專利名稱：一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及家畜動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，尤其適合于以牛、羊、兔、馬、驢等家畜動物腦為原料的磷脂酰絲氨酸的提取方法。
背景技術：
牛腦磷脂酰絲氨酸(PS)有增強記憶，抗老年性癡呆等作用已經被國內外動物實驗和臨床驗證，參見、劉平.磷脂酰絲氨酸的藥理及臨床應用研究進展，國外醫學藥學分冊1981，18(4)，207-230。但以牛腦為原料，批量提取生產PS有困難。李斯M.B等(1981)和阿比德等(1998)綜述PS的層析制備和分析方法，制備方法及其復雜。參見李斯MB等，磷脂和甾類分析和制備(Lees MBet al.preparation and Analysis of phosphatides Lipids and steroids，1981，328-345)和阿比德等，色譜學B集1998，(717)279-293(Abidi，SL et al.Journal ofchromatography B，717(1988)279-293).陳蘇等研究高壓液相制備方法，雖然可用于試劑制備，但產量實在有限。參見陳蘇等.色譜學B集1995，(666)178-182(Su chen et al.Journal of chromatography B.666，1995，178-182)。美國用大豆磷脂和L-絲氨酸在磷脂酶D作用下合成PS，并研究成功提取制備方法，參見美國專利5700668(united states patent 5700668)。但這種用大豆磷脂合成的PS其臨床效果遠不如牛腦提取的PS。經過許多重復實驗檢證，該方法也不適合于牛等動物腦提取PS。
我國畜牧養殖正在快速發展，肉牛屠宰量很大，牛腦隨牛頭廉價銷出，有的食用，有的扔掉。近些年來，我們一直從事牛腦PS的提取研究，為牛腦的增值利用開辟新路子、摸索成功可工業生產的牛腦PS提取制備方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種以牛、羊、兔、馬、驢等家畜動物腦為原料的工藝簡單并適于工業化生產的提取磷脂酰絲氨酸的方法。
本發明的目的可通過如下技術措施來實現a、先將干燥動物腦碎成顆粒，再向顆粒中加入丙酮，攪拌萃取，除去含有干腦粒中膽固醇和油類的丙酮上清液，殘渣蒸干；b、向蒸干的殘渣加入正己烷或乙醇或氨水乙醇溶液，攪拌萃取，除去含有磷脂復合物的萃取液，殘渣蒸干；c、向蒸干的殘渣加入乙醚，攪拌萃取，萃取液經蒸濃后加入堿性水溶液，攪拌、凍結、解凍，濾除沉淀，進一步除去剩余的磷脂，然后將上清液調PH＝3～6，蒸除乙醚，再蒸干得粗磷脂酰絲氨酸。
本發明的目的還可通過如下技術措施來實現將c工序中粗磷脂酰絲氨酸干粉溶于正己烷中，加入醋酸鈉乙醇溶液，攪拌、靜置分層，除去含有肌醇磷脂的下層，上部正己烷蒸干得高純度磷脂酰絲氨酸；或者將c工序中蒸除乙醚后直接加入與剩余溶液大致同量的正己烷，攪拌、靜置分層，除去含有肌醇磷脂的下層，上部正己烷蒸干得磷脂酰絲氨酸；前面所述的攪拌萃取為3～5次，每次1～3小時；所述的氨水乙醇溶液及堿性水溶液的PH＝7.5～11；所述的解凍控制溫度為4～7℃；所述的醋酸鈉乙醇溶液是指含醋酸鈉的40～60％乙醇。
本發明的技術措施是先將干燥動物腦碎成大致為0.2～0.4cm的顆粒，再向顆粒中加入體積為3～5倍量的丙酮，攪拌萃取，除去含有干腦粒中膽固醇和油類。若抽提肌醇磷脂和PS磷脂復合物的溶劑為乙醚時，乙醚加入量為蒸干的殘渣體積的3～5倍量，得乙醚提取液，可蒸去大部分乙醚使剩余的乙醚溶液體積為乙醚提取的干物質的3～5倍量。將該乙醚溶液加入到PH＝7.5～11的Na2CO3水溶液中成鹽，攪拌1小時，-10～20℃凍結，4～7℃緩慢解凍。除去下部沉淀，將上清液用2～5％HCl調PH＝3～6。蒸除乙醚，蒸干水分得干粉；或蒸除乙醚后加入與剩余溶液同量的正己烷，攪拌分層，取上部正己烷層，蒸去正己烷得干物質。然后再向干物質加入3～5倍正己烷(或上述中最后加入的正己烷得到的上部正己烷層)，再加入體積5～10倍干物質量含醋酸鈉的40～60％乙醇液攪拌，靜止分層，除去下部白色沉淀(主要為肌醇磷脂)取上部正己烷層，蒸干得磷脂酰絲氨酸，磷脂酰絲氨酸純度為90～93％。
