專利名稱：內嗎啡肽－1及內嗎啡肽－2的液相合成法的制作方法
技術領域：
本發明涉及肽的制備，尤其是一種內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成方法。
背景材料內嗎啡肽(endomorphins，EMs)分為內嗎啡肽-1(endomorphin-1，EM-1，Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，酪氨酰脯氨酰色氨酰苯丙胺)和內嗎啡肽-2(endomorphin-2，EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰苯丙酰胺)，是μ阿片受體(mu-opioid receptor，MOR)的內源性激動劑，對MOR具有極高的親和力和選擇性，并具有廣泛的生理、藥理效應特別是強效的鎮痛作用。
內嗎啡肽的氨基酸組成及結構如下式所示 EM-1Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2EM-2Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2研究表明，內嗎啡肽不但在心血管系統、呼吸調節及細胞損傷保護等方面具有重要作用，同時具有強效的鎮痛作用。腦室注射(icv.)、鞘內注射(it.)內嗎啡肽均可產生與嗎啡等效的鎮痛作用[Zadina JE等，Nature，1997，386499-502；Tseng LF等，J Pharmacol Exp Ther，2000，292576-583]，但卻不產生嗎啡所具有的某些副作用[Carrigan K A等，Psychopharmacology，2000，151299-305；Czapla M A等，Am.J.Respir.Crit.Care Med，2000，162994-999]。更為特別的是內嗎啡肽能劑量依賴性地對抗異常疼痛，特別是在神經源性痛的調節中，內嗎啡肽比嗎啡有更強的抑制作用，因此，內嗎啡肽可能用于治療當前比較棘手的神經性疼痛[Przewlocka B等，Eur J Pharmacol，1999，367(2-3)189-96]。同時，EMs對嗎啡依賴的大鼠亦有鎮痛作用，這一點對臨床改進阿片類藥物的研制、提高鎮痛效果可能有重要的啟示。
已有的大量研究發現，EMs盡管只由四個氨基酸殘基組成，卻蘊涵了豐富的生命信息，通過高親和性、高選擇性地與μ受體結合而介導許多生理功能，特別是其在痛覺感受和痛覺調節過程中的獨特作用，豐富了人們對痛覺調節的認識，為多肽化學家及藥學家研制開發強效、低毒的新型鎮痛藥提供了新思路，而且其構象的相對簡單，為阿片領域的研究、阿片肽的化學模擬及新型高效的鎮痛藥的開發提供了更加便捷的模式，從而激起了廣泛的研究熱潮。同時，隨著研究的深入，EMs及其模擬物的商業及臨床應用將成為必然。因此，如何簡單、高效、廉價而又能大規模的獲得EMs，以用于研究需要及規模化生產，已十分重要。
現有文獻中，前人多采用從生物材料中提取的方法或采用固相合成法合成的方法獲得內嗎啡肽，但數量有限，不適合規模化生產，且成本高。本發明提供了一種全新的內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成路線，在采用最小保護的策略下，我們對氨基酸的N-端采用芐氧羰基(Z-)保護，由于Z-保護的氨基酸及肽容易結晶，因此，極大的方便了中間產物的純化；同時采用[2+2]片段縮合法，片段的合成采用DCC-HOSu(二環己基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺)法進行，而片段偶聯則采用DCC-HOBt(二環己基碳二亞胺/1-羥基苯駢三氮唑)法進行的組合縮合方式進行EMs的全合成，Z-保護基的脫除采用催化氫化進行，并采用普通硅膠柱層析方法直接得到高純度的終產物，從而簡化了合成步驟及純化方法，方便了合成，大大的提高了產率，節約了生產成本。
發明內容
本發明的目的在于提供一條經過優化的內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成方法，具有操作簡單，低成本、高純度、高產率的簡便高效特征，并能適用于規模化生產。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現本發明技術方案是針對各氨基酸或肽鏈的不同特征采用最小保護或不保護，并根據其特征采用不同的縮合方式，結合DCC-HOBt縮合法，DCC-HOSu活化酯法進行全合成；中間產物不必純化或僅采用低溫析晶法即可純化，終產物用普通硅膠柱層析。
本發明采用[2+2]片段縮合法，以芐氧羰基酪氨酰脯氨酸(Z-Tyr-Pro)為第I片段，以芐氧羰基色氨酰苯丙酰胺(Z-Trp-Phe-NH2)或芐氧羰基苯丙氨酰苯丙酰胺(Z-Phe-Phe-NH2)作為第II片段，在采用最小保護的策略下，對氨基酸的N-端采用Z-保護，而C-端則采用簡單Na+鹽保護或不保護的策略；保護基的脫除分別采用鈀碳(Pd/C)催化氫化或酸解進行，片段的合成采用DCC-HOSu法進行，而片段偶聯則采用DCC-HOBt法進行。
