2.根據權利要求1所述的任一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是發酵條件為在經勻漿處理的肝臟中加入2倍肝重量的磷酸緩沖液，發酵時體系pH值保持在5.5、溫度22℃的條件下，48小時完成發酵。
3.根據權利要求2所述的肝過氧化氫酶制備方法，其特征是在體系中加入檸檬酸等有機酸調節體系的pH值為4.1，再加入3％的氯化鈉，放置2小時去除雜蛋白。
4.根據權利要求3所述的肝過氧化氫酶制備方法，其特征是在pH6.5條件下，在體系中加入1％PT放置2小時進一步去除雜蛋白。
5.根據權利要求1至4所述的一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是在經勻漿處理的肝臟中加入帶有磷酸緩沖液的水，并加入適量的含硒化合物或銅鹽或二氯苯酚。
6.根據權利要求1至4所述的一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是在經勻漿處理的肝臟中加入帶有磷酸緩沖液的水，并加入適量亞硒酸鈉和二氯苯酚混合物。
7.根據權利要求1至4所述的任一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是再將產物進行DEAE-CELL離子交換樹脂層析，經層析后的產物進行冷凍干燥處理。
8.根據權利要求5所述的任一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是再將產物進行DEAE-CELL離子交換樹脂層析，經層析后的產物進行冷凍干燥處理。
9.根據權利要求6所述的任一種肝過氧化氫酶制備方法，其特征是再將產物進行DEAE-CELL離子交換樹脂層析，經層析后的產物進行冷凍干燥處理。
全文摘要
本發明公開一種利用動物肝臟制備過氧化氫酶的方法。本方法所涉及的方法是將動物肝臟勻漿發酵處理，經分離得到澄清酶液，再經等電點沉淀、PT沉淀，去除雜蛋白后，獲得高活力的淡黃色肝過氧化氫酶產品。該方法投資少，酶產率高，生產周期短。
文檔編號C07K1/14GK1676604SQ200410029898
公開日2005年10月5日 申請日期2004年4月1日 優先權日2004年4月1日
發明者金德美 申請人:金德美