本發明的技術措施若抽提的肌醇磷脂和磷脂復合物的溶劑為正己烷，可將大部分正己烷蒸除，剩余正己烷溶液體積為正己烷提取干物質的3～5倍。然后先除去肌醇磷脂等雜質，再將正己烷蒸除，得干物質后溶于乙醚，最后蒸除乙醚，得磷脂酰絲氨酸，純度為92～95％。
本發明的技術措施若用丙酮除去腦中膽固醇及油脂，干燥得干腦粒，再向干腦粒中加入體積為3～5倍量的正己烷，攪拌萃取3～5次，每次1～3小時，得正己烷提取液，蒸除含有腦總磷脂復合物的正己烷，經乙醚處理后再蒸干得粗磷脂酰絲氨酸，純度為53％。采用此方案可節約使用大量乙醇。
所述的氨水可用氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、醋酸鈉或醋酸鉀替代，但效果以氨水為最好。所述的正己烷可用氯仿、二氯甲烷、甲苯、乙醚替代，一般以正己烷為優選，以減少有機溶劑使用的種類，減少有機溶劑回收塔的建設，簡化生產工藝。
本發明選用常規的有機溶劑提取，可實現大規模工業化生產。腦粒用丙酮除去膽固醇及油類，用乙醇除去卵磷脂，腦磷脂，用正己烷、乙醚提取以磷脂酰絲氨酸和肌醇磷脂為主要成分的磷脂混合物，再用正己烷、堿乙醇溶劑除去沉下肌醇磷脂及雜質，得粗磷脂酰絲氨酸。粗磷脂酰絲氨酸溶于乙醚、該乙醚溶液加入堿性溶液中成鹽，冷凍，解凍除沉淀，上清液調PH＝3～6。正己烷攪拌提取，靜置分層，得正己烷層，蒸去正己烷得高純度磷脂酰絲氨酸。也可將提取的磷脂酰絲氨酸和肌醇磷脂磷脂復合物溶于乙醚，再溶于堿性水溶液冷凍除雜，然后再用正己烷、堿乙醇除肌醇磷脂，得高純度磷脂酰絲氨酸。還可用正己烷提取除去膽固醇及油的腦顆粒得總磷脂復合物，其后操作同以磷脂酰絲氨酸和肌醇磷脂為主成分的磷脂復合物提取磷脂酰絲氨酸方法，但純度較低。
具體實施例方式
實施例11、將鮮牛腦(或冷凍的牛腦)切片，60℃通風烘干，也可自然條件下曬干或晾干，干燥溫度越低越好，低溫干燥最好，碎成0.3cm左右的顆粒，向干燥的牛腦顆粒中加體積為4倍量的丙酮，常溫攪拌萃取4次，每次2小時，除去丙酮上清液，殘渣蒸至無丙酮味；2、向蒸干的殘渣內加入體積為4倍量的PH＝9的氨水乙醇溶液，攪拌萃取4次，每次2小時，殘渣蒸干，提取液可用于再提取卵磷脂和腦磷脂；3、向蒸干的殘渣內加入乙醚，得乙醚提取液，過濾蒸除大部分乙醚，所剩乙醚溶液的體積為乙醚提取的干物質的4倍為止。將其加入到PH＝8.5的Na2CO3水溶液中，攪拌1小時，-18℃凍結，6℃緩慢解凍。可見淡黃色上清液和下部沉淀，除沉淀后將上清液用4％HCl調PH＝5，蒸干水分得干粉。
4、將干粉溶于體積為4倍量的正己烷中，再加入體積為8倍干粉量的含醋酸鈉的50％乙醇，攪拌、靜止分層，可見下面有白色沉淀(沉淀可用于提取肌醇磷脂)。然后將上部正己烷層移出，減壓蒸干得磷脂酰絲氨酸，純度為93％。
實施例21、如果所用原料為鮮兔腦、羊腦、馬腦、驢腦等家畜動物腦，腦的干燥方法同牛腦，如果所用原料為提取過膽固醇后的干腦顆粒，可直接按實施例1中2開始做，下同。
實施例3實施例1中步驟2，向蒸干的殘渣中加入氨水乙醇溶液，是為了除去腦渣中含有的卵磷脂和腦磷脂。
該步驟也可先向腦渣內加入體積為4倍量的無水乙醇，攪拌萃取4小時，提取4次，每次2小時，可提取含約50％卵磷脂，也含約25％的腦磷脂及其他磷脂類，但主成分是卵磷脂，有利于卵磷脂的進一步純化。然后再用渣4倍量PH＝9的氨水乙醇提取，攪拌萃取4次，每次2小時，干后的提取物中含腦磷脂在60％左右，也含有10％卵磷脂及其他磷脂，但主成分是腦磷脂，利于腦磷脂的進一步分離，其他步驟同實施例1。
實施例4實施例1中步驟3，向蒸干的殘渣加入4倍量的乙醚提取，乙醚也可用正己烷、甲苯或氯仿、二氯甲烷替代，提取方法同乙醚，但將提取物加入Na2CO3水溶液時，必須先將正己烷等(甲苯、氯仿、二氯甲烷)蒸發掉，然后用3倍乙醚溶解，再加入Na2CO3堿液，其他步驟同實施例1。