芐氧羰基酪氨酰脯氨酸(Z-Tyr-Pro)片段的合成Z-Tyr-OH與L-Pro-OH采用DCC-HOSu法，四氫呋喃(THF)或THF、NaHCO3/H2O混合溶液作為反應溶劑；接肽反應終止后，用鹽酸酸化處理；常規后處理后采用低溫石油醚結晶，得固體Z-Tyr-Pro-OH；芐氧羰基色氨酰苯丙酰胺(Z-Trp-Phe-NH2)及芐氧羰基苯丙氨酰苯丙酰胺(Z-Phe-Phe-NH2)片段的合成芐氧羰基色氨酸(Z-Trp-OH)與苯丙酰胺鹽酸鹽(Phe-NH2.HCl)采用DCC-HOSu法縮合，用NaHCO3水溶液中和鹽酸鹽，用THF/EA(1∶2，v/v)析晶得Z-Trp-Phe-NH2固體；Z-Phe-OH與Phe-NH2.HCl采用DCC-HOSu法縮合，NaHCO3水溶液中和鹽酸鹽，用乙酸乙酯(EA)析晶得Z-Phe-Phe-NH2晶體；芐氧羰基酪氨酰脯氨酰色氨酰苯丙酰胺(Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)及芐氧羰基酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰苯丙酰胺(Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)的合成采用鈀碳催化氫化脫保護，Z-Tyr-Pro-OH與H2N-Trp-Phe-NH2采用DCC-HOBt法縮合，EA/PE(1∶2，V/V)析晶得到Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2固體；Z-Tyr-Pro-OH與H2N-Phe-Phe-NH2采用DCC-HOBt法縮合，EA析晶得到Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2固體；采用鈀碳催化氫化脫去保護四肽Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的Z-保護基，再經硅膠柱層析(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝50∶10∶1，v/v)純化，得內嗎啡肽-1(endomorphin-1，，H2N-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，酪氨酰脯氨酰色氨酰苯丙酰胺)，純度≥98％；脫去保護四肽Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2的Z-保護基，再經硅膠柱層析(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝60∶12∶1，v/v)純化，得內嗎啡肽-2(endomorphin-2，H2N-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰苯丙酰胺)，純度≥95％。
本發明的優點和產生的有益效果是1、本發明采用一條優化合成路線，針對各氨基酸及肽鏈的不同特性，采用片段縮合法的合成策略，對氨基酸采用最小保護或不保護及不同的縮合方法，片段的合成采用DCC-HOSu法進行，而片段偶聯則采用DCC-HOBt法進行的組合縮合方式進行，對基團的保護及脫保護均簡單高效，具有合成路線簡單，步驟少，成本低的顯著特征，特別適用于規模化生產或工業生產。
2、本發明的另一顯著特征是純化方法簡單，中間產物不必純化，或僅采用低溫析晶法即可純化；終產物不必經昂貴的HPLC純化，僅用普通硅膠柱層析即可獲得高純度產物，從而簡化了合成步驟及純化方法，方便了合成，大大地提高了產率，節約了生產成本，使內嗎啡肽推廣生產成為可能。
3、本發明研究試驗出的一套優良的內嗎啡肽合成路線及方法，達到操作簡化，純化簡單高效，生產方便可靠，生產成本低廉的目的，為內嗎啡肽的工業化規模生產及實驗室小量生產均提供了可靠的技術支持，并可極大地推動內嗎啡肽的深入研究及作為多肽藥物的開發及臨床應用研究；同時，亦可為其他多肽及多肽藥物的合成及規模化生產提供思路。
具體實施例方式
下面以實施例的方式對本發明的技術方案再作進一步說明實施例1內嗎啡肽-1的液相合成(1)Z-Tyr-Pro-OH的合成將等摩爾量的Z-Tyr與HOSu溶于無水THF中，在℃冷卻及充分攪拌下，緩慢滴加入溶解了等量DCC的預冷THF溶液，再室溫反應，過夜。抽濾，得Z-Tyr-OSu溶液。攪拌，然后將1.5倍量的L-Pro用NaHCO3溶液溶解后，滴加入Z-Tyr-OSu溶液中，室溫反應約2d。反應結束后，緩慢滴加6mol/L HCl，至溶液PH為2。然后減壓濃縮去THF，用乙酸乙酯萃取，再酸洗，然后用NaCl溶液洗至中性，加入無水硫酸鈉干燥。濾掉無水硫酸鈉，再減壓濃縮去掉乙酸乙酯，得糖漿狀物。經冰冷的石油醚研磨過濾、洗滌，得到淡黃色固體Z-Tyr-Pro-OH，收率68.2％，Rf＝0.25(PE∶EA＝1∶3(添加少量冰HAc)，V/V)。質譜(ESI-MS)[M+H]+413；與計算值413一致。
