專利名稱：一種海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤活性環肽組分，具體地說是一種單細胞多核海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用。
背景技術：
癌癥、心血管疾病、愛滋病是威脅人類健康的三大類主要疾病，因而也是當前全球研究最熱門的三種疾病。針對這三類疾病目前所用的藥物大多是化學合成藥物，毒副作用極大，而且至今尚沒有得到一種特別理想的合成藥物。從天然藥源生物中篩選具有抗腫瘤、抗病毒活性的化合物，進而通過化學修飾或半合成成為具有獨特療效的天然藥物及藥源，其意義特別重大。
環肽是指一類主要由α-氨基酸和一些不常見的非蛋白氨基酸以肽鍵形成的環狀天然小分子化合物。環肽的結構同大環超分子如冠醚、環糊精、杯芳烴等有所相似，容易形成氫鍵網絡；此外，環肽還存在內在構象約束，因而在超分子化學及分子識別方面引起了人們的廣泛注意。
專利號為93108015.0、94103298.1、95105200.4、97194526.8、96192543.4、97195724.X、01817777.8等中國專利中分別就一些已有環肽結構進行了修飾，產生了一定的活性，但是化學修飾的環肽構型多沒有天然存在環肽構型穩定，并且化學修飾或合成的環肽具有一定毒性，又容易污染環境。
以往專利中環肽多來源于陸地動物、植物、微生物，資源有限、種類單一，如CN99815515.2、CN02114663.2等。海洋生物以其物種的多樣性及其代謝產物的化學結構的多樣性為優勢，已經成為生物活性物質的巨大寶庫。海洋生物不同于陸地生物，海洋生物中蘊藏著大量結構新穎、化學性質特殊、生物活性極其強烈的物質。海洋生物所含的肽類化合物，特別是環肽類化合物，在抗腫瘤、抗病毒、抗菌以及酶抑制劑活性方面顯示了巨大的潛力，這方面的研究一直是海洋天然產物化學研究中最吸引人、最活躍的領域之一。目前就已經在海洋生物中鑒定的200多個環肽類化合物而言，主要來源于海鞘、海綿、軟體動物、藍藻以及微生物，其中大部分化合物來源于軟體動物海鞘和海綿，但是海鞘和海綿資源有限、養殖困難，因而限制了環肽類化合物的制備及利用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種單細胞多核海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用，分離出的環肽組分具有較好抗腫瘤活性、毒副作用小，且其制備工藝簡單。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用。
具體過程為取新鮮海洋綠藻Bryopsis sp.清洗、擠干，用甲醇或乙醇浸提，過濾得甲醇或乙醇溶液，減壓濃縮后依次用的正丁醇和氯仿萃取；取正丁醇層，減壓濃縮真空干燥得組分1；氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水和正己烷萃取，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇體積濃度為50～80％，然后再加入氯仿靜置分層，減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2；通過分級分離制備的具活性的兩組分分別在氯仿和正丁醇中，通過茚三酮丙酮試劑(0.2％)檢測兩組分(組分1和2)為環肽類物質。
所述甲醇-水的體積比通常為7.5～9∶1～2.5；海洋綠藻Bryopsis sp.通常為蘚羽藻Bryopsis hypnoides、塔形羽藻Bryopsis plumosa、假根羽藻Bryopsiscorticulans或Bryopsis maxima。
本發明具有如下優點1.原料易得。Bryopsis sp.是一種極其特殊的綠藻，主要分布在熱帶、亞熱帶淺海區，每年7月到11中旬月繁殖速度較快，資源豐富，適合于大批量采集儲存，而且這種綠藻具有多種繁殖方式，人工養殖也較容易。因此以Bryopsis sp.為材料大批量制備抗腫瘤活性物質提供了極大的資源優勢，不存在材料供應不足的問題。
2.環肽組分毒副作用小。Bryposis sp.本身安全、可食，本發明從Bryopsissp.中制備的抗腫瘤環肽類組分具有較好的抗腫瘤活性，其為天然活性物質，與其它化學合成藥物相比更具有毒副作用小，因此其可作為保健品和藥劑口服，特別是可作為抗腫瘤試劑以片劑、膠囊、液體、糖漿等的形式口服。
3.制備工藝簡單。通過簡單的有機試劑分級分離、制備Bryposis sp.環肽具有資源優勢、工藝簡潔等特點。
4.成本低。所用試劑為乙醇或甲醇、正丁醇、氯仿等，所以生產成本低，由此可以降低這種腫瘤治療藥物的價格。
5.應用性好。本發明由海洋綠藻——Bryopsis sp.中發現并制備兩具有抗腫瘤活性的環肽組分，兩環肽類組分在疾病治療上具有潛在的利用價值，屬于極有潛力的海洋天然活性物質，可在治療腫瘤、抗病毒及功能性食品、保健品上應用。兩活性環肽組分還可進一步分離、純化，鑒定結構，進行適當的修飾或以其本身制備更加高效的抗腫瘤藥物。
圖1為Bryposis sp.環肽組分制備工藝流程。
具體實施例方式
實施例1參見圖1所示，Bryopsis sp.環肽組分的制備工藝流程。
新鮮Bryopsis sp.，用蒸餾水迅速清洗2～3遍、擠干，稱重約1kg；每次用2L甲醇回流提取3次，各2h，過濾，合并3次所得甲醇濾液，減壓濃縮至體積1～1.5L，然后依次用等體積的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇層再用等體積蒸餾水洗1～2次，靜置分層取正丁醇層，減壓濃縮，真空干燥為組分1。氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水(體積比9∶1)和正己烷各1L，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇濃度到60％，然后再加入等體積的氯仿靜置分層；減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2。
以水合茚三酮為顯色劑，采用薄層原位化學反應方法(濃鹽酸，110℃，1～2h)，對組分1、2檢測確認為環肽類化合物。這類化合物易結晶，熔點大多高于200℃，多為左旋體，親脂性較強，可溶于弱及中等極性的溶劑，如氯仿、甲醇、乙酸乙酯、苯等溶劑，因而可以用這類有機試劑分級提取。