實施例5如實施例1步驟3中用正己烷提取而不用乙醚提取，可將正己烷提取液濃縮，所剩的正己烷溶液的體積為其所提取的干物質的4倍量，然后加入體積為7倍干物質量的含醋酸鈉的45％乙醇、攪拌、靜止、分層、除去白色的肌醇磷脂沉淀。移出正己烷層，蒸除正己烷得干粉，干粉用體積為4倍量乙醚溶解，加入PH＝8的Na2CO3水溶液，攪拌1小時，-15℃凍結，6℃緩慢解凍，得上清液，用3％HCl調PH＝5，蒸發回收乙醚后，蒸干水分得磷脂酰絲氨酸干粉。最好在蒸發回收乙醚后，向剩余水溶液內加入正己烷，攪拌，靜止得正己烷層，蒸除正己烷，磷脂酰絲氨酸純度為94％。
實施例61、如實施例1步驟1丙酮抽提膽固醇及油類的方法，向丙酮抽提過的干腦粒中加入4倍量的正己烷(正己烷可用乙醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯取代)，4次抽提，每次抽提2小時，可得正己烷溶液，蒸除正己烷可得腦中總磷脂復合物。
2、如實施例1中步驟3，上述抽提的總磷脂復合物溶解于乙醚，以下操作如實施例1中步驟3。緩慢解凍后，可除去大量卵磷脂、腦磷脂沉淀，上清液調PH＝6蒸除乙醚后，蒸干水分得粗PS干粉，干粉磷脂酰絲氨酸含量達53％。
3、上述粗PS干粉按實施例1中4操作可得粗磷脂酰絲氨酸，純度達84％。
權利要求
1.一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于a、先將干燥動物腦碎成顆粒，再向顆粒中加入丙酮，攪拌萃取，除去含有干腦粒中膽固醇和油類的丙酮上清液，殘渣蒸干；b、向蒸干的殘渣加入正己烷或乙醇或氨水乙醇溶液，攪拌萃取，除去含有磷脂復合物的萃取液，殘渣蒸干；c、向蒸干的殘渣加入乙醚，攪拌萃取，萃取液經蒸濃后加入堿性水溶液，攪拌、凍結、解凍，濾除沉淀，進一步除去剩余的磷脂，然后將上清液調PH＝3～6，蒸除乙醚，再蒸干得粗磷脂酰絲氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于將c工序中粗磷脂酰絲氨酸干粉溶于正己烷中，加入醋酸鈉乙醇溶液，攪拌、靜置分層，除去含有肌醇磷脂的下層，上部正己烷蒸干得高純度磷脂酰絲氨酸。
3.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于將c工序中蒸除乙醚后直接加入與剩余溶液大致同量的正己烷，攪拌、靜置分層，除去含有肌醇磷脂的下層，上部正己烷蒸干得磷脂酰絲氨酸。
4.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述的攪拌萃取為3～5次，每次1～3小時。
5.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述的氨水乙醇溶液的PH＝7.5～11，所述的堿性水溶液的PH＝7.5～11。
6.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述的解凍控制溫度為4～7℃。
7.根據權利要求1所述的一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述的醋酸鈉乙醇溶液是指含醋酸鈉的40～60％乙醇。
全文摘要
本發明提供一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法，a.先將干燥動物腦碎成顆粒，再向顆粒中加入丙酮，攪拌萃取，除去含有干腦粒中膽固醇和油類的丙酮上清液，殘渣蒸干；b.向蒸干的殘渣加入正己烷或乙醇或氨水乙醇溶液，攪拌萃取，除去含有磷脂復合物的萃取液，殘渣蒸干；c.向蒸干的殘渣加入乙醚，攪拌萃取，萃取液經蒸濃后加入堿性水溶液，攪拌、凍結、解凍，濾除沉淀，進一步除去剩余的磷脂，然后將上清液調pH＝3～6，蒸除乙醚，再蒸干得粗磷脂酰絲氨酸。再將粗磷脂酰絲氨酸干粉溶于正己烷中，再加入醋酸鈉乙醇溶液，攪拌、靜置分層，除去含有肌醇磷脂的下層，上部正己烷減壓蒸干得高純度磷脂酰絲氨酸。
文檔編號C07F9/10GK1583766SQ20041002422
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月1日 優先權日2004年6月1日
發明者劉代成, 楊雅婷 申請人:山東師范大學