(2)Z-Trp-Phe-NH2的合成將等摩爾量的Z-Trp與HOSu溶于無水THF中，在℃冷卻及充分攪拌下，緩慢滴加入溶解了等量DCC的預冷THF溶液，再室溫反應，過夜。抽濾，濾去DCU，濾液抽濾至圓底燒瓶中，得Z-Trp-OSu溶液。攪拌，然后將1.2倍量的Phe-NH2.HCl用稍過量的NaHCO3溶液溶解中和后，滴加入Z-Trp-OSu溶液中，室溫反應約2d。TLC檢測原料點消失后，減壓濃縮去THF，殘留溶液用乙酸乙酯溶解，萃取。乙酸乙酯層合并，依次進行酸洗、飽和NaHCO3洗滌，最后再用NaCl溶液洗至中性。加入無水硫酸鈉干燥，過夜。濾掉無水硫酸鈉，減壓濃縮去掉乙酸乙酯，得固體物。用THF/EA(1∶2，v/v)重結晶，干燥，得白色固體Z-Trp-Phe-NH2，收率86.1％，Rf＝0.24(PE∶EA＝1∶3，V/V)。質譜(ESI-MS)[M+H]+485；與計算值485一致。
(3)色氨酰苯丙酰胺(H2N-Trp-Phe-NH2)的合成將Z-Trp-Phe-NH2溶于無水甲醇中，加入0.15倍量的10％的Pd/C，攪拌，通入氫氣氫化3h，濾去催化劑，濾液減壓濃縮至干(浴溫不超過40℃)，得H2N-Trp-Phe-NH2，作為氨基組分，直接進行下一步反應。
(4)Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2將等摩爾量的Z-Tyr-Pro-OH及HOBt溶于無水DCM/DMF混合溶劑中，冰鹽浴冷卻攪拌下，緩慢滴加入溶解了等摩爾量DCC的預冷DCM溶液，再室溫反應12h后，濾去DCU，得Z-Tyr-Pro-OBt溶液。冰鹽浴，攪拌，加入上步所得的已溶于預冷無水DCM的H2N-Trp-Phe-NH2溶液，冰鹽浴反應1h，然后恢復至室溫反應。約30h后，減壓濃縮去DCM，殘留物用乙酸乙酯溶解后，依次進行酸洗、飽和NaHCO3洗滌，最后再用NaCl溶液洗至中性，無水硫酸鈉干燥，得粗產物。用EA/PE(1∶2，V/V)重結晶，干燥，得Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2固體，收率91.6％，Rf＝0.24(PE∶EA∶HAc＝3∶30∶1，V/V)。質譜(ESI-MS)[M+H]+745；與計算值745相一致。
(5)內嗎啡肽-1(H2N-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)的獲得將Z-Tyr-Pro-Trp-P he-NH2溶于無水甲醇中，加入0.15倍量10％的Pd/C，攪拌，通入氫氣氫化，5h后，濾去催化劑，濾液減壓濃縮至干(浴溫不超過40℃)，得粗肽。采用普通硅膠柱層析(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝50∶10∶1，v/v)純化，干燥，得純肽H2N-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2(內嗎啡肽-1，endomorphin-1)，收率73.1％，純度≥98％；Rf＝0.39(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝50∶10∶1，v/v)，Rf＝0.45(CH3CN∶MeOH∶H2O＝4∶1∶1，v/v)；RP-HPLC分析(體系35％乙腈/水(含0.1％TFA))tR＝7.1min；質譜(ESI-MS)[M+H]+611；與計算值611相一致。
實施例2內嗎啡肽-2的液相合成(1)Z-Phe-Phe-NH2操作步驟同內嗎啡肽-1(2)；等摩爾量的Z-Phe與HOSu、DCC反應過夜，得Z-Phe-OSu溶液；然后與用NaHCO3溶液溶解中和的等摩爾量的Phe-NH2.HCl反應約2d，后處理并干燥后，最后獲得白色固體。用EA重結晶，干燥，得針狀白色晶體，收率90.5％，Rf＝0.65(PE∶EA＝1∶3，V/V)。質譜(ESI-MS)[M+H]+446；與計算值446一致。
(2)苯丙氨酰苯丙酰胺(H2N-Phe-Phe-NH2)的合成操作步驟同內嗎啡肽-1合成步驟(3)。將Z-Phe-Phe-NH2溶于無水甲醇中，加入0.15倍量10％的Pd/C，反應時間3h，得H2N-Phe-Phe-NH2，作為氨基組分，直接進行下一步反應。
(3)Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2操作步驟同內嗎啡肽-1合成步驟(4)。等摩爾量的Z-Tyr-Pro-OH、HOBt、DCC，反應12h，得Z-Tyr-Pro-OBt溶液。將上步所得氨基組分H2N-Phe-Phe-NH2加入，反應約30h，后處理并干燥后最后得粗產物。用EA重結晶，干燥，得Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2白色固體，收率81.4％；Rf＝0.27(PE∶EA∶HAc＝3∶30∶1，V/V)。質譜(ESI-MS)[M+H]+706；與計算值706相一致。