抗腫瘤活性體外篩選實驗1)四氮咪鹽(Microculture Tetrozolium，MTT)還原法細胞株P388小鼠白血病；作用時間48小時；結果分析組分1與組分2對P388小鼠白血病都具有抑制作用。組分1在1mg/ml作用明顯；組分2在1mg/ml、0.25mg/ml、0.063mg/ml活性較強。
表1環肽組分對P388小鼠白血病細胞生長的影響對腫瘤細胞的抑制率％
2)磺酰羅丹明B(Sulfor Rodamine B，SRB)蛋白染色法細胞株A-549人肺癌細胞；作用時間72h結果分析組分1、對A-549人肺癌細胞生長具有較好的抑制效果，組分2在0.25mg/ml作用明顯。
表2環肽類組分對A-549人肺癌細胞生長影響對腫瘤細胞的抑制率％
由以上結果表明，通過簡單的有機試劑分級分離、制備Bryposis sp.環肽具有資源優勢、工藝簡潔等特點；Bryposis sp.本身安全、可食，并且已制備兩環肽組分具有較好的抗腫瘤活性。
實施例2取新鮮蘚羽藻(Bryopsis hypnoides)，用蒸餾水迅速清洗2遍、擠干，稱重約1kg；每次用3L乙醇提取3次，各2h，過濾，合并3次所得乙醇濾液，減壓濃縮至體積1～1.5L，然后依次用等體積的正丁醇和氯仿萃取。正丁醇層再用等體積蒸餾水液洗1～2次，取正丁醇層，減壓濃縮，真空干燥為組分1。氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水(體積比8.5∶1.5)2L和正己烷1L，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇濃度到80％，然后再加入等體積的氯仿靜置分層；減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2。
實施例3取新鮮塔形羽藻(Bryopsis plumosa)，用蒸餾水迅速清洗2遍、擠干，稱重約1kg；每次用2.5L乙醇提取2次，各4h，過濾，合并2次所得乙醇濾液，減壓濃縮至體積1～1.5L，然后依次用等體積的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇層再用等體積蒸餾水洗1次，取正丁醇層，減壓濃縮，真空干燥為組分1。氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水(體積比8.5∶1.5)和正己烷各0.8L，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇濃度到80％，然后再加入等體積的氯仿靜置分層；減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2。
實施例4取新鮮假根羽藻(Bryopsis corticulans)，用蒸餾水迅速清洗4遍、擠干，稱重約1kg；每次用2L乙醇提取4次，各2h，過濾，合并4次所得乙醇濾液，減壓濃縮至體積1～1.5L，然后依次用等體積的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇層再用等體積蒸餾水洗3次，取正丁醇層，減壓濃縮，真空干燥為組分1。氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水(體積比9∶1)和正己烷各1.2L，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇濃度到70％，然后再加入等體積的氯仿靜置分層；減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2。
實施例5取新鮮Bryopsis maxima，用蒸餾水迅速清洗4遍、擠干，稱重約1kg；每次用3L乙醇提取2次，各3h，過濾，合并2次所得乙醇濾液，減壓濃縮至體積1～1.5L，然后依次用等體積的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇層再用等體積蒸餾水洗2次，取正丁醇層，減壓濃縮，真空干燥為組分1。氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水(體積比9∶1)和正己烷各1.5L，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇濃度到50％，然后再加入等體積的氯仿靜置分層；減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2。
權利要求
1.一種海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用。
2.按照權利要求1所述海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用，其特征在于取新鮮海洋綠藻Bryopsis sp.清洗、擠干，用甲醇或乙醇浸提，過濾得甲醇或乙醇溶液，減壓濃縮后依次用正丁醇和氯仿萃取；取正丁醇層，減壓濃縮真空干燥得組分1；氯仿層減壓濃縮至干后加甲醇-水和正己烷萃取，待靜置分層后取甲醇層，調節甲醇體積濃度為40～80％，然后再加入氯仿靜置分層，減壓濃縮氯仿層，真空干燥得組分2；組分1和2即為抗腫瘤活性環肽組分。
3.按照權利要求1所述海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用，其特征在于所述甲醇-水的體積比為7.5～9∶1～2.5。
4.按照權利要求1所述海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用，其特征在于所述海洋綠藻Bryopsis sp.為蘚羽藻Bryopsis hypnoides、塔形羽藻Bryopsis plumosa、假根羽藻Bryopsis corticulans或Bryopsis maxima。
全文摘要
本發明涉及抗腫瘤活性環肽組分，具體地說是一種單細胞多核海洋綠藻在提取抗腫瘤活性環肽組分中的應用；本發明優點為原料易得，資源豐富；制備的抗腫瘤環肽組分毒副作用小，抗腫瘤活性較好；制備工藝簡單；成本低；可開發潛力大，應用性好。
文檔編號C07K14/405GK1690076SQ200410020450
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月23日 優先權日2004年4月23日
發明者王廣策, 王發左, 葉乃好, 劉海航, 曾呈奎 申請人:中國科學院海洋研究所