(4)內嗎啡肽-2(H2N-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)的獲得操作步驟同內嗎啡肽-1合成步驟(5)。將Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2溶于無水甲醇中，加入10％Pd/C0.15倍量，反應時間5h，最后抽干得粗肽。采用普通硅膠柱層析(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝60∶12∶1，v/v)純化，干燥，得純肽(內嗎啡肽-2，endomorphin-2)，收率84.0％，純度≥95％；Rf＝0.30(EA∶MeOH∶濃NH3.H2O＝60∶12∶1，V/V)，Rf＝0.43(CH3CN∶MeOH∶H2O＝4∶1∶1，v/v)；RP-HPLC分析(體系35％乙腈/水(含0.1％TFA))tR＝6.5min；質譜(ESI-MS)[M+H]+572；與計算值572相一致。
權利要求
1.一種內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成法，其特征是針對各氨基酸或肽鏈的不同特征，對氨基酸采用最小保護或不保護及不同的縮合方式，并以DCC-HOSu法(二環己基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺法)或DCC-HOBt法(二環己基碳二亞胺/1-羥基苯駢三氮唑法)為肽鍵生成方法，采用[2+2]多肽片段縮合法進行全合成；保護基的脫除分別采用催化氫化或酸解脫除；根據不同的中間產物的特性，對中間產物采取不必純化或僅采用低溫析晶法方法純化，而終產物內嗎啡肽-1或內嗎啡肽-2采用普通硅膠柱層析法純化。
2.根據權利要求1所述的一種內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成法，其特征是以芐氧羰基酪氨酰脯氨酸(Z-Tyr-Pro)為第I片段，以芐氧羰基色氨酰苯丙酰胺(Z-Trp-Phe-NH2)或芐氧羰基苯丙氨酰苯丙酰胺(Z-Phe-Phe-NH2)作為第II片段，片段I、II的合成采用DCC-HOSu法進行，并用NaHCO3水溶液中和鹽酸鹽，而片段I、II的偶聯則采用DCC-HOBt法進行；對作為羧基組分的氨基酸N-端采用Z-(芐氧羰基-)保護，而對作為氨基組分的脯氨酸(Pro)的C-端則采用Na+鹽保護，對作為氨基組分的苯丙酰胺鹽酸鹽(Phe-NH2.HCl)用稍過量的NaHCO3溶液或氫氧化鈉溶解中和；Z-保護基的脫除采用鈀/碳(Pd/C)或氫氧化鈀/碳(Pd(OH)2/C)催化氫化，Na+鹽保護的脫除采用鹽酸酸化。
3.根據權利要求1所述的一種內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成法，其特征是中間產物Z-Tyr-Pro-OH經冰冷(＜0℃)的石油醚研磨析晶得到，中間產物Z-Trp-Phe-NH2用四氫呋喃/乙酸乙酯析晶得到，中間產物Z-Phe-Phe-NH2用乙酸乙酯析晶得到，Z-保護四肽Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2用乙酸乙酯/石油醚析晶得到，Z-保護四肽Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2用乙酸乙酯析晶得到。
4.根據權利要求1至3任一項所述的一種內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2的液相合成法，其特征是最終產物內嗎啡肽-1及內嗎啡肽-2分別由Z-保護四肽(Z-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2及Z-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)經Pd/C或Pd(OH)2催化氫化脫Z-保護得到，并采用以乙酸乙酯、甲醇、濃氨水構成的體系作為流動相的硅膠柱層析法純化。
全文摘要
一種內嗎啡肽－1及內嗎啡肽－2的液相合成法。針對內嗎啡肽的各氨基酸及肽鏈的不同特征，對氨基酸采用最小保護或不保護，并采用[2+2]多肽片段縮合法，以DCC－HOSu縮合法作為片段肽鍵生成方法，并以DCC－HOBt縮合法作為片段偶聯方法進行全合成；中間產物采用析晶化純化，終產物采用普通硅膠柱層析方法純化，獲得高純度產物。本發明方法合成步驟少，產率高，純化及生產操作簡單，節約了生產成本，為內嗎啡肽的實驗室生產特別是工業化規模生產均提供了可靠的技術支持，并可極大地推動內嗎啡肽及相關肽的開發及應用研究。
文檔編號C07K1/00GK1715295SQ20041002631
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月3日 優先權日2004年7月3日
發明者王銳, 張啟軍 申請人:蘭